JP5918295B2

JP5918295B2 - 融合蛋白質、その製造方法、及び融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法

Info

Publication number: JP5918295B2
Application number: JP2014082756A
Authority: JP
Inventors: 寧生 ▲頼▼; ▲憲▼斌 ▲黄▼; 惠君游
Original assignee: 佛教慈濟醫療財團法人大林慈濟醫院
Priority date: 2014-04-14
Filing date: 2014-04-14
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2034-04-14
Also published as: JP2015203013A

Description

本発明は、融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法に関し、強直性脊椎炎（ＡｎｋｙｌｏｓｉｎｇＳｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）の治療に用いられる臨床研究に関する。

強直性脊椎炎（ＡｎｋｙｌｏｓｉｎｇＳｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）の発病メカニズムは、ヒト白血球型抗原Ｂ―２７（ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｉｃａｎｔｉｇｅｎ−Ｂ２７、略称ＨＬＡ−Ｂ２７）の発現に関連する。ＨＬＡ―Ｂ２７は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ、略称ＭＨＣｃｌａｓｓＩ）分子に属し、重鎖（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ、略称ＨＣ）及びβ₂ミクログロブリン（β₂−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、略称β₂ ｍ）により構成される。小胞体中でＨＬＡ―Ｂ２７が合成されると、ＨＬＡ―Ｂ２７は、抗原ペプチドに結合され、ＨＬＡ―Ｂ２７と抗原ペプチドとの結合複合体はトランスゴルジ体（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ）により細胞膜に輸送され、抗原ペプチドは細胞の表面に現れる。

ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ、４６：２９７２−８２、２００２ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２７７：２３４５９−６８、２００２ＪＩｍｍｕｎｏｌ、１７３：１６９９−７１０、２００４；ＪＩｍｍｕｎｏｌ、１８６：２６７２−８０、２０１１ＪＩｍｍｕｎｏｌ、１６３：６６６５−７０、１９９９；ＪＥｘｐＭｅｄ、１８０：２１６３−７１、１９９４

しかしながら、２００２年ＫｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒＳ氏ら（非特許文献１を参照）及びＤａｎｇｏｒｉａＮＳ氏ら（非特許文献２を参照）の研究では、ＨＬＡ―Ｂ２７の重鎖は、小胞体中とβ₂ミクログロブリン及び抗原ペプチドとが結合する前に、自然と緩やかに折り畳まれる傾向があり、誤って折り畳まれたＨＬＡ―Ｂ２７重鎖が小胞体内に堆積され蛋白質変性反応を引き起こしＨＬＡ―Ｂ２７重鎖二量体（Ｂ２７−ＨＣ）₂を形成する。ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖二量体（Ｂ２７−ＨＣ）₂は、β₂ミクログロブリンに結合せず、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖二量体が細胞膜で発現されると、自然にナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ−ｃｅｌｌｓ、略称ＮＫｃｅｌｌｓ）とＴｈ１７細胞（Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ１７ｃｅｌｌｓ）が活性化され、炎症反応が引き起こされ、強直性脊椎炎の主要な潜在的な原因となった（非特許文献３を参照）。

また、他の資料によると、ＨＬＡ―Ｂ２７と結合する抗原ペプチドは小胞体中でＨＬＡ―Ｂ２７重鎖が正確に折り畳まれるのを助ける（非特許文献４を参照）。このため、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖は強直性脊椎炎を治療するための重要な薬物であり、ＨＬＡ―Ｂ２７が結合する抗原ペプチドを小胞体内まで有効的に輸送し、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖の折り畳みを促進し、強直性脊椎炎を治療する潜在的なメカニズムになる。然しながら、現在の関連する研究分野では、正確な大きさ及び配列の抗原ペプチドを小胞体内に輸送する適切な技術方法が開発されていない。

そこで、本発明者は上記の欠点が改善可能と考え、鋭意検討を重ねた結果、合理的設計で上記の課題を効果的に改善する本発明の提案に到った。

本発明は、このような従来の問題に鑑みてなされたものである。上記問題を解決するため、本発明は、融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法を提供することを主目的とする。つまり、正確な大きさ及び配列の抗原ペプチドを小胞体内に輸送し、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖が小胞体内で正確に折り畳まれるのを促進する。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法は、人間を治療する方法を除く方法であり、以下の工程を含む。Ｔａｔペプチド、（Ｈｉｓ）₆ペプチド、ユビキチン蛋白質、及び抗原ペプチドを含有する融合蛋白質を製造する工程ａを含む。Ｔａｔペプチドにより細胞外から細胞の細胞質中に融合蛋白質を導入する「融合蛋白質を細胞外から細胞質に輸送する工程ｂ」を含む。細胞質中のユビキチン蛋白質Ｃ端加水分解酵素により融合蛋白質中から抗原ペプチドを切り出す「抗原ペプチドを切り出す工程ｃ」を含む。細胞質中の小胞体の膜のＴＡＰ１／２輸送蛋白質により切り出された抗原ペプチドを小胞体内に導入する「抗原ペプチドを小胞体に輸送する工程ｄ」を含む。

本発明は、抗原ペプチドを小胞体内に有効的に輸送する。輸送された抗原ペプチドは、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖が正確に折り畳まれるのを助け、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖二量体の数量を減少させ、炎症反応の発生を抑える。これにより本発明は強直性脊椎炎の治療の臨床研究に応用可能である。
本発明は、癌治療の研究にも応用可能である。細菌由来の抗原ペプチドをヒト細胞の小胞体に輸送した後、抗原ペプチドがヒト細胞のＨＬＡ―Ｂ２７により細胞の表面に現れ、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させ、細胞毒反応を引き起こす。故に本発明は、癌治療の研究分野に応用可能であり、本方法により特定の抗原ペプチドを癌細胞の中に導入すると、癌細胞のＭＨＣＣｌａｓｓＩ分子は、抗原ペプチドが輸送された細胞膜に現れ、この際、癌細胞は活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞に毒殺され、癌治療の効果を達成することができる。

本発明の一実施形態による融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法を示すフローチャートである。本発明の一実施形態による融合蛋白質を説明する模式図（一）である。本発明の一実施形態による融合蛋白質を説明する模式図（二）である。本発明の一実施形態において融合蛋白質が細胞に輸送された数値を示す図である。本発明の一実施形態において融合蛋白質が細胞に輸送された数値を示す図である。本発明の一実施形態において融合蛋白質が細胞に輸送された数値を示す図である。本発明の一実施形態において融合蛋白質が細胞に輸送された数値を示す図である。本発明の一実施形態において抗原ペプチドが細胞表面に現れた数値を示す図である。本発明の一実施形態において抗原ペプチドが細胞表面に現れた数値を示す図である。本発明の一実施形態において抗原ペプチドが細胞表面に現れた数値を示す図である。本発明の一実施形態において融合蛋白質が細胞に輸送された後、アポトーシスした細胞量を示す図である。本発明の一実施形態において融合蛋白質が細胞に輸送された後、アポトーシスした細胞量を示す図である。本発明の一実施形態において融合蛋白質が細胞に輸送された後、アポトーシスした細胞量を示す図である。

本発明における好適な実施形態について、添付図面を参照して説明する。尚、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を限定するものではない。また、以下に説明される構成の全てが、本発明の必須要件であるとは限らない。

（一実施形態）
図１から図３に示す融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法は、融合蛋白質１００を製造する工程ａを含む。融合蛋白質１００の配列はＮ端からＣ端にかけて順にＴａｔペプチド１０、（Ｈｉｓ）₆ペプチド２０、ユビキチン蛋白質３０、及び抗原ペプチド４０を含有する、または、図２に示すように、順に（Ｈｉｓ）₆ペプチド２０、Ｔａｔペプチド１０、ユビキチン蛋白質３０、及び抗原ペプチド４０を含有する。図３によると、抗原ペプチド４０の配列はＲＲＦＫＥＧＧＲＧＧＫＹまたはＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬである。配列がＲＲＦＫＥＧＧＲＧＧＫＹである場合、抗原ペプチド４０はクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のＤＮＡｐｒｉｍａｓｅ由来であり、形成される融合蛋白質１００はＴＨＵＣ融合蛋白質１００という。配列がＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬである場合、抗原ペプチド４０は人間のＨＬＡ―Ｂ２７重鎖由来であり、形成される融合蛋白質１００はＴＨＵＢ融合蛋白質１００という。

また、融合蛋白質１００の製造方法は、以下の工程を含む。工程１では、融合蛋白質１００のｃＤＮＡを設計し、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡをクローニングする。工程２では、ｃＤＮＡクローンをベクターＤＮＡに挿入し、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によりベクターＤＮＡを大腸菌細胞株に導入し、大腸菌細胞株でｃＤＮＡをからのタンパク質を発現し、融合蛋白質１００を大量に発現する。工程３では、大腸菌細胞株内の蛋白質を抽出する。工程４では、工程３で抽出された蛋白質を精製する。融合蛋白質１００は、（Ｈｉｓ）₆ペプチド２０を含有するため、融合蛋白質１００はＮｉ²⁺―Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにより容易に生成される。これにより工程３で抽出された蛋白質に対して、Ｎｉ²⁺―Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて親和クロマトグラフィーを行い、高速蛋白質液体カラム（ＦＰＬＣ）を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、抽出された融合蛋白質１００を精製する。

融合蛋白質１００を細胞外から細胞質に輸送する工程ｂでは、強直性脊椎炎患者の末梢血単核球（以下「ＰＢＭＣｓ」という）を抽出した後、ＰＢＭＣｓの培養液に融合蛋白質１００を加え（各５ｘ１０６細胞毎に５μｍ／ｍｌの融合蛋白質１００を加える）、ＰＢＭＣｓ細胞を培養する。従来の技術では、Ｔａｔペプチド１０のアミノ酸の配列はＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲであり、これは密集する正電荷を帯びるペプチドである。Ｔａｔペプチド１０はこれと融合する蛋白質を含有すると共に細胞膜を貫通し細胞質内（ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ．５７：５５９−５７７、２００５）に進入する。これにより、融合蛋白質１００はＴａｔペプチド１０により、ＰＢＭＣｓの細胞外からＰＢＭＣｓの細胞質中に導入される。また、抗原ペプチド４０を切り出す工程ｃでは、ＰＢＭＣｓ細胞質中のユビキチン蛋白質Ｃ端加水分解酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ）により、精確に自動的にユビキチン蛋白質３０のＣ端を切断する。これにより、ユビキチン蛋白質Ｃ端加水分解酵素により、融合蛋白質１００から本発明の抗原ペプチド４０が切り出される。なお、抗原ペプチド４０を小胞体に輸送する工程ｄでは、上述の工程ｃに於いて切り出された抗原ペプチド４０は、ＰＢＭＣｓ細胞質中の小胞体の膜のＴＡＰ１／２輸送タンパク質により小胞体内まで輸送される。

また、本発明は融合蛋白質１００をＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞群に輸送する。Ｃ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞は、ヒトリンパ細胞株（ｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｉｄｃｅｌｌｌｉｎｅ）であり、この細胞の表面には誤って折り畳まれたＨＬＡ―Ｂ２７重鎖が現れる。本発明の融合蛋白質１００がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞に輸送された後、抗原ペプチド４０が小胞体中に輸送される方法及び原理は、上述のＰＢＭＣｓの輸送と同じである。

図４Ａから図４Ｄは、本発明のＴＨＵＣ融合蛋白質１００或いはＴＨＵＢ融合蛋白質１００が細胞に輸送された後の数値を示す図である。図４Ａ及び図４ＢはＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の輸送を図示し、図４Ｃ及び図４ＤはＰＢＭＣｓの輸送を図示する。図４Ａ及び図４Ｂのトランスフェリン受容器（Ｔｆｒｅｃｅｐｔｏｒ）は内部制御群（ｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ）であり、ＴＨＵ、ＨＵＢ、ＨＵＣは実験体群である。ＴＨＵは融合蛋白質１００であるが抗原ペプチド４０を含有せず、ＨＵＢ及びＨＵＣは他の融合蛋白質１００であるがＴａｔペプチド１０を含有しない。本発明のＴＨＵＣ融合蛋白質１００が細胞に導入された後、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖二量体（Ｂ２７−ＨＣ）₂の数量が著しく減少し、図４Ａ、図４Ｃ及び図４Ｄのように、ＴＨＵＢ融合蛋白質１００が細胞に導入された後、同様の効果を達成することができる（図４Ｂ参照）。

また、図５Ａから図５Ｃは、本発明のＴＨＵＣ融合蛋白質１００或いはＴＨＵＢ融合蛋白質１００がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞に導入された後、フローサイトメトリーによりＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の表面に表示される抗原ペプチド４０を計測した数値を示す図である。ＴＨＵ、ＨＵＢ、ＨＵＣは、実験体群であり、Ｙ軸の数値はＷ６／３２モノクローナル抗体の平均チャンネル蛍光強度（Ｍｅａｎｃｈａｎｎｅｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、略称ＭＣＦ）の数値を表し、実験で用いられるＷ６／３２モノクローナル抗体はＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の表面のβ₂ミクログロブリン（β₂ｍ）に連結されるＨＬＡ―Ｂ２７重鎖（ＨＣ）に結合されるため、Ｗ６／３２モノクローナル抗体の平均チャンネル蛍光強度は、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖が折り畳まれる正確な数量を反映し、またＨＬＡ―Ｂ２７に結合される抗原ペプチド４０がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の表面に表示される数量を反映する。

本発明のＴＨＵＣ融合蛋白質１００がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞に導入された後、抗原ペプチド４０がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の表面に現れる数量は著しく増加する。図５Ａに示すように、ＴＨＵＢ融合蛋白質１００がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞に導入された後も同様の効果が得られる。図５Ｂに示すように、ＴＡＰ１ｓｈＲＮＡを運用し、Ｃ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の小胞体のＴＡＰ１が蛋白質を輸送しノックダウンすると、ＴＨＵＣ融合蛋白質１００またはＴＨＵＢ融合蛋白質１００のいずれをＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞に導入しても、抗原ペプチド４０がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の表面に現れる数量は増加しない（図５Ｃ参照）。

また、図６Ａから図６Ｃは、本発明のＴＨＵＣ融合蛋白質１００或いはＴＨＵＢ融合蛋白質１００がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞に導入され、Ｃ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞が抗原ペプチド４０を細胞膜に表し、抗原ペプチド４０により活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を加えた後、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスしたＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の数量を計測した数値を示す図である。活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の製造方法は以下の通りである。強直性脊椎炎患者のＰＢＭＣｓを取得し、インターロイキン―２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２、略称ＩＬ−２）とＴＨＵＣ融合蛋白質１００或いはＴＨＵＢ融合蛋白質１００によりＰＢＭＣｓを刺激し活性化させた後、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する。ＴＨＵは対象群であり、ＴＡＰ１ｓｈＲＮＡはＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞内のＴＡＰ１が輸送した蛋白質をノックダウンする。このほか、アポトーシスしたＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞はＡｎｔｉ―ＡＣＴＩＶＥＣａｓｐａｓｅ―３抗体によりマークされ、数値は図６Ａから図６Ｃ中のＹ軸に表示されている。

本発明のＴＨＵＣ融合蛋白質１００がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞に導入された後、アポトーシスしたＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の数量は明確に増加する。図６Ａに示すように、アポトーシス反応は活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞に関係すると証明され、図６Ｂに示すように、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は細胞毒殺（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）反応を引き起こし、Ｃ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞をアポトーシスさせる。反対に、本発明のＴＨＵＢ融合蛋白質１００がＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞に導入された後、アポトーシスしたＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞の数量は増加しない（図６Ｃの参照）。

したがって、図６Ａから図６Ｃの数値が証明するように、抗原ペプチド４０が細菌由来ならば、抗原ペプチド４０はＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させて細胞毒反応を引き起こし、宿主の細胞のＣ１Ｒ―Ｂ２７０４細胞はアポトーシスする。反対に、抗原ペプチド４０が宿主の細胞と同じ人間由来の場合、抗原ペプチド４０はＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化せず、細胞毒反応を引き起こさない。

上述したように、本発明の種融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法は、正確な大きさ及び配列の抗原ペプチド４０を細胞の小胞体内に輸送し、ＨＬＡ―Ｂ２７重鎖が小胞体内で正確に折り畳まれるのを促進した後、正確に折り畳まれたＨＬＡ―Ｂ２７重鎖はβ₂ミクログロブリンに結合され、ＨＬＡ―Ｂ２７を形成し、ＨＬＡ―Ｂ２７と抗原ペプチド４０とを結合させた後、抗原ペプチド４０を細胞の表面に表す。よって、本発明はＨＬＡ―Ｂ２７重鎖二量体の数量を減少し、炎症反応の発生を更に低減する。故に、本発明は強直性脊椎炎治療の臨床研究に応用可能である。

このほか、細菌由来の抗原ペプチド４０をヒト細胞に輸送した後、抗原ペプチド４０はヒト細胞のＨＬＡ―Ｂ２７により細胞の表面に現れ、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化して細胞毒反応を引き起す。故に、本発明は、癌治療研究分野に運用可能であり、本方法を用いて特定の抗原ペプチドを癌細胞に導入すると、癌細胞のＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子は輸送される抗原ペプチドを細胞膜に表す。この際、癌細胞は活性化的されたＣＤ８＋Ｔ細胞に毒殺され、癌治療の効果を達成する。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。

１００融合蛋白質、
１０Ｔａｔペプチド、
２０（Ｈｉｓ）₆ペプチド、
３０ユビキチン蛋白質、
４０抗原ペプチド。

Claims

Ｔａｔペプチド、（Ｈｉｓ）₆ペプチド、ユビキチン蛋白質、及び抗原ペプチドを含有する融合蛋白質を製造する工程ａと、
前記Ｔａｔペプチドにより細胞外から前記細胞の細胞質中に前記融合蛋白質を導入する「融合蛋白質を細胞外から細胞質に輸送する工程ｂ」と、
前記細胞質中のユビキチン蛋白質Ｃ端加水分解酵素により前記融合蛋白質中から前記抗原ペプチドを切り出す「抗原ペプチドを切り出す工程ｃ」と、
前記細胞質中の小胞体の膜のＴＡＰ１／２輸送蛋白質により、切り出された前記抗原ペプチドを前記小胞体内に導入する「抗原ペプチドを小胞体に輸送する工程ｄ」と、を含み、
前記抗原ペプチドのアミノ酸の配列はＲＲＦＫＥＧＧＲＧＧＫＹであり、
人間を治療する方法を除くことを特徴とする融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。
Ｔａｔペプチド、（Ｈｉｓ）₆ペプチド、ユビキチン蛋白質、及び抗原ペプチドを含有する融合蛋白質を製造する工程ａと、
前記Ｔａｔペプチドにより細胞外から前記細胞の細胞質中に前記融合蛋白質を導入する「融合蛋白質を細胞外から細胞質に輸送する工程ｂ」と、
前記細胞質中のユビキチン蛋白質Ｃ端加水分解酵素により前記融合蛋白質中から前記抗原ペプチドを切り出す「抗原ペプチドを切り出す工程ｃ」と、
前記細胞質中の小胞体の膜のＴＡＰ１／２輸送蛋白質により、切り出された前記抗原ペプチドを前記小胞体内に導入する「抗原ペプチドを小胞体に輸送する工程ｄ」と、を含み、
前記抗原ペプチドのアミノ酸の配列はＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬであり、
人間を治療する方法を除くことを特徴とする融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。
前記融合蛋白質の配列は、Ｎ端からＣ端にかけて順に前記Ｔａｔペプチド、前記（Ｈｉｓ）₆ペプチド、前記ユビキチン蛋白質、及び前記抗原ペプチドを含有することを特徴とする請求項１または２に記載の融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。
前記融合蛋白質の配列は、Ｎ端からＣ端にかけて順に前記（Ｈｉｓ）₆ペプチド、前記Ｔａｔペプチド、前記ユビキチン蛋白質、及び前記抗原ペプチドを含有することを特徴とする請求項１または２に記載の融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。