CN103755814B - Tat-il-24-kdel融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，是指TAT穿膜肽和内质网定位信号肽KDEL分别连接在白细胞介素-24(IL-24)的N端和C端的融合蛋白。其制备步骤包括：PCR扩增获取TAT-IL-24-KDEL编码基因，利用pET28-SUMO作为载体，转化BL21(DE3)，异源表达带有SUMO标签的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。由于融合蛋白以包涵体形式表达，经过变复性、镍柱纯化和标签去除操作后获得高纯度的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。利用流式细胞实验检测纯化的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用，利用免疫荧光实验检测融合蛋白在胞内的定位情况。本发明首次制备了TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，纯度达到92％，能够有效定位于内质网上从而促进乳腺癌细胞MCF-7的凋亡。

Description

TAT-IL-24-KDEL融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程，尤其涉及一种TAT-IL-24-KDEL融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
1995年FisherP.B.通过差减杂交技术发现一个新的与人黑色素瘤分化相关基因，当时称为mda-7，并发现随着黑色素瘤细胞生长、发展和转移，mda-7的表达逐渐减少至最终消失，证实了其表达产物MDA-7具有抑制黑色素瘤细胞增生、促进黑色素瘤细胞终末分化的能力。2002年，Caudell等研究证实了MDA-7的细胞因子属性，重新命名为人白细胞介素24(Humaninterleukin-24，hIL-24)。迄今为止，已有大量实验证明IL-24具有显著地选择性抑制多种肿瘤生长、诱导肿瘤细胞增殖的能力，这种抑制作用不依赖于p53、Rb和p16等抑癌基因的状态，且对正常细胞没有影响。MDA-7／IL-24的作用谱很广，可诱导包括黑色素瘤、多形性胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、鼻咽癌及前列腺癌等肿瘤细胞的生长抑制和凋亡。IL-24作为细胞因子，不仅在激活免疫细胞、调节整个抗癌免疫反应和造血系统中起重要作用，还具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡和直接抑制肿瘤细胞的增殖、转移作用，其显著地抗肿瘤特性使之成为肿瘤治疗研究的新热点。
早期研究表明，MDA-7／IL-24是通过与肿瘤细胞膜表面的受体复合物IL-20R1／IL-20R2和IL-22R1／IL-20R2结合，激活JAK／STAT信号途径使STAT3磷酸化而调节胞内相关基因的表达发挥生长抑制和促凋亡作用的。Sauane等的研究结果提出MDA-7／IL-24也可通过非JAK／STAT依赖途径发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。最近有大量文献证明MDA-7／IL-24可以通过调控内质网应激反应和线粒体完整性抑制肿瘤细胞生长和凋亡。针对IL-24的内质网作用途径，运用基因工程技术大量制备IL-24蛋白，并将其用于促进肿瘤细胞凋亡的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，并提供一种TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的制备方法，以获得高浓度高纯度的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，同时提供一种TAT-IL-24-KDEL融合蛋白在肿瘤治疗上的用途。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，是将TAT穿膜肽和内质网定位信号肽KDEL分别融合到IL-24蛋白的N端和C端，构成TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；所述TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
上述TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
A、构建pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒；
B、利用E.coliBL21(DE3)异源表达SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；
C、分离纯化TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；
D、体外检测TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用和融合蛋白在细胞内的定位。
步骤A的具体方法是，采用PCR扩增方法获得SUMO标签和TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的编码基因，并采用融合PCR的方法将SUMO和TAT-IL-24-KDEL的编码基因无缝连接，利用含有T7启动子的pET28a(+)表达载体构建重组质粒。
步骤B的具体方法是，将含有pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒的E.coliBL21(DE3)在37℃下培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃诱导10h，异源表达SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，融合蛋白以包涵体形式存在。
步骤C的具体方法是，在变性条件下，利用His标签的亲和层析分离纯化SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，蛋白复性以后，用SUMO蛋白酶在融合蛋白上切除SUMO标签并再次利用His亲和层析去除SUMO标签，分离纯化TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。
步骤D的具体方法是，利用流式细胞实验检测纯化的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的凋亡作用，利用免疫荧光实验检测融合蛋白在胞内的定位情况。
本发明的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白能够有效定位于内质网上，从而促进乳腺癌细胞MCF-7的凋亡。
上述TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的制备方法的具体步骤如下：
1、构建pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒
1.1、以含有TAT穿膜肽编码序列的上游引物5’-CGCGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGAGCCCAGGGCCAAGAGTTCC-3′(下划线表示TAT穿膜肽编码序列)和下游引物5’-CCGCTCGAGTCAGAGCTCGTCCTTGAGCTTGTAGAATTTCTGC-3’(下划线表示内质网定位信号肽KDEL编码序列)为反应引物，以全长的IL-24基因为模板，PCR扩增获得TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的编码基因。
1.2、用基因纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，将目的基因和pET28a(+)／SUMO表达质粒用BamHI和XhoI进行双酶切，T4连接酶连接后转化E.coliBL21(DE3)，挑选阳性克隆送样测序。
2、利用E.coliBL21(DE3)异源表达SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。将测序正确的含有pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒的E.coliBL21(DE3)在37℃下培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃诱导10h，异源表达SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。
3、分离纯化SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白
3.1、由于融合蛋白以包涵体的形式表达，所以需要对其进行变复性。在变性条件下，利用His标签的亲和层析分离纯化SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。
3.2、利用透析复性的方法，对纯化的融合蛋白进行复性。
3.3、蛋白复性以后，用SUMO蛋白酶在融合蛋白上切除SUMO标签并再次利用His亲和层析去除SUMO标签，分离纯化TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。
4、体外检测TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用。利用流式细胞实验检测纯化的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的活性。分别将终浓度为0nM，5nM，10nM和20nM的融合蛋白加入乳腺癌MCF-7细胞，24h后用AnnexinV-FITC／PI凋亡双染试剂盒处理样品，检测融合蛋白对MCF-7的凋亡作用。
利用免疫荧光技术检测融合蛋白中穿膜肽TAT和内质网定位信号肽KDEL对IL-24定位的影响。先用IL-24的一抗和PE标记的二抗对目的蛋白进行免疫荧光反应，再用内质网形态染色试剂盒对内质网进行染色，然后将二者重叠，观察IL-24在细胞中的定位情况。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)首次将人类免疫缺陷病毒HIV-1的TAT穿膜肽和内质网定位信号肽KDEL分别融合到IL-24的N端和C端，构成TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。构建pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒，经过异源表达和分离纯化，大量制备TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。最终TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的浓度为0.6g／L，纯度为92％。
(2)TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的TAT穿膜肽可以将IL-24蛋白转移到细胞内，而内质网定位信号肽KDEL可以将进入细胞内的IL-24定位到内质网上，与其受体GRP78／BiP结合发挥作用。
本发明首次在体外检测了TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的活性。流式细胞实验和免疫荧光实验结果表明，该融合蛋白能高效的定位到内质网上并发挥抗肿瘤效应，这使得TAT-IL-24-KDEL融合蛋白在肿瘤治疗上有很大的应用前景。
附图说明
图1是pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒的构建过程；
图2A是SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的表达情况，主要以包涵体的形式表达；
图2B是融合蛋白在变性条件下利用镍柱亲和层析纯化的结果；
图2C是融合蛋白用SUMO蛋白酶进行酶切后的结果；
图2D是酶切后用镍柱亲和层析进行纯化得到目的蛋白TAT-IL-24-KDEL；
图2E是利用IL-24的抗体对目的蛋白进行Westernblot检测的结果；
图3A、图3B是纯化的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用和胞内定位情况；其中，图3A是流式细胞实验结果；图3B是融合蛋白在细胞内的定位分析。
具体实施方式
实施例1
TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的制备
1、构建pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒
a.获取TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的编码基因。以全长的IL-24基因为模板，利用含有TAT穿膜肽编码序列的上游引物和含有内质网定位信号肽KDEL编码序列的下游引物，通过PCR扩增将TAT穿膜肽和内质网定位信号肽KDEL的编码基因分别融合到IL-24基因的N端和C端，获得TAT-IL-24-KDEL融合蛋白编码基因。
上游引物：5’-CGCGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGAGCCCAGGGCCAAGAGTTCC-3′(下划线表示TAT穿膜肽编码序列)；
下游引物：5’-CCGCTCGAGTCAGAGCTCGTCCTTGAGCTTGTAGAATTTCTGC-3’(下划线表示内质网定位信号肽KDEL编码序列)。
PCR反应的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒(Omega)回收目的片段。
b.利用BamHI和XhoI将所得的TAT-IL-24-KDEL基因片段和pET28a(+)／SUMO表达质粒双酶切。T4DNA连接酶16℃连接过夜，获得重组表达质粒pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL，将连接产物转化E.coliBL21(DE3)感受态。挑选阳性克隆，通过菌液PCR和重组质粒上酶切初步验证阳性克隆，将初步验证正确的重组菌送样测序。
2、利用E.coliBL21(DE3)异源表达SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白
将测序正确的含有pET28a(+)／SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒的E.coliBL21(DE3)在含有50μg/mL卡那霉索的LB培养基中37℃培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导10h，异源表达SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。在4℃下，5000×g离心15min，收集菌体。超声破碎细胞，分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE结果显示，融合蛋白几乎全部以包涵体的形式表达。
3、SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的变复性和纯化
a.SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的变性和纯化
将包涵体溶解在含有8M尿素的50mMTris-Hcl缓冲液(pH8.0)中，在变性条件下利用镍柱亲和层析进行分离纯化。用10CV的含有8M尿素的50mMTris-Hcl缓冲液(pH8.0)平衡HisTrapTMHP亲和柱(1ml／min)。将含有SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的变性上清液以1ml／min的流速上样，带有His标签的SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白被选择性的亲和吸附。用平衡缓冲液以2ml／min的流速冲洗去除杂蛋白，最后用含有200mM咪唑和8M尿素的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)以2ml／min流速洗脱SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。
b.SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的复性
将变性纯化得到的融合蛋白在含有2M尿素的50mMTris-Hcl缓冲液(pH8.0)中透析过夜进行复性，然后将复性的融合蛋白在PBS中透析三次以彻底除尽尿素。
c.去除SUMO标签，分离纯化得到TAT-IL-24-KDEL融合蛋白
利用SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切，将SUMO蛋白酶和融合蛋白以1∶1000(w／w)的比例混合，30℃孵育1h或4℃过夜，去除SUMO标签。将酶切反应液浓缩后进行镍柱亲和层析，未酶切完全的融合蛋白、SUMO蛋白酶和SUMO标签均含有His标签，能够亲和在镍柱上，收集穿出液，得到TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。
4、纯化的TAT-IL-24-KDEL蛋白的定量
总蛋白浓度采用Bradford法来测定。将纯化得到的收集液进行SDS-PAGE电泳，电泳后用考马斯亮蓝R-250染色30min，然后用脱色液脱色，最后用计算机软件Gel-Proanalyzer扫描凝胶，分析TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的纯度，浓度及纯化工艺的回收率。
通过以上变复性和纯化操作，获得浓度为0.6g／L，纯度为92％的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白。
实施例2
TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的活性检测
体外检测TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用和细胞内定位作用。
1、采用流式细胞实验检测TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用，具体操作如下：
1.1、用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基配成单细胞悬浮液，将106个细胞接种到60mm培养皿内，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
1.2、将融合蛋白用无血清的DMEM培养基稀释成终浓度为5nM，10nM和20nM的溶液，分别加入培养皿中，以PBS为阴性对照。
1.3、24h后，先用不含EDTA的0.125％的胰酶消化，加入3mL完全培养基配成单细胞悬浮液后离心，1000r，5min。再用PBS洗两次并离心，1000r，5min。加入100μLBindingbuffer和FITC标记的AnnexinV(20μg/mL)10μL，室温避光孵育30min。再加入PI(50μg/mL)5μL，避光反应5min后，加入400μLPBS，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测，同时设置AnnexinV-FITC及PI单染各一管作为对照。
1.4、统计分析实验结果。Q1表示细胞碎片，Q2表示死细胞和晚期凋亡细胞，Q3表示活细胞，Q4表示早期凋亡细胞。
2、利用免疫荧光技术检测融合蛋白中穿膜肽TAT和内质网定位信号肽KDEL对IL-24定位的影响，具体操作如下：
2.1、用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基配成单细胞悬浮液，以每孔3×105个／mL细胞接种于6孔板，每孔体积2ml，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
2.2、倒掉6孔板中的培养液，将融合蛋白用无血清的DMEM培养基稀释成终浓度为20nM的溶液，加入6孔板中，培养12h。
2.3、倒掉培养液，用PBS洗涤两次，每次5min。然后用1mL4％多聚甲醛室温固定20-30min。用PBS洗涤两次，每次5min。再用0.2％的TritonX-100透化10min后，PBS洗涤两次，每次5min。
2.4、用10％的脱脂奶粉37℃封闭30min后，加入抗IL-24的一抗，37摄氏度孵育1.5h。PBS洗涤3次，每次5min。然后加入PE标记的二抗，37℃孵育1h。PBS洗涤3次，每次5min。
2.5、加入1mL清理液和10μLGENMED染色工作液，对内质网进行染色，混匀后，室温下孵育10-30s，吸弃染色液并加入500μL清理液，即刻在10min内置于荧光显微镜下观察。

Claims (2)

1.一种TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，其特征在于：将TAT穿膜肽和内质网定位信号肽KDEL分别融合到IL-24蛋白的N端和C端，构成TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；所述TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、构建pET28a(+)/SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒；
B、利用E.coliBL21(DE3)异源表达SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；
C、分离纯化TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；
D、体外检测TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡作用和融合蛋白在细胞内的定位；
步骤A的具体方法是，采用PCR扩增方法获得SUMO标签和TAT-IL-24-KDEL融合蛋白的编码基因，并采用融合PCR的方法将SUMO和TAT-IL-24-KDEL的编码基因无缝连接，利用含有T7启动子的pET28a(+)表达载体构建重组质粒；
步骤B的具体方法是，将含有pET28a(+)/SUMO-TAT-IL-24-KDEL重组质粒的E.coliBL21(DE3)在37℃下培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃诱导10h，异源表达SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，融合蛋白以包涵体形式存在；
步骤C的具体方法是，在变性条件下，利用His标签的亲和层析分离纯化SUMO-TAT-IL-24-KDEL融合蛋白，蛋白复性以后，用SUMO蛋白酶在融合蛋白上切除SUMO标签并再次利用His亲和层析去除SUMO标签，分离纯化TAT-IL-24-KDEL融合蛋白；
步骤D的具体方法是，利用流式细胞实验检测纯化的TAT-IL-24-KDEL融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的凋亡作用，利用免疫荧光实验检测融合蛋白在胞内的定位情况。
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