CN1819841A - 利用mda-7增强免疫诱导的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过间接活化PKR来增强或诱导抗免疫原性分子的免疫应答的组合物和方法。更具体地说,通过共注射MDA-7多肽和免疫原性分子来提高免疫治疗的效果,其中的免疫原性分子是为了获得抗该分子的免疫应答。这种免疫治疗包括肿瘤疫苗及其组合物。
Description
发明背景
本申请要求2002年8月21日申请的美国临时专利申请No.60/404,932、2002年8月5日申请的美国临时专利申请No.60/370,335和2002年三月5日申请的美国临时专利申请No.60/361,755的优先权,本文已特地将其全部公开信息纳入作为参考。美国政府依据授予国立癌症研究所的基金CA86587而拥有本发明的权利。
A.发明领域
一般来说本发明涉及免疫学和分子生物学领域。更具体地讲,本发明涉及通过提供有效量的MDA-7多肽增强或诱导针对免疫原性分子的免疫应答的诊断、预防和治疗组合物及方法。在一个实施方案中,本发明涉及通过给予有效量的MDA-7多肽来增强疫苗如肿瘤疫苗的免疫原性。
B.相关领域描述
免疫治疗在肿瘤研究中是一个进展快速的领域,通过免疫治疗可以在亚细胞水平、细胞水平、分子水平和大分子水平开发肌体天然的保护外源侵袭的能力。免疫治疗也被称为生物学治疗、生物治疗或生物反应调节治疗,直接或间接地通过攻击肿瘤细胞或降低其他肿瘤治疗方法(如化疗)的副作用为某些类型肿瘤的治疗提供了一种可供选择的方法。
例如,免疫系统可以将肿瘤细胞识别为外源物质,因此肿瘤细胞被免疫系统作为摧毁的靶位。不幸的是,免疫应答一般不足以阻止肿瘤的生长。但是,免疫治疗领域最近的研究集中在探索增强或补充免疫系统天然防御机制的方法上。最近在研究或在使用的免疫治疗的例子是免疫佐剂(如牛型结核菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美国专利5,801,005;5,739,169;Hui和Hashimoto,1998;Christodoulides等,1998),细胞因子治疗(如干扰素,IL-1,GM-CSF和TNF)(Bukowski等,1998;Davidson等,1998;Hellstrand等,1998)和基因治疗(如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等,1998;Austin-Edward和Villaseca,1998;美国专利5,830,880和5,846,945)以及单克隆抗体(如抗神经节苷脂GM2抗体、抗HER-2抗体、抗p185抗体)(Pietras等,1998;Hanibuchi等,1998;美国专利5,824,311)。
可应用免疫治疗的一个领域是肿瘤的治疗。正常组织内环境的稳定是一个细胞增殖和死亡高度平衡的过程。这种平衡一旦被破坏就会发展到生癌状态(Solyanik等,1995;Stokke等,1997;Mumby和Walter,1991;Natoli等,1998;Magi-Galluzzi等,1998)。例如,头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌和脑癌就是这种结果导致的许多癌症中的几种(Erlandsson,1998;Kolmel,1998;Mangray和King,1998;Gertig和Hunter,1997;Mougin等,1998)。事实上,肿瘤的发生率很高以至于单单美国每年死于肿瘤的人数就超过500,000。
到目前为止,对于许多普通类型的肿瘤来说只有少数几种有效的治疗方案可供选择。不同的个体要根据肿瘤的类型、疾病的发展阶段以及其他因素如年龄、性别和健康状况来选择治疗方案。最常规的治疗方案是手术治疗、放射治疗和化疗。手术在肿瘤的诊断和治疗中扮演主要角色。放疗、化疗和免疫治疗是手术治疗的替代方案(Mayer,1998;Ohara,1998;Ho等,1998)。化疗通常会因为药物难以达到实体瘤内而受到限制(el-Kareh和Secomb,1997)。
编码MDA-7蛋白的cDNA,本文被称为MDA-7,已被Jiang等,1995(WO 95/11986,本文已纳入作为参考)所描述。mda-7cDNA编码的蛋白被认为是黑色素瘤发生发展的强力调节因子。Jiang等利用消减杂交技术(Jiang等,1995,本文已纳入作为参考)鉴定出了参与人黑色素瘤细胞生长和分化调节的基因。将活跃增殖的人HO-1黑色素瘤细胞来源的cDNA与干扰素-β(IFN-β)和mezerin-分化的人HO-1黑色素瘤细胞来源的cDNA进行消减杂交得到了一个cDNA文库,然后用该文库鉴定出了几个黑色素瘤分化相关(mda)cDNA,其中包括mda-7。Mda-7mRNA的表达是与黑色素瘤的恶性进展程度成负相关的,因为试验证明与原发和转移的黑色素瘤相比正常的黑色素细胞内的mRNA表达水平是升高的,而在裸鼠体内增强肿瘤形成的处于垂直生长期的黑色素瘤细胞内的mda-7mRNA的表达水平是下降的。现在还不清楚MDA-7是否可诱导凋亡,也不清楚MDA-7是否参与免疫应答。
基因治疗是生物医药研究中另一个新出现的领域,其焦点集中在通过将治疗性重组核酸导入患者的体细胞内而治疗疾病。现在已有多个基因治疗的临床试验开始进行,其中包括各种肿瘤、AIDS、囊性纤维化、腺苷脱氨酶缺乏症、心血管疾病、Gaucher病、类风湿性关节炎等的治疗。到目前为止,腺病毒是转移基因治疗药物最常用的工组。利用腺病毒作为基因治疗药物的优点在于其较高的转导效率、不感染非分裂细胞、其基因组易于操作以及与宿主基因组发生非同源重组的概率较低等。利用基因治疗方法治疗肿瘤的主要模式是诱导凋亡。这可以通过使肿瘤细胞对其他药物敏感或通过刺激细胞内通路直接诱导凋亡来实现。其他肿瘤治疗方法利用了肿瘤需要血管形成以供应促进其生长所必要的营养成分。内皮抑制素和血管他丁就是这种治疗方法的例子(WO 00/05356和WO 00/26368)。
利用裸DNA或非病毒载体作为免疫原性分子的载体进行基因免疫在肿瘤和感染性疾病的动物模型中已经取得了相当的成功。但是,这些研究与人的临床试验所取得的结果不相吻合,在临床试验中所观察到的免疫诱导/增强通常都是很有限的。而且,增强免疫应答的能力可以作为判断预后的指标。利用本发明的方法诱导免疫来检测患者就可以确定该患者是否适于进行免疫治疗。因此,本发明对于提高基因免疫和鉴定免疫分子的可行性是十分有益的。不论从治疗前景(免疫治疗)来看,还是从预防性和可能的诊断前景来看,在免疫应答领域取得进展都有持续的需求。
发明概述
本发明的基础部分在于我们观察到MDA-7能以依赖蛋白激酶(PKR)的方式诱导和/或活化,PKR活化导致eIF-2α的磷酸化。在增强或促进免疫应答的方法中已经使用过PKR。本发明所基于的其他现象见于实施例部分。因此,本发明涉及增强和/或促进免疫应答的方法和组合物,这种免疫应答是通过MDA-7肽、多肽或编码MDA-7肽或多肽的核酸、以及任何可诱导这种免疫应答的化合物所诱导的。
本发明的组合物包括免疫原性组合物,其中术语“免疫原性组合物”是指能产生抗该组合物的免疫应答的组合物(细胞免疫或体液免疫)。在本发明的某些实施方案中,免疫原性组合物包括一个分子,使用该分子后能产生或可检测到抗该分子的免疫应答(在存在或不存在本发明的MDA-7组合物的情况下),以及部分或全部重组MDA-7多肽或者编码该多肽的核酸。
MDA-7肽或多肽优选至少含有SEQ ID NO:2的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、156、157、160、170、180、190、200或206个连续氨基酸,或者含有SEQ ID NO:2的全部氨基酸。重组MDA-7多肽可以是经修饰的,或者是其末端被截短的。在本发明的某些实施方案中,MDA-7多肽含有SEQ ID NO:2的49-206、75-206或100-206位的氨基酸。分泌型MDA-7多肽含有SEQ ID NO:2的49-206位的氨基酸,但是第一个48位氨基酸是缺失的,这种分泌形式的多肽特别适于被称为“MDA-7多肽”,可用于本发明的任何组合物和方法中。另外,MDA-7氨基酸序列还可以包含异源氨基酸序列,如分泌信号序列。在某些实施方案中,分泌信号序列是一个带正电荷的N端序列,含有一个疏水的核。在另外一些实施方案中,分泌信号可以引导MDA-7或其片段进入内质网或线粒体。
需要注意的是在本发明的任何一个涉及多肽的实施方案中,编码该多肽的核酸也可以利用。因此,在本发明的某些方面,利用的是编码MDA-7的核酸和/或编码免疫原性肽或多肽的核酸。核酸可包含在表达载体或构建体中。载体可以是病毒载体也可以是非病毒载体。在某些实施方案中,构建体是病毒载体,如腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、多瘤病毒、弹状病毒或甲病毒。组合物可包含约103到1015、105到1013、107到1011或1010个病毒颗粒。核酸还可以包含与核酸相连接的启动子。优选一个核酸分子编码多个多肽,如1、2、3、4、5或更多个多肽,其中包括一个MDA-7多肽和一个或多个免疫原性多肽。
编码MDA-7的核酸可编码上述的任何MDA-7多肽,或至少含有SEQ ID NO:1的20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610或618个连续氨基酸。
本发明组合物所含有的“免疫原性分子”是指单独或与本发明的组合物一起可激发免疫应答的分子。免疫原性分子在无MDA-7和/或佐剂存在的情况下是不能诱导或激发免疫应答的;另外,如果免疫原性分子在无MDA-7和/或佐剂存在的情况下能诱导或激发免疫应答,MDA-7或佐剂可以增强抗该免疫分子的免疫应答。在某些实施方案中,免疫原性分子含有一个或多个多肽。
在本发明另外的实施方案中,针对一种免疫原的免疫应答可通过注射MDA-7或编码MDA-7的核酸再加上细胞因子、趋化因子或其类似物来激发,这些细胞因子包括而不限于白细胞介素和干扰素,特别是IFNα、IFNβ、IFNγ和λIFNs。细胞因子或趋化因子可以多肽或编码多肽的核酸的形式提供。通过给予含MDA-7和细胞因子或趋化因子的组合物可以起到治疗效果,如激发针对免疫原、癌症细胞、肿瘤细胞、过度增殖细胞或其他疾病状况的免疫应答。细胞因子、趋化因子及其类似物优选包含在药物制剂中。
组合物可以同时包含MDA-7和细胞因子或趋化因子,也可以是两个不同的组合物分别包含MDA-7和细胞因子或趋化因子,二者联合使用。如果用两种组合物,则可以同时或先后注射。其中一个于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时或1、2、3、4、5、6、7天注射,另一个在其前或后注射。
细胞因子、趋化因子或其类似物可以是哺乳动物来源的,特别优选人源的多肽。
本发明的免疫原性分子包括抗原或表位,抗该抗原或表位的免疫应答是可以观察到的,或者是我们所期望的。“抗原”是指能被抗体或T细胞受体特异识别的一种物质或物质的一部分。其同义词是“免疫原”。本发明的抗原包括一个或多个表位,表位是指抗原决定簇。抗原决定簇是指抗原分子上与抗体或T细胞受体结合位点相互作用的结构,这种相互作用是分子互补的结构。抗本发明的免疫分子的免疫应答可以是细胞免疫也可以是体液免疫。本发明的组合物优选包含编码本发明的抗原和表位的核酸。这种核酸是包含在上述表达载体中的与编码MDA-7有关的核酸。而且这种核酸可以连接上启动子。编码免疫原性多肽的核酸包括免疫基因。在某些实施方案中,免疫基因编码结核杆菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性调节素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外壳-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨针抗原、风疹抗原、流行性腮腺炎抗原、α甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、或WT1。任何蛋白类的免疫原性分子都可以以免疫原的形式包含在组合物中。
在本发明的某些实施方案中,抗原是肿瘤抗原、微生物抗原、病毒抗原、真菌抗原或其他疾病相关抗原。疾病相关抗原是一种由于某种特定疾病而产生的抗原,或者是某种特定疾病的标记物。肿瘤抗原也是一种疾病相关抗原,这种疾病是指肿瘤。肿瘤抗原包括而不限于PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。可用于本发明的特别是那些人肿瘤抗原,其中一些已在上面作了描述。在某些情况下,利用异种抗原即那些来自于啮齿类动物的抗原有特别的优势,有时异种抗原活化免疫系统的能力比同种抗原更强。
微生物抗原、病毒抗原和真菌抗原是指来源于微生物、病毒或真菌的抗原。微生物包括而不限于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌以及本文讨论的其他微生物。病毒抗原特别包括但不限于本文所讨论的病毒来源的抗原。因此,本发明的方法和组合物特别适用于诱导或激发抗病毒、微生物或真菌的免疫应答。
免疫原性分子可以是小分子、核酸、肽或多肽。在某些特殊实施方案中,免疫原性分子是T细胞活化分子。本发明的组合物包含疫苗。疫苗是分离抗原的制剂,这些抗原在某些情况下是从病毒、细菌或其他病原中分离的,疫苗可注射给肌体以诱导免疫。
本发明还有一个实施方案,其中所述组合物还包括胶体载体。胶体载体包括而不限于类蛋白、乳剂或脂质体。组合物还包括除MDA-7多肽以外的佐剂。
本发明的组合物特别优选包含在药物制剂、稀释剂或溶液中。
本发明还包括涉及本发明组合物的方法。本发明的方法一般都涉及如何促进患者的免疫应答,其中包括给予患者有效量的MDA-7多肽或启动子控制下的编码MDA-7的核酸。在其他实施方案中,本发明的方法还包括通过给予患者有效量的MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸加上细胞因子、趋化因子或其类似物以激发免疫应答,其中细胞因子、趋化因子包括而不限于IFNα、IFNβ、IFNγ、λIFNs、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10或IL-12。“有效量”是指能达到预期效果的剂量。另外“有效量”也指能产生治疗效果的剂量。因此,在某些特定实施方案中,优选需要促进或增强免疫应答的受体。在本发明的某些实施方案中,“有效量”是指能达到特定目的的剂量,如增强、提高、诱导、改善或促进免疫应答,这种效果是可以通过本领域技术人员熟知的各种方法直接或间接检测的。
本发明还有一个实施方案,其中最后成为免疫原性的分子也提供给受体。在这种情况下,分子和MDA-7多肽或编码MDA-7的核酸在同一组合物中提供或先后提供。提供的方法包括体内或体外。
在本发明的某些实施方案中,方法涉及治疗或预防的目的以诱导、促进或增强受体的免疫应答。如果是体内则将免疫原性分子组合物和MDA-7组合物(指含有MDA-7肽或多肽、或者含有编码MDA-7肽或多肽的核酸的组合物)给予受体。在各种实施方案中,至少含有一种细胞因子、趋化因子或其类似物的组合物可以包含在本发明的MDA-7组合物中,或者和本发明的MDA-7组合物一起提供。本文所讨论的任何组合物都可用于本发明的方法。在某些实施方案中,受体是人或其他哺乳动物。本发明的方法优选包括抗特定免疫原性分子的疫苗。
另外,本发明的方法还可用于诊断或预后的目的。这时所观察到的抗特定分子的免疫应答就是疾病或其预后的指示剂。本发明的所有方法和组合物都可用于体内或体外。
免疫应答可通过各种方法检测,其中包括而不限于测定细胞因子浓度或产量的增加、T细胞增殖的提高、B细胞增殖的提高、T细胞活性的升高、NK细胞活性的升高、巨噬细胞活性的升高、或者抗体产生量的增加。在某些实施方案中,细胞因子如干扰素(即IFN-α,IFN-β,IFN-γ)或白细胞介素(如IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10或IL-12)可作为免疫应答的指示剂。
在某些情况下,组合物可分多次给予受体,至少或最多1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多次。组合物可每小时、每天、每周、双周、每月或每年给予一次,或者每1,2,3,4,5,6或7天或者更多天、每1,2,3,4或5周或者更多周、或者每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月或更多个月给一次药。组合物可通过口服、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、连续灌注、直接注射、区域注射、气管内灌注、损伤部位注射或血管内注射给予细胞或受体。全身给药或全身治疗也是本发明特别值得注意的一部分。
组合物的给予可结合其他治疗措施。在某些实施方案中,除了本发明的组合物外还提供抗肿瘤、抗微生物或抗病毒治疗。在某些实施方案中,抗肿瘤治疗是指化疗、手术治疗、放疗、激素治疗或基因治疗。基因治疗也可以作为抗微生物或抗病毒治疗的方法。另外,也可使用细胞因子或趋化因子治疗,如IFN-α,IFN-β,IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10和/或IL-12。
特别值得注意的是有关本发明的一个实施方案的方面或特征也可适用于本文所讨论的本发明的其他任何实施方案。本发明的另外一个实施方案是增强抗免疫原免疫应答的方法,该方法包括给予患者编码免疫原的核酸;并且给予患者有效量的MDA-7多肽,其中MDA-7多肽能增强抗免疫原的免疫应答。免疫原也可以产物、肽或多肽的方式提供。在另一个实施方案中,MDA-7与至少一种细胞因子或趋化因子如IFNα、IFNβ或IFNγ联合给药。
免疫原包括结核杆菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性调节素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外壳-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨针抗原、风疹抗原、流行性腮腺炎抗原、α甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETSG250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2,MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2或WT1。
本发明还提供了一种治疗患者肿瘤的方法,该方法包括给予患者肿瘤抗原;以及给予有效量的MDA-7多肽,其中MDA-7多肽可增强所诱导的免疫应答,为患者提供治疗效果。治疗肿瘤的方法还包括给予患者有效量的细胞因子或趋化因子,其中MDA-7和细胞因子或趋化因子可增强所诱导的免疫应答,为患者提供治疗效果。本文所以的术语“治疗效果”是指任何能增强或促进与患者疾病治疗有关的健康水平的结果,其中包括癌前病变、癌症和过度增殖疾病的治疗。下列所举的例子是非穷尽性的:患者生命延长一段时期,疾病的恶性程度降低或延迟,过度增殖减弱,肿瘤生长放缓,转移延迟,肿瘤细胞减少或肿瘤细胞增殖速度降低,以及患者由于疾病而导致的疼痛减弱。
在某些特定实施方案中,本发明涉及在患者体内治疗肿瘤的方法,其中包括(a)给予患者免疫原性分子以诱导抗该免疫原性分子的免疫应答;以及(b)给予患者有效量的MDA-7多肽,其中MDA-7能增强所诱导的免疫应答,与单独使用免疫原性分子相比可缩小肿瘤。治疗肿瘤的方法还包括给予患者至少一种有效量的细胞因子或趋化因子。所得到的肿瘤缩小是指肿瘤大小的缩小或肿瘤生长速率的降低。在某些实施方案中,免疫原性分子是肿瘤抗原,包括PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。
在某些特定实施方案中,本发明涉及从细胞的线粒体中释放细胞色素c的方法,该方法包括使细胞与有效量的MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸接触以诱导或促进细胞色素c从线粒体内的释放。在某些实施方案中,细胞是指肿瘤细胞。肿瘤细胞包括而不限于肺、头颈、胰腺、前列腺、肾、骨、睾丸、乳腺、颈、胃肠、淋巴、脑、卵巢、白血病、骨髓瘤、结肠、食管、皮肤、甲状腺、肝或膀胱肿瘤细胞。编码MDA-7的核酸可包含在载体内。本文所用的载体是指表达载体或转移载体。表达载体含有mda-7编码多聚核苷酸转录所必须的核酸序列。转移载体是将表达载体转移到细胞内的方式。在各种实施方案中,载体指表达载体。表达载体可通过病毒载体或非病毒载体转移。病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。在其他的实施方案中,MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸是给予患者或受体的。MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸可通过下列方法给药:瘤内注射、气管内注射、静脉注射、心包内注射、肌肉注射、皮下注射、局部涂药、粘膜给药、口服、洗胃、皮下或直接注射到免疫应答减弱的位点。MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸的使用剂量可在103到1015个病毒颗粒之间。在其他的实施方案中,MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸可以多次给药。在切除肿瘤前或切除肿瘤后,或者前后都可将MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸注射到肿瘤床内。在某些实施方案中,MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸可在化疗、手术、免疫治疗、激素治疗或放疗前、期间或之后给予患者。MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸可在化疗、手术、免疫治疗、激素治疗或放疗之前72小时、24小时、或者之后72小时、24小时给予患者。
在某些实施方案中,本发明涉及促进或增加肿瘤细胞内肿瘤抑制蛋白-上皮细胞钙粘蛋白或PETN表达的方法。该方法包括使细胞与有效量的MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸接触以促进或增加上述一种或两种肿瘤抑制蛋白的表达。
在各种实施方案中,本发明涉及降低肿瘤细胞内原癌蛋白PI3K表达的方法,该方法包括使细胞与一定量的MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸接触以有效降低PI3K的表达。在某些实施方案中,原癌蛋白可调节细胞-细胞之间的粘附作用和/或细胞内的信号传递。
在其他一些实施方案中,本发明涉及诱导肿瘤细胞G2期细胞周期停滞的方法,该方法包括使一定量的MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸与细胞接触以有效诱导肿瘤细胞的G2期细胞周期停滞。G2期细胞周期停滞可被Cdc25c通路抑制所诱导。
本发明还有一些实施方案涉及诱导肿瘤抗血管形成的方法,该方法包括使肿瘤细胞或肿瘤细胞临近的内皮细胞与有效量的MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸接触,其中MDA-7多肽可与IL-22受体结合以有效诱导抗血管形成。在某些实施方案中,抗血管形成是内皮细胞向生长因子的迁移被抑制造成的。生长因子包括而不限于VEGF和/或bFGF。抗血管形成也可来自于对内皮细胞分化的抑制。
本发明的某些实施方案涉及将MDA-7转移给细胞的方法,该方法包括获得MDA-7靶向性构建体,其中MDA-7靶向性构建体包含编码MDA-7多肽的DNA分子或编码MDA-7多肽的核酸以及启动子控制下的靶向性序列,使细胞与一定量的靶向性构建体接触以有效地将MDA-7靶向性构建体转移到细胞内。在某些实施方案中,靶向性构建体含有编码MDA-7的DNA,其中MDA-7无功能性信号肽,但是却有核定位信号肽、内质网信号肽或线粒体信号肽。
本发明的其他实施方案涉及MDA-7与特定分子和/或其活性抑制剂的联合使用。
在某些实施方案中,本发明的方法包括给予MDA-7蛋白或编码MDA-7的核酸和NF-κB的抑制剂以诱导或促进肿瘤细胞的死亡。NF-κB的抑制剂包括IκB和舒林酸,后者是一种非甾体类抗炎药物。在其他实施方案中,COX-2蛋白或其活性抑制剂也是本发明的一部分。本发明还包括Hsp90的抑制剂,如格尔德霉素及其类似物。值得注意的是蛋白激酶及其活性抑制剂也是本发明的一部分。而且,除舒林酸之外的其他抗炎药物也可作为本发明的一部分,如萘普生。
一旦MDA-7与IL-22受体结合,IL-22受体就可抑制血管形成。在本发明的某些方面,IL-22激动剂可单独或与MDA-7联合作为抗血管形成药物。
而且,从MDA-7的相互作用和活性来看可以清楚地看到MDA-7包括在某种通路中,这可作为本发明的一部分加以利用。MDA-7可影响β-链蛋白和P13激酶(PI3K)信号通路。而且MDA-7还可以促进IL-6,IFN-γ,IL-12,TNF-α和GM-CSF的分泌。因此,在本发明的某些实施方案中,有促进外周血单核细胞(PMBC)分泌IL-6,IFN-γ,IL-12,TNF-α和/或GM-CSF的方法,该方法包括给予细胞有效量的MDA-7。MDA-7还可以活化STAT3的表达,因此可用于本发明的方法和组合物中以达到这种活化的目的。
值得注意的是本文所讨论的与本发明一个方面有关的实施方案也适用于与本发明其他方面有关的实施方案。而且,本发明的任一组合物都可用于本发明的所有方法中。
本发明的其他方法涉及利用MDA-7诱导肿瘤的抗血管形成。肿瘤是血管化的,在肿瘤周围被诱导生成许多血管。本发明利用MDA-7多肽通过诱导抗血管形成抑制或反转这一过程。术语“诱导抗血管形成”是指血管化的反转或抑制,或者是指已开始的血管形成的抑制。在某些实施方案中,给予患有肿瘤的患者以有效量的MDA-7多肽使其与IL-22受体阳性细胞上的IL-22受体结合从而诱导肿瘤的抗血管形成。IL-22受体阳性细胞是细胞表面表达IL-22受体的细胞,IL-22受体可结合MDA-7。因此,在某些实施方案中,患者的IL-22受体阳性细胞可给予有效量的MDA-7。其载体实施方案中,IL-22受体阳性细胞是内皮细胞。因此,给予MDA-7多肽的细胞就是患者的内皮细胞。另外,这些细胞不需要靠近(临近或紧靠)肿瘤或肿瘤细胞。它们可以远离(不靠近)肿瘤。而且在某些实施方案中,MDA-7多肽可以是分泌形式的MDA-7,并且可以是糖基化的。
除非有明确的说明,本说明书中所用的“一个”或“一种”可以指一个或多个。如本文权利要求中所用的,当“一个”或“一种”与单词“含有”连用时可以指一个,也可以指一个以上。本文所用的“另一个”至少是指第二个或更多个。
附图简述
下面的附图形成本说明书的一部分,还用于证明本发明的特定方面。通过参考这些附图中的一个或多个结合本文特定实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1A.Ad-mda-7(2500个病毒颗粒)处理后A549(野生型p53)和H1299(p53缺失)细胞的细胞死亡情况。图1B.Ad-mda-7处理后A549和H1299细胞内剂量依赖的PKR表达情况。图1C.Ad-mda-7处理后A549和H1299细胞的免疫荧光共聚焦显微镜照片。
图2A.PBS、Ad-Luc或Ad-mda7处理后A549细胞裂解物内PKR、磷酸化-PKR、eIF-2α和磷酸化eIF-2α的表达情况。以肌动蛋白的表达作为对照。
图2B.经Ad-Luc或Ad-mda7处理48小时的A549细胞裂解物蛋白部分与抗人Tyk2、Stat1、Stat3或p38抗体进行免疫沉淀,然后用抗人磷酸化Tyk2、Stat1、Stat3或p38抗体染色。图2C.经PBS、Ad-Luc或Ad-mda7处理的A549细胞内Bid、PARP、胱冬酶-3、胱冬酶-8和胱冬酶-9的表达情况。以肌动蛋白的表达作为对照。
图3A-3C.Ad-mda7转导后经2-AP处理的肺癌细胞。图3A.Ad-mda7和2-AP联合处理的A549细胞的死亡情况。图3B.经Ad-mda7和10mM 2-AP联合处理后的A549细胞蛋白部分的免疫染色情况。试验设三复孔。图3C.Ad-mda7或Ad-Luc联合10mM2-AP处理后细胞内的蛋白合成情况。
图4A-4C.PKR+/+和PKR+/-细胞来源的MEFs内PKR依赖的Ad-mda7诱导的凋亡。图4A.Ad-mda7处理48小时后PKR、MDA-7和肌动蛋白的表达。图4B.PBS、Ad-Bak、或Ad-mda7处理48小时后细胞死亡情况。图4C.经Ad-mda7处理后形态学显示只有PKR+/+细胞出现凋亡。
图5A-5B.腺病毒介导的MDA-7过量表达抑制肺癌细胞的增殖并可诱导其死亡。图5A.XTT分析细胞的存活能力。图5B.PBS、Ad-Luc(2500vp)或Ad-mda-7(2500vp)处理后A549细胞的死亡百分率。细胞转导后用流式细胞仪分析。每个细胞系都设三复孔,数据用平均值±标准差表示。
图6A-6B.Ad-mda7对线粒体膜电位及凋亡的影响。线粒体内细胞色素c的释放是通过H1299细胞(图6A)和1549细胞(图6B)的免疫印迹检测的。
图7A-7B.Ad-mda7对线粒体膜电位的影响。Ad-mda-7、Ad-p53和星形孢菌素(1μM)转导后测定线粒体膜电位。其中所指示的细胞用CsA(10μM)预处理。H1299(图7A)和A549(图7B)细胞用电位敏感性的染料-四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐(TMRE)和荧光染色,然后通过流式细胞仪分析。结果以三个独立试验的平均值±标准差表示。
图8A-8B.环孢霉素(CsA)不能阻止线粒体膜电位的丢失。H1299(图8A)和A549(图8B)细胞用Ad-mda-7、Ad-p53和星形孢菌素(1μM)处理。其中所指示的细胞用CsA(10μM)预处理。然后将细胞裂解,通过荧光燃料TMRE染色测定线粒体膜电位。
图9.Ad-mda-7上调外通路。Ad-mda-7-处理的A549细胞通过免疫印迹分析BAK、BAX、Bcl-2、TNF-α、TNF-R1、TRADD、FasL、Fas和FADD表达的改变。
图10.用示意图表示几种能诱导线粒体膜电位改变的促凋亡基因的效应,这些基因可打开MMP依赖的通道使细胞色素c释放出来,从而与APAF-1和胱冬酶8形成凋亡小体。
图11A-11C.Ad-mda-7不能明显改变β-联蛋白的稳态水平。图11A.MDA-MB-435不经过任何处理(条带1),或每个细胞转导2000vp的Ad-Luc(条带2)或Ad-mda-7(条带3)。处理后48小时收获细胞并裂解,利用特异性的单克隆抗体通过Western印迹分析其MDA-7蛋白、β-联蛋白和β-肌动蛋白的表达。图11B.H1299或HUVEC转导Ad-Luc或Ad-mda-7(MOI 1000vp/细胞),处理后48小时用抗MDA-7的多克隆抗体染色,通过免疫荧光观察亚细胞结构内MDA-7蛋白的表达情况。图中显示的是两个不同试验的具有代表性的视野。图11C.Ad-mda-7转导的H1299和HUVEC细胞的凋亡。H1299和HUVEC细胞转导Ad-Luc或Ad-mda-7后48小时通过Annexin V染色分析细胞的凋亡情况。显示的结果是3个以上试验的代表。
图12A-12C.图12A.MDA-7对β-联蛋白的调节。乳腺癌细胞用Ad-Luc或Ad-mda-7处理48小时,每个细胞转染2000vp。细胞固定后用免疫荧光显微镜观察β-联蛋白的位置。结果显示的是3个不同试验的典型代表。图12B.MDA-MB-453乳腺癌细胞或HUVEC细胞用Ad-Luc、Ad-p53或Ad-mda-7处理(MOI 1000vp/细胞),48小时后通过免疫荧光染色分析β-联蛋白。图12C.MDA-7调节β-联蛋白的反式激活。H1299细胞通过脂转染胺(lipofectamine)转染带LEF/TCF启动子的TopFlash质粒或带LEF/TCF启动子的FopFlash质粒。转染后3小时细胞再转导Ad-GFP或Ad-mda-7病毒,MOI为1000(H1299)。48小时后分析荧光素酶的活性。数据用3个样品的平均值±标准差表示。本试验进行了两次,结果一致。
图13A-13C.Ad-mda-7上调上皮细胞钙粘蛋白的表达并抑制肿瘤细胞的迁移。图13A.NSCLC肿瘤细胞(H1299,A549)用PBS、Ad-mda-7或Ad-Luc处理(MOI为2000vp/细胞),转染后48小时用胰酶消化细胞,PBS洗涤并与抗上皮细胞钙粘蛋白的一抗共孵育。通过FACS分析发现Ad-mda-7可以增加这两株肺癌细胞系表面的上皮细胞钙粘蛋白的表达。数据用3个样品的平均值±标准差表示。本试验进行了三次以上,结果一致。图13B.H1299细胞转导Ad-mda-7或Ad-Luc以评价细胞-细胞的粘附作用。Ad-mda-7处理的细胞比Ad-Luc处理的细胞迁移少。图13C.H1299细胞转导Ad-mda-7或Ad-Luc以评价细胞-细胞的粘附作用。Ad-mda-7处理的细胞比Ad-Luc或PBS处理的细胞表现出更强的同质性粘附作用。这些试验至少进行了2次,结果一致。
图14A-14C.Ad-mda-7调节β-联蛋白和PI3K通路中的分子。图14A.Ad-mda-7上调(i)APC和(ii)GSK-3β。检测MDA-MB-453细胞的裂解物中GSK-3β和APC蛋白的稳定态水平。条带1,未处理的细胞;条带2,Ad-Luc处理的细胞;条带3,Ad-mda-7处理的细胞。每个细胞2000vp处理48小时。图14B.Ad-mda-7下调PI3K、ILK-1、PLC-γ和FAK的表达。检测Ad-mda-7转导的MDA-MB-453细胞的裂解物中PI3K、ILK-1、PLC-γ和FAK的稳定态水平。图14C.(i)Ad-mda-7调节H1299细胞内的pFAK。条带1,未处理的;条带2,Ad-Luc处理的;条带3,Ad-mda-7处理的;条带4,LY294002,终浓度为20μM。每个细胞1000vp处理48小时。(ii).Ad-mda-7上调MDA-MB-453肿瘤细胞内的PTEN。抗-PTEN单克隆抗体用于检测细胞裂解物,Western印迹分析未处理的(条带1)、Ad-Luc-处理的(条带2)和Ad-mda-7处理的(条带3)MDA-MB-453细胞。这些试验至少进行了2次,结果一致。
图15.示意图说明Ad-mda-7诱导的β-联蛋白和PI3K通路的调节。MDA-7上调肿瘤抑制蛋白的表达,下调原癌蛋白的表达。
图16.DU145、LNCaP和PC-3前列腺癌细胞内MDA-7的表达。这些细胞用Ad-mda-7、Ad-Luc转染,或者加入PBS为空白对照。分别于转染后24、48和72小时收获细胞,用SDS样品缓冲液裂解。然后将蛋白固定到硝酸纤维素膜上与抗MDA-7抗体进行杂交。相应的β-肌动蛋白水平作为载样对照。
图17.DU145、LNCaP和PC-3前列腺癌细胞以及PrEC上皮细胞的存活能力分析。这些细胞用Ad-mda-7、Ad-Luc转染,或者用PBS处理。在转染后1到4天内每天收获一些细胞,用0.4%的台盼蓝染色直到出现死细胞。存活的细胞用血细胞计数器计数。数据是三个复孔得来的;显示的是与PBS处理组相比所得到的细胞存活百分率,横条代表标准误(SE)。
图18A-18B.MDA-7诱导的凋亡。图18A.DU145、LNCaP和PC-3前列腺癌细胞以及PrEC上皮细胞用Ad-mda-7、Ad-Luc转染,或者用PBS处理。处理后72小时收获细胞,用流式细胞仪分析处于亚G0/G1期的细胞作为凋亡细胞。每个试验组取20000个细胞;用直方图表示数据。数据得自两复孔;显示的是平均值,横条代表标准误(SE)。图18B.转染72小时后,用烟酸己可碱33258染色分析粘附的细胞。箭头指正在经历凋亡的细胞。所有的细胞系放大倍数都是×20。
图19.转染Ad-mda-7后的DU145、LNCaP和PC-3前列腺癌细胞以及PrEC上皮细胞的细胞周期分析。处理后72小时收获细胞,用流式细胞仪分析细胞周期。每个试验组取20000个细胞;用直方图表示数据。细胞周期用X轴代表。数据得自两复孔;显示的是平均值,横条代表标准误(SE)。
图20A-20B.DU145和LNCaP细胞内MDA-7负调节的靶蛋白。细胞用Ad-mda-7、Ad-Luc转染或用PBS处理,转染或处理48小时后收获细胞,用SDS样品缓冲液裂解细胞。蛋白固定到硝酸纤维素膜上,然后与MDA-7靶通路相关的各种抗体杂交。利用Western印迹分析Du145细胞(图20A)和LNCaP细胞(图20B)内MDA-7活化的凋亡级联反应(胱冬酶9、-3和PARP)和负调节的靶蛋白。相应的β-肌动蛋白的水平也显示在图中。
图21A-21B.转染Ad-mda-7、Ad-Luc或用PBS处理的DU145和LNCaP细胞内MDA-7下调的与G2细胞周期停滞有关的蛋白质。处理72小时后收获细胞,用SDS样品缓冲液裂解细胞。蛋白固定到硝酸纤维素膜上,然后与调节细胞周期的蛋白的抗体杂交。图21A,DU145细胞;图21B,LNCaP细胞。相应的β-肌动蛋白的水平表示为载样对照。
图22A-22C.图22A.内皮细胞(HUVEC和HMVEC)与各种浓度的sMDA-7(b,c,e,f)或内皮抑制素(h,i,k,l)混合,接种到96孔板中。未处理的细胞作为对照(a,d,g,j)。24小时后在光学显微镜下观察内皮细胞形成毛细管样结构的能力。HUVEC(b,c)和HMVEC(e,f)细胞内毛细管样结构形成的能力都可被sMDA-7抑制,并且是剂量依赖性的。但是在HUVEC(h,i)和HMVEC(k,l)细胞内相同浓度的内皮抑制素却都没有抑制效应。图22B.sMDA-7的免疫耗竭可导致HUVEC细胞(b,c)毛细管样结构形成能力的恢复,其形成能力与未处理的对照组(a)相似(×4放大)。图22C.sMDA-7抑制100ng/ml VEGF诱导的HUVEC细胞迁移的能力。与不含sDMA-7蛋白的对照组相比,sMDA-7可显著抑制HUVEC细胞的迁移。
图23A-23B.Western印迹和免疫荧光分析sMDA-7处理的HUVEC和HMVEC细胞内pSTAT-3蛋白的表达情况。图23A.Western印迹分析4小时和24小时时HUVEC(a)和HMVEC(b)细胞内pSTAT-3蛋白的表达。图23B.免疫荧光分析sMDA-7处理的HUVEC细胞内pSTAT-3在核内的定位,结果表明与对照组一样pSTAT-3定位于胞浆内。
图24.用IL-22R1封闭抗体(1ng/ml和5ng/ml)处理HUVEC细胞。24小时后收获细胞,与sMDA-7(5ng/ml)的基质胶(Matrigel)混合物观察管状结构形成情况。未处理细胞(a);5ng sMDA-7处理细胞(b);IL-22R1抗体(1ng)处理细胞(c);IL-22R1(1ng)和sMDA-7(5ng)处理细胞(d);IL-22R1抗体(5ng)处理细胞(e);IL-22R1抗体(5ng)和sMDA-7(5ng)处理细胞(f);抗IL-10R抗体(5ng)处理细胞(g);抗IL-10R抗体(5ng)和sMDA-7(5ng)处理细胞(h);(4×放大)。半定量分析HUVEC细胞管状结构形成的数目,结果证明sMDA-7处理的HUVEC细胞与未处理的或用IL-22R1抗体处理的细胞相比数目显著下降。sMDA-7的抑制效应与pSTAT-3表达量的增加相关,而存在IL-22R1抗体时,sMDA-7对pSTAT-3的活化被抑制。横条代表标准误(SE)。
图25A-25B.sMDA-7和内皮抑制素(12.5ng)包裹到含bFGF(60ng)的基质胶内,皮下植入到无胸腺的裸鼠中。含bFGF的基质胶作为阳性对照,而单独的基质胶作为阴性对照。在第10天,将基质胶取出,观察新血管形成的情况(图25A)和血红蛋白的含量(图25B)。与对照相比,含sDMA-7的基质胶血红蛋白含量显著下降。
图26A-26D.图26A.A549肿瘤细胞和293-mda-7细胞的等量混合物包裹到基质胶(1×106)中,然后植入到裸鼠的皮下(n=10)。植入后用测径尺测量肿瘤,利用t检验来计算肿瘤体积改变的统计学意义。移植肿瘤细胞和亲本293细胞等量混合物的动物作为对照组(n=10)。与经亲本293细胞处理的肿瘤相比,含293-mda-7细胞的肿瘤的生长明显受到抑制(p=0.001)。每一时间点代表每一组肿瘤的平均直径。横条代表标准误。图26B.含293-mda-7细胞的肿瘤组织内MDA-7蛋白的检测(条带3和条带4)以及含亲本293细胞的肿瘤内MDA-7蛋白的检测(条带1和2)。图26C.试验结束时收获肿瘤并进行分析。(a)移植293细胞和293-mda-7细胞的动物所获得的肿瘤总的外观和大小;(b)苏木精和伊红染色的组织切片;(c)CD31免疫组化染色表明293-mda-7处理的肿瘤血管形成减少;(d)TUNEL染色表明内皮细胞和肿瘤周围细胞出现凋亡。图26D.肿瘤样品中血红蛋白含量分析表明与接受亲本293细胞的动物相比接受293-mda-7细胞的动物肿瘤内血红蛋白含量下降。
图27A-27B.图27A.(a)小鼠右下腹皮下注射5×106A549细胞以建立A549肿瘤。当可明显感觉到肿瘤时,将动物分为两组(每组8只),分别进行如下处理:对照组在小鼠的右上腹植入包裹293细胞的基质胶,试验组动物植入包裹293-mda-7细胞的基质胶。用测径尺测量肿瘤,利用t检验来计算肿瘤体积改变的统计学意义。与经293细胞处理的肿瘤相比,用293-mda-7细胞处理的肿瘤的生长明显受到抑制(p=0.001)。每一时间点代表标准误;(b)Western印迹分析血清中的sMDA-7,结果表明与对照组(条带2和4)相比,试验组动物产生sMDA-7,如致密的条带所显示(条带1、3和5)。图27B.在试验结束时收集肿瘤并进行分析。(a)移植293细胞和293-mda-7细胞的动物所获得的肿瘤总的外观和大小;(b)苏木精和伊红染色的组织切片;(c)CD31免疫组化染色表明293-mda-7处理的肿瘤血管形成减少;(d)免疫组化染色表明基质胶包裹的细胞染色呈MDA-7阳性。
图28.MDA-7的加工和分泌。图的上面是用图示表示的MDA-7的一级氨基酸序列。下面(左边)是MDA-7蛋白的亲水性指数。下面(右边)是内源性和分泌的MDA-7的Western印迹分析结果。
图29A-29B.Ad-mda7活化非折叠蛋白质反应通路(UPR)蛋白。H1299细胞用Ad-luc和Ad-mda7处理,48小时后将细胞裂解,Western印迹分析应激蛋白的表达。细胞裂解物中BiP、GADD34和PP2A的表达情况(图29A)。细胞裂解物中胱冬酶7、胱冬酶12和XBP-1的表达情况(图29B)。
图30.Ad-mda7可破坏钙离子流,增加线粒体的不稳定性。分析Ad-mda7转导的H1299肿瘤细胞。钙离子流和线粒体的完整性通过共聚焦显微镜分析。
图31A-31B.MDA-7蛋白是高度糖基化的。稳定表达MDA-7蛋白的293-mda-7细胞用不同的去糖苷酶处理,其中包括糖肽酶F(GlycoF)、唾液酸酶和内切糖苷酶H(EndoH)(图31A)。Western印迹分析表明MDA-7是高度糖基化的(图31B)。
图32A-32B.图32A.衣霉素和布雷菲德菌素A可阻断MDA-7蛋白的分泌。衣霉素和布雷菲德菌素A(用量为1和2μg/mL)都可以抑制MDA-7蛋白的分泌,使Ad-mda7转导的H1299细胞内内源性MDA-7蛋白的浓度增加。图32B.Ad-mda7介导的凋亡不需要MDA-7的分泌。分泌的MDA-7蛋白不能诱导肿瘤细胞的杀伤,也不是Ad-MDA7介导的凋亡以及最终的肿瘤细胞的杀伤所必须的。
图33A-33B.图33A.靶向性质粒的构建。构建不同的mda-7构建体以便把MDA-7靶向性地导入到各种亚细胞结构中。其中包括含N端信号肽的全长版本(为分泌用)、无信号肽的mda-7构建体(为胞浆表达)、含核定位信号(NLS)的mda-7构建体以及含ER信号肽的mda-7构建体。这些构建体都被克隆到pShooter载体(Invitrogen)中。图33B.靶向性载体的细胞内表达及分泌蛋白的表达。Western分析用于检测图27A所描述的不同构建体转染的H1299细胞裂解物以及上清液中MDA-7蛋白的表达。
图34.MDA-7靶向性进入不同的亚细胞结构。免疫荧光分析不同MDA-7靶向性构建体(如图27A所描述)转染的H1299细胞内MDA-7蛋白的表达情况。
图35.MDA-7的ER靶向性可阻断克隆形成。通过克隆形成单位(CFU)试验发现靶向性进入内质网(ER)的MDA-7蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖。当MDA-7在胞浆和核内表达时无抗肿瘤活性。
图36.ER靶向性的MDA-7是细胞毒性的。H1299细胞转染MDA-7靶向性质粒,用存活/死亡试验进行评价。靶向性进入ER的MDA-7蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖,因为可见到死亡的细胞增加(红色的,溴化乙锭染色)。空白、胞浆的以及核靶向性的MDA-7的杀伤效应很弱。
图37.ER靶向性的MDA-7是促凋亡因子。通过Hoescht分析发现MDA-7蛋白靶向性地进入ER可诱导凋亡。
图38.CFU分析PC3细胞内MDA-7的亚细胞结构定位。PC3前列腺癌细胞分别转导编码GFP对照、全长MDA-7和线粒体靶向性MDA-7的质粒,分析其克隆形成能力。与对照组相比,全长MDA-7可使克隆形成能力下降35%,而线粒体靶向性MDA-7可使PC3细胞的克隆形成能力和存活能力进一步下降。
图39A-39B.Ad-mda7和NF-κB通路的关系。图39A.通过电子迁移率漂移分析发现Ad-mda7可提高A549细胞内NF-κB的DNA结合活性。图39B.显性负性突变体I-kB转染H1299细胞可显著抑制细胞的生长。
图40.舒林酸而不是吲哚美辛可抑制NF-κB通路的活化。
图41.舒林酸以剂量依赖的方式抑制TNF介导的NF-κB的活化。
图42.Ad-mda7协同舒林酸诱导H1299细胞的凋亡。
图43.联合治疗(72小时)可使处于亚G1期的细胞数显著增加。
图44.舒林酸和Ad-mda7联合治疗可显著增加凋亡。
图45.剂量逐渐升高的I期临床试验的设计,其中mda-7通过瘤内注射给予晚期肿瘤患者,所用的是非复制型的腺病毒构建体(Ad-mda7)。试验设计标明每组患者的数目、病毒的剂量和活组织检测的时间。
图46.用图表表示Ad-mda7诱导的血清细胞因子动力学,结果用血清细胞因子升高的百分率对注射后的天数来表示。结果表明瘤内注射Ad-mda7后血清细胞因子出现瞬时升高。
图47.每组内瘤内注射Ad-mda7所产生的血清细胞因子。大多数患者出现全身细胞因子(IL-6,IL-10,IFNγ,TNFα,GM-CSF)的瞬时升高。
图48.接受瘤内注射Ad-mda7的患者体内CD8+T细胞百分率增加的水平。在mda7处理后15天CD3+CD8+T细胞增加30±13%。
图49.瘤内注射Ad-mda7后患者外周血CD8+细胞增加。
说明性实施方案的描述
本发明涉及增强患者免疫应答的方法。增强和提高免疫应答可通过肌体阻止、抑制和降低发生感染、疾病的能力而达到预防和治疗效果。因此,在某些实施方案中,MDA-7多肽的功能是作为治疗的佐剂。在另外一些实施方案中,MDA-7多肽可与细胞因子、趋化因子及其类似物联合应用,如干扰素α、β和/或γ以增强或提高患者的免疫应答。
本发明还涉及增强或提高免疫应答以检测和鉴定以前未发现具有免疫原性的分子。因此,在某些实施方案中,本发明的方法用于诊断的目的以确定免疫原性分子,特别是用于免疫治疗的免疫原性分子。
在其他的实施方案中,本发明涉及预测免疫治疗对候选患者的治疗效果。本发明的方法和组合物可用于患者,并检测所诱导的免疫应答。免疫应答的检测可预测患者是否适于进行免疫治疗。
A.MDA-7
本发明的组合物和方法是利用MDA-7多肽来增强免疫应答。MDA-7多肽是另一类推断的肿瘤抑制因子,已经证明可抑制p53野生型、p53缺失型及p53突变型肿瘤细胞的生长。另外,p53缺失型细胞内凋亡相关的BAX基因的表达上调说明MDA-7能够以不依赖p53的机制诱导肿瘤细胞的损伤。申请人观察到腺病毒介导的MDA-7的过量表达可导致双链RNA活化的丝氨酸/苏氨酸激酶(PKR)快速诱导和活化,从而使eIF-2α以及其他PKR靶底物磷酸化,凋亡被诱导。如PKR缺失型成纤维细胞所显示,Ad-mda7诱导的凋亡不依赖功能性的PKR通路。这些特征说明MDA-7可作为PKR的诱导因子,具有广泛的治疗、预后及诊断价值,因此可作为所诱导的免疫应答的增强因子。
PKR具有抗病毒和抗细胞功能,可参与某些生理过程的调节,如细胞的生长和分化(美国专利No.6,326,466;Feng等,1992;Petryshyn等,1988;Petryshyn等,1984;Judware等,1991)、肿瘤抑制(Koromilas等,1992;Meurs等,1993)以及信号转导通路的调节(Leonardo等,1989;Kumar等,1994;Maran等,1994)。
PKR的上调可诱导各种肿瘤细胞系的凋亡。而且,在脊髓发育不良中,染色体5q上IRF-1基因的关键性致癌性缺失也显示与PKR表达水平的降低有关(Beretta等,1996),肺癌和结肠癌的免疫组化分析结果表明与PKR的表达和生存期的延长有关(Haines等,1992)。PKR可通过多种信号转导通路的活化介导抗肿瘤形成活性,从而达到抑制生长和诱导凋亡的作用。这些通路的活化发生在潜伏的无活性的同源二聚体被活化的信号诱导发生结构改变而导致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等,2001)。PKR一旦活化以后就能使各种靶底物磷酸化,这在生长调控和凋亡诱导中有很重要的作用(Saelens等,2001;Sudhakar等,2000)。免疫系统的刺激与凋亡有关(Albert等,1998;Chen等,2001;Saif-Muthama等,2000;Restifo等,2001)。另外,人工诱导的凋亡已被证明可增强疫苗的免疫原性,这是因为通过凋亡细胞的转染而活化的树突状细胞的刺激效应(Sasaki等,2001;Chattergoon等,2000)。
Mda-7 mRNA已在人PMBC中被鉴定(Ekmekcioglu等,2001),据报道人MDA-7无细胞因子活性。根据其基因和蛋白序列的特征,MDA-7已被命名为IL-24(NCBI数据库登录号:XM_001405)。鼠MDA-7蛋白同源物FISP(IL-4-诱导的分泌蛋白)已报道为Th2特异性的细胞因子(Schaefer等,2001)。FISP的转录可被TCR和IL-4受体的结合及随后的PKC和STAT6的活化所诱导,这可被敲除试验所证实。FISP的表达特点已被证实,但还没有发现这个推断出的细胞因子的功能17。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)与mda-7基因有78%的同源性,已被证实与伤口愈合有关(Soo等,1999;Zhang等,2000)。Mob-5也是一种分泌蛋白,在大鼠转化细胞中可能是一种细胞表面受体(Zhang等,2000)。因此,mda-7基因和MDA-7分泌蛋白的同源物可在各物种中表达和分泌。但是,没有数据显示MDA-7具有细胞因子活性。这种活性可通过增强抗原的免疫原性用于治疗各种疾病和感染。
Mda-7 cDNA(SEQ ID NO:1)编码一种新型的、进化保守的、具有206个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:2),预测的分子量为23.8kDa。据推测氨基酸序列含有一个疏水性骨架,位置约为氨基酸26到45,具有信号序列的特征。除了一个含42个氨基酸残基的片段与白细胞介素10(IL-10)有54%的同源性外,该蛋白质的序列与已知的蛋白无显著的同源性。结构分析表明MDA-7(IL-BKW或IL-20)具有细胞因子家族的结构特征(WO 98/28425,本文已纳入作为参考)。其结构特征和一小段氨基酸片段的有限一致性显示MDA-7可能具有细胞外功能。MDA-7的表达与黑色素瘤的恶性程度成负相关关系,因为试验证明与原发和转移的黑色素瘤相比正常的黑色素细胞内的mRNA表达水平是升高的,而在裸鼠体内增强肿瘤形成的处于垂直生长期的黑色素瘤细胞内的mda-7 mRNA的表达水平是下降的。其他有关MDA-7的信息和数据见专利申请09/615,154和10/017,472,本文已纳入作为参考。
其他的试验证明MDA-7表达的升高可在体外抑制肿瘤细胞的生长,并且可以选择性地诱导人乳腺癌细胞的凋亡和抑制裸鼠体内肿瘤的生长(Jiang等,1996和Su等,1998)。Jiang等(1996)报道认为mda-7在各种起源的肿瘤细胞内都是一种有效的生长抑制基因,其中包括乳腺、中枢神经系统、宫颈、结肠、前列腺和结缔组织。克隆抑制分析可用于证明MDA-7表达的上升可增强人宫颈癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、结肠癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(HONE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑色素瘤(HO-1和C8161)、成胶质细胞瘤多形体(glioblastome multiforme)(GBM-18和T98G)以及骨肉瘤(Saos-2)细胞生长的抑制作用。Mda-7在正常细胞(HMECs、HBL-100和CREF-Trans6)内的过量表达显示出有限的生长抑制作用,这说明mda-7转基因的效应在正常细胞内是不明显的。综上所述,这些数据说明MDA-7表达升高所产生的体外生长抑制作用对肿瘤细胞的效应高于对正常细胞的效应。
Su等(1998)报道了对MDA-7抑制肿瘤细胞生长的机制的研究。研究结果表明MDA-7在乳腺癌细胞系MCF-7和T47D内的异位表达可诱导凋亡,但是对正常的HBL-100细胞无影响,结果是通过细胞周期分析和TUNEL分析得出的。转染腺病毒mda-7(“Ad-mda-7”)的细胞裂解物经Western印迹分析表明凋亡刺激蛋白BAX的表达上调。Ad-mda-7转染上调BAX蛋白的表达只发生在MCF-7和T47D细胞内,而不发生在正常的HBL-100和HMEC细胞内。这些结果使研究人员提高了Ad-mda-7体外转导对MCF-7肿瘤细胞异种移植肿瘤形成的效应。体外转导可抑制肿瘤异种移植模型中肿瘤的形成和发展。
在本发明的某些实施方案中,mda-7是作为表达MDA-7多肽的核酸来提供的。在某些特殊的实施方案中,核酸是病毒载体,其中载体的剂量至少为103,104,105,106,107,108,109,1010,1011,1012,1013,1014,1015或更高的pfu或病毒颗粒。在某些实施方案中,病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。最优选的病毒载体是腺病毒载体。在其他特殊的实施方案中,核酸是非病毒载体。
在某些实施方案中,表达多肽的核酸是与启动子相连接的。适于本发明的启动子的非限定性例子包括CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22和MHC II类分子的启动子,但是任何可用于启动mda-7基因或本发明的免疫原的启动子,如本文所描述的那些启动子,相信都可用于实现本发明。
本发明的核酸优选通过注射给药。其他的实施方案也包括通过多次注射给予核酸。在某些实施方案中,注射可在疾病或肿瘤位点的局部、疾病或肿瘤位点的某个区域、或远离疾病或肿瘤位点。在某些实施方案中,核酸的注射是通过连续灌注、瘤内注射、腹腔注射或静脉注射。在其他的实施方案中,核酸是在切除肿瘤前、或切除肿瘤后,或者切除肿瘤前后都注射到肿瘤床的部位。另外,核酸可在化疗、生物治疗、免疫治疗、手术或放疗前、期间或之后给予患者。患者优选人。在其他的实施方案中,患者是肿瘤患者。
1.核酸、载体和调节信号
本发明涉及mda-7基因及其基因产物MDA-7有关的多聚核苷酸或核酸分子。另外,本发明还涉及与免疫原性分子相关的多聚核苷酸或核酸分子。这些多聚核苷酸或核酸分子可以从哺乳动物细胞内分离并纯化。值得注意的是,分离和纯化的MDA-7核酸分子,不论是分泌的或是全长的版本,都是与mda-7基因产物有关的核酸分子,都可以是RNA或DNA的形式。同样,与免疫原性分子有关的核酸分子也可以是RNA或DNA的形式。本文所用的术语“RNA转录子”是指DNA核酸分子转录出来的产物-RNA分子。这种转录子可编码一种或多种多肽。
如本申请所使用的,术语“多聚核苷酸”是指核酸分子、RNA或DNA,可从总基因组核酸中分离。因此,“编码MDA-7的多聚核苷酸”是指含MDA-7编码序列的核酸片段,也可以从基因组总DNA和蛋白中分离或纯化。当本申请指MDA-7编码多聚核苷酸或核酸的功能或活性时,它就意味着编码能增强免疫应答的分子的多聚核苷酸。另外,“编码免疫原的多聚核苷酸”是指含免疫原编码序列的核酸片段,也可以从基因组总DNA和蛋白中分离或纯化。当本申请指编码免疫原的免疫基因的功能或活性时,它就意味着编码能诱导人体免疫应答的免疫原性分子的多聚核苷酸。
术语“cDNA”是指以RNA为模板制备的DNA。与基因组DNA或RNA转录子相比,利用cDNA的优势在于其稳定性和易于利用重组DNA技术进行操作的能力(见Sambrook,1989;Ausubel,1996)。当全部或部分基因组序列有一些时则需要时间。另外,cDNA是有优势的,因为它代表了多肽的编码区,已经剔除了内含子和其他调节序列。
另外需要注意的是从一个给定细胞内分离出的给定的MDA-7编码核酸或mda-7基因可被核酸序列稍微有差异但还能编码MDA-7多肽的天然突变体或突变株替代;人的MDA-7多肽是特殊的实施方案。因此,本发明也包括具有细微氨基酸改变但活性相同的MDA-7的衍生物。
术语“基因”简单地说就是指功能性蛋白、多肽或肽编码单位。正如本领域技术人员所理解的,这个功能术语包括能表达或适于表达蛋白、多肽、功能域、肽、融合蛋白以及突变体的基因组序列、cDNA序列和较小的基因工程基因片段。编码MDA-7或其他治疗性多肽如免疫原的核酸分子含有下列长度,或至少含有下列长度的连续核酸序列:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000或更多个核苷酸、核苷或碱基对。这种序列与SEQ ID NO:1(MDA-7编码序列)一致或互补。
“与其他编码序列有实质区别的”是指目的基因为核酸片段的部分编码序列,这个片段不含有天然编码核酸的大部分,如大的染色体片段或其他功能基因或cDNA编码区。当然,这是指天然分离的核酸片段,不包括后来人工添加到片段上的基因或编码区。
在某些特定的实施方案中,本发明涉及独立的DNA片段和插入编码MDA-7蛋白、多肽或肽的DNA序列的重组载体,这些MDA-7蛋白、多肽或肽含有包含在其氨基酸序列内的与上述SEQ ID NO:2一致的连续氨基酸序列,与MDA-7相应的序列被命名为“人MDA-7”或“MDA-7多肽”。
术语“与上述SEQ ID NO:2基本一致的序列”是指与部分SEQ ID NO:2基本对应的序列,其中只有相当少的氨基酸是与SEQ ID NO:2的氨基酸不一致,但其生物功能是等价的。
术语“生物功能等价”是本领域所熟知的,在本文中还有更详细的定义。因此,如果一个序列的氨基酸有约70%、约71%、约72%、约73%、约74%、约75%、约76%、约77%、约78%、约79%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或者约99%,以及二者之间的,如约70%到约80%、优选的是约81%到约90%;或者更优选的是约91%到约99%与SEQ ID NO:2的氨基酸一致或功能等价,则该序列是“与上述SEQ ID NO:2基本一致”,因而蛋白的生物活性得以保持。在某些特定的实施方案中,MDA-7蛋白、多肽或肽或生物功能等价物的生物活性包括增强免疫应答的活性。在其他特定的实施方案中,为蛋白、多肽或肽或者生物功能等价物的免疫原、免疫原性分子具有免疫原性,这是指该分子能诱导人体的免疫应答。在其他某些实施方案中,本发明涉及独立的DNA片段和重组载体,这些片段和载体的序列内具有与上述SEQ ID NO:1基本一致的序列。术语“与上述SEQ ID NO:1基本一致”与上面所描述的意义一样,是指核酸序列与部分SEQ ID NO:1基本一致,只有少数几个密码子与SEQ ID NO:1的密码子不同,但功能是等价的。而且,编码具有MDA-7活性的蛋白、多肽或肽的DNA片段是最常用的。
在特定的实施方案中,本发明涉及独立的核酸片段和插入编码MDA-7多肽或肽的DNA序列的重组载体,这些多肽或肽的氨基酸序列具有与MDA-7多肽一致或基本一致的连续氨基酸序列。在其他的实施方案中,本发明涉及独立的核酸片段和插入编码免疫原、蛋白、多肽或肽的DNA序列的超组载体,这些免疫原、蛋白、多肽或肽的氨基酸序列具有与免疫原一致或基本一致的连续氨基酸序列。
本发明的载体主要用于转化细胞使其含有可调控的真核细胞启动子(即可诱导的、可抑制的、组织特异性的)控制下的mda-7基因。另外,如果无其他原因,为了便于载体的体外操作,载体内也可以包含筛选标记。但是,筛选标记在产生重组细胞时可能发挥重要作用。
表1和2,见下,列出了可用于本发明的各种调节信号。
表1-可诱导元件
元件 | 诱导剂 | 参考文献 |
MT II | 佛波酯(TPA)重金属 | Palmiter等,1982;Haslinger和Karin,1985;Searle等,1985;Stuart等,1985;Imagawa等,1987;Karin等,1987;Angel等,1987b;McNeall等,1989 |
MMTV(鼠乳腺肿瘤病毒) | 糖皮质激素 | Huang等,1981;Lee等,1981;Majors和Varmus,1983;Yamamoto等,1983;Lee等,1984;Ponta等,1985;S即i等,1986 |
-干扰素 | poly(rI)Xpoly(rc) | Tavernier等,1983 |
腺病毒5E2 | Ela | Imperiale和Nevins,1984 |
胶原酶 | 佛波酯(TPA) | Angel等,1987a |
基质降解酶 | 佛波酯(TPA) | Angel等,1987b |
SV40 | 佛波酯(TFA) | Angel等,1987b |
鼠MX基因 | 干扰素,新城病病毒 | Hug等,1988 |
GRP78基因 | A23187 | Resendez等,1988 |
α-2-巨球蛋白 | IL-6 | Kunz等,1989 |
波形蛋白 | 血清 | Rittling等,1989 |
MHCI类基因H-2κb | 干扰素 | Blanar等,1989 |
HSP70 | Ela,SV40大T抗原 | Taylor等,1989;Taylor和Kingston,1990a,b |
多育曲霉素 | 佛波酯-TPA | Mordacq和Linzer,1989 |
肿瘤坏死因子 | PMA | Hensel等,1989 |
甲状腺刺激激素α基因 | 甲状腺激素 | Chatterjee等,1989 |
表2-其他启动子/增强子元件
启动子/增强子 | 参考文献 |
免疫球蛋白重链 | Banerji等,1983;Gillies等,1983;Grosschedl和Baltimore,1985;Atchinson和Perry,1986,1987;Imler等,1987;Neuberger等,1988;Kiledjian等,1988; |
免疫球蛋白轻链 | Queen和Baltimore,1983;Picard和Schaffner,1985 |
T-细胞受体 | Luria等,1987,Winoto和Baltimore,1989;Redondo等,1990 |
HLA DQα和DQβ | Sullivan和Peterlin,1987 |
β-干扰素 | Goodbourn等,1986;Fujita等,1987;Goodbourn和Maniatis,1985 |
白细胞介素-2 | Greene等,1989 |
白细胞介素-2受体 | Greene等,1989;Lin等,1990 |
MHC II类分子5 | Koch等,1989 |
MHC II类分子HLA-DRα | Sherman等,1989 |
β-肌动蛋白 | Kawamoto等,1988;Ng等,1989 |
肌肉肌酸激酶 | Jaynes等,1988;Horlick和Benfield,1989;Johnson等,1989a |
前清蛋白(甲状腺运载蛋白) | Costa等,1988 |
弹性蛋白酶I | Omitz等,1987 |
金属硫蛋白 | Karin等,1987;Culotta和Hamer,1989 |
胶原酶 | Pinkert等,1987;Angel等,1987 |
白蛋白基因 | Pinkert等,1987,Tronche等,1989,1990 |
α-胎甲蛋白 | Godbout等,1988;Campere和Tilghman,1989 |
γ-珠蛋白 | Bodine和Ley,1987;Perez-Stable和Constantini,1990 |
β-珠蛋白 | Trudel和Constantini,1987 |
c-fos | Cohen等,1987 |
c-HA-ras | Triesman,1985;Deschamps等,1985 |
胰岛素 | Edlund等,1985 |
神经细胞黏附分子(NCAM) | Hirsch等,1990 |
a1-抗胰蛋白酶 | Latimer等,1990 |
H2B(TH2B)组蛋白 | Hwang等,1990 |
鼠或I型胶原 | Rippe等,1989 |
葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78) | Chang等,1989 |
大鼠生长激素 | Larsen等,1986 |
人血清淀粉样物质A(SAA) | Edbrooke等,1989 |
肌钙蛋白I(TN I) | Yutzey等,1989 |
血小板衍生生长因子 | Pech等,1989 |
Duchenne肌营养不良 | Klamut等,1990 |
启动子/增强子 | 参考文献 |
SV40 | Banerji等,1981;Moreau等,1981;Sleigh和Lockett,1985;Firak和Subramanian,1986;Herr和Clarke,1986;Imbra和Karin,1986;Kadesch和Berg,1986;Wang和Calame,1986;Ondek等,1987;Kuhl等,1987Schaffner等,1988 |
多瘤病毒 | Swartzendruber和Lehman,1975;Vasseur等,1980;Katinka等,1980,1981;Tyndell等,1981;Dandolo等,1983;Hen等,1986;S即i等,1988;Campbell和Villarreal,1988 |
逆转录病毒 | Kriegler和Botchan,1983;Kriegler等,1984a,b;Bosze等,1986;Miksicek等,1986;Celander和Haseltine,1987;Thiesen等,1988;Celander等,1988;Chol等,1996;Reisman和Rotter,1989 |
乳头状瘤病毒 | Campo等,1983;Lusky等,1983;Sp和idos和Wilkie,1983;Spalholz等,1985;Lusky和Botchan,1986;Cripe等,1987;Gloss等,1987;Hirochika等,1987,Stephens和Hentschel,1987 |
乙型肝炎病毒 | Bulla和Siddiqui,1988;Jameel和Siddiqui,1986;Shaul和Ben-Levy,1987;Spandau和Lee,1988 |
人免疫缺陷病毒 | Muesing等,1987;Hauber和Cullan,1988;Jakobovits等,1988;Feng和Holl和,1988;Takebe等,1988;Berkhout等,1989;Laspia等,1989;Sharp和Marciniak,1989;Braddock等,1989 |
巨细胞病毒 | Weber等,1984;Boshart等,1985;Foecking和Hofstetter,1986 |
长臂猿白血病病毒 | Holbrook等,1987;Quinn等,1989 |
真核细胞内控制蛋白编码基因转录的启动子和增强子是由多个基因元件组成的。细胞内的机器能将每个元件所传递的调节信息收集起来并整合,使不同的基因分别进化,通常形成转录调节复合物。
本文所用的术语“启动子”是指一组转录调控模块,在RNA多聚酶II的起始位点周围成簇。许多关于启动子是如何组织的构想都来自于对几种病毒启动子的分析,其中包括HSV胸腺嘧啶激酶(tk)和SV40早期转录单位的启动子。这些试验再加上最近的研究表明启动子是由不连续的功能模块组成的,每个模块约含7-20bp的DNA,并且每个模块都有一个或多个转录活化蛋白的识别位点。
每个启动子中至少有一个模块的功能是定位RNA合成的起始位点。最知名的例子是TATA框,但是某些启动子没有TATA框,如哺乳动物末端脱氧核酸转移酶基因和SV40晚期基因的启动子,这些启动子含有与起始位点本身重叠的一个不连续元件以固定起始的位置。
另外一些启动子元件可调节转录起始的频率。一般来说,这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域,尽管最近发现有许多启动子也含有位于起始位点下游的功能元件。不同元件之间的距离是很灵活的,因此当元件反转或相对移动时启动子的功能保持不变。对于tk启动子来说,不同元件之间的距离增加到50bp时活性才开始下降。根据启动子的不同,其每个元件或者协同、或者独立发挥功能以活化转录。
增强子最初被鉴定为能增强启动子转录活性的基因元件,位于同一DNA分子的较远位置。这种在远处发挥作用的能力在原核细胞转录调节的经典研究中是没有先例的。后来的试验表明具有增强子活性的DNA区域的结构与启动子很相似。它们是由许多单个的元件组成的,其中每个元件都可以结合一个或多个转录蛋白。
增强子和启动子的基本区别是其调控方式。增强子区必须以整体的形式才能在远处刺激转录;而启动子区或其组成元件则不需要这样。另一方面,启动子必须含有一个或多个在特定位点并且以特定方向启动RNA合成起始的元件,而增强子缺乏这种活性。除了这种调控方式的不同,启动子和增强子是十分相似的。
启动子和增强子具有相似的活化细胞内转录的基本功能。它们之间通常是重叠的,并且相邻,具有很相似的组织结构。通盘考虑这些特征就会发现增强子和启动子是同源性实体,结合到这些序列上的转录活化蛋白与细胞内的转录机器以基本相同的方式相互作用。
在某些实施方案中,本发明所用的启动子是巨细胞病毒(CMV)的启动子。该启动子位于pcDNAIII内,可从Invitrogen购买,在本发明中普遍使用。其他可用于本发明的启动子有dectin-1和dectin-2启动子。下面列出了其他一些可用于本发明的病毒启动子、细胞启动子/增强子和可诱导的启动子/增强子。其他任何的启动子/增强子的结合(如真核启动子数据库中的每一个)也都可以用于调控编码寡糖处理酶、蛋白折叠辅助蛋白、筛选标记蛋白或异源目的蛋白的结构基因的表达。
另外被证明是有用的信号是多聚腺苷酸信号。这种信号可来自人生长激素(hGH)基因,牛生长激素(BGH)基因或SV40。
内部核糖体结合位点(IRES)元件的使用可产生多基因、多顺反子信使RNA。IRES能绕过5-甲基化帽子依赖的翻译所需要的核糖体扫描模式,在内部位点起始翻译(Pelletier和Sonenberg,1988)。来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒)的IRES元件已被描述(Pelletier和Sonenberg,1988),另外还有来自哺乳动物信使RNA的IRES(Macejak和Sarnow,1991)。IRES元件可与异源的开放阅读框架相连接。多个开放阅读框架可一起转录,每个都被IRES分开,形成多顺反子信使RNA。利用IRES元件的这一特点,每个开放阅读框架都可以接近核糖体以有效翻译。多个基因可在单个启动子/增强子的控制下高效表达转录出一条信使RNA。
在任何情况下都应该清楚启动子是一种DNA元件,当其位于基因的上游时才能发挥功能导致该基因的表达。本发明的大多数目的基因构建体都位于启动子元件的下游。
2.蛋白、肽和多肽
a.生物功能等价物
本发明涉及通过提供有效量的MDA-7多肽增强免疫应答。在某些实施方案中,MDA-7多肽是直接提供的。在某些特殊的实施方案中,MDA-7多肽是在治疗前提供的。在另外一些特殊的实施方案中,MDA-7多肽与其他免疫原性分子,如抗原同时给予以达到免疫治疗的目的。在其他特殊的实施方案中,MDA-7多肽是在治疗后提供,在某些情况下是在提供免疫原性分子以后,以达到加强、检测或预测所诱导的免疫应答的目的。
本发明的其他实施方案包括使用纯化的蛋白组合物,该组合物中含有MDA-7蛋白、截短形式的MDA-7以及MDA-7氨基酸序列来源的肽,后者可给予细胞或肌体以抑制血管形成。截短的MDA-7分子包括从MDA-7氨基酸残基46-49开始的分子以及N端截短的分子。优选的分子起始于46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和182、以及末端在206位残基。在其他的实施方案中,残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45和46也包含在MDA-7的其他连续氨基酸残基内,如SEQ ID NO:2所示。
正如本领域技术人员所理解的,可对MDA-7多肽或肽、免疫原性分子或免疫基因产物进行修饰和改变,所得到的分子具有相似的或预期的特征。例如,某些氨基酸可被蛋白结构中的其他氨基酸所替代,但是不会丢失与某些结构如抗体的抗原结合区或某些分子如Tat和RNA聚合酶II的结合位点的结合活性。
由于蛋白的结合能力和性质可决定蛋白的生物功能活性,因此在蛋白序列上可进行某些氨基酸序列的替代(当然也包括其编码DNA序列)而得到具有相似活性的蛋白质(拮抗的)。因此,发明者可在HIV多肽或肽(或其编码DNA)进行各种改变而不会丢失其生物功能或活性。
对于功能等价物来说,本领域熟练的技术人员应该理解这个概念来自于生物功能等价蛋白或肽的定义,是指一个分子的特定部位内发生一些有限的改变,所得到的分子具有与原分子相似的生物活性。因此本文所定义的生物功能等价肽是指某些而不是大多数或全部氨基酸被替代的那些肽。特别是对于小肽来说,可以改变的氨基酸很少。当然,根据本发明可以很容易地在多种不同的蛋白/肽上进行不同的替代。
很容易理解的是某些残基对于维持蛋白或肽的生物活性或结构特性是十分重要的,就是那些位于酶或RNA聚合酶II结合区的活性位点上的残基,这些残基一般不允许改变。对于本发明来说,那些诱导免疫应答所必须的残基一般不应改变,对于MDA-7多肽和免疫基因产物来说都是如此。
氨基酸的替代一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性,如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。通过对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析发现精氨酸、赖氨酸和组氨酸是带正电荷的残基;丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸是较小的氨基酸;苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有基本一致的形状。因此,基于这些考虑,本文把下列的亚类定义为生物功能等价物:精氨酸、赖氨酸和组氨酸;丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸;苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
为了有效地量化这种改变,需要考虑氨基酸的水性指数。基于其疏水性和电荷特征,每个氨基酸都被赋予一个水性指数,分别为异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);蛋氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
氨基酸的水性指数对于一个蛋白的结合活性的重要性是本领域所熟知的(Kyte& Doolittle,1982,本文已纳入作为参考)。已知某些氨基酸被具有相似水性指数或分数的其他氨基酸替代可以保持相似的生物活性。在基于水性指数进行改变时,优选用水性指数在±2以内的氨基酸进行替代,更优选的是水性指数在±1以内的,最优选的是水性指数在±0.5以内的。
基于亲水性进行有效的氨基酸替代也是本领域所熟知的,尤其是当用于免疫实施方案中的所产生的生物功能等价蛋白或肽时,如本发明的实施方案。美国专利4,554,101,本文已纳入作为参考,描述了蛋白质的局部最大平均亲水性是由其临近氨基酸的亲水性控制的,与其免疫原性和抗原性相关,即与蛋白的生物特性有关。
如美国专利4,554,101详细描述的,每个氨基酸都被赋予了一个亲水性值:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);蛋氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3)苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。
在基于相似的亲水性值进行改变时,优选用亲水性值在±2以内的氨基酸进行替代,更优选的是亲水性值在±1以内的,最优选的是亲水性值在±0.5以内的。
当讨论集中在因氨基酸改变而导致的功能等价多肽时,也需要注意编码DNA的改变也会造成上述氨基酸的变化,也需要考虑基因密码子的退化以及两个或多个密码子可以编码同一个氨基酸。一个氨基酸及其密码子的表列在本文的下面以便于这种实施方案的应用,或其他的应用,如设计探针和引物等。
b.合成肽
本发明的组合物可以包括经修饰来保护其生物功能的肽。生物功能保护肽与未保护肽相比在给予人体时具有某种优势,见美国专利5,028,592的描述,本文已纳入作为参考,保护肽通常具有更高的药理活性。
本发明所用的组合物也可包括包含所有L氨基酸、所有D氨基酸或其混合物的肽。D氨基酸的使用可以提高蛋白质对人体内天然蛋白酶的耐受性,降低其免疫原性,因而可能具有更长的生物半衰期。
本发明还描述了用于本发明的各个实施方案的MDA-7肽和/或免疫原。分析了特殊肽激发免疫应答的能力。在肽相对较小的特定实施方案中,本发明的肽也可利用常规技术在溶液或固相支持物上合成。各种自动合成仪都是商业化的,可根据已知的操作方法使用。见Stewart和Young,(1984);Tam等,(1983);Merrifield,(1986);以及Barany和Merrifield(1979),本文都已纳入作为参考。短肽序列或重叠肽文库一般约含有35到50个氨基酸,与本文所描述的所选区域相对应,可以很容易地合成并通过筛选试验找到具有活性的肽。另外,重组DNA技术也可以使用,其中编码本发明的肽的核苷酸序列被插入到表达载体内,然后转化或转染到适当的宿主细胞内,在适宜表达的条件下培养。
本发明的组合物可以包括经修饰来保护其生物功能的肽。生物功能保护肽与未保护肽相比在给予人体时具有某种优势,见美国专利5,028,592的描述,本文已纳入作为参考,保护肽通常具有更高的药理活性。
本发明所用的组合物也可包括包含所有L氨基酸、所有D氨基酸或其混合物的肽。D氨基酸的使用可以提高蛋白质对人体内天然蛋白酶的耐受性,降低其免疫原性,因而可能具有更长的生物半衰期。
c.体外制备蛋白
按照本发明的某些实施方案转导病毒载体后,初级哺乳动物细胞培养物可通过各种方式制备。为了使细胞在体外以及与表达构建体接触时保持存活需要在含正确比例的氧、CO2和养分的环境中培养细胞,并且确保不被微生物污染。细胞培养技术已有很多报道,本文以参考文献的方式描述(Freshner,1992)。
上述的一个实施方案包括利用基因转导永生化的细胞以制备和/或生产蛋白质。目的蛋白的基因可按上面描述的方法转移到适当的宿主细胞中,然后在适宜的条件下培养细胞。事实上任何多肽的基因都适用这种方法。重组表达载体的制备及其所包含的元件都已在上面讨论过。另外,所产生的蛋白可以是细胞所正常合成的内源性蛋白。
本发明的其他实施方案利用自身的B淋巴细胞系,这些细胞系用表达免疫基因产物、尤其是具有免疫活性的蛋白的病毒载体转染。哺乳动物宿主细胞系的其他例子包括Vero和HeLa细胞、其他B细胞系和T细胞系,如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji等,以及中国仓鼠卵巢细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞。另外,还可以选择表达插入序列或能以所希望的方式修饰和处理基因产物的宿主细胞系。蛋白产物的这种修饰(如糖基化)和处理(如断裂)对于蛋白的功能来说是十分重要的。不同的宿主细胞具有不同的蛋白质翻译后处理和修饰机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达外源蛋白正确修饰和处理。
许多筛选系统可以使用,其中包括而不限于HSV胸腺嘧啶激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因,分别位于tk-、hgprt-和aprt-细胞内。另外,抗代谢耐受性也可作为筛选的基础:dhfr使细胞对耐受;gpt使细胞对霉酚酸耐受;neo使细胞对氨基糖苷G418耐受;hygro使细胞对潮霉素耐受。
动物细胞可以两种模式在体外增殖:非锚定依赖的细胞悬浮在培养物悬液中生长,锚定依赖的细胞需要粘附在固相基质上增殖(即细胞呈单层生长)。
能连续传代的细胞系通过非锚定依赖的方式或用悬液培养是广泛应用的大规模制备细胞和细胞产物的主要方式。但是悬浮培养的细胞也有其局限性,如与粘附细胞相比其致瘤性弱,蛋白产生能力低。
B.增强免疫应答
1.双链RNA活化的丝氨酸/苏氨酸激酶(PKR)
本发明的方法可用于增强免疫应答。该方法利用了干扰素诱导的双链(ds)RNA活化的丝氨酸/苏氨酸激酶(PKR)在Ad-mda7诱导的凋亡中的作用。PKR是一种68kDa的丝氨酸/苏氨酸激酶,主要以潜伏的形式存在于哺乳动物细胞的胞浆内(Jagus等,1999)。位于氨基端的两个dsRNA结合区与dsRNA或其他活化因子相互作用使PKR的构象改变从而发生自身磷酸化和活化(Zhang等,2001;Vattem等,2001)。PKR一旦活化就能磷酸化各种靶底物,其中了解最多的eIF2α,它的磷酸化可以抑制蛋白的合成,抑制生长和诱导凋亡(Saelens等,2001;Sudhakar等,2000)。PKR在HeLa、Cos1、U937和NIH3T3肿瘤细胞内的活化可诱导凋亡和细胞死亡(Jagus等,1999)。另外,PKR敲除鼠来源的胚胎成纤维细胞(MEFs)对各种刺激因子如dsRNA、TNF-α和脂多糖诱导的程序性细胞死亡耐受(Der等,1997)。在本发明的某些实施方案中,MDA-7和/或编码MDA-7核酸可与干扰素合用来活化细胞内的PKR。这种组合物活化的PKR可导致PKR活性的升高。某些情况下的PKR活化可诱导靶细胞在体外或体内的凋亡。
PKR表达的上调可诱导各种肿瘤细胞系的凋亡。而且,对于脊髓发育不良来说,染色体5q上的IRF-1基因的关键性瘤性缺失明显与PKR水平的降低有关(Beretta等,1996),肺癌和结肠癌的免疫组化分析结果表明PKR的表达与生存期的延长有关(Haines等,1992)。PKR可通过多种信号转导通路的活化介导抗肿瘤形成活性,从而发挥抑制生长和诱导凋亡的作用。这些通路的活化发生在潜在的无活性同源二聚体形成之后,这种同源二聚体的形成是由于活化信号的诱导通过构象改变而发生自身磷酸化和活化(Vattem等,2001)。PKR一旦活化以后就能使各种靶底物磷酸化,这在生长调控和凋亡诱导中有很重要的作用(Saelens等,2001;Sudhakar等,2000)。免疫系统的刺激与凋亡有关(Albert等,1998;Chen等,2001;Saif-Muthama等,2000;Restifo等,2001)。另外,人工诱导的凋亡已被证明可增强疫苗的免疫原性,这是因为通过凋亡细胞的转染而活化的树突状细胞的刺激效应(Sasaki等,2001;Chattergoon等,2000)。几种病毒RNA可抑制PKR的活化(Kitajewski等,Cell 45:195-200(1986);Clarke等,Nucleic Acids Res.19:243-248(1991);Ghadge等,J.Virol.68:4137-4151(1994)),其他是有效的活化因子(Hovanessian,A.G.,J.Interferon Res.9:641-647(1989))。HIV-1mRNA转录子的TAR序列已被证明在低浓度时既可以活化(Edery等,Cell 56:303-312(1989);SenGupta等,NucleicAcids Res.17:969-978(1989);Judware等,J.Interferon Res.13:153-160(1993))又可以抑制(Gunnery等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8687-8691(1990))PKR的活化。
人(Meurs等,Cell 62:379-390(1990))和鼠的PKR(Feng等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5447-5451(1992);Baier等,Nucleic Acids Res.21:4830-4835(1993))都已被克隆出来并被测序,这两个cDNA具有高度的核苷酸序列一致性(Feng等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5447-5451(1992))。以前几个试验的结果显示PKR的RNA结合区位于激酶的N端部分(Feng等,1992;McCormack等,1992;Patel等,1994;Green等,1992;Patel等,1992)。尽管已经有试验表明PKR序列中几个富含正电荷的残基所在的短片段的缺失可以消除dsRNA诱导的PRK活化。美国专利6,326,466描述了一个不连续的PKR或氨基酸基序是结合调节性dsRNA所必须的,也是足够的(Feng等,1992)。另外,有试验表明PKR拮抗剂可用于治疗不成熟或细胞死亡有关的疾病,如HIV-1感染所导致的T细胞耗竭。
相反,在本发明的某些实施方案中也涉及了增强PKR表达的分子。给予该分子可升高宿主内的MDA-7水平并且可以增强宿主的免疫应答。因此,作为本发明的一个备选实施方案,有一种组合物包含具有增强PKR表达的生物活性的分子。在另外一个实施方案中,该分子是在给予免疫原性分子,如抗原,之前或之后提供的。这种具有增强PKR表达的生物活性的分子可以是干扰素。
申请人已经发现Ad-mda7可诱导和活化ds-RNA依赖的蛋白激酶(PKR),导致eIF-2α的磷酸化和肺癌细胞的凋亡。用丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂--氨基嘌呤(2-AP)处理可消除Ad-mda7诱导PKR活化、eIF2α磷酸化和凋亡。另外,无PKR的非野生型成纤维细胞对Ad-mda7诱导的凋亡耐受。这些数据说明PKR在Ad-mda7介导的凋亡中发挥关键作用。另外,PKR已被证明为一个重要的致瘤性调节因子,MDA-7诱导的PKR活化说明MDA-7在改善本领域现有的治疗、预测和诊断方法中具有重要价值。PKR的活化还可以增强参与免疫活化的许多分子的表达。因此Ad-mda7或其他方法诱导的PKR活化有利于增强抗致病因子的免疫应答。
2.线粒体渗透性转变
以前的研究已经表明免疫系统的刺激与凋亡有关(Albert等,2001;Chen等,2001;Saif-Muthama等,2000;Restifo等,2001)。另外通过肺癌患者的I期和II期临床试验证明将含野生型p53的腺病毒(Ad-p53)转移到肺癌中可诱导凋亡和细胞死亡。但不幸的是由于凋亡下游介质中某些分子的改变使某些患者对Ad-p53基因转移耐受。因此需要找到其他的基因来治疗对野生型p53基因转移耐受的肿瘤患者。Mda-7是一个新型的肿瘤抑制基因,试验证明它可以诱导p53敏感性和p53耐受性肿瘤细胞的凋亡,但是却不能诱导正常细胞的凋亡(Jiang等,1996;Su等,1998;Ekmekcioglu等,2001;Mhashilkar等,2001;Saeki等,2000)。
已经证实线粒体的活化和细胞色素c的释放是细胞发生凋亡的关键环节。一类促凋亡刺激因子(包括p53、BAX、BAK和星形孢菌素)依赖于线粒体膜电位(MMP)的变化,从而诱导线粒体渗透性转变(MPT)依赖的通道的开放。这些通道是一种跨越线粒体内外膜的多蛋白复合物。随着MMP的改变,细胞色素c和其他凋亡因子从线粒体内释放出来进入细胞浆。这类凋亡因子中细胞色素c通过MMT依赖的通道的释放可被环孢霉素A(CyA)和bonkregic acid阻断,因而抑制了凋亡和细胞死亡的发生。但是,其他诱导凋亡的因子如Bid可能不依赖于MMP的变化来释放细胞色素c,而是通过MPT非依赖的通道释放细胞色素c,这样就不会被CyA或bonkregic acid阻断。
试验证明MDA-7可通过MPT非依赖的通道诱导释放细胞色素c,这种释放不会被CyA阻断。p53敏感性和p53耐受性细胞内都可以发生这种独特的作用机制说明Ad-mda-7和Ad-p53发生作用的分子机制不同。Ad-mda-7如何通过MPT非依赖的通道诱导凋亡还不清楚,也许部分是由于外在的死亡受体通路的活化,如上述的FasL表达水平的升高。FasL可通过活化胱冬酶8作用于外在的死亡受体通路,从而导致Bid的断裂和线粒体的活化。Kim等(2000)也报道Bid不象BAK或BAX,它可以通过一个不依赖MPT依赖通道的通路诱导细胞色素c的释放。
Patae等(2002,已提交)证明腺病毒介导的MDA-7的过量表达可导致p53敏感性和p53耐受性肺癌细胞的快速凋亡。Ad-mda-7在线粒体内的作用机制好像是通过MPT非依赖的通道释放细胞色素c,进而活化处决者胱冬酶并裂解细胞。FasL的表达上调、胱冬酶8的活化和Bid的断裂说明Ad-mda-7优先通过外在的死亡受体通路活化线粒体并导致MPT非依赖的细胞色素c释放。而且,使用Ad-mda-7是一种治疗对Ad-p53和其他MPT依赖的细胞死亡过程耐受的肿瘤患者的新型方法。
3.β-联蛋白和PI3K信号通路
β-联蛋白和PI3K控制的信号通路都参与凋亡和细胞存活通路的调节以及细胞与细胞的粘附、迁移及转移的调节。已知这些信号通路中的某些通路在许多不同类型的肿瘤内都有遗传的或后天的改变,其中包括肺癌、乳腺癌和结肠癌(Lebedeva等,2002;Novak等,1999)。β-联蛋白是Wnt通路中一个关键的下游效应因子,可以结合和活化TCF/LEF家族中的转录因子引起TCF/LEF反应性基因的转录。β-联蛋白参与细胞-细胞的粘附、细胞内信号转导及转录的调节。在许多人的肿瘤中有β-联蛋白表达水平的升高,其中较显著的是结肠癌和胃癌。最近发现β-联蛋白表达水平的升高与人乳腺癌的不良预后有关。另外,某些推测出的β-联蛋白/TCF反应性基因,包括那些调节细胞周期进展及细胞分化能力丧失的基因如细胞周期蛋白D1、基质溶解因子和c-myc,以及这些基因的产物在乳腺肿瘤及表达活化的β-联蛋白的细胞系中的表达都有升高(McCormick F,1999)。这些现象说明致癌性的Wnt通路是通过β-联蛋白发挥作用的,参与乳腺增生及乳腺癌的发生和发展(Michaelson等,2001;Smalley等,2001)。另外,乳腺癌细胞内上皮细胞钙粘蛋白、APC和GSK-3β表达水平的下降和β-联蛋白表达水平的上升可导致β-联蛋白在核内的积聚,从而激活β-联蛋白-LEF/TCF信号通路(Yang等,2001)。在多种类型的肿瘤内参与Wnt/β-联蛋白通路信号传递的分子都有突变或异常调节。例如,多数结肠癌发生结肠腺瘤性息肉病相关基因(APC)的突变(Berrie C,2001)。APC可结合并促进β-联蛋白的降解,因此APC的突变会导致β-联蛋白的积聚。含有野生型APC的结肠癌内与β-联蛋白有关的基因发生突变,因此β-联蛋白对APC介导的降解耐受。因而β-联蛋白活性的增加是大多数(>80%)结肠癌以及其他组织来源的肿瘤的一个普遍特征(Easwaran等,1999;Peifer等,2000)。
在Wnt信号级联中,APC、轴蛋白、凝聚蛋白和GSK-3β组成破坏复合体,调节β-联蛋白的稳定性。在没有接受Wnt信号的细胞内,GSK-3β被认为可以磷酸化β-联蛋白,从而使后者被蛋白酶体降解。Wnt信号抑制GSK-3β的活性。因此β-联蛋白不再被磷酸化,因而积聚并与TCF/LEF形成核复合体,活化Wnt反应性基因如myc、细胞周期蛋白D1等(van Noort等,2002)。Ad-mda-7处理可增加肿瘤抑制基因如APC、GSK-3β和上皮细胞钙粘蛋白的表达水平,降低PI3K信号通路中原癌基因的表达水平。在Ad-mda-7处理的肿瘤细胞中,β-联蛋白游离到浆膜上,被阻止向核内转移,最终抑制了生长促进基因的转录活性。
上皮细胞钙粘蛋白的表达和调节是控制肿瘤进展和生长的重要因素。Ad-mda-7诱导的上皮细胞钙粘蛋白表达的上升在阻止β-联蛋白向核内转运的机制中发挥关键作用。利用人肿瘤标本进行相关的试验,以及利用培养的肿瘤细胞和转基因鼠模型进行的功能试验表明上皮细胞钙粘蛋白的丢失有时与上皮肿瘤的发生有关。尽管这种“概念蛋白开关”的功能还不清楚,但是最近的研究证明钙粘蛋白可与酪氨酸激酶受体相互作用,提示钙粘蛋白表达的变化不仅可以调节肿瘤细胞的粘附,还可以影响信号转导进而改变肿瘤细胞的表型(Parker等,2001)。
对磷酸肌醇3激酶(PI3Ks)在信号转导、细胞骨架的重排及膜交换中的作用的了解是相当广泛的。有证据表明PI3K超家族的成员及PI3K信号通路中的成分对于人的许多肿瘤的发展起重要作用。已知这个复合通路参与细胞生长、分化、迁移、增殖和存活的调节,因此PI3K通路中的成分就成为控制肿瘤细胞生长和扩散的潜在靶位(Fry MJ,2001)。试验证实PI3K信号通路的抑制可作为抑制肿瘤细胞增殖的有效方法(Katso等,2001;Cavallaro等,2002)。
PI3K在各种细胞功能的调节中发挥重要作用,如生长、存活以及恶变。PI3K本身具有癌基因活性和活化其他信号蛋白如癌蛋白的能力。PI3K的抗凋亡效应是通过活化其他信号通路的蛋白如蛋白激酶B(Akt/PKB)和/或PKB依赖的酶(GSK-3β、ILK-1)而实现的。PI3K在细胞的恶性变中扮演关键角色,可与某些病毒或细胞癌蛋白(src,ras,rac,T-antigen,etc.)形成复合物,这些癌蛋白只有在PI3K存在的情况下才有恶性转化活性。试验证实Ad-mda-7能直接抑制PI3K的功能,也能抑制PI3K调节的其他原癌基因的功能(Mhashilkar等,2002,已提交)。Ad-mda-7编码一个新型的肿瘤抑制基因,可以上调其他肿瘤抑制基因如上皮细胞钙粘蛋白、GSK-3β、APC和PTEN的表达。尤其重要的是,Ad-mda-7转导肿瘤细胞可明显下调癌蛋白如PLC-γ、PI3K、Akt、FAK和β-联蛋白的表达(图15)。生长因子、整合素和其他配基与不同的膜受体结合后产生信号传递的过程中,会产生一个分子事件的复合级联反应。配基与受体的结合可活化PLC-γ→FAK→PI3K→Akt级联,最终导致基因表达的从新开始。Ad-mda-7可下调这个级联中各个成员的表达。肿瘤抑制因子PTEN可阻断FAK、PI3K和Akt信号传递。因此,Ad-mda-7对这些信号分子的作用可以通过PTEN上调这些分子的表达来解释。然而,Ad-mda-7也可以下调PLC-γ的表达,这不是由PTEN调节的。因此,MDA-7可能对PLC-γ和PTEN上游的分子起作用。Ad-mda-7通过活化β-联蛋白和PI3K通路中的分子发挥其在肺癌和乳腺癌细胞中抗增殖效应。已经证实癌基因的活化可导致β-联蛋白和PI3K通路中的分子之间相互作用。例如,β-联蛋白可被PI3K的p85-α亚单位稳定。另外,由于β-联蛋白在细胞核内的固定而活化的细胞周期蛋白D1可被Wnt-1和ILK信号通路调节,ILK对细胞周期蛋白D1的诱导包括乳腺上皮细胞内的CREB信号通路(Woodfield等,2001;D’Amico等,2000)。
试验证明Ad-mda-7可通过增加乳腺癌细胞和肺癌细胞内肿瘤抑制蛋白稳定态的水平以及降低癌蛋白的表达水平来调节β-联蛋白和PI3K信号通路。某些试验结果清楚地表明β-联蛋白和PI3K信号通路是相对富余的,但是Ad-mda-7可以协调地调节这些信号通路的多个成员以发挥抗增殖、凋亡及抗转移表型的作用。Ad-mda-7的转染可引起β-联蛋白在细胞核及浆膜上的从新分布,这样就可以调节细胞-细胞之间的粘附作用和细胞内的信号传递从而有效地抑制肿瘤细胞的转移扩散(Mhashilkar等,2002,已提交)。
4.G2细胞周期调控
试验表明利用复制缺陷型的腺病毒过量表达MDA-7可导致许多类型的肿瘤发生生长抑制和凋亡,其中包括黑色素瘤、成胶质细胞瘤、骨肉瘤、以及乳腺癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌和前列腺癌,但是不包括正常的人上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞(Jiang等,1996;Su等,1998;Madiredi等,2000;Saeki等,2000;Mhashilkar等,2001)。另外还有报道显示MDA-7介导的肿瘤抑制是通过胱冬酶级联和/或PKR的活化、促凋亡蛋白(BAX,BAK)和抗凋亡蛋白(BCL-2,BCL-XL)比例的改变和/或处于G2/M期的细胞增加诱导的(Saeki等,2000;Lebedeva等,2002;Pataer等,2002)。
MDA-7是两个异源二聚体受体的配基,IL-22R1/IL-22R2和IL-20R1/IL-20R2。MDA-7与这些受体的结合可导致Jak-Stat通路的活化(Dumoutier等,2001;Wang等,2002;Kotenko等,2000)。Jak1和Tyk2是酪氨酸蛋白激酶Jak家族的成员,可与细胞因子的受体相互作用并活化之,其中包括IL-10(Aringer等,1999)。IL-10通过Jak1和Tyk2激酶活化Stat1或Stat3(Kotenko等,2000)。
前炎症细胞因子-肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可通过胱冬酶级联、JNK通路和IKK/NF-κB之间的相互作用诱导肿瘤抑制和凋亡。另外它还可以诱导BAX-BAK的相互作用,在免疫应答的调节中扮演重要角色(Baud等,2001,Wang等,1998;Sundararajan等,2001)。TNF-α通过与1型和2型受体(TNF-R1和TNF-R2)的相互作用产生生物学活性,活化多种类型细胞内的多个信号通路(Tartaglia等,1992)。TNF-R1信号复合体是由三聚体的受体、TNF-R1结合死亡域蛋白(TRADD)、FAS结合死亡域蛋白(FADD)、TRAF2以及受体相互作用蛋白(RIP)组成的(Locksley等,2001)。FADD可补充和活化胱冬酶原8,启动凋亡通路,其中胱冬酶3和胱冬酶7是两个主要的效应胱冬酶(Muzio等,1996;Cryns等,1998)。活化的胱冬酶8也可以裂解Bid(BHS作用域死亡激动剂),使细胞色素c从线粒体内释放诱导凋亡(Li等,1998;Green等,1998)。与此相对应的是,TRAF2和RIP参与c-Jun N-端激酶(JNK)和IKK的活化,结果分别导致c-Jun和NF-κB的活化(Ashkenazi等,1998)。尽管JNK/c-Jun活化对TNF-α-诱导的凋亡的影响还不十分清楚,但是在多数类型的细胞内IKK和NF-κB的活化可抑制TNF-α诱导的凋亡(Ahkenazi等,1998)。IKK/NF-κB通路所产生的保护作用在TNF-α诱导的凋亡中不起作用,这是因为在TNF-α诱导的凋亡过程中IKK是被胱冬酶3相关的胱冬酶蛋白酶解(Tang等,2001)。这些靶蛋白组成TNF-α诱导的凋亡的信号通路,显示与MDA-7诱导的凋亡信号通路相似,都是通过胱冬酶级联的活化、NF-κB的抑制和JNK的活化。这说明TNF-R1作为TNF-α的受体之一是MDA-7配基的关键部分。
已有报道显示MDA-7通过抑制Cdc25C通路诱导细胞停滞在G2/M期(Saeki等,2000;Lebedeva等,2002;Ekmekcioglu等,2001;Peng等,1997)。MDA-7对Cdc25C的抑制可以导致Chk1和Chk2的基础水平下降,二者是由DNA损伤诱导的(Peng等,1997)。p53的状态也可能与MDA-7诱导的G2期停滞细胞增加有关,因为在G1期停滞时活化的p21和p27在含野生型p53的LNCaP细胞内被激活,而在含突变型p53的DU145细胞内不被激活。另外,LNCaP细胞处于G2期的百分率比Du145细胞低很多(Toyoshima等,1994)。PKR还可以促进G2期停滞,因为PKR在DU145细胞内而不是LNCaP细胞内被活化,而且已有报道显示PKR的活化可诱导G2/M停滞(Dagon等,2001;Zamanian-Daryoush等,1999)。另外,Saito(2002,已提交)研究证实cdc2、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1在IFN-E和密执霉素(MEZ)诱导的G2/M期停滞中的表达模式与以前所报道的细胞周期基因的表达模式一致(Tang等,2001)。Ad-mda-7导致的G2停滞好像不被DNA损伤或DNA复制的抑制所诱导,因为含突变或缺失p53的DU145和PC细胞内检测不到非整倍体或多倍体染色体(Tsuiki等,2001;Cross等,1995)。这些结果说明MDA-7可通过抑制Cdc25C通路直接诱导G2期停滞。
TNF-α的这些效应器功能好像与MDA-7的相似。因此,Ad-MDA-7可通过胱冬酶级联、Jak-Stat和JNK通路的活化以及IKK/NF-κB的抑制诱导前列腺癌细胞生长抑制和选择性凋亡,通过抑制Cdc25C通路诱导细胞停滞于G2期(Saito,2002,已提交)。
5.分泌型MDA-7具有抗肿瘤形成活性
MDA-7的过量表达可抑制多种类型肿瘤细胞在体内和体外的生长。最近报道了一种分泌型的MDA-7(sMDA-7),是一种肿瘤形成的强力抑制因子。Ramesh等(2002,已提交)已经证实在体外sMDA-7可抑制内皮细胞的分化(微管形成)和内皮细胞向内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的迁移。而且,sMDA-7的抗内皮细胞血管形成活性通常是由IL-22受体(IL-22r)介导的,如加入sMDA-7蛋白后可活化信号转导子和转录活化子(STAT-3)所提示的。IL-22r的阻断抗体与sMDA-7共同使用可取消对微管形成的抑制。sMDA-7在体内可阻断基质胶试验中的肿瘤血管形成,血管化程度降低,血红蛋白含量减少。sMDA-7的抑制活性比相同浓度的重组内皮抑制素高25倍。人肺癌细胞与稳定表达MDA-7的293细胞的体内混合试验(1∶1)表明可显著抑制肿瘤的生长和血管形成。另外,sMDA-7的系统给药可抑制鼠异种移植模型中肺癌的体内生长。肿瘤微血管密度的减少和血红蛋白含量的下降说明肿瘤的抑制是因为sMDA-7的抗血管形成活性。这说明胞内形式的MDA-7的肿瘤抑制活性是通过直接杀伤肿瘤细胞来介导的,而分泌型MDA-7的肿瘤抑制活性是由抑制血管形成来介导的。这些结果证明可以开发以MDA-7为基础的治疗措施来治疗原发肿瘤及其转移瘤,这是因为它们不仅可以作用于肿瘤细胞,而且可以作用于肿瘤的血管(Ramesh等,2002,已提交)。
将mda-7基因导入各种类型的肿瘤细胞内都可以抑制其在体外和体内的生长,而对于正常细胞的毒性却很小(Su等,1998;Saeki等,2000;Mhashilkar等,2001;Saeki等,待发表;Dumoutier等,2001)。这种抗肿瘤活性归功于MDA-7蛋白的过量表达。最近的试验表明糖基化的MDA-7可在体外分泌(Madireddi等,2000;Jiang等,1996;Saeki等,待发表;Dumoutier等,2001)。尽管MDA-7的分泌及其与两个不同受体的结合已有报道,但是sMDA-7蛋白在肿瘤中的功能意义还未作评价(Madireddi等,2000;Rich等,2001)。已知sMDA-7在人PBMC中的功能是作为原-Th1细胞因子,引起IFN-γ、IL-6和TNF-α的表达(Caudel等,待发表)。在最近的研究中,Ad-mda-7抑制内皮细胞分化和降低Ad-mda-7处理的异种移植肺肿瘤的血管密度的能力已被确证(Saeki等,2000;Wang等,2002)。MDA-7的抗肿瘤活性和细胞因子活性是与其他Th1型细胞因子如IL-12和IFN-γ所观察到的是一致的(Ekmekcioglu等,2001;Ellerhorst等,2002;Huang等,2001)。
Ramesh等(2002,已提交)的试验表明sMDA-7在体内和体外都有很高的抗血管形成活性,sMDA-7可抑制肿瘤在小鼠体内的生长。另外,sMDA-7不能反转分化的内皮细胞的表型,但是可以阻断分化的起始,与IFN-γ对内皮细胞的效应相似(Lebedeva等,2002;Maheshwari等,1991)。除了对微管形成的抑制效应以外,sMDA-7还可以阻断内皮细胞的迁移,这种效应其他抗血管形成药物如内皮抑制素和乳腺丝抑蛋白也有(Pataer等,2002;Madireddi等,2000;Zhang等,2000)。比较sMDA-7和重组人内皮抑制素对微管形成的抑制活性发现相同浓度的sMDA-7所产生的效应至少比内皮抑制素高25倍。据推测sMDA-7比内皮抑制素的活性高可能是因为sMDA-7产生抗血管活性只需要极低的浓度,过量表达的sMDA-7可直接抑制肿瘤的生长。因此MDA-7的这种双重功能使其成为一种独特的治疗药物(Ramesh等,2002,已提交)。
也有试验表明sMDA-7的抗血管形成活性是受体介导的,包括信号转导通路和转录因子-3(STAT-3)的活化。受体介导的抗血管形成活性也见于IFN-γ和血小板反应蛋白(Fickenscher等,2002;Jimenez等,2000)。最近已经报道了内皮抑制素的受体(Joki等,2001)。PKR作为Ad-mda-7介导的凋亡的关键介质已被Pataer等(2002)证明。但是,在同一个试验中,PKR在内皮细胞内的表达水平好像是不变化的,因此排除了sMDA-7的抗血管形成活性是PKR介导的可能性(Pataer等,2002)。
MDA-7可以较早地作用于分化程序,因为它对去分化的内皮细胞不起作用。另外,mda-7基因被认为在黑色素瘤细胞的分化过程中是上调的(Jiang等,1995)。MDA-7蛋白表达的丢失与肿瘤的侵袭性密切相关,在肿瘤发展的过程中MDA-7蛋白逐渐丢失,从而肿瘤的分化程度逐渐降低(Ellerhorst等,2002;Jiang等,1995)。因此,MDA-7在调节黑色素瘤和内皮细胞的分化过程中起关键作用。这说明mda-7可有效治疗原发癌和转移癌。
6.MDA-7的肿瘤抑制活性是由细胞内的蛋白介导的
MDA-7诱导各种不同类型的肿瘤的凋亡,并释放出可溶性的MDA-7蛋白产物。将含可溶性MDA-7蛋白的MDA-7表达细胞的上清液直接转移到原发肿瘤中却发现不能诱导旁观者介导的凋亡。共培养试验也得到了同样的结果。试验证明Ad-mda7(含mda-7肿瘤抑制基因的腺病毒载体)对正常细胞的毒性很小,但却可以快速诱导各种肿瘤细胞系发生高水平的凋亡。Ad-mda7转导的肿瘤细胞可在胞内表达高水平的MDA-7蛋白并且可以分泌一种可溶性的糖基化的蛋白,其分子量比胞内的MDA-7高。这些可溶性蛋白可以被纯化,但是其对肿瘤细胞的毒性是有限的。现在正在设计一个试验来确定如果细胞内的MDA-7靶向定位到特定的亚细胞结构,它的杀伤活性是否能得到提高。利用能使表达的蛋白靶向性地到达各种亚细胞结构的载体构建出了几个mda-7的质粒构建体。mda-7 cDNA被人工删除了分泌信号序列,因此构建出的mda-7表达载体可使表达的蛋白定位到胞浆、细胞核或内质网(ER)中。另外,包含分泌信号的全长mda-7 cDNA被亚克隆到胞浆骨架中。这种靶向性载体通过转染到肺癌细胞内评价其MDA-7蛋白的表达,通过Western印迹分析发现所有的载体都可以表达高水平的胞内MDA-7。亚细胞结构靶向性的MDA-7蛋白表达是通过免疫组化方法确定的。利用流式细胞术和克隆形成试验,靶向性MDA-7杀伤肿瘤细胞的能力得以评价。胞浆和细胞核mda-7构建体不能诱导细胞死亡,而全长的MDA-7(分泌型)具有细胞毒性。ER靶向性的mda-7构建体也能诱导肿瘤细胞的死亡。因此从这些数据中可以得到几个结论。首先,MDA-7是一种具有肿瘤抑制活性和细胞因子活性的分子。MDA-7在亚细胞结构内的定位可影响细胞的反应,胞内MDA-7诱导的凋亡需要进入分泌通路。最后,MDA-7可从ER中激发信号从而导致细胞发生程序性死亡和胞浆应激分子的活化。另外,已有试验证明定位到线粒体的MDA-7蛋白与全长的MDA-7蛋白相比可引起死亡细胞的增加。因此,进入线粒体的靶向性MDA-7还可以增强其抗肿瘤活性和抗凋亡效应。
7.判断候选患者预后的方法和组合物
因而,本发明涉及一种增强免疫应答的新方法。在某些实施方案中,本发明涉及用于预测候选患者的预后以确定是否适合进行免疫治疗的方法和组合物。候选患者给予或共同给予MDA-7多肽,然后测定其诱导的免疫应答。本领域的技术人员应该熟知测定免疫应答的方法,在下面的部分讨论了一些非限定性的例子。对免疫应答的检测显示患者是免疫应答的良好候选者是指该患者可以各种方式受益于免疫治疗。在特殊的实施方案中,免疫治疗是指给予候选患者以本发明的组合物。
在其他的实施方案中,本发明包括诊断或预后试验以确定受体是否能产生抗免疫原性分子的免疫应答。加入MDA-7可以检测到不加MDA-7时所观察不到的免疫应答。在另一个实施方案中,诊断或预后试验用于确定受体内的T细胞、NK细胞或巨噬细胞的活性是否升高。在另外一个实施方案中,诊断或预后试验用于确定受体内的细胞因子浓度是否升高。在上述各种试验中,如果得到肯定的答案,则本发明包括利用文本所描述的组合物来激发免疫应答。在其他的实施方案中,出现免疫应答或被诱导出免疫应答的受体用本发明的方法治疗以增强其免疫应答。
在某些实施方案中,组合物和方法涉及增加一种相对较新的肿瘤治疗途径:生物治疗,也称为免疫治疗、生物治疗或生物反应调节治疗。免疫治疗可刺激肌体产生直接或间接抗肿瘤的天然免疫系统,或者降低某些肿瘤治疗措施所产生的副作用。
在本领域中已知免疫系统是一个复杂的细胞和器官网络,这些细胞和器官一起使肌体抵抗外源或非自身入侵者的攻击。这个网络是肌体抵抗疾病的一个主要系统。免疫系统保护肌体所用的一个机制是识别健康细胞和外源细胞的区别然后清除外源细胞。当免疫系统的完整性部分或全部降低时就会产生肿瘤。
肿瘤已经成为西方世界死亡的主要因素,仅次于心脏病。据估计目前在美国有三分之一的人会患癌症,五分之一的人会死于癌症。肿瘤可被视为失去正常生长调节机制的细胞。利用裸DNA或非病毒载体的核酸免疫或疫苗已在肿瘤和感染疾病的动物模型中取得了相当的成功。但是,这些研究与人的临床试验所取得的结果不相吻合,在核酸免疫的临床试验中所观察到的免疫诱导/增强通常都是很有限的。本发明描述了一种通过共注射mda-7基因或MDA-7蛋白来增强人体内免疫诱导的方法,该方法可激发天然的免疫应答,活化PKR,因而可以增强抗外源目的基因或目的蛋白产物的免疫应答。本发明的其他实施方案包括细胞因子如干扰素(即IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ)与MDA-7或编码MDA-7的核酸共同注射的方法和组合物。本发明的新方法可提高现有的免疫治疗的效果。
本发明涉及本领域已知疫苗的利用,优选那些免疫诱导能力低的疫苗,以及增强抗各个疫苗的免疫应答。肿瘤疫苗是另一种形式的免疫治疗。感染疾病如麻疹、腮腺炎和破伤风的疫苗是有效的,因为这些疫苗可使肌体的免疫细胞暴露到位于感染物质表面的弱抗原上。这样就可以使免疫细胞产生较多的浆细胞,后者可产生抗体。T细胞识别感染物质后也可增殖,并且一旦活化后就可以产生记忆。因此当感染物质再次进入肌体时,免疫系统内的细胞就已经产生并对感染发生反应,然后阻止这种感染。
肿瘤疫苗可帮助患者的免疫系统识别肿瘤细胞。这些疫苗可帮助肌体排斥肿瘤并阻止肿瘤的复发。与抗感染疾病的疫苗不同,肿瘤疫苗是在疾病确诊后注射的,而不是在疾病发生前。当肿瘤很小时就给予肿瘤疫苗可以根除肿瘤。例如,给患者注射以防止皮肤癌复发的肿瘤疫苗已研制出来,目前正在进行临床试验(MelanA/MART1和gp100)。其他正在研究的肿瘤疫苗有Avicine,这是一种以抗原为基础的治疗措施,可治疗晚期结肠癌,以及一种含恶性B细胞特异性受体分子的基因工程融合蛋白,可用于治疗和防止淋巴瘤的复发。其他可作为肿瘤疫苗靶位的肿瘤包括肾癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
抗体如Herceptin和Rituxan可用于免疫治疗。Herceptin被用于治疗产生过量HER-2的转移乳腺癌。Rituxan用于治疗复发的或对化疗不敏感的B细胞非霍奇金氏淋巴瘤。
在本发明中,给予免疫原性分子如恶性B细胞特异性的受体分子可在患者体内诱导抗该受体分子的免疫应答。再给予MDA-7多肽可以增强这种免疫应答,因此可以提高免疫治疗的效率,降低达到治疗效果所需要的剂量。在这种情况下,受体分子含有来源于肿瘤特异性表位或肿瘤相关表位的肽。表位就是指含有抗原的抗原决定簇。本发明所用的抗原可以有一个或多个表位,其中至少一个表位是免疫原性的,以及/或是可以诱导免疫应答的。注射的肽可连接到载体蛋白上以便于转移到体内。在其他的实施方案中,肽可以连接到MDA-7多肽上。
对于癌性肿瘤来说,联合治疗包括了给予肿瘤疫苗和编码MDA-7多肽的核酸,给药的时间可在常规治疗如肿瘤切除、化疗和放疗之前、之后和之间。如果在切除肿瘤后进行免疫治疗,编码MDA-7和/或免疫原性分子的表达构建体和载体可注射到肿瘤床内。
在某些实施方案中,核酸是包含在病毒载体或非病毒载体内。在其他的实施方案中,含mda-7的组合物位于胶体悬液中,如脂质体、乳液或类蛋白。
尽管没有关于这些构建体操作性的特定原理可以遵循,但是MDA-7与IL-10的某些氨基酸具有明显同源性,并且其位于C端的D螺旋区在不同物种之间具有保守性,可能是受体结合区。因此优选含有这个30-35氨基酸区域的分子。
在某些实施方案中,本发明包括通过提供有效量的MDA-7以增强抗共注射的免疫原性分子的免疫应答的方法。下列现象表明免疫应答的增强:细胞因子表达或活性的升高、T细胞或T细胞群(例如,辅助T细胞、细胞毒T细胞、NK细胞)的增殖、B细胞或B细胞群的增殖、细胞毒T细胞的活化以及抗体的产生。
在本发明的某些实施方案中,也可以提供抗原以诱导抗该抗原的免疫应答,在这种实施方案中,接受抗原的宿主具有免疫系统。抗原可以是肿瘤抗原、微生物抗原、病毒抗原或真菌抗原,以及上述物质的混合物。在某些特殊的实施方案中,抗原是肿瘤抗原,如PSA,CEA,MART,MAGE1,MAGE3,gp100,BAGE,GAGE,TRP-1,TRP-2,AFP,muc1,NY-ESO,bcr-abl或PMSA。
本发明的其他实施方案涉及加快或促进康复的方法,或者降低创伤性治疗所导致的损伤的方法,创伤性治疗是指引起正常细胞损伤的治疗方法。这种损伤可导致中性粒细胞减少、贫血、血小板减少以及淋巴细胞减少。在某些实施方案中,创伤性治疗是指化疗和/或放疗。MDA-7可给予将要实施、正在实施或已经实施了创伤性治疗的患者。MDA-7可在治疗前、治疗后或治疗过程中提供,优选免疫治疗。
在某些实施方案中,增强免疫应答的方法包括通过给予细胞或患者有效量的MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸以诱导干扰素或白细胞介素如IL-6、干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达,从而诱导免疫增强分子如IL-6、IFNγ或TNFα的产生。另外也可以提供外源的或重组的干扰素或白细胞介素(即不是由经处理的细胞或患者所产生的干扰素或白细胞介素)。
本发明的另外一个目的涉及通过提供分子和MDA-7来增强抗该免疫分子的免疫应答的方法,其中MDA-7是通过给受体注射表达构建体的方式提供给受体的,表达构建体含有至少编码SEQ ID NO:2的10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200或206个连续氨基酸的核酸,其中核酸被置于控制转录的启动子的调控之下。本文已讨论了许多启动子,都可用于本发明中,但是本发明并不限于这些启动子。在某些特殊的实施方案中,表达构建体是病毒载体。病毒载体包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体和多瘤病毒载体。
受体可以不止一次地注射MDA-7、免疫原性分子或者某些特定实施方案中的细胞因子(即干扰素),比如两次、三次、四次或更多次。MDA-7、免疫原性分子或者某些特定实施方案中的细胞因子(即干扰素)可以同时给予或在不同的时间给予。而且这些化合物可以通过静脉注射、直接注射、腹腔注射、局部注射、全身注射或口服提供给受体。
本发明的某些实施方案涉及治疗肿瘤的方法,该方法可以使肿瘤缩小或降低肿瘤的生长速度,该方法包括给予患者免疫原性分子,其中免疫原性分子可在患者体内诱导免疫应答;给予患者以有效量的MDA-7多肽,其中MDA-7多肽可增强所诱导的免疫应答,与单纯用免疫原性分子治疗相比可以缩小肿瘤。在这种实施方案中,MDA-7多肽可以被认为是治疗的佐剂。MDA-7多肽也可以和上述已讨论的本领域已知的其他佐剂联合使用。在各个实施方案中,MDA-7多肽都可以和干扰素如IFN-α、IFN-β或IFN-γ联合使用。
在其他的实施方案中,各种癌性状态的治疗方法都包括在本发明的范围内。例如,黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、白血病、神经母细胞瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑瘤、结肠癌和膀胱癌。一般来说,本发明的组合物和方法直接用于治疗各种肿瘤,可从增强的免疫应答中受益。
在某些实施方案中,MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸可与细胞因子或编码细胞因子的核酸一起使用。细胞因子包括而不限于:干扰素α(登录号为E00175和CAA23798,本文已纳入作为参考)、干扰素β(登录号为M28622和AAA36040,本文已纳入作为参考)或干扰素登录号为X13274和CAA31639,本文已纳入作为参考)(Allen和Fantes,1980;Lawn等,1981;Diaz等,1993;本文都已纳入作为参考)。细胞因子可调节脊椎动物体内的细胞增长、分化及免疫防御。干扰素(IFN)家族是一类独特的细胞因子,包含分泌型的多功能蛋白。IFNs是脊椎动物抗病毒、抗细菌以及抗寄生虫感染的成分,也是防御某些肿瘤的成分。它们通过诱导各种蛋白的合成来发挥其活性。有几个直接或间接的证据表明这些蛋白中的某些蛋白具有肿瘤抑制活性。本发明适用的干扰素诱导的蛋白包括而不限于:(i)双链RNA活化的蛋白激酶,它可被磷酸化进而灭活真核细胞肽链起始因子eIF-2;(ii)干扰素调节因子IRF-1和IRF-2,它们可以调节干扰素以及某些干扰素可诱导蛋白的表达;以及(iii)RNA酶L,这是一个可被(2’-5’)寡聚腺苷酸活化的潜在的内源性核糖核酸酶,也是一种干扰素可诱导的酶家族的产物。本发明的组合物和方法可与干扰素或编码干扰素的核酸联合使用。其他的实施方案包括活化PKR的组合物和方法。某些类型的细胞如肿瘤和其他过度增殖的细胞内的PKR活化一般都可诱导凋亡。因此,MDA-7和IFN联合使用的方法和组合物可作为一种治疗方式来增强免疫应答,以及一种抗肿瘤方法。利用干扰素的组合物和方法可见美国专利Nos.6,379,701、6,372,218、6,350,589、6,331,525、6,250,469、6,207,145、6,204,022和6,177,074所描述的例子,本文都已纳入作为参考。
C.基因转移
本发明的组合物和方法用于给予患者本发明的组合物和方法。
1.病毒转化
a.腺病毒感染
转移重组DNA的一个方法涉及腺病毒表达载体的应用。尽管腺病毒载体整合到基因组DNA效率很低,但是这一缺点被其基因转移的高效率所掩盖。“腺病毒表达载体”是指那些含腺病毒序列的载体,这些腺病毒序列足以(a)支持构建体的包装以及(b)最终使克隆到其中的重组基因得以表达。
载体是经基因工程改造的腺病毒。根据腺病毒的基因结构我们知道腺病毒是一个36kb的线性双链DNA病毒,它允许长达7kb的外源序列替换腺病毒DNA的大片段(Grunhaus和Horwitz,1992)。与逆转录病毒不同的是,腺病毒感染宿主细胞不会导致染色体的整合,因为腺病毒DNA是以游离体的方式进行复制,没有潜在的遗传毒性。另外,腺病毒结构稳定,大量扩增后也没检测到基因组重排的发生。
腺病毒特别适于作为基因转移的载体,因为它具有中等大小的基因组、易于操作、高滴度、靶细胞范围广以及很高的感染性。病毒基因组的两端各含有一个100-200碱基对的反向重复序列(ITRs),这是病毒DNA复制和包装所必须的顺式作用元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区含有不同的转录单位,二者被一组病毒DNA复制子分开。E1区(E1A和E1B)编码调节病毒基因组以及少数几个细胞基因转录的蛋白。E2区(E2A和E2B)的表达可导致参与病毒复制的蛋白质的表达。这些蛋白参与DNA的复制、晚期基因的表达和宿主细胞的关闭(Renan,1990)。晚期基因的产物,其中包括大多数病毒外壳蛋白,只在主要晚期启动子(MLP)驱动的单个初级转录子经有意义的处理后才得以表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染的后期效率特别高,这个启动子所控制的所有mRNA都含有一个5-三联前导序列(TPL)序列,该序列可调控mRNA的翻译。
在现有的系统中,重组腺病毒是通过穿梭载体与原病毒载体之间的同源重组制备的。由于两个原病毒载体之间可能发生重组,因此在这个过程中可能会产生野生型腺病毒。因此,关键的是从每个噬菌斑中分离出单个病毒克隆,然后检验其基因组结构。
现有的腺病毒载体是复制缺陷型的,其制备和传播依赖于独特的辅助细胞系,称为293细胞,该细胞是通过Ad5DNA片段转化人胚胎肾细胞而得到的,可以表达E1蛋白(Graham等,1977)。由于腺病毒基因组中的E3区是可有可无的(Jones和Shenk,1978),现有的腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1区、D3区或者两个区内携带外源DNA(Graham和Prevec,1991)。天然的腺病毒大约包装105%的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等,1987),可以插入约2kb的外源DNA。由于E1区和E3区中有大约5.5kb的DNA可被替代,因此现有腺病毒的最大容量在7.5kb以下,或者约占载体总长度的15%。80%以上的腺病毒基因组必须保留在载体骨架内。
辅助细胞可来源于人的细胞,如人胚胎肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或其他类型的人胚胎间质细胞或上皮细胞。另外,辅助细胞也可以来自于其他哺乳动物的细胞,只要这些细胞可感染人的腺病毒。这类细胞包括Vero细胞或其他类型的猴胚胎间质细胞或上皮细胞。如上所述,最常用的辅助细胞是293细胞。
Racher等(1995)描述了一种培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法。一种方式是通过将单个细胞接种到1升的硅化培养板(Techne,Cambridge,UK)中使天然细胞的聚集物生长,培养板中含有100-200ml培养基。以40rpm的速度搅拌猴通过台盼蓝染色估计细胞的存活率。在另一种方式中,按照如下方法使用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin,Stone,UK)(5g/l):将悬浮在5ml培养基中的细胞接种物加到250ml Erlenmeyer培养板的载体(50ml)内,保持静止1到4小时,并偶尔搅拌。然后用50ml新鲜的培养基替换原来的培养基并开始振荡。为了制备病毒,使细胞生长到约80%融合,此后再替换培养基(总体积的25%),然后加入MOI为0.05的病毒。培养物静止过夜,然后将体积增加到100%,开始振荡72小时。
腺病毒可以是复制缺陷型的,或者至少在某些条件下是复制缺陷型的,腺病毒载体的特性被认为不是成功实现本发明的关键。腺病毒可以是已知的42种不同血清型或A-F亚组中的任何一个。C亚组中的5型腺病毒是常用的起始材料以便于获得本发明可用的条件复制缺陷型腺病毒载体。这是因为5型腺病毒是一种大量生化信息和基因信息已知的人腺病毒,在利用腺病毒作为载体的构建过程中已经被大量采用。
如上所述,根据本发明典型的载体都是复制缺陷型的并且不含腺病毒的E1区。因此,将转化构建体插入到E1编码序列被删除的位置上是最方便的。但是,腺病毒序列内构建体插入的位置不是本发明的关键。编码目的基因的多聚核苷酸也可插入到E3替代载体的E3删除区,如Karlsson等(1986)所描述,或者E4区,其中辅助细胞系或辅助病毒可补充这个E4缺陷。
腺病毒的扩增和操作方法是本名誉技术人员所熟知的,腺病毒在体内和体外都有很宽的宿主范围。这组病毒可以获得很高的滴度,如可达到每毫升109-1011噬菌斑形成单位,并且具有较高的感染性。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主基因组中。腺病毒转导的外源基因可以是游离体,因此对宿主细胞的遗传毒性很低。据报道用野生型腺病毒进行免疫没有任何副作用(Couch等,1963;Top等,1971),说明腺病毒具有很高的安全性和治疗价值,可以作为体内基因转移的载体。
腺病毒载体已被用于真核细胞的基因表达(Levrero等,1991;Gomez-Foix等,1992)和疫苗的研制(Grunhaus和Horwitz,1992;Graham和Prevec,1992)。动物试验表明重组腺病毒可用于基因治疗(Stratford-Perricaudet和Perricaudet,1991;Stratford-Perricaudet等,1990;Rich等,1993)。重组腺病毒可通过各种方式给予不同的组织,其中包括气管滴注(Rosenfeld等,1991;Rosenfeld等,1992)、肌肉注射(Ragot等,1993)、外周静脉注射(Herz和Gerard,1993)以及立体定向地接种到脑内(Le Gal La Salle等,1993)。
b.逆转录病毒感染
逆转录病毒是一组单链RNA病毒,其特点是可以在感染细胞内通过逆转录过程将其自身的RNA转录成双链DNA(Coffin,1990)。所得到的DNA能以前病毒的形式稳定地整合到细胞染色体内,指导病毒蛋白的合成。病毒的整合会导致病毒的基因滞留在受体细胞及其子代细胞内。逆转录病毒基因组含有三个基因:gag、pol和env,分别编码外壳蛋白、聚合酶和包膜成分。gag基因上游有一个序列含有一个基因组包装成病毒颗粒的所需要信号。两个长末端重复序列(LTR)分别位于病毒基因组的5’和3’末端。其中含有强启动子和增强子序列,也是整合到宿主细胞基因组内所必须的(Coffin,1990)。
为了构建逆转录病毒载体,将编码目的基因的核酸插入到病毒基因组内以替换某些病毒序列,构建出一个复制缺陷型的病毒。为了制备病毒颗粒,需要构建一个含有gag、pol和env基因但是不含有LTR及包装成分的包装细胞系(Mann等,1983)。当含cDNA的重组质粒与逆转录病毒的LTR和包装序列一起被导入到这个细胞系时(如通过钙磷酸盐沉淀法),包装序列就使重组质粒的RNA转录子包装成病毒颗粒,后者随后分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986;Mann等,1983)。收集含重组逆转录病毒的培养基,有选择地浓缩,然后用于基因转移。逆转录病毒载体可以感染多种类型的细胞。但是其整合和稳定表达需要宿主细胞能够分裂(Paskind等,1975)。
需要注意的是使用缺陷型逆转录病毒载体也很有可能在包装细胞内产生出有复制能力的野生型病毒,这可能是由重组事件导致的,其中gag、pol、env序列上游的重组病毒插入片段的完整序列可以整合到宿主基因组中。但是包装细胞的使用可以使重组发生的可能性大大降低(Markowitz等,1988;Hersdorffer等,1990)。
c.AAV感染
腺伴随病毒(AAV)是一种可用于本发明的诱人的载体系统,因为它的整合效率高、能感染非分裂的细胞,因此可用于将基因转移到组织培养物内的哺乳动物细胞内(Muzyczka,1992)。AAV具有很宽的宿主范围(Tratschin等,1984;Laughlin等,1986;Lebkowski等,1988;McLaughl in等,1988),这就意味着它可用于本发明。有关rAAV载体制备和使用的详细描述见美国专利5,139,941和4,797,368,本文都已纳入作为参考。
利用AAV转移基因的试验包括LaFace等(1988);Zhou等(1993);Flotte等(1993);以及Walsh等(1994)所描述的。重组AAV载体已被成功地用于标记基因的体内和体外转导(Kaplitt等,1994;Lebkowski等,1988;Samulski等,1989;Shelling和Smith,1994;Yoder等,1994;Zhou等,1994;Hermonat和Muzyczka,1984;Tratschin等,1985;McLaughlin等,1988)以及转导人类疾病相关的基因(Flotte等,1992;Luo等,1994;Ohi等,1990;Walsh等,1994;Wei等,1994)。最近,利用AAV载体治疗囊性纤维化的I期临床试验已被批准。
AAV是一种依赖性的细小病毒,它需要与其他病毒共同感染(腺病毒或疱疹病毒的其他成员)以便在培养的细胞内产生增殖性感染(Muzyczka,1992)。如果缺少辅助病毒的共感染,野生型AAV基因组就会通过其末端整合到人的19号染色体上,以原病毒的形式潜伏其中(Kotin等,1990;Samulski等,1991)。但是rAAV所整合的对象不仅仅限于19号染色体,除非AAV Rep蛋白也表达(Shelling和Smith,1994)。如果携带AAV原病毒的细胞再感染辅助病毒,AAV基因组就会从染色体或重组质粒中“复活”,获得正常的增殖性感染(Samulski等,1989;McLaughlin等,1988;Kotin等,1990;Muzyczka,1992)。
一般来说,重组AAV(rAAV)病毒是通过共感染含目的基因的质粒制备的,目的基因的两侧是两个AAV末端重复序列(McLaughlin等,1988;Samulski等,1989;本文都已纳入作为参考),也可以与含野生型AAV编码序列的表达质粒共感染,其中AAV编码序列不含末端重复序列,如pIM45(McCarty等,1991;本文已纳入作为参考)。细胞也可以转染或感染腺病毒或携带AAV辅助功能所需要的腺病毒基因的质粒。以这种方法制备的rAAV病毒种子中所含有的腺病毒必须从rAAV病毒颗粒中分离出去(例如通过氯化铯密度梯度离心)。另外,含AAV编码区的腺病毒载体以及含AAV编码区和部分或全部腺病毒辅助基因的细胞系也可以使用(Yang等,1994a;Clark等,1995)。也可以使用携带整合原病毒形式的rAAV DNA的细胞系(Flotte等,1995)。
d.其他的病毒载体
其他的病毒载体也可用于构建本发明的构建体。病毒如痘苗病毒(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986;Coupar等,1988)和疱疹病毒来源的载体也可以使用。用它们转染各种哺乳动物细胞有几个吸引人的特征(Friedmann,1989;Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986;Coupar等,1988;Horwich等,1990)。
委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的一个分子克隆株经基因工程改造后成为一个复制完整型疫苗载体,可用于表达外源病毒蛋白(Davis等,1996)。试验证明VEE的感染可刺激很强的免疫应答,因此VEE可能是一个免疫治疗十分有用的载体(Caley等,1997)。本发明还说明VEE病毒可用于靶向性地转染树突状细胞。
随着最近对缺陷型乙肝病毒的了解,对不同病毒序列的结构功能关系有了新的认识。体外试验表明即使其基因组缺失高达80%病毒依然保留辅助病毒依赖的包装能力和反转录能力(Horwich等,1990)。这说明基因组的大部分可被外源核酸序列替代。Chang等(1991)最近已将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因导入到鸭乙肝病毒的聚合酶、表面及前表面编码序列的位置上。它可以与野生型病毒一起共转染到禽类肝细胞瘤细胞系内。含高滴度重组病毒的培养基可用于转染原代的鸭肝细胞。在转染后24小时可检测到稳定的CAT基因表达(Chang等,1991)。
在本发明另外的实施方案中,需转移的编码MDA-7的核酸可置于感染性病毒内,这些病毒已经经过改造可表达特异的结合配基。另外,需转移的编码MDA-7的核酸还可置于经改造后表达免疫原的感染性病毒内。因此病毒颗粒可以特异性地结合靶细胞上的同源受体并将内含物转运到细胞内。最近通过将乳糖残基加到病毒包膜上对逆转录病毒进行了化学修饰,基于这种修饰开发出了一种具有特异靶向性的新型逆转录病毒载体。这种修饰可以使病毒通过唾液酸糖蛋白受体特异地感染肝细胞。
例如,为了使重组逆转录病毒具有靶向性,使用了抗逆转录病毒包膜蛋白的抗体和抗细胞特异性受体的抗体。抗体用链亲和素与生物素成分相连接(Roux等,1989)。通过抗主要组织相容性复合体I类分子和II类分子的抗体,这些病毒可以感染各种人源细胞,这些细胞的表面抗原被专宿病毒在体外打孔(Roux等,1989)。
2.非病毒转导
除了利用病毒转移编码MDA-7蛋白的核酸外,下面还有一些其他的将重组基因转移到宿主细胞的方法,也包含在本发明的范围之内。
a.脂质介导的转化
在本发明的另外一个实施方案中,基因构建体可以包裹到脂质体或脂质制剂内。脂质体是一种包含磷脂双层膜和内部水性介质的囊状结构。多层脂质体具有被水性介质分开的多层脂质。当磷脂混悬到过量的水溶液中可以自然地形成脂质体。在形成封闭的结构前脂质成分发生自身重排,将水和溶解到其中的溶质包裹到脂双层内(Ghosh和Bachhawat,1991)。将基因构建体与脂转染胺(Lipofectamine)(Gibco BRL)混合也是本发明考虑的范围。
脂质介导的核酸转移技术及外源DNA在体外的表达技术已经很成熟(Nicolau和Sene,1982;Fraley等,1979;Nicolau等,1987)。Wong等(1980)的试验证明利用脂质体在培养的鸡胚胎、HeLa细胞和肝细胞瘤细胞内转移和表达外源DNA是可行的。
以脂质为基础的非病毒制剂提供了一种腺病毒基因治疗的替代方法。但是许多细胞培养试验表明以脂质为基础的非病毒基因转移、通过以脂质为基础的制剂系统转移基因的用途有限。以脂质为基础的非病毒基因转移的一个主要缺点是包含非病毒转移载体的阳离子脂质具有毒性。脂质体在体内的毒性可以部分解释体外和体内基因转移效率的差异。导致这种矛盾结果的另外一个因素是当存在和不存在血清蛋白时脂质载体的稳定性有差异。脂质载体与血清蛋白之间的相互作用对脂质载体的稳定性有很大影响(Yang和Huang,1997)。阳离子脂质可以吸引和结合带负电荷的血清蛋白。脂质载体与血清蛋白结合后或者被溶解或者被巨噬细胞吞噬而被排出循环外。现有的体内脂质转移方法利用皮下注射、真皮内注射、瘤内注射或颅内注射以免阳离子脂质在循环内出现毒性和稳定性的问题。脂质载体与血浆蛋白的相互作用导致了体外(Felgner等,1987)和体内(Zhu等,1993;Philip等,1993;Solodin等,1995;Liu等,1995;Thierry等,1995;Tsukamoto等,1995;Aksentijevich等,1996)基因转移效率的差异。
最近在脂质制剂工艺中所取得的进展改善了体内基因转移的效率(Smyth-Templeton等,1997;WO 98/07408)。一种新型脂质制剂是由等摩尔的1,2-二(油酰氧基)-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP)和胆固醇组成的,可以明显提高体内的基因转移效率,大约可以提高150倍。DOTAP:胆固醇脂质制剂据说可以形成独特的结构,被称为“三明治脂质体”。这种制剂据报道可以将DNA夹到双层和“瓶状结构”之间。这种脂质的这些结构特征有许多优点,如胆固醇可以增加阳离子胶体的稳定性、两个二维DNA包装及血清稳定性提高。
脂质制剂的制备通常是在脂质体混合物经(I)反相蒸发(II)脱水-水合(III)去污剂透析以及(IV)薄膜水合后再经过超声处理和系列挤出而获得的。制备出来后这种脂质结构就可以用于包裹在循环中具有毒性的(化疗药物)或稳定的(核酸)化合物。脂质包裹可降低这些化合物的毒性并延长其在血清内的半衰期(Gabizon等,1990)。许多疾病的治疗都可以利用以脂质体为基础的基因转移方法以增强常规治疗措施或新型治疗措施,特别是免疫治疗措施的疗效。
在本发明的某些实施方案中,脂质载体可与红细胞凝集病毒混合。这样可以促进脂质体与细胞膜的融合,加快脂质包裹的DNA进入细胞内(Kaneda等,1989)。在其他的实施方案中,脂质体可与细胞核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)混合或结合(Kato等,1991)。本发明还有一个实施方案是脂质载体与HVJ和HMG-1二者混合或结合。
3.药物制剂及其输递
在本发明的某些实施方案中,涉及通过输递编码MDA-7蛋白的表达构建体以增强免疫应答的方法。另外,该方法还可以输递编码免疫原的表达构建体。表达构建体还可以含有编码MDA-7和免疫原的序列。涉及免疫应答的疾病包括那些可用疫苗预防或治疗的疾病。其中包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺的癌前病变、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌以及其他任何与免疫应答有关的、能通过给予MDA-7蛋白来增强所诱导的免疫应答进行治疗的疾病。
药用组合物的有效剂量一般定义为足以可检测地、可重复地改善、减轻、降低或限制疾病或其症状的剂量。较严格的定义是指去除、根除或治愈疾病。
患者最好具有充分的骨髓功能(如外周粒细胞的绝对量>2,000/mm3,血小板计数为100,000/mm3)、足够的肝功能(胆红素<1.5mg/dl)和足够的肾功能(肌氨酸酐<1.5mg/dl)。
a.给药
在某些特殊的实施方案中,期望利用本发明的方法和组合物杀死细胞、抑制细胞的生长、抑制肿瘤的转移、降低肿瘤和组织的大小以及反转和降低肿瘤细胞的恶性表型。给药的途径可以是多种多样的,根据损伤的部位和性质,包括真皮内注射、胃肠外途径给药、静脉注射、肌肉注射、鼻内给药以及口服给药。
瘤内注射或肿瘤血管内注射特别适于散发的、固体的、易接近的肿瘤。局部、区域或全身给药都可以。对于>4cm的肿瘤来说,注射的体积约为4-10ml(优选10ml),而对于<4cm都肿瘤来说,注射的体积约为1-3ml(优选3ml)。多点注射时单个剂量约为0.1-0.5ml。通过多点注射使病毒颗粒与肿瘤接触是优选的,间隔约为1cm。
对于肿瘤的手术治疗来说,可在手术前使用本发明以使那些不宜手术的肿瘤可以被切除。另外,本发明也可在手术时和/或手术后使用以治疗残存的肿瘤或转移瘤。例如,肿瘤切除后可在肿瘤床内注射或灌注含MDA-7和免疫原性分子的组合物,或者编码MDA-7的构建体和免疫原性分子。可以通过植入手术部位的导管在切除肿瘤后持续灌注。周期性的术后治疗也可以考虑。
本发明的一个实施方案是通过灌注将肽或肽复合物转移到细胞内的。也可以持续灌注表达构建体或病毒构建体。持续灌注的构建体或肽的剂量由所期望的摄取量所决定。本发明描述了一个灌注的实施例,其中细胞培养物的起始浓度为每毫升106个细胞,细胞先被标记、洗涤,然后与100μg合成肽共孵育两小时。
在适当的时候可以进行持续给药,例如在切除肿瘤后需要处理肿瘤床以根除残存的只能在显微镜下才能看到的肿瘤时。通过注射器或导管给药是最常用的。这种持续的灌注可以进行一段时间,如在开始治疗后持续约1-2小时、约2-6小时、约6-12小时、约12-24、约1-2天、约1-2周或更长时间。一般情况下,通过持续灌注给予的治疗组合物的剂量与单次给药或多点注射的剂量相同,在灌注期间可以在一段时间内略作调整。
治疗方案也是多种多样的,一般根据肿瘤的类型、肿瘤的位置、疾病的恶性程度以及患者的健康状况和年龄来定。显然某些类型的的肿瘤需要攻击性较强的治疗措施,同时,某些患者却无法耐受繁重的治疗措施。医生最适宜根据对治疗药物的效力和毒性(如果有)的了解作出决定。
在某些实施方案中,被治疗的肿瘤可能是,至少最初可能是无法切除的。利用治疗性病毒构建体处理可以增加切除肿瘤的可行性,因为经处理后肿瘤的边缘可能萎缩,或者某些侵润性部位可能消失。经治疗后肿瘤就有可能被切除了。切除后进行的其他处理可用于根除肿瘤部位的只有在显微镜下才能看到的残存肿瘤。
对于原发肿瘤和切除后的肿瘤床来说,典型的治疗方式是进行多次处理。一般来说原发肿瘤的治疗是在2周内进行6次注射。两周的疗程可重复进行1、2、3、4、5、6或更多次。在治疗期间,可以从新评价是否需要完成已计划的剂量。
治疗包括各种“单位剂量”。单位剂量是指预定量的治疗组合物。注射的量以及注射途径和制剂都是临床治疗领域的技术人员所熟知的。单位剂量不一定一次注射,还可以在一段时间内连续注射。本发明的单位剂量用术语病毒构建体的噬菌斑形成单位(pfu)和病毒颗粒来表示更方便。单位剂量可以是103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu或病毒颗粒(vp),或者更高。
给予患者的蛋白的剂量为,或者至少为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0.9.0、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000ng/ml或更高。
b.可注射的组合物和制剂
转移免疫原性分子、编码MDA-7蛋白和/或免疫原的表达构建体的某些方法是通过全身给药完成的。但是,本文所描述的药用组合物还可以通过胃肠外途径、静脉注射、真皮内注射、肌肉注射或腹腔注射的方式给药,见美国专利5,543,158;5,641,515和5,399,363的描述(本文都已完整纳入作为参考)。
核酸构建体的注射可以通过注射器或注射溶液的其他方法完成,只要表达构建体可以通过注射用针头的孔径。最近出现了一种新型无针注射系统(美国专利5,846,233),该系统含有一个被称为喷嘴的腔室用于盛溶液,一个动力装置用于将溶液推出喷嘴到达注射部位。注射器系统也可用于基因治疗,将预定量的溶液精确多点注射到任意深度(美国专利5,846,225)。
活性化合物溶液可以游离碱或药用盐的形式以水制备,混以适当的表面活性剂,如羟丙纤维素。分散剂可用甘油、液体聚乙烯甘油、及其混合物或油制备。在普通储存或使用条件下,这些制剂需要加入防腐剂以防止微生物的生长。适宜注射的药用形式包括无菌水溶液、无菌分散剂或无菌粉末,后者可在使用时制备成无菌水溶液或无菌分散剂(美国专利5,466,468,本文已完整纳入作为参考)。无论何种形式都必须是无菌的,并且要有一定的流动性以便于用注射器注射。各种制剂在制造和储存条件下都必须是稳定的,并且必须要防止微生物,如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂和分散介质,其中包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙烯甘油等)、以及上述物质的适当混合物和/或蔬菜油。可以通过使用包被剂如卵磷脂、使分散剂中颗粒保持合适的尺寸、或加入表面活性剂使制剂保持适当的流动性。微生物等的生长可通过加入各种抗生素和抗真菌药物如对羟基苯甲酸酯类(parabens)、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来控制。大多数情况下优选等渗物质,如葡萄糖溶液或氯化钠溶液。可在组合物中加入延缓吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶来延迟注射组合物的吸收。
为了通过胃肠外途径给予水溶液,在需要时溶液应适当缓冲,液体首先用足量的盐溶液和葡萄糖溶液稀释以达到等渗。这些特殊的水溶液特别适于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、瘤内注射和腹膜内注射。在这种关系中,本领域的技术人员按照本说明书的描述应当了解所用的无菌水性介质。例如,单次剂量的药物可溶解到1ml等渗NaCl溶液中,或者加入到1000ml皮下输液液体中,或者注射到适当到部位(见《Remington药物学》(″Remington’s Pharmaceutical Sciences″),第15版,1035-1038页和1570-1580页)。根据所治疗的患者的状况可适当调整注射的剂量。在任何情况下,都应该由负责注射的人来确定每个个体的用药剂量。而且用于人的治疗时制剂都必须符合FDA生物标准办公室要求的无菌、热源、一般安全性和纯度标准。
无菌注射液可通过如下过程制备:将活性化合物加入到一定α量的合适溶剂中,然后与上面所描述的其他组分混合,如果需要再过滤除菌。一般来说,分散剂是通过如下过程制备的:将各种无菌活性组分加入到含基础分散介质的无菌载体内,再与所需要的上述其他组分混合。如果利用无菌粉末制备无菌注射液,最常用的方法是αα利用真空干燥和冷冻干燥技术制备活性组分的粉末,然后添加上述过滤除菌溶液中的所需组分。
本文所描述的组合物可制备成中性溶液或盐溶液。药用盐溶液包括加酸的盐溶液(与蛋白的游离氨基结合),可用无机酸如盐酸或磷酸,或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等制备。用游离羧基制备的盐溶液可以来源于无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁,以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等。制备完成后,溶液就可以通过与剂型相配的方式以及能产生治疗效果的剂量给予受体。制剂可以各种剂型如注射液、药物释放颗粒等给药。
本文所用的“载体”包括各种溶剂、分散介质、载体、包被剂、稀释剂、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延缓剂、缓冲液、载体溶液、悬液、胶体等。这些介质和试剂作为药用物质的方法是本领域所熟知的。除了那些与活性组分不相容的常规介质或试剂外,都可用于治疗组合物。额外的活性组分也可以掺入到组合物中。
术语“药用的”是指给予人体时不会产生变态反应或不适当反应的分子实体和组合物。含有作为活性组分的蛋白的水性组合物的制备方法是本领域所熟知的。一般来说,这种组合物可制备成可注射的形式,如溶液或悬液;或者适于在注射前制备成溶液或悬液的固体。
c.佐剂
正如本领域所熟知的,免疫原性分子、免疫原或肽组合物的免疫原性可被免疫应答的非特异性刺激因子增强,就是大家所熟知的佐剂。合适的佐剂包括所有可用的免疫刺激化合物,如细胞因子、毒素或合成的组合物。在本发明中,给予有效量的MDA-7多肽可增强免疫应答,因而可被看作佐剂。在其他的实施方案中,增强PKR表达的分子也被认为可以增强免疫应答,也是本发明可用的免疫刺激化合物。
除了MDA-7外,也可以用其他佐剂,其中包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物、如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A以及单磷酸脂质A(MPL)。RIBI含有三种从细菌中提取的组分-MPL、海藻糖二真菌烷(TDM)和细胞壁骨架(CWS),溶于2%的角鲨烷/吐温80中形成乳液。MHC抗原也可以使用。
佐剂的例子包括完全弗氏佐剂(含灭活的结核杆菌的非特异性免疫应答刺激因子)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
除了MDA-7外,本发明的某些方面也涉及其他具有佐剂活性的组合物。佐剂及其功能和转运机制都是本领域所熟知的,其他佐剂的非限定性例子包括Adjumer(即PCPP盐;聚磷腈);Adju-Phos(即磷酸铝凝胶);Algal Glucan(即b-葡聚糖;葡聚糖);Algammulin(即γ菊糖/明矾混合佐剂);Alhydrogel(即氢氧化铝凝胶;明矾);抗原制剂(即SPT,AF);Avridine(即N,N-二八癸酰-N’,N’-双(2-羟乙基)丙二酰胺;CP20,961);BAY R1005(即N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡萄糖酰)-N-八癸酰十二烷基胺羟乙酸盐);骨化三醇(即la,25-二羟维生素D3;1,25-二(OH)2D3;1,25-DHCC;la,25-二羟胆骨化醇);磷酸钙凝胶(即磷酸钙);霍乱毒素(CT)和霍乱毒素B亚单位(CTB)(即CT;CTB亚单位;CTB);霍乱毒素A1-亚单位-蛋白AD-片断融合蛋白(即CTA1-DD基因融合蛋白);CRL1005(即封闭共聚物P1205);含细胞因子的脂质体(即含细胞因子的脱水水合囊泡);DDA(即溴化二甲基八癸酰胺;溴化二甲基二硬脂酰胺(CAS注册号:3700-67-2));DHEA(即脱氢表雄酮;雄甾烯二酮;普拉睾酮);DMPC(即二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱;1,2-二肉豆蔻酰-sn-3-磷脂酰胆碱;(CAS注册号:18194-24-6));DMPG(即二肉豆蔻酰磷脂酰甘油;sn-3-磷脂酰甘油-1,2-二肉豆蔻酰钠;(CAS注册号:67232-80-8));DOC/铝复合物(即脱氧胆酸钠盐;DOC/Al(OH)3/矿物质载体复合物);弗氏完全佐剂(即CIA;FCA);弗氏不完全佐剂(即IFA;FIA);γ菊酚;Gerbu佐剂;GM-CSF(即粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;沙莫司汀(酵母来源的rh-GM-CSF));GMDP(即N-乙酰氨基葡萄糖-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-内氨酰-D-异谷氨酰拿(CAS注册号:70280-03-4));咪喹莫特(即1-(2-甲丙基)-IH-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺;R-837;S26308);ImmTherTM(即N-乙酰氨基葡萄糖-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-甘油二软脂酸盐;DTP-GDP);含共刺激分子的抗体的免疫脂质体(即从脱水-水合载体制备的免疫脂质体(DRVs));干扰素-g(即Actimmune(rhIFN-γ,Genentech,Inc.);免疫干扰素;IFN-g;γ-干扰素);白细胞介素-1β(即IL-10;IL-1;人白细胞介素1β成熟多肽117-259);白细胞介素-2(即IL-2;T-细胞生长因子;阿地白介素(去-内酰胺-1,丝氨酸-125人白细胞介素2);Proleukin;Teceleukin);白细胞介素-7(即IL-7);白细胞介素-12(即IL-12;天然杀伤细胞刺激因子(NKSF);细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF));ISCOM(s)TM(即免疫刺激复合物);Iscoprep 7.0.3.TM;脂质体(即含蛋白或Th细胞和/或B细胞肽的脂质体,含有或不含有内陷的白细胞介素-2的微生物,BisHOP或DOTMA;A,[L(抗原)]);洛索立宾(即7-烯丙基-8-氧鸟苷);LT-OA或LT口服佐剂(即大肠杆菌不稳定的肠毒素强亲和毒素);MF59;MONTANIDE ISA 51(即纯化的IFA;不完全弗氏佐剂);MONTANIDE ISA 720(即可代谢的油佐剂);MPLTM(即3-Q-去乙酰-4’-单磷酰基脂A(3-Q-desacyl-4’-monophosphoryl lipid A);3D-MLA);MTP-PE(即N-乙酰-L-内氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-(羟基-磷酰氧))乙胺单钠盐);MTP-PE脂质体(即MTP-PE抗原呈递脂质体);Murametide(即Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3);Murapalmitine(即Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-甘油二棕榈酰);D-Murapalmitine(即Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-sn-二棕榈酰);NAGO(即神经酰胺酶半乳糖氧化酶);非离子表面活性载体(即NISV);Pleuran(即b-葡聚糖;葡聚糖;PLGA,PGA和PLA(即乳酸和羟乙酸的同聚物或共聚物;丙交酯/乙交酯聚合物;聚乳酸共乙交酯);Pluronic L121(即泊洛沙姆401);PMMA(即聚甲基甲基丙烯酸酯);PODDSTM(即类蛋白微球);Poly rA:Poly rU(即多聚腺苷酸多聚尿苷酸复合物);Polysorbate 80(即吐温80;脱水山梨糖醇单-9-八癸盐聚(氧-1,2-乙烷二酰)衍生物);Protein Cochleates;QS-21(即Stimulon QS-21佐剂);Quil-A(即Quil-A皂甙,Quillaja皂甙);Rehydragel HPA(即高蛋白吸附性氢氧化铝凝胶;明矾);Rehydragel LV(即低粘度的氢氧化铝凝胶;明矾);S-28463(即4-氨基-otec,-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-乙醇);SAF-1(即SAF-m;Syntex佐剂);Sclavo肽(即IL-1b 163-171肽);Sendai脂蛋白体,含Sendai的脂质基质(即含Sendai糖蛋白的载体;fusogenic脂蛋白体;FPLs);Span 85(即Arlacel 85,脱水山梨醇三油酸酯);Specol;Squalane(即Spinacane;Robane;2,6,10,15,19,23-六甲基二十四烷);角鲨烷(Spinacene;Supraene;2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22二十四己烷);硬脂酰酪氨酸(即八癸酰酪氨酸氢氯化物);Theramide(即N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-二棕榈氧丙胺(DTP-DPP));苏氨酰-MDP(即Termurtide;[thr1]-MDP;N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺);Ty粒子(即Ty-VLPs,(病毒样颗粒));Walter Reed脂质体(即含吸附到氢氧化铝上的脂质A的脂质体,[L(脂质A+抗原)+铝])。
除了佐剂以外,共注射生物反应性调节剂(BRM)也是所期望的,试验表明该物质可上调T细胞免疫或下调细胞抑制活性。这种BRM包括而不限于西咪替丁(CIM;1200mg/d)(Smith/Kline,PA);或低剂量的环磷酰胺(CYP;300mg/m2)(Johnson/Mead,NJ)以及细胞因子如γ-干扰素、IL-2、IL-12,或编码具有免疫辅助功能的蛋白的基因,如B-7。
d.联合治疗
在某些实施方案中,本发明的组合物可以通过提供MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的表达构建体来增强疫苗的效应。在某些实施方案中,疫苗是肿瘤疫苗。这些组合物以联合有效剂量来提供以杀伤或抑制细胞的增殖。这个过程包括使细胞与表达构建体、试剂或多种因子同时接触。这一过程可通过使细胞与单个组合物或包含两种药物的药物制剂接触、或者通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来完成,其中一种组合物包含表达构建体,另一种组合物包含第二种药物。
在本发明的一个实施方案中,除了其他的抗凋亡药物或细胞周期调节药物外,mda-7基因治疗也可以和免疫治疗联合使用。另外,免疫治疗可在其他药物治疗之前或之后数分钟到数周内进行。在其他药物和表达构建体分别给予细胞的实施方案中,一般要确保两种治疗措施实施的间隔不要超过每种治疗的有效期,这样药物和表达构建体就可以对细胞产生协同效应。在这种情况下,实施两种治疗措施的间隔一般在约12-24小时之内,优选6-12小时之内。在某些情况下,可以适当延长治疗的间期,如两种治疗措施之间间隔数天(2,3,4,5,6或7)到数周(1,2,3,4,5,6,7或8)。
不同治疗措施的各种组合都可以使用,例如,A代表基因治疗,B代表作为免疫治疗方案一部分的免疫原性分子,如抗原:A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/AB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
给予患者本发明的治疗性表达构建体要按照给予这种化合物的通用方法进行,同时要考虑载体的毒性(如果有的话)。如果需要可以进行多个疗程。各种标准的治疗措施以及手术都可以和本文描述的治疗措施联合应用。
i.化疗
肿瘤的治疗也包括化疗和放疗在内的各种方式的联合治疗。联合化疗包括顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝脲、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、新霉酰胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、transplatinum、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱和氨甲蝶呤,以及上述物质的类似物或衍生物。
ii.放疗
引起DNA损伤并被广泛应用的因素包括大家所熟知的-射线、X-射线和/或向肿瘤细胞直接转移放射性同位素。其他形式的DNA损伤因子如微波、质子束辐射(美国专利5,760,395和4,870287)和紫外辐射也可以考虑。所有这些因素最可能引起对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持的大范围损伤。X射线的剂量范围从每天50-200伦琴,持续一段时间(3到4周),到2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的使用剂量范围很宽,可根据同位素的半衰期、所激发射线的强度和类型以及肿瘤细胞摄取的量而定。
1945年,R.R.Wilson建议使用质子束治疗肿瘤。利用质子治疗的优点在于其下列物理特性:(1)质子渗透到组织内后所产生的辐射剂量随质子的向内流动而上升,接近终点时达到最大剂量(″Bragg峰″),超出终点后下降为零(2)单能束的质子具有几乎一样的范围,因此在相同的深度可转移最大剂量,以及(3)强度相对较大的质子在到达目的地的过程中不会偏离直线很多。
在治疗肿瘤或其他疾病时为了使质子束达到最大的治疗效果,医生需要了解治疗的准确位置以及治疗位点内组织的特点。现在已经有一些新的成像技术如X射线电子计算机断层摄影术(CT扫描)和磁共振成像技术(MRI)可以达到所需要的精确度。现在利用质子治疗肿瘤患者是可行的。
本文所用的术语“使接触”或“暴露于”用于细胞时是指治疗性构建体和化疗或放疗药物转移给靶细胞、或直接与靶细胞一起放置的过程。为了达到杀死或抑制肿瘤细胞的目的,两种药物要以能联合有效杀死细胞或阻止细胞分裂的剂量给予细胞。
iii.基因
在另外的实施方案中,免疫原性分子作为基因治疗方案的一部分提供。编码mda-7的载体与编码下列基因产物之一的第二载体一起转移可联合诱导对靶组织的效应。另外,编码两个基因的单一载体也可以使用。
(a.)抗原
在某些实施方案中,本发明涉及改善免疫治疗效果的方法。抗肿瘤抗原的免疫应答也可以通过MDA-7来诱导。肿瘤抗原包括PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、PMSA、结核杆菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性调节素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外壳蛋白-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨针抗原、风疹抗原、流行性腮腺炎抗原、甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m或WT1。诱导抗肿瘤抗原免疫应答的使用方法是特别需要考虑的,见美国专利5,552,293和6,132,980的描述,本文已特地纳入作为参考。
(b.)细胞程序性死亡的调节因子
凋亡或细胞程序性死亡是正常胚胎发育、成年组织内环境稳定的维持以及癌变的抑制中的一种基本过程(Kerr等,1972)。已知Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶家族是其他系统中凋亡的重要调节因子和效应因子。试验证明Bcl-2蛋白与滤泡淋巴瘤有关,在控制各种凋亡刺激因子引起的凋亡以及增加细胞的存活中扮演重要角色(Bakhshi等,1985;Cleary和Sklar,1985;Cleary等,1986;Tsujimoto等,1985;Tsujimoto和Croce,1986)。现在已经发现进化保守的Bcl-2蛋白是相关蛋白家族的一个成员,可以被归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂。
Bcl-2被发现以后,就被证明可以抑制各种刺激因素引起的细胞死亡。而且现在已经发现存在一个Bcl-2细胞死亡调节蛋白家族,它们具有相同的结构,其序列同源。这个家族内的不同成员或者具有与Bcl-2相似的功能(如BclXL、BclW、Mcl-1、A1、Bfl-1),或者具有与Bcl-2相反的功能,可促进细胞的死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
(c.)其他物质
可与本发明联合使用以提高治疗效果的其他物质也可以考虑。这些物质包括可上调细胞表面受体和GAP连接的免疫调节剂、抑制细胞增殖和分化的物质、细胞粘附抑制剂以及能提高内皮细胞对凋亡诱导因子敏感性的物质。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子;干扰素α、β、γ;IL-2和其他细胞因子;F42K和其他细胞因子类似物;MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。本发明还可以考虑上调细胞表面受体或其配基如Fas/Fas配基、DR4或DR5/TRAIL的表达,通过其对内皮细胞的自分泌或旁分泌效应赋予本发明以凋亡诱导能力。通过增加GAP连接的数量来提高细胞内的信号传递也可以增强对临近内皮细胞的抗增殖效应。在其他的实施方案中,细胞增殖或分化抑制剂可与本发明联合使用以提高治疗的抗过度增殖效应。细胞粘附的抑制剂也可以提高本发明的效应。细胞粘附抑制剂的例子有病灶粘连激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他丁。能增加内皮细胞对凋亡的敏感性的其他物质,如抗体c225,也可用于本发明以提高治疗的效果。
4.免疫原性分子的鉴定
本发明利用了申请人所发现的MDA-7可上调干扰素诱导的、ds-RNA依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PKR)的表达这一现象。PKR可以通过活化多个参与生长抑制和凋亡诱导的信号转导通路发挥抗肿瘤形成活性。这些通路的活化发生在潜伏的无活性的同源二聚体被活化的信号诱导发生结构改变而导致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等,2001)。PKR一旦活化以后就能使各种靶底物磷酸化,这在生长调控和凋亡诱导中有很重要的作用(Saelens等,2001;Sudharkar等,2000)。
PKR的活化是Ad-mda7诱导的凋亡中的关键事件。利用特异性苏氨酸/激酶抑制剂2氨基嘌呤(2-AP)抑制PKR可使Ad-mda7诱导的凋亡完全反转,eIF-2α的磷酸化消失以及蛋白合成被抑制。蛋白合成的抑制对于凋亡的诱导来说是很关键的,这可能是因为一个或几个短命的蛋白参与凋亡的抑制。另外,其他被PKR控制的通路也是很重要的,如参与NF-κB、p53、MEK、IRF-1或FADD调节的那些通路(Jagus等,1999;Gil等,1999;Cuddihy等,1999;Balachandran等,1998)。
尽管有多个信号通路参与Ad-mda7介导的凋亡过程,但是PKR的活化是关键因素,因为缺少PKR的MEFs不能发生凋亡,而具有野生型PKR的MEFs可以发生凋亡。凋亡的这种抑制作用好像是mda-7特异性的,因为用促凋亡Ad-Bak载体转导缺乏PKR的MEFs可以导致非损伤性凋亡。一个研究这种现象的模型被构建出来,其中MDA-7和PKR位于凋亡级联中Bak促凋亡基因的上游。在这个模型中,MDA-7可诱导PKR的活化,通过各种细胞内信号通路诱导胱冬酶活化和凋亡的发生。Bak位于PKR的下游,因此它诱导凋亡就不依赖于PKR的活化。试验结果还显示发生了BID的裂解和胱冬酶8的活化,这与本领域以前所得到的研究结果一致,说明PKR诱导的凋亡一般都是通过Fas、FADD、胱冬酶-8和BID的活化介导的(Balachandran等,1998)。
因此,腺病毒介导的MDA-7的过量表达可导致PKR被快速诱导和活化,随即eIF-2α以及PKR的其他靶底物被磷酸化,然后凋亡被诱导。通过2-AP特异性抑制肺癌细胞内的PKR可消除Ad-mda7诱导的PKR活化、PKR靶底物磷酸化和凋亡的发生。通过无PKR的成纤维细胞试验发现Ad-mda7诱导的凋亡依赖于具有正常功能的PKR通路。这些结果说明多功能的PKR基因作为Ad-mda7介导的凋亡的关键介质具有一种新的作用。而且,由于通过本文的描述发现PKR对于MDA-7诱导的凋亡来说是一个关键因子,MDA-7已被证明可以诱导免疫应答,因此,本发明的某些实施方案考虑通过诱导PKR的表达来增强免疫应答,结果显示MDA-7多肽可以增强免疫应答。
在另外的实施方案中,本发明的方法用于鉴定免疫原性分子。本发明特别适用于增强抗免疫原性分子的免疫应答,这些免疫原性分子是以前未发现的,或者其免疫原性处于常规免疫检测方法的检测下限以下。
本发明还涉及预测候选患者是否适于进行免疫治疗的方法。按照本发明的描述进行诊断试验可以通过分析抗免疫原性分子,如抗原的免疫应答来判断一个患者的病情是否能保持长期无进展。本发明涉及的其他诊断试验可用于判断一个患者是否适于采用本发明的方法来治疗涉及免疫应答的疾病。
在一个实施方案中,本发明包含一个确定受体是否产生了抗免疫原性分子的免疫应答的诊断试验。在另一个实施方案中,诊断试验用于判断受体体内的T细胞、NK细胞或巨噬细胞的活性是否升高。在其他的实施方案中,诊断试验用于判断受体体内的细胞因子浓度是否升高。无论那种试验,如果受体出现肯定的结果,则本发明可以利用本文所描述的组合物来激发免疫应答。在另一个实施方案中,产生免疫应答或者产生被诱导的免疫应答的受体被处理以增强这种免疫应答。
D.免疫刺激
1.诱导免疫应答
细胞因子可促进抗化合物的免疫应答。因为MDA-7具有细胞因子活性,这种活性可用于治疗方法或预防方法。抗下列任何一个抗原的免疫应答都可以影响与抗原有关的疾病的治疗效果,或影响抗该疾病的预防效果。
在本发明中,MDA-7可增强抗疾病相关抗原的免疫应答。在本发明的某些实施方案中,抗原与微生物、真菌、病毒或肿瘤药物相关,或来源于微生物、真菌、病毒或肿瘤药物。本发明的抗原所来源的微生物包括而不限于:肺炎球菌属的83个血清型或更多,链球菌属的细菌如酿脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、马链球菌(S.equi)、狗链球菌(S.canis)、牛链球菌(S.bovis)、马肠链球菌(S.equinus)、咽峡炎链球菌(S.anginosus)、血链球菌(S.sanguis)、唾液链球菌(S.salivarius)、缓症链球菌(S.mitis)、变异链球菌(S.mutans),其它绿色链球菌属、消化链球菌属、链球菌属的相关种、肠球菌属的细菌如粪肠球菌、屎肠球菌,葡萄球菌属的细菌如表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌,鼻咽内的特异性细菌如流感嗜血杆菌,假单胞菌属的细菌如铜绿假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、鼻疽假单胞菌,布鲁氏菌如马尔他布氏杆菌、猪布氏杆菌、流产布氏杆菌、百日咳博德特氏菌、脑膜炎奈瑟菌、淋球菌、粘膜炎莫拉菌、白喉棒状杆菌、溃疡棒杆菌、假结核棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、解脲棒杆菌、溶血隐秘杆菌(Corynebacteriumhemolyticum)、马棒状杆球菌等,单核细胞增多性李斯特杆菌、星状诺卡氏菌(Nocordia asteroides),拟杆菌,放线菌,梅毒螺旋体,细螺旋体,以及相关的微生物。本发明还可用于抗革兰氏阴性细菌,如肺炎克雷白菌、大肠杆菌、变形菌、沙雷菌、不动杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yershiniaenterocolitica)、假结核耶尔森菌、土拉热弗朗西斯菌、肠杆菌、Bacteriodes和军团菌等。另外,本发明还可用于控制寄生虫感染以及微生物引起的微观感染,如隐孢子虫、贝氏等孢子球虫、鼠弓形虫、阴道毛滴虫、环孢子菌,以及沙眼衣原体及其他衣原体感染,如鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体。
本发明所涉及的细菌抗原和/或致病菌的致病因子包括而不限于结核杆菌可溶性因子(Mtb),表皮葡萄球菌来源的酚可溶性调节素(PSM),林球菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、亲水气单胞菌、铜绿假单胞菌、肉毒梭菌芽孢杆菌的脂多糖(LOS)。
本发明的病毒抗原所来源的病毒包括而不限于:流感病毒A、B和C,副流感病毒、副黏液病毒、新城疫病毒、呼吸道合胞体病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、腺伴随病毒、细小病毒、Epstein-Barr病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、冠状病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒(如CMV-G和CMV-M抗原)、人乳头状瘤病毒、B病毒、水痘-带状疱疹病毒、痘病毒、风疹病毒、狂犬病病毒、细小核糖核酸病毒、轮状病毒和Kaposi相关的疱疹病毒、肝炎病毒A、B、C、D、E、F、G以及其他肝炎病毒、西尼罗河病毒、流感病毒、paopvaviruses、逆转录病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、和风疹病毒。
本发明的抗原所来源的真菌包括而不限于:正圆形糠秕孢子菌、威尼克外瓶霉、Piedraia horta、Trichosporon beigelii、白色念珠菌、Sporothrix schenckii、Cladophialophora carrionii、疣状瓶霉、两种着色霉、Pseudallescheria boydii、足菌肿马杜拉分支菌、灰色马杜拉分支菌、甄氏外瓶霉、镰形顶孢霉、甄氏外瓶霉、烂木瓶霉、长穗双极菌、皮炎万吉拉菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、P.brasiliensis、念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、卡氏肺孢子虫、酒曲菌、根毛霉、犁头霉、Blastomyces dermititidis、荚膜组织胞浆菌、Paracoccidiodes属、蛙粪霉菌。
另外还可以考虑将部分或全长MDA-7与其他细胞因子和/或要激发免疫应答的抗原融合形成融合蛋白。这种融合蛋白可给予受体以诱导或促进抗该抗原的免疫应答。
本发明包括促进受体免疫应答的方法,该方法包括给予受体有效量的MDA-7以促进免疫应答。免疫应答的促进可根据下列现象来观察:细胞因子表达或活性升高、T细胞或T细胞群(例如,辅助T细胞、细胞毒T细胞、NK细胞)的增殖、B细胞或B细胞群的增殖、细胞毒T细胞的活化以及抗体的产生。
在本发明的某些实施方案中,也可以提供抗原以诱导抗该抗原的免疫应答。抗原可以是肿瘤抗原、微生物抗原、病毒抗原或真菌抗原,以及上述物质的混合物。在某些特殊的实施方案中,抗原是肿瘤抗原,如PSA,CEA,MART,MAGE1,MAGE3,gp100,BAGE,GAGE,TRP-1,TRP-2或PMSA。
本发明的其他实施方案包括促进或加快康复的方法,或减轻创伤性治疗所导致的损伤的方法,创伤性治疗是指引起正常细胞损伤的治疗方法。这种损伤可导致中性白细胞减少、贫血、血小板减少以及淋巴细胞减少。在某些实施方案中,创伤性治疗是指化疗和/或放疗。可给予将要实施、正在实施或已经实施了创伤性治疗的患者有效量的MDA-7以提高免疫治疗的效果。MDA-7可在治疗前、治疗后或治疗过程中提供。
MDA-7可与抗肿瘤药物或具有抑制肿瘤增殖活性的化合物联合给予患者以增强这种化合物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。这种化合物包括肿瘤抑制剂和下面“联合化疗”部分所讨论的化合物。在某些实施方案中,抗肿瘤化合物是p53、Rb、WT、FHIT、p16、PTEN、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27或TRAIL。
抗肿瘤抗原的免疫应答也可以用MDA-7加强。肿瘤抗原包括PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、PMSA、结核杆菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性调节素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外壳-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨针抗原、风疹抗原、流行性腮腺炎抗原、α甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m或WT1。诱导抗肿瘤抗原的免疫应答的用途是本发明需特别考虑的,见于美国专利5,552,293和6,132,980的描述,本文特地纳入作为参考。
有关免疫应答的诱导、促进或增强的许多分析方法都是本领域技术人员所熟知的,其中有些在实施例中作了描述,并且已纳入本文作为参考。一种分析方法是检测其他细胞因子表达的增加,如IL-6、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-12。其他检测所诱导的免疫应答的方法则是通过检测T细胞、NK细胞或巨噬细胞所升高的活性。
值得注意的是有关MDA-7和/或免疫原性分子如抗原的任何实施方案都适用于增强免疫应答的方法。更特别的是,有关MDA-7的实施方案可增强抗各种免疫原性分子的免疫应答,其中免疫原性分子可以是以前被鉴定出的,也可以是以前未知的。
作为一种诊断方法,本发明涉及T细胞反应的分析,包括分析自身B细胞系(B-LCL)、树突状细胞或MHC匹配的细胞来源的细胞。术语“自身的”是指来自于受体的细胞,效应细胞也来自同一受体。自身B-LCL可用将要被诊断、被治疗或被转化的受体的外周血单个核细胞(PBMCs)制备。在一个特殊的实施方案中,自身B-LCL来自于HIV感染的受体,被用作T细胞反应试验的靶细胞以预测B-LCL供体内的长期无进展情况。
树突状细胞(DC)作为一种抗原呈递细胞在T细胞活化中发挥关键作用。在抗原呈递细胞(APC)中DC细胞是比较独特的,因为这些细胞具有很强的活化幼稚T细胞的能力(Steinman,1991)。DC先天性地表达,或者在成熟后表达几种分子,这些分子可介导与反应性T细胞的物理相互作用,并且可将活化信号传递给反应性T细胞。这些分子包括MHCI类分子和II类分子、CD80(B7-1)和CD86(B7-2)、CD40、CD11a/CD18(LFA-1)、以及CD54(ICAM-1)(Steinman,1995;Steinman,1991)。DC可以将抗原呈递给CD8+和CD4+T淋巴细胞。DC在被刺激后可分泌几种T细胞刺激因子,其中包括IL-1β、IL-6、IL-8、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)和MIP-1γ(Mohamadzadeh,1996;Ariizumi,1995;Kitajima,1995;Caux,1994;Enk,1992;Heufler,1992;Matsue,1992;Schreiber,1992)。粘附分子表达和细胞因子分泌这两种特性其他APC也具有(即活化的巨噬细胞和B细胞),但是其他APC活化幼稚T细胞的能力要比DC弱的多。
在其他的实施方案中,淋巴细胞表面标记物试验可用于分析T细胞表面的各种受体是否存在,这些分析方法是本领域技术人员所熟知的,其中包括免疫荧光分析和流式细胞术。T细胞反应可通过本领域技术人员所熟知的各种方法检测。这些分析方法中的一些将在下面进行详细描述。
a.3[H]胸腺嘧啶掺入试验
不同样品来源的PBMC的增殖反应可通过标准的3[H]胸腺嘧啶掺入试验进行分析,见已发表的文献的描述(Nehete,1996;Nehete,1995)。T细胞增殖反应对E6和E7肽的影响可通过细胞内掺入的3[H]胸腺嘧啶的增加倍数来计算(以刺激指数(SI)来表示),增加的倍数是通过与未加肽的对照组比较得来的。当SI的值在2.0以上时,如约2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0以上时,被认为是阳性反应。SI的值通常用与肽共孵育细胞培养基的放射活性(cpm)除以未与肽共孵育细胞培养基(只有培养基)的放射活性值来计算。
b.用51[Cr]标记试验检测细胞的溶解
细胞介导的淋巴细胞溶解(CML)可用于指示T细胞反应的程度。靶细胞在与效应细胞接触前用放射性的铬-51(51[Cr])标记。释放到培养基中的51[Cr]的量与细胞介导的溶解成正比。在本发明的一个特殊实施方案中,培养自身B淋巴细胞,在与细胞毒细胞共孵育前2小时加入51[Cr]铬酸钠。
c.γ-干扰素的产生
干扰素γ(γ-干扰素)也被称为II型干扰素或免疫干扰素,是由T细胞和NK细胞产生的。对T辅助细胞的发育非常重要。因为它是一个基础的巨噬细胞活化因子,因此它在细胞介导的免疫中是一个强细胞因子。γ-干扰素可增加MHCI类分子和II类分子的表达水平,因此可促进抗原呈递和其他识别反应。它还可以放大TNF-α的效应,增加血管内皮细胞表面粘附分子的表达水平,导致T细胞粘附和外渗。最后,作为本发明权利要求的一部分,γ-干扰素可由CTL分泌,因此γ-干扰素的水平可作为指示CTL活性及CTL反应的指标。γ-干扰素的水平可用标准方法检测。
d.四聚物分析
四聚物分析方法是本领域技术人员所熟知的,见Altman,1996
e.细胞因子的产生
细胞因子是调节免疫应答和不同类型细胞的分化通路的重要蛋白。其在T细胞的调节和发育中也发挥关键作用,细胞因子包括γ-干扰素、白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、淋巴毒素、MIF、TGF-β、TNF-α以及其他趋化因子。细胞因子的检测方法是本领域所熟知的。
本发明还涉及确定受体是否表达,或者是否能够表达能特异性指示免疫应答的分子的方法。由于MDA-7提供了一种增强免疫应答的方式,因此本发明的方法包括检测免疫系统指示剂如蛋白、肽或多肽的表达,这些蛋白、肽或多肽可被免疫系统的细胞分别表达。有许多方法可定量或定性地检测分子的表达水平,其中包括检测象征特定单体型的DNA序列,或者测定蛋白或mRNA的表达水平。这些方法都是本领域技术人员所熟知的。下面提供了一些例子。
f.血清学分析
本发明包括利用血清学试验评价免疫系统指示剂表达水平的方法。这些试验利用抗原-抗体反应定量和定性地检测抗原的水平。有许多分析方法可以使用,本领域的技术人员应该知道如何在本发明的范围内使用它们。
g.ELISAs,免疫分析和免疫组化分析
免疫分析一般都是结合分析。最常用的免疫分析方法是各种类型的酶联免疫吸附分析(ELISAs)和放射免疫分析(RIA),这些都是本领域所熟知的。用组织切片进行免疫组化检测也是很有用的。本发明所涉及的免疫分析包括而不限于美国专利No.4,367,110(双抗夹心法)和No.4,452,901(Western印迹)所描述的方法。其他分析方法包括体外和体内的标记配基的免疫沉淀分析和免疫细胞化学分析。分析所诱导的免疫应答是否存在可直接在组织样品中进行。体外原位杂交方法是大家所熟知的,包括检测抗原特异性抗体与组织、细胞或细胞提取物的结合。这些都是本领域技术人员能熟练掌握的常规技术。
实施例
下面的实施例用于证明本发明的某些特定实施方案。本领域的技术人员应该了解实施例中所描述的技术是发明人发现的具有代表性的技术,可以很好地实现本发明,因此可以被认为是实现本发明的最佳模式。但是,本领域的技术人员根据本说明书可以对本文所描述的某些实施方案作各种修改,在不偏离本发明的精神和范围的情况下也可以得到相似或相同的结果。
实施例1:AD-MDA7诱导肺癌细胞内的PKR表达和细胞的凋亡
a.细胞系和试剂
人肺癌细胞系A549(wt p53)、H1299(p53缺失)和H322J(突变型p53)得自美国典型培养物收集中心。PKR+/+和PKR-/-鼠胚胎成纤维细胞(MEF)由Dr.Glen Barber(迈阿密大学医学院(University of Miami School of Medicine))惠赠。MEF细胞用含10%胎牛血清、10mM谷氨酰胺、100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素(LifeTechnologies,Inc.,Grand Island,NY)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)培养,培养条件为5%CO2,温度为37℃。2-氨基嘌呤硝酸盐(2-AP)购自SigmaChemical Co.(St.Louis,MO)。
b.病毒
Ad-mda7、Ad-Bax、AdBak、Ad-p53和Ad-Luc载体的构建以前已有报道(Pataer等,2000)。腺病毒载体在各种肿瘤细胞系内的转导效率可通过Ad-LacZ感染细胞,然后测定转染70%以上的细胞所需要的病毒滴度来确定。
c.流式细胞术分析和XTT分析
凋亡细胞用碘化丙锭染色,然后用FACS检测。收获细胞后离心,然后再悬浮于含50g/ml碘化丙锭、0.1%Triton X-100和0.1%柠檬酸钠的磷酸盐缓冲液中。样品在4℃储存16小时,在进行FACS(Becton-Dickenson FACScan,Mountain View,CA;FL-3channel)分析前剧烈振荡。细胞的存活能力用XXT试验进行分析,将细胞接种到96孔板中,每孔100L液体。用Ad-mda7或对照载体处理后,按照Roche的说明书(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)使细胞与XTT四唑盐共孵育。根据酶联免疫吸附(ELISA)检测仪上所得到的吸光度来分析细胞的存活能力。
d.免疫印迹分析
转染48小时后,制备细胞提取物进行免疫印迹分析,见以前的文献描述(Pataer等,2000)。所使用的抗体如下:Bcl-2、Bak、Bax、PKR(K-17)、eIF-2α、β-肌动蛋白、p38(A-12)、磷酸特异性p38(D-8)、stat1(C-136)、磷酸特异性stat1(A-2)、stat3(F-2)、磷酸特异性stat3(B-7)、抗-Tyk2(C-20)和磷酸特异性-Tyk(PY-99)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA);胱冬酶3、胱冬酶-9、胱冬酶-8和Bid(PharMingen,San Diego,CA)以及磷酸特异性PKR[pT451]和eIF-2α[pS51](BioSource International,Camarillo,CA)。MDA-7的多克隆和单克隆抗体购自Introgen Therapeutics,Inc.(Houston,TX)。
e.重组腺病毒的制备
构建出的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)携带编码人细胞外MDA-7(或荧光素酶)的核酸,该核酸与内部CMVIE启动子相连,其下游是SV40多聚腺苷酸(pA)信号。同时构建了只含CMV-pA构建体的对照载体。携带基因表达盒的Ad-5载体与质粒pJM17(Graham和Prevec 1992)共转染293细胞以获得重组病毒Ad-mda7、AdLuc和AdCMVpA。挑取噬菌斑获得病毒颗粒,用PCR/限制性酶切分析和序列测定确定基因组序列的正确性。在293细胞内繁殖病毒并通过HPLC纯化。
f.转导和细胞增殖研究
本试验所用的肿瘤细胞或正常细胞用Ad-mda7转染(以AdCMVpA或AdLuc为对照),转染剂量MOIs逐渐增加(病毒颗粒/细胞;0、100、250、500、1000、2500、5000、10000vp/细胞,浓度逐渐增加)。细胞或者以500-2000个细胞/孔接种到96孔板中进行氚标胸腺嘧啶掺入-细胞增殖试验,或者以105-106个细胞/孔接种到6孔板中进行蛋白表达分析或凋亡分析,或者以104个细胞/孔接种进行Alamar-blue分析。
Ad-mda7或AdLuc(或AdCMVpA)转染用逐渐增加的MOIs(根据病毒颗粒/细胞;MOI范围为0-10,000病毒颗粒/细胞)。细胞转染后3到5天进行氚标胸腺嘧啶/凋亡试验、蛋白表达试验以及alomar试验。
g.细胞内蛋白合成的检测
细胞用Ad-mda7或Ad-Luc处理48小时。在指示的位置用1mM 2-AP处理细胞48小时。蛋白合成的检测用以前所描述的方法进行(14)。经处理后,约1×106细胞与2Ci/ml的L-[U-14C]氨基酸混合物(Amersham,Piscataway,NJ)在37℃共孵育10分钟。加入20%(wt/vol)三氯醋酸终止反应,酸可沉淀成分中的放射活性用闪烁扫描计数器测定。
h.共聚焦分析
以4×105细胞/孔的剂量将细胞接种到带槽的波片中培养过夜,然后用Ad-mda7、Ad-Luc或PBS处理。48小时后用PBS洗涤细胞,然后在4%的多聚甲醛中固定过夜。用0.2%triton-X100在4℃处理细胞20分钟使细胞的渗透性增加,然后用5%的正常马血清和1%的正常羊血清封闭。加入兔多克隆抗MDA-7抗体和鼠单克隆抗-PKR(B-10)抗体在4℃共孵育过夜,然后加入罗丹明或FITC标记的羊抗兔IgG在37℃孵育30-45分钟。然后在共聚焦显微镜下观察细胞。
i.统计学分析
附图中显示的数据代表三个或多个独立试验的平均值,横条代表标准差(SD)。多组和配对比较的统计学分析分别用ANOVA和两端斯氏t检验(two-tailedStudent’t test)进行分析,p<0.05被认为具有统计学意义。
A549(wt p53)、H1299(p53缺失型)和H322J(突变型p53)肺癌细胞用Ad-mda7、Ad-Luc或PBS处理后24到96小时通过流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,结果显示Ad-mda7的转染可以使三株肺癌细胞发生高百分率的凋亡(图1A)。利用XTT试验分析Ad-mda7、Ad-Luc或PBS转染对细胞存活能力的抑制作用。与FACS结果一样,Ad-mda7转染后48小时可明显抑制细胞的生长。Western印迹分析和共聚焦显微镜观察发现Ad-mda7转染后PKR的表达出现剂量依赖型的上升(图1B,1C),但是转导对照载体(Ad-Luc)或其他促凋亡载体如Ad-Bax、Ad-p53或Ad-Bak的细胞或用PBS处理的细胞却没有出现上述结果。
因此,干扰素诱导的、ds-RNA依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PKR)的表达上调可在Ad-mda7处理后观察到。Ad-mda7转导肺癌细胞可导致PKR以不依赖p53的方式活化(图1A和1B)。PKR的表达上调也可见于其他类型的肿瘤细胞,包括结肠癌和乳腺癌,说明这种关系并不是肺癌细胞特异性的。PKR的上调表现出Ad-mda7特异性,因为用携带荧光素酶报告基因或其他促凋亡基因如p53(Ad-p53)、Bax(Ad-Bax)或Bak(Ad-Bak)的腺病毒载体转染肿瘤细胞却没有出现PKR的变化(图1B和1C)。另外,PKR的功能特性表面它是一个重要的致瘤性调节因子(Jagus等,1999)。PKR的上调可导致各种肿瘤细胞系的凋亡。另外,脊髓发育不良中染色体5q上IRF-1基因的关键性缺失好像与PKR的表达水平降低有关,肺癌和结肠癌的免疫组化分析表明PKR的表达与生存期延长有关。
实施例2:AD-MDA7活化PKR、EIF2α和PKR的其他靶底物
利用实施例1描述的材料和方法可观察到Ad-mda7在体外对PKR的活化。Ad-mda7处理细胞(A549)通过免疫印迹分析其磷酸化PKR的存在。试验表明只有Ad-mda7处理的细胞内PKR及其磷酸化活化形式的表达才会升高(图2A)。PKR下游靶底物eIF-2α、Tyk2、Stat1、Stat3和p38的磷酸化也证明了丝氨酸/苏氨酸激酶的活化(图2A)。Ad-mda7的处理导致随后的凋亡发生,胱冬酶3、8和9被活化,BID和PARP被裂解(T图2C)。PKR的活化好像是Ad-mda7和下游胱冬酶活化特异性的,因为用胱冬酶抑制剂预处理不会阻断PKR的磷酸化。
PKR可通过多个参与生长抑制和凋亡诱导的信号转导通路的活化来介导抗肿瘤形成效应。这些通路的活化发生在潜伏的无活性的同源二聚体被活化的信号诱导发生结构改变而导致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等,2001).PKR一旦活化以后就能使各种靶底物磷酸化,这在生长调控和凋亡诱导中有很重要的作用(Saelens等,2000;Sudharkar等,2000)。免疫沉淀试验所得到的结果与这个模型所得到的结果是一致的,都表明Ad-mda7的转导可活化PKR(图2A),导致磷酸化的PKR(活性形式)和磷酸化的eIF-2α的增加。其他与凋亡诱导和生长调控有关的PKR靶底物包括Stat1、Stat3、p38和Tyk2,试验表面都可被PKR磷酸化(Deb等,2001;Goh等,2000)。
PKR的活化是Ad-mda7诱导的凋亡中的关键事件,因为利用特异性苏氨酸/激酶抑制剂2氨基嘌呤(2-AP)抑制PKR可使Ad-mda7诱导的凋亡几乎完全反转,eIF-2α的磷酸化消失以及蛋白合成被抑制。蛋白合成的抑制对于凋亡的诱导来说是很关键的,这可能是因为一个或几个短命的蛋白参与凋亡的抑制。另外,其他被PKR控制的通路也是很重要的,如参与NF-κB、p53、MEK、IRF-1或FADD调节的那些通路(Jagus等,1999;Gil等,1999;Cuddihy等,1999;Balachandran等,1998)。
实施例3:AD-MDA7诱导凋亡依赖于PKR的活化
利用实施例1所描述的材料和方法研究特异性丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂2氨基嘌呤(2-AP)的效应以确定Ad-mda7的凋亡诱导和PKR活化之间的关系。单纯高浓度的2-AP(10mM)对细胞的存活率没有影响。但是,2-AP却可以剂量依赖的方式阻断Ad-mda7转导细胞发生凋亡和细胞杀伤(图3A)。2-AP对凋亡的抑制好像是Ad-mda7特异性的,因为用Ad-Bak、Ad-Bax、Ad-p53或癌基因抑制剂处理的细胞没有出现对凋亡的抑制现象。免疫沉淀试验表明2-AP的处理可抑制PKR和eIF-2α的磷酸化,从而抑制PKR的活化(图3B)。2-AP阻断eIF-2α磷酸化的能力可导致eIF-2α蛋白合成抑制(图3C)和凋亡诱导抑制(图3A)的反转。
实施例4:MEF细胞内AD-MDA7诱导的凋亡和PKR的活化
利用实施例1所描述的材料和方法评价PKR敲除小鼠来源的MEF细胞内的PKR活化和Ad-mda7的凋亡诱导活性。尽管PKR缺失型(-/-)MEF细胞和PKR野生型MEF细胞都能有效转导和表达MDA-7蛋白(图4A),但是只有PKR野生型MEF在Ad-mda7转导后出现凋亡,这说明Ad-mda7所诱导的细胞杀伤是PKR依赖型的。与Ad-mda7不同,Ad-BAK诱导的凋亡不依赖于PKR在基因组内的状态(图4C),PKR缺失型MEF和PKR野生型MEF都可以发生凋亡,说明PKR的活化不需要所有的促凋亡基因参与。
尽管有多个通路参与,但是PKR的活化对Ad-mda7诱导的凋亡来说是很关键的,因为缺少PKR的MEF细胞不发生凋亡,而具有野生型PKR的MEF细胞正好相反。凋亡的这种抑制作用好像是mda-7特异性的,因为用促凋亡Ad-BAK载体转染缺少PKR的MEF细胞却可以导致非损伤性的凋亡。基于这些结果合成了一个试验模型,其中MDA-7和PKR位于凋亡级联反应中促凋亡BAK基因的上游。在这个模型中,MDA-7诱导PKR的活化,通过各种细胞内通路诱导胱冬酶的活化和凋亡的发生。BAK位于PKR的下游,它对凋亡的诱导不依赖于PKR的活化。令人感兴趣的是,与以前所得到的结果一致,也可以看到BID的裂解和胱冬酶8的活化,这说明PKR诱导的凋亡通常是通过Fas、FADD、胱冬酶-8和BID的活化介导的(Balachandran等,1998)。
腺病毒介导的MDA-7的过量表达可导致PKR被快速诱导和活化,随即eIF-2α以及PKR的其他靶底物被磷酸化,然后凋亡被诱导。通过2-AP特异性抑制肺癌细胞内的PKR可消除Ad-mda7诱导的PKR活化、PKR靶底物磷酸化和凋亡的发生。通过无PKR的成纤维细胞试验发现Ad-mda7诱导的凋亡依赖于具有正常功能的PKR通路。
实施例5:Ad-mda7诱导肺癌细胞内的PKR表达和细胞的凋亡
材料和方法
1.细胞系和免疫印迹试验
A549和H1299人肺癌细胞系得自美国典型培养物收集中心(ATCC,Rockville,MD)。所有的细胞都用含10%胎牛血清、10mM谷氨酰胺、100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY)的RPMI1640培养基培养,培养条件为5%CO2,温度为37℃。所用的抗体如下:BAK、BAX、Bcl-2、Fas、FasL、FADD、TNFα、TNFR1、TRADD、β-肌动蛋白(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)和细胞色素c(PharMingen,San Diego,CA)。
2.腺病毒的制备和转导
Ad-mda-7、Ad-p53、Ad-LacZ和Ad-Luc载体的构建方法以前已有报道(Pataer等,2000)。腺病毒载体对细胞系的转导效率通过Ad-LacZ感染细胞来确定。下面试验所需要的病毒滴度至少能转染70%的细胞。
3.凋亡和细胞存活率分析
凋亡细胞用碘化丙锭染色,然后用FACS检测。收获细胞后离心,然后再悬浮于含50g/ml碘化丙锭、0.1%Triton X-100和0.1%柠檬酸钠的磷酸盐缓冲液(PBS)中。样品在4℃储存16小时,在进行FACS(Becton-Dickenson FACScan,MountainView,CA;FL-3channel)分析前剧烈振荡。细胞的存活能力用XXT试验进行分析,将细胞接种到96孔板中,每孔100L液体。第一天细胞用Ad-mda-7、Ad-p53和对照载体转染。在第二天,按照Roche的说明书(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)使细胞与XTT四唑盐共孵育4到24小时。根据酶联免疫吸附(ELISA)检测仪上所得到的吸光度来分析细胞的存活率。
4.线粒体膜电位测定
电位敏感性的荧光染料四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐(TMRE)(Molecular Probes,Eugene,OR)用于测定ΔΨm。细胞与25nM TMRE在37℃、暗室中孵育30分钟,然后用PBS洗涤,在FACS的FL-2通道上分析(FACScan:Becton Dickinson,MountainView,CA)。
5.测定细胞色素c的释放
细胞色素c从线粒体内的释放通过免疫印迹试验进行测定。收获细胞后离心,在pH为7.4的含25mM Tris和5mM MgCl2的冰冷缓冲液中温和裂解5分钟。细胞裂解物用16000g离心5分钟,收获上清液与1×Laemmli还原SDS-PAGE样品缓冲液混合,10-20×106细胞的提取物用15%的SDS-PAGE溶解。将多肽转移到硝酸纤维素膜(0.2μM,Schleicher & Scheull,Keene,NH)上,然后与单克隆抗体7H8.2C12(Pharmingen,San Diego,CA)杂交以检测细胞色素c。
6.统计学分析
附图中显示的数据代表三个或多个独立试验的平均值,横条代表标准差(SD)。多组和配对比较的统计学分析分别用ANOVA和两端斯氏t检验进行分析,p<0.05被认为具有统计学意义。
细胞的存活率利用XTT试验分析。p53-耐受的(A549)和p53-敏感的(H1299)肺癌细胞系在转染后48到72小时其细胞存活率都明显下降(图5A)。通过流式细胞仪检测亚二倍体的细胞群来评价凋亡的诱导情况。A549(p53-耐受的)和H1299(p53-敏感的)肺癌细胞系在Ad-mda-7转导后48到96小时都被诱导出现凋亡。而Ad-Luc或PBS处理的细胞没有出现凋亡(图5B)。Ad-mda-7转导的A549和H1299肺癌细胞系在转导后48小时都发生了细胞色素c的释放。这与凋亡的结果一致,说明线粒体参与凋亡的级联反应。
实施例6:AD-MDA-7对线粒体膜电位变化和凋亡的影响
线粒体膜电位(MMP)的中断是MPT依赖性凋亡因子所诱导的凋亡过程中所发生的典型事件。对于H1299细胞来说,Ad-p53和癌基因抑制剂都可以通过MPT依赖的通道诱导MMP的变化和凋亡的发生,如实施例5所描述的材料和方法。MMP的变化和凋亡的发生都可以被CsA所阻断,后者是一种选择性的MPT依赖性通道阻断剂(图6A,7A)。但是,Ad-mda-7虽然不能诱导MMP的变化,依然能诱导凋亡,并且这种凋亡不被CsA抑制。Ad-p53不能诱导A549细胞的凋亡或MMP的改变(图6B,7B)。但是癌基因抑制剂所诱导的MMP改变和凋亡都可被CsA阻断,因为CsA可抑制MMP依赖型通道。令人感兴趣的是,Ad-mda-7可诱导MMP的改变,但是这种改变不能被CsA反转。另外,CsA不能抑制Ad-mda-7所诱导的凋亡。这些数据都说明Ad-mda-7通过MMP非依赖型通道所诱导的凋亡和细胞色素c释放可被CsA所阻断。
实施例7:环孢霉素A可阻断线粒体膜电位的丢失
为了确定环孢霉素A对线粒体膜电位的影响,H1299细胞(图8A)和A549细胞(图8B)按上面描述的方法用Ad-mda-7、Ad-p53和星形孢菌素(1μM)处理。如图所示,细胞用10μM的环孢霉素A预处理。然后裂解细胞,用TMRE染色后测定MMP的变化。结果发现环孢霉素A确实可以影响MMP的改变。
实施例8:AD-MDA-7上调外在通路
为了确定Ad-mda-7是否能通过Bcl-2家族的基因或死亡受体通路活化线粒体,用免疫印迹试验分析Ad-mda-7处理细胞(A549)内上述BAK、BAX、Bcl-2、TNF-α、TNF-R1、TRADD、FasL、Fas和FADD表达的改变(图9)。试验表明Bcl-2家族的基因没有发生变化,只有FasL的表达出现明显上调。另外,以前的研究表明胱冬酶8的活化和BID的裂解与外在通路的活化一致,可能都是通过Ad-mda-7上调FasL的表达。
实施例9:线粒体膜电位的变化
图10用示意图的形式表明几种可诱导MMP变化的促凋亡基因(如BAX、BAK和p53)的效应,MMP的改变可使MMP依赖型通道开放,细胞色素c释放并与APAF-1和胱冬酶8形成凋亡复合体。这种凋亡复合体可启动凋亡过程,最终由胱冬酶-3、-6和-7裂解各种细胞内的底物。这些促凋亡基因可被CsA或bonkregic acid抑制,后者可封闭MMP依赖型通道防止MMP的变化和细胞色素c的释放。
实施例10:AD-MDA-7调节乳腺癌细胞和肺癌细胞内的-β联蛋白通路
材料和方法
1.细胞系
乳腺癌细胞系MDA-MB-453、T47D、MCF-7、SkBr3以及肺癌细胞系H1299和A549得自美国典型培养物收集中心(ATCC,Rockville,MD)。细胞用DMEM培养基(GIBCO/BRL,Life Technologies,Grand Island,NY)和10%的胎牛血清培养。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)得自Clonetics Inc.(San Diego,CA)。抗-APC兔多克隆抗体、抗-GSK-3β单克隆抗体、抗-PLC-γ单克隆抗体、抗-FAK单克隆抗体、抗pAKT抗体、抗-ILK-1抗体、抗-PTEN抗体和二抗如FITC/罗丹明标记的抗鼠IgG、抗兔IgG购自Santa-Cruz Biotechnology;抗β-联蛋白单克隆抗体、FITC标记的抗-β-联蛋白单克隆抗体、抗-E-钙粘着蛋白单克隆抗体得自TransductionLabs。抗-MDA-7多克隆抗体和单克隆抗体是按照以前所描述的方法制备的(Mhashilkar等,2001)。
2.重组腺病毒的制备和转染
携带mda-7基因的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)按以前描述的方法制备(Su等,1998)。Ad-p53和Ad-Luc(荧光素酶)的构建以前已有描述(Mhashilkar等,2001;Saeki等,2000)。细胞系用各种MOI的Ad-mda-7(以Ad-Luc为对照)转染,如前所述(Mhashilkar等,2001)。注意这些病毒制备物的vp/pfu比例为25。
3.微芯片分析
MICROMAX人类cDNA系统I--定向试剂盒(MICROMAX Human cDNA System I--Direct kit)(NEN Life Science Products,Inc.)是一种含2400个人cDNA的通用筛选芯片,MICROMAX定向系统:人癌基因和肿瘤一致基因(MICROMAX DirectSystem:Human Oncogenes and Tumor Suppressors)(NEN Life Science Products,Inc.)是一种含280个肿瘤相关人cDNA的芯片。从Ad-mda-7或Ad-Luc(1000vp/cell,24hr)转染的H1299细胞内提取mRNA,按照厂商的说明书进行操作。
4.Western印迹分析
细胞裂解物(105-106个细胞悬浮于500μL含5%2-β-巯基乙醇(2βME)的Laemmli缓冲液中)用SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳和Western印迹进行分析,所用的是以前所描述的辣根过氧化物酶的Super-Signal底物(Pierce Inc.)(Mhashilkar等,2001)。
β-联蛋白诱导的荧光素酶分析
TOPFLASH试剂盒(Clontech,Palo Alto,CA)利用的是一个含TCF/LEF启动子的质粒,该启动子控制荧光素酶的表达。β-联蛋白与TCF/LEF的结合以及向核内的转位可诱导荧光素酶活化。肿瘤细胞用携带TCF启动子的质粒转导(1μg/每孔,用脂转染胺介导)。第二天,细胞用Ad-mda-7或Ad-GFP转导,剂量为每个细胞1000vp。48小时后,洗涤细胞并用Reporter裂解试剂盒裂解,分析荧光素酶的活性。
6.台盼蓝染色
细胞的存活率用台盼蓝排出试验进行检测。腺病毒载体处理的肿瘤细胞用胰酶消化后,取一部分与0.1%的台盼蓝以1∶1的比例混合。在光学显微镜下计数总细胞树和存活细胞数。
7.FACS分析和Annexin V试验
利用抗体通过FACS分析细胞表面标记物如上皮细胞钙粘蛋白的变化及凋亡发生的情况,Annexin V分析试剂盒的使用方法见以前的描述(Mhashilkar等,2001)。
8.细胞-细胞粘附试验
载体处理后24小时用胰酶消化细胞,通过不断地吹打混合制备单细胞悬液(单细胞的比例>98%,t=0时)。室温下将细胞转到含PBS/1%FBS的eppendorf管中,浓度为106细胞/ml。每2小时取一部分细胞分析处于悬浮状态的单个活细胞的百分数(细胞团不计在内)。
9.免疫荧光分析
在带槽的波片(Nunc)上生长的细胞用载体转染,48小时后分析MDA-7蛋白的表达水平和/或β-联蛋白和PI3K通路中不同蛋白表达的变化。细胞用乙醇∶乙酸混合物(9.5∶0.5)固定,然后用一抗在4℃处理1小时。细胞用PBS洗涤并用二抗标记。然后在Nikon荧光显微镜下观察波片,并用Nikon数码相机拍照(DXM1200System)。
10.细胞迁移试验
以每孔5×105个细胞的量将肿瘤细胞(A549)接种到6孔组织培养板中。第二天,细胞用Ad-mda-7或Ad-Luc转染,MOI为3000个病毒颗粒(vp)/细胞,转染持续4小时。转染完成后给细胞补充完全培养基。转染后24小时收获细胞用于迁移试验。简言之,将细胞沉降多支管(cell sedimentation manifold)(Creative ScientificMethods,Mesa,AZ)置于Teflon包被的波片上。移去细胞沉降多支管后加上含10%FBS的新鲜RPMI-1640。用连接到倒置显微镜上的Nikon数码相机拍摄每孔中粘附细胞所占的环形面积。
11.统计学分析
本试验的结果是否具有统计学意义用斯氏t-检验进行计算。
与未处理的细胞或Ad-Luc转导的细胞相比,Ad-mda-7转导的乳腺癌细胞(MDA-MB-453)内MDA-7蛋白的表达水平明显升高,而β-联蛋白蛋白的稳态水平只有轻微的下降(图11A)。其他的乳腺癌细胞系和肺癌细胞系也得到了相似的结果。免疫荧光试验表明Ad-mda-7-转导的乳腺癌细胞(H1299)胞浆内有明显的MDA-7染色,而正常的HUVEC细胞内MDA-7只有典型的点状染色(图11B)。Ad-mda-7可诱导H1299肿瘤细胞的凋亡,但是却不能诱导正常细胞的凋亡(图11C)。Ad-mda-7还可以强烈地诱导所检测的所有肺癌细胞(n=5)和乳腺癌细胞(n=6)的凋亡(Jiang等,1996;Mhashilkar等,2001;Saeki等,2000;Patae等,2002)。
实施例11:转染Ad-Mda-7后β-联蛋白的亚细胞定位和分布
本试验分析了转染Ad-Mda-7后β-联蛋白的亚细胞定位和分布。与大多数肿瘤细胞一样,未处理的细胞或Ad-Luc处理的乳腺癌细胞(MDA-MB-453、MCF-7和SkBr3)内出现典型的胞浆和核β-联蛋白染色(图12A)。但是,Ad-mda-7转导的细胞一般不出现核染色,β-联蛋白位于MDA-7表达细胞的浆膜上。胞浆/核β-联蛋白向浆膜的从新分布见于NSCLC细胞(H1299)。需要注意的是选择适当的载体剂量和试验时间可使诱导的凋亡程度降到最低;通过台盼蓝排出试验发现这些细胞中有75%是活的。为了确定β-联蛋白的这种从新分布是否能使细胞进入凋亡的早期阶段,用处理乳腺癌细胞和肺癌细胞,Ad-p53对这些细胞系来说是一种强凋亡诱导因子。在MDA-MB-453细胞内,β-联蛋白的亚细胞分布与Ad-p53、Ad-Luc转染的细胞及未处理的细胞一致,而只有经Ad-mda-7转染的细胞内观察到β-联蛋白的从新分布(图12B),这说明β-联蛋白的从新分布不单单是凋亡信号的结果。同样的结果也见于H1299肺癌细胞。
以前的研究已经证明Ad-mda-7诱导凋亡具有肿瘤选择性。因此,正常的人内皮细胞(HUVECs)用于分析Ad-mda-7对β-联蛋白从新分布的影响。用Ad-mda-7、Ad-p53和Ad-Luc处理的HUVECs与未处理的细胞一样具有相似的核/胞浆弥散β-联蛋白分布模式(图12B)。因此,β-联蛋白从核内的排出应该是MDA-7过量表达特异性的,并且只出现在肿瘤细胞内。
利用TopFlash/FopFlash系统分析β-联蛋白介导的反式激活的功能活性,以此来评价β-联蛋白从新分布所造成的影响。该系统利用TCF/LEF启动子控制荧光素酶的表达。对于H1299NSCLC细胞来说,与作为对照的Ad-GFP构建体相比,Ad-mda-7的转导可显著抑制TopFlash试验中的荧光素酶活性(p=0.001)。而在FopFlash试验中(其中质粒携带突变型TCF/LEF启动子,因此不依赖于β-联蛋白),没有发现对荧光素酶的影响(图12C)。在MDA-MB-453细胞内也观察到了相似的对β-联蛋白介导的荧光素酶活性的抑制。
实施例12:AD-MDA-7上调上皮细胞钙粘蛋白的表达、抑制细胞的迁移、促进细胞的粘附
上皮细胞钙粘蛋白代表了一个膜受体家族,该家族介导钙依赖性的同型细胞-细胞的粘附作用。在肿瘤发展过程中如果钙粘蛋白的表达缺失或功能丧失就会导致细胞的迁移和增殖失控(Ivanov等,2001)。利用实施例10描述的材料和方法用抗上皮细胞钙粘蛋白的单克隆抗体进行表面染色可以发现乳腺癌细胞和肺癌细胞经Ad-mda-7转导后其上皮细胞钙粘蛋白的表达水平显著上升(p=0.001)(图13A)。上皮细胞钙粘蛋白表达水平上调的功能意义还可以通过监测细胞的迁移和细胞-细胞的粘附作用来作进一步评价。细胞经Ad-mda-7或对照的Ad-Luc处理后进行单层细胞迁移试验。与Ad-Luc处理的细胞相比,Ad-mda-7可显著降低细胞的迁移能力(图13B)。检测分散的单个细胞之间的同型细胞-细胞之间的粘附作用。与Ad-Luc或空载体转染的细胞相比,Ad-mda-7转染的细胞发生聚集和同型粘附的比例要明显提高。因此Ad-mda-7转染的细胞中单细胞所占的比例下降(图13C)。
实施例13:AD-MDA-7对APC、GSK-3B、PLC-Γ以及PI3K通路中其他促凋亡基因的调节
APC和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)分子是β-联蛋白的负调节因子。Ad-mda-7转导MDA-MB-453细胞(图14A)和H1299细胞都可以上调肿瘤抑制蛋白APC和GSK-3β的表达。用Ad-mda-7转导细胞分析PI3K通路中各种原癌基因的表达情况。原癌基因如PI3K、FAK、ILK-1和PLC-γ可被Ad-mda-7明显抑制,但是在Ad-Luc处理的H1299细胞内没有变化(图14B)。H1299肺癌细胞用于评价pFAK的调节(图14C(i))。Ad-mda-7可以明显下调H1299和A549NSCLC细胞内pFAK和PI3K的表达。PI3K抑制剂LY294002作为阳性对照。Ad-mda-7对H1299细胞内的pFAK的抑制能力比LY294002强(比较图14C(i)的条带3和条带4)。Ad-mda-7处理的乳腺癌细胞和肺癌细胞内Akt和pAkt的表达水平也下降。Ad-mda-7可明显上调肿瘤抑制因子PTEN的表达,PTEN是PI3K信号通路中的中枢负调节因子(图14C(ii))。
实施例14:AD-MDA-7感染的前列腺癌细胞和前列腺上皮细胞内MDA-7的表达
材料和方法
1.细胞系和细胞的培养
人前列腺癌细胞系DU145、LNCaP和PC-3得自美国典型培养物收集中心(Manassas,VA)。正常的前列腺上皮细胞系PrEC得自Clonetics(San Diego,CA),DU145、LNCaP和PC-3细胞用含10%胎牛血清、抗生素和L-谷氨酰胺(GIBCO/BRL)的RPMI 1640培养基培养。PrEC用PrEBM培养基培养,按照厂家的说明书添加一些成分。
2.重组腺病毒载体的构建
携带mda-7基因的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)载体按照如下过程构建。mda-7基因连接上内部CMV-IE启动子,后面连接上SV40多聚腺苷酸尾巴[poly(A)]。Ad-Luc(荧光素酶)用作对照载体。简言之,携带基因表达盒的Ad5载体与质粒pJM17共转染HEK 293细胞以获得重组病毒Ad-mda7和AdLuc。挑取噬菌斑获得病毒颗粒,用PCR/限制性酶切分析和DNA序列测定确定基因组序列的正确性。在293细胞内繁殖病毒并通过色谱纯化。
3.基因转导
利用编码绿色荧光蛋白的Ad载体(Ad-GFP)进行的预试验表明MOI为3000的腺病毒可使93.4%以上的DU145和PC-3细胞,76.2%以上的LNCaP细胞及82%以上的PrEC细胞感染。因此,MOI为3000的Ad-mda-7和Ad-Luc用于随后的试验。细胞接种到10-cm的培养皿中,每个培养皿接种5-10×105个细胞,用于蛋白表达的分析或者通过FACS分析细胞周期。细胞在接种后24小时用Ad载体感染。
4.细胞增殖试验
所有细胞系都接种到6孔组织培养板中,接种密度为每孔1×105个细胞。然后用Ad-mda-7或Ad-Luc感染肿瘤细胞,或者以PBS为空白对照处理肿瘤细胞。每个处理组的细胞都接种3个复孔,培养5天。在预定的时间点上用胰酶消化并收获细胞,然后用0.4%的台盼蓝(GIBCO BRL,Grand Island,NY,USA)染色以显示死细胞。用血细胞计数器计数活细胞。
5.凋亡细胞染色
细胞接种到6孔组织培养板中,接种密度为每孔1×105个细胞,然后用Ad-mda-7或Ad-Luc感染。感染后72小时细胞通过Hoechst 33258染色(SigmaChemical Co.,St.Louis,MO,USA)分析凋亡情况。根据凋亡小体和/或染色体凝集情况确定凋亡细胞。
6.细胞周期分析
细胞接种到10cm的培养皿中(每个培养皿接种5-10×105个细胞),然后用Ad-mda-7和Ad-Luc感染,或者用PBS处理。在转染后的特定时间点上,用胰酶消化后收获细胞,用冰冷的PBS洗涤两次,70%的乙醇固定,储存在-20℃。细胞用冰冷的PBS洗涤两次后用RNA酶处理(37C处理30分钟,500单位/ml;SigmaChemicalCo.),DNA用PI染色(50g/ml;Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN,USA)。细胞所处的周期及凋亡的比例(处于亚-G0/G1期的细胞)利用FACScan(EPICS XL-MCL;Beckman Coulter,Inc.,Fullerton,CA,USA)检测。
7.有丝分裂指数
Ad-mda-7感染后72小时收获细胞并用细胞周期分析中的方法固定。固定后细胞用碘化丙锭染色,RNA酶处理,然后用荧光显微镜分析。每个样品至少在荧光显微镜下随机计数500个细胞,缺少核膜及染色体出现凝集的细胞被鉴定为发生有丝分裂的细胞。
8.免疫印迹分析
细胞用Ad-mda-7和Ad-Luc感染,或者用PBS处理。在37℃孵育细胞以指定的时间,然后收集细胞制备全细胞裂解物。制备方法为:用含蛋白酶抑制剂(Roche,Germany)的1×SDS样品缓冲液(62.5mM Tris-HCL、2%SDS、10%甘油、50mM二硫苏糖醇(dithiothereitol)、4mM尿素、0.01%溴酚蓝)裂解细胞。蛋白样品在95℃的水浴中加热5分钟。12000rpm离心10分钟后从上清液中收集蛋白样品,利用BCA反应(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL,USA)定量检测蛋白含量。50g蛋白质通过10%SDS-PAGE(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)分开,电转移到硝酸纤维素膜上(Hybond-ECL;Amersham Biosciences,Inc.,Piscataway,NJ,USA)。用溶于PBS-Tween 20(0.1%)中的5%乳液在室温下封闭1小时,在4℃条件下以适当稀释度的一抗杂交过夜。然后用PBS-Tween 20洗涤两次,每次15分钟,再与辣根过氧化物酶连接的二抗(Amersham Biosciences,Inc.)在室温下共孵育1小时,二抗用5%milk/PBS-Tween 20稀释,稀释度为1∶2000。用PBS-Tween 20洗涤两次,每次15分钟,然后用ECL Western印迹检测试剂(Amersham Biosciences,Inc.)检测增强型化学发光(ECL)胶片(Hyperfilm;Amersham Biosciences,Inc.)以确定蛋白的量。另外,为了分析磷酸化的蛋白质,用Tris缓冲盐代替PBS。杂交膜用抗β-肌动蛋白抗体(Sigma Chemical Co.)探测。如图所示,为了确保上样量一致,转移的蛋白量一致,重组MDA-7蛋白用于制备兔多克隆抗体,在用亲和层析进一步纯化。这个抗体所用的稀释度为1∶5000(用1mg/ml的储存液稀释);胱冬酶9(1∶500,兔多克隆抗体),胱冬酶3(1∶500,兔多克隆抗体),PARP(1∶250,鼠单克隆抗体)(Pharmingen,San Diego,DA,USA);β-肌动蛋白(1∶5000,鼠单克隆抗体)(Sigma Chemical Co.);磷酸化-JNK(1∶1000,兔多克隆抗体);NFkB(1∶500,兔多克隆抗体),磷酸化-STAT3(1∶500,鼠单克隆抗体)(Santa CruzBiotechnology);PKR,磷酸化-Tyk2,磷酸化-STAT1,Cdc25C(1∶1000,兔多克隆抗体)(Cell Signaling Technology,Inc.);cyclin B1(1∶200,鼠单克隆抗体;Lab Vision Corp.,Fremont,CA,USA);磷酸化-Jak1(1∶500,羊多克隆抗体),p27Kip1(1∶500,兔多克隆抗体),Chk1(1∶1000,鼠单克隆抗体),Cdc2(1∶500,鼠单克隆抗体)(Santa Cruz Biotechnology);Chk2(1∶1500,兔多克隆抗体),(NovusBiologicals,Littleton,Co,USA);p21WAF1(Oncogene Research Products,Boston,MA);周期蛋白A(1∶2000,鼠单克隆抗体)(Sigma Chemical Co.);周期蛋白E(1∶1000,鼠单克隆抗体)(BD Transduction Laboratories)。
为了检测细胞内MDA-7蛋白的表达,DU145、LNCaP和PC-3细胞接种到6孔组织培养板中(每孔1×105个细胞),然后用编码MDA-7的腺病毒载体(Ad-mda-7)或编码荧光素酶的腺病毒载体(Ad-Luc)感染。用磷酸盐缓冲液(PBS)处理的空白转染细胞作为阴性对照。转染后24小时、48小时和72小时,所有细胞的总裂解物用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分开,分析转染Ad-mda-7的细胞内MDA-7蛋白的表达情况(图16)。转染后24到72小时Mda-7在所有细胞内成功诱导和表达。PrEC细胞也得到相似的结果。
实施例15:MDA-7的过量表达可抑制前列腺癌细胞的增殖
DU145、LNCaP、PC-3和PrEC细胞接种到6孔组织培养板中(每孔1×105个细胞),按照实施例13描述的方法感染。感染1-5天内每天计数活细胞。与Ad-Luc感染的对照细胞或PBS处理的细胞相比,DU145和LNCaP细胞在Ad-mda-7感染后第四天出现明显的增殖抑制(p<0.01)。感染Ad-Luc或Ad-mda-7的PC-3和PrEC细胞没有观察到明显的增殖抑制(图17)。
实施例16:MDA-7的过量表达可诱导前列腺癌细胞的凋亡
用Ad-mda-7感染后,通过FACScan和Hoechst 33258染色分析DU145、LNCaP、PC-3和PrEC细胞的凋亡变化。Ad-mda-7感染后72小时,利用荧光激活细胞分类仪(FACS)分析,结果表明三株肿瘤细胞中处于亚G0/G1期的细胞数明显增多,这是出现凋亡变化的标志。但是,感染Ad-Luc的细胞或PBS处理的细胞没有观察到上述变化。同样,转染Ad-mda-7或Ad-Luc的正常细胞中处于亚G0/G1期的细胞数也没有出现明显的变化(图18A)。为了进一步确证这种结果,在感染后72小时进行Hoechst 33258染色。Ad-mda-7感染后肿瘤细胞出现凋亡,而正常细胞没有出现。感染Ad-Luc的所有细胞都没有出现变化(图18B)。
实施例17:MDA-7的过量表达可诱导G2期停滞
为了确定MDA-7是否如以前所报道的人肺癌细胞系、乳腺癌细胞系和黑色素瘤细胞系试验(Saeki等,2000)一样能够诱导前列腺癌细胞发生G2/M期停滞,利用实施例13所描述的FACScan分析细胞周期。用碘化丙锭(PI)染色的细胞周期试验结果表明,与Ad-Luc感染的对照细胞或PBS处理的细胞相比,用Ad-mda-7感染后72小时,DU145、LNCaP、PC-3细胞中处于G2/M期的细胞百分率明显增加(图19)。但是,与肿瘤细胞相比,PrEC细胞出现的G2/M期抑制的很弱。这说明MDA-7可选择性地影响肿瘤细胞。为了确定MDA-7是否可以诱导G2期停滞或M期停滞,测定DU145、LNCaP、PC-3和PrEc细胞的有丝分裂指数(图19)。结果表明Ad-mda-7可诱导G2-期停滞,但不能诱导M期停滞。
实施例18:MDA-7对前列腺癌细胞的抑制功能
为了确定Ad-mda-7是否可以诱导凋亡,如实施例13所描述的那样检测DU145和LNCaP细胞内胱冬酶的活化。结果表明DU145和LNCaP细胞经Ad-mda-7转染后72小时胱冬酶级联被活化,其中包括胱冬酶9、胱冬酶3和多聚(ADP-核糖)多聚酶(PARP)的裂解。这些结果说明MDA-7可通过前列腺癌细胞内的胱冬酶级联反应诱导凋亡。
另外,利用Western印迹分析DU145和LNCaP细胞内MDA-7的信号转导功能以确定MDA-7是如何诱导生长抑制和凋亡的(图20A和20B)。下游信号靶位Stat1、Stat3、JNK和NFkB出现磷酸化或被抑制。MDA-7诱导LNCaP细胞内磷酸化Jak1的增加、DU145细胞内磷酸化Tyk2的显著增加以及DU145细胞内磷酸化Jak1的轻微下降。Ad-mda-7可引起两株细胞内Stat1的磷酸化水平升高,而Stat3的磷酸化水平下降或保持不变。Ad-mda-7可显著诱导两株细胞内JNK的磷酸化,而DU145细胞内的NFkB下降。这些结果说明Ad-mda-7可调节前列腺癌细胞内的信号转导通路。
实施例19:与CDC25C表达下调相关的G2期停滞
为了研究Ad-mda-7有效诱导前列腺癌细胞发生G2期停滞的机制,通过实施例13所描述的Western印迹分析与G1/S期转换点和G2/M期转换点有关的蛋白。在这个分析试验中,DU145和LNCaP细胞用PBS处理,或者用Ad-mda-7或Ad-Luc感染。处理后72小时制备总细胞裂解物,进行FACS分析,蛋白浓度用SDS-PAGE检测。与对照细胞相比(以未处理的细胞或感染Ad-Luc的细胞为对照),Ad-mda-7感染的两株细胞内磷酸化和未磷酸化的Cdc25C都减少,Chk1、Chk2和细胞周期蛋白B1的表达下降(图21A和21B)。另外,Ad-mda-7可明显降低LNCaP细胞内的Cdc2而不降低DU145细胞内的Cdc2。而且,将Ad-mda-7加到两株细胞内可降低细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E的表达水平,这两个蛋白与G1/S期转换点和S期有关。LNCaP细胞内与G1/S期转换点和/或G2/M期转换点有关的p27和p21表达升高,而DU145细胞内的这两个蛋白没有变化。这说明Ad-mda-7通过促进p53的表达来增加p27和p21(图21B)。这些结果表明可诱导与Cdc25C下调有关的G2期停滞,与以前所描述的细胞周期FACS分析结果一致。
实施例20:分泌型Mda-7抑制内皮细胞的分化和迁移
材料和方法
1.细胞培养
人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549(腺癌)和人胚胎肾细胞(293)得自美国典型培养物收集中心(ATCC;Rockville,MD),用添加10%胎牛血清(GIBCO-BRL,Grand Island,NY)的Hams/F12培养基(A549)和DMEM(293)培养基培养。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人皮肤毛细血管内皮细胞(HMVEC)购自Clonetics(Walkerville,MD),用添加5%胎牛血清的内皮细胞基础培养基培养,再添加厂商提供的“弹头试剂盒”内的试剂。本试验中所用的内皮细胞是3-9代的细胞。
2.分泌型MDA-7蛋白的制备和纯化
通过携带全长mda-7 cDNA的真核表达载体转染293细胞制备MDA-7蛋白。转染后细胞在潮霉素(0.4μg/ml)中筛选14天。稳定表达的细胞系(293-mda-7)通过Western印迹试验和ELISA来检测其产生可溶性MDA-7的情况。通过ELISA分析发现以每孔1×106细胞接种后24小时,293-mda-7细胞大约可产生30-50ng/mlsMDA-7。为了大规模纯化MDA-7蛋白,使293-mda-7细胞在150mm组织培养板中生长到90%的细胞汇合。收集组织培养上清液,用以前所描述的亲和层析方法纯化蛋白(Blumberg等,2001)。sMDA-7蛋白的大小和纯度通过银染凝胶电泳和Western印迹分析确定。
3.内皮细胞分析
内皮细胞分化(微管形成)分析利用体外血管形成分析试剂盒(Chemicon,Temecula,CA)完成。简言之,HUVEC和HMVEC细胞生长到80%汇合后,收集细胞,重悬到生长介质中,然后以每孔2×104细胞的量接种到包被基质胶的96孔板内(Chemicon,Temecula,CA)。在孔内加入不同浓度的MDA-7蛋白,37℃孵育24小时。以未加MDA-7蛋白的孔作为阴性对照。通过在光学显微镜下计数微管的数目来确定sMDA-7抑制微管形成的能力。所有的样品都设双复孔。以MDA-7和内皮抑制素(Calbiochem)作为对照试验,细胞按照上述方法接种并用各种浓度的蛋白处理。微管形成分析前24小时,进行中和试验的HUVEC细胞在6孔板内用IL-22R中和抗体(5ng/ml)预处理。其他所有的试验过程都与上面所描述的一样。
4.内皮细胞迁移试验
用HUVEC细胞进行迁移试验。细胞在含5%胎牛血清(FBS)的基础培养基中饥饿过夜,然后收集细胞并重悬于同样的培养基中,以每孔1×105个细胞的浓度接种到带8μm滤膜(Millipore,Cambridge,MA)的24孔穿孔插入物(transwell insert)的上表面。将插入物放到6孔板中,6孔板的孔中含有添加VEGF(100ng/ml)或VEGF+MDA-7(10ng/ml)的培养基。含穿孔的培养板在37℃孵育过夜使细胞迁移。在后面的时间中,拆开孔,膜用结晶紫固定,迁移到孔的下层的细胞在高倍显微镜(×40)下计数。
5.Western印迹分析
为了确定加入sMDA-7后pSTAT-3表达的变化,按照以前描述的方法进行Western印迹分析(Wang等,2002)。简言之,胰酶消化后收集细胞,重悬到裂解缓冲液中(62.5mM Tris-HCl、2%SDS、10%甘油、4M尿素)。每种蛋白样品(50μg)都稀释到20μl含5%2-巯基乙醇(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)的裂解缓冲液中,在95℃的水浴中加热5分钟。蛋白提取物通过在垂直板凝胶电泳仪(Bio-Rad)上进行10%SDS-PAGE而分开。分开的蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜(Hybond-ECL;Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,England)上,然后用封闭液(5%奶粉和0.3%Tween 20,溶于PBS中)封闭1小时。膜与抗pSTAT-3的一抗(1∶1000)和抗β-肌动蛋白的一抗(1∶10000)共孵育,然后与辣根过氧化物酶标记的二抗(Amersham)共孵育。最后,利用Amersham的增强型化学发光蛋白印迹检测系统在增强型化学发光胶片(Hyperfilm,Amersham)上观察蛋白。
6.利用基质胶Plus Assay分析体内的血管形成
为了确定sMDA-7的抗血管形成活性,进行体内血管形成试验。简言之,sMDA-7和bFGF与500μl基质胶(Beckton and Dickenson)在冰上混合,然后注射到无胸腺裸鼠的皮下。注射只含bFGF(60ng)的基质胶的动物作为阳性对照,注射不含生长因子的基质胶的动物作为阴性对照。每组5只动物。试验在第10天终止,收获基质胶,拍照后按照以前描述的方法进行血红蛋白分析(Caudel等,2002)。
7.体内试验
在试验开始前,将106亲本293细胞和293-mda-7细胞注射到裸鼠皮下以观察其在体内形成肿瘤的能力,观察期为1个月。以这种浓度的细胞接种没有观察到肿瘤形成。为了进行体内混合试验,人肺癌细胞(A549)生长到90%汇合时收集起来,重悬到无菌PBS中,浓度为5×106个细胞/毫升。这些肿瘤悬液与等量的亲本293细胞或293-mda-7细胞(5×106个细胞/毫升)混合,温和振荡后注射到无胸腺的BALB/c雌裸鼠皮下(每只动物注射106个细胞)。每组含8只动物。如前所述监测和测量肿瘤的生长情况(Maheshwari等,1991)。试验结束时通过CO2吸入麻醉动物,取出肿瘤进行下一步的试验。
为了评价sMDA-7对远端肿瘤的影响,在裸鼠右下腹部皮下注射A549肿瘤细胞(5×106细胞)以建立皮下肿瘤。当肿瘤长到50-60mm3时,将动物分成两组(每组10只)。一组接受含亲本293细胞(1×106)的基质胶,一组接受293-mda-7细胞(1×106)。将含细胞的基质胶皮下注射到荷瘤小鼠的右上腹部。按照上面描述的方法测量肿瘤,观察sMDA-7对肿瘤生长的影响。在试验结束时麻醉动物,取出肿瘤进行下一步的试验。
8.免疫组化分析
按照以前描述的方法(Wang等,2002)将组织染色以检测CD31和TUNEL。阴性对照是不用一抗染色或用同型抗体染色的组织切片。组织切片进行定量分析,用双盲的方式解释结果。
9.统计学分析
斯氏t-检验用于计算试验结果的统计学意义。
实施例21:分泌型MDA-7(SMDA-7)可抑制内皮细胞的分化
分泌型MDA-7(sMDA-7)可抑制内皮细胞的分化。用HUVEC细胞和HMVEC细胞评价sMDA-7抑制内皮细胞分化的能力(图22A)。加入sMDA-7蛋白可显著抑制内皮细胞内微管的形成。抑制效应是剂量依赖性的,在10ng/ml时可完全抑制微管的形成(图22A)。而未处理的细胞没有出现对微管形成的抑制(图22A)。去除试验表明所观察到的对内皮细胞微管形成的抑制是由于sMDA-7蛋白而不是制备物中不相关的蛋白。在与HUVEC细胞接触前利用免疫方法使sMDA-7的活性丧失会导致对内皮细胞微管形成的抑制功能丢失(图22B)。而且,相同浓度的sMDA-7对HUVEC细胞和HMVEC细胞的抑制效应是重组人血管他丁的25倍(图22A)。sMDA-7对内皮细胞微管形成的这种抑制活性说明sMDA-7具有较高的抗血管形成活性。
为了确定sMDA-7是否能抑制内皮细胞的迁移,在血管内皮细胞生长因子(VEGF)存在的条件下进行迁移试验。sMDA-7(10ng/ml)可阻断血管形成诱导因子诱导的内皮细胞迁移,而在对照组中没有观察到抑制效应(图22C)。这种抑制作用是剂量依赖性的,浓度为50ng时达到最大抑制效应。利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为诱导因子也可以观察到相似的抑制活性。
利用试验来验证sMDA-7对血管形成的抑制是否是通过IFN-γ和IP-10的产生来介导的。在不同时间点收集sMDA-7处理的HUVEC细胞的培养上清液,通过ELISA检测IFN-γ和IP-10的含量。IP-10而不是IFN-γ可被sMDA-7诱导。但是所产生的IP-10量(15-32pg/ml)没有显著增加,不足以解释sMDA-7所产生的显著抑制效应。
实施例22:SMDA-7活化内皮细胞内STAT-3的表达
sMDA-7与内皮细胞接触后所激发的信号转导机制用实施例1所描述的材料和方法进行研究。利用Western印迹来分析HUVEC细胞和HMVEC细胞内STAT-3的活化(图23A)。内皮细胞培养基中加入sMDA-7可使磷酸化形式的STAT-3(pSTAT-3)蛋白表达显著升高,最早在加入sMDA-74小时后就可以观察到。pSTAT-3表达的增加是时间依赖性的,在处理后24小时达到最高值(图23A)。经sMDA-7处理后HUVEC细胞内定位到细胞核内的pSTAT-3蛋白增多,而未处理的细胞未出现这种变化也说明了sMDA-7对pSTAT-3的激活作用(图23B)。
实施例23:MDA-7对内皮细胞分化成毛细管样结构(微管形成)的抑制作用是由STAT-3的活化介导的,并且可通过阻断IL-22R1部分恢复
sMDA-7对内皮细胞分化的抑制效应是受体介导的。利用实施例19的材料和方法进行试验以确定sMDA-7对内皮细胞分化的抑制效应是否是由受体介导的,试验方法是在sMDA-7存在或不存在的情况下加入抗白细胞介素22的受体1(IL-22R1)的封闭抗体(图24)。与对照组相比,经sMDA-7(5ng)处理的HUVEC细胞微管形成能力被完全抑制(图24)。但是,用IL-22R1封闭抗体预处理HUVEC细胞可完全消除MDA-7对微管形成的抑制效应(图24)。IL-22R1抗体的这种消除作用是剂量依赖性的。加入1ng封闭抗体(1∶5的比例)只能部分恢复细胞的微管形成能力(<60%,图24),而加入5ng封闭抗体(1∶1的比例)就可以完全恢复HNVEC细胞的微管形成能力(>90%,图24)。加入中和性抗体对HUVEC细胞的微管形成能力没有显著影响(图24)。
为了进一步确定IL-22R1抗体的特异性,利用抗IL-10受体(IL-10R)的中和性抗体进行下一步的试验。在存在IL-10R中和性抗体的情况下,未处理的对照组与sMDA-7处理组一样可以抑制HUVEC细胞形成的微管(图24)。这些结果说明sMDA-7通过IL-22R1介导对内皮细胞的特异性抑制效应。半定量分析试验表明与对照组相比,sMDA-7可显著抑制sMDA-7/IL-24和IL-22R1抗体处理细胞所形成的微管数量(p=0.001)(图24)。
HUVEC细胞内pSTAT-3蛋白表达的活化也可以证明sMDA-7的抑制效应是由受体介导的。加入sMDA-7后HUVEC细胞内的磷酸化形式的STAT-3(pSTAT-3)蛋白的表达明显增高(图24)。但是在存在IL-22R1抗体的情况下sMDA-7不能介导pSTAT-3表达的增高(图24)。这些结果说明sMDA-7的抗内皮细胞活性是由IL-22R1介导的。
实施例24:包裹SMDA-7蛋白的基质胶可抑制体内的血管生成
为了确定sMDA-7是否能在体内抑制血管形成,按照实施例19所描述的方法进行基质胶分析试验。SMDA-7蛋白(10ng)包裹到含bFGF的基质胶内,然后植入小鼠的皮下。在植入后10天检查基质胶,结果发现与对照组相比,bFGF诱导的血管形成被sMDA-7所抑制(图25A)。基质胶内血红蛋白含量的测定结果表明与不含bFGF的、只含bFGF的以及含重组人内皮抑制素的对照相比,sMDA-7可明显抑制bFGF诱导的血管形成(p=0.0001)(图25B)。尤其令人吃惊的是,sMDA-7导致的血红蛋白含量减少比无bFGF的对照组还要明显。
实施例25:分泌MDA-7的293-MDA7细胞与肿瘤细胞在体内混合可抑制皮下的人肺癌异种移植物
通过实施例19描述的体内混合试验检测sMDA-7抑制肿瘤生长的能力。A549肿瘤细胞与亲本293细胞或293-mda-7细胞混合(1∶1的比例)后注射到小鼠右下腹部的皮下。在可触摸到肿瘤时开始测量肿瘤的大小。与注射A549细胞和亲本293细胞混合物的动物相比,注射A549细胞和293-mda-7细胞混合物的动物体内的肿瘤生长明显受到抑制(p=0.001)(图26A)。裸鼠体内单独注射293细胞或293-mda-7细胞不能形成肿瘤。
移植后22天处死动物,取出肿瘤进行下一步的试验。Western印迹分析表明MDA-7蛋白在含A549肿瘤细胞和293-mda-7细胞混合物的肿瘤内的表达水平与含A549肿瘤细胞和293细胞混合物的肿瘤内的表达水平一样(图26B)。肿瘤组织的组织病理学检测表明对照组和试验组动物的肿瘤细胞增殖指数或肿瘤细胞的浸润没有显著区别(图26C)。但是,通过CD31染色发现含293-mda-7细胞的肿瘤血管化水平比含293细胞的对照肿瘤明显减少(图26C)。肿瘤血管化的降低与肿瘤内血红蛋白含量的下降成正相关关系,接受A549肿瘤细胞和293-mda-7细胞混合物的动物与接受A549肿瘤细胞和亲本293细胞混合物的动物相比所收获的肿瘤内血红蛋白的含量减少(图26D)。试验组动物肿瘤组织的TUNEL染色显示内皮细胞和内皮细胞周围的肿瘤细胞发生了凋亡,如棕色区域所显示(图26C)。而对照组的肿瘤组织没有出现TUNEL阳性染色。
实施例26:包裹分泌MDA-7的293细胞的基质胶可抑制皮下人肺癌移植物的生长
如实施例19所描述,在小鼠右下腹部皮下接种A549细胞。当肿瘤长到50mm3时,将产生sMDA-7的293细胞(293-mda-7)或亲本293细胞(对照)包裹到基质胶中,然后皮下植入到离肿瘤较远的位置(右上腹部),监测肿瘤的生长情况。与对照组相比,分泌MDA-7的293细胞可显著抑制A549肺癌异种移植物的生长(p=0.001)(图27A)。与对照组相比,植入包裹的分泌MDA-7蛋白的293细胞可使肿瘤的生长抑制到50%。为了确定抑制效应来自于sMDA-7,取动物的血清样品通过Western印迹和ELISA检测血清内的MDA-7蛋白。通过Western印迹分析发现植入分泌MDA-7的293细胞的动物血清在40Kd处出现sMDA-7的致密条带(图27A)。而对照组只出现很浅的条带,这些条带可能是与血清蛋白的交叉反应造成。通过ELISA检测到sMDA-7的血清水平约为50ng/ml。
在试验结束时,收获肿瘤和含293-mda-7细胞的基质胶,然后进行染色。利用抗MDA-7的单克隆抗体对来源于接受293-mda-7细胞的动物的基质胶进行免疫组化分析,结果发现有MDA-7蛋白的表达,这些区域呈棕色(图27B)。而接受亲本293细胞的动物来源的基质胶中没有检测到MDA-7蛋白的表达(图27B)。另外,通过CD31染色发现经293-mda-7处理的肿瘤与亲本293细胞处理的肿瘤相比血管化程度降低(图27B)。肿瘤组织的组织病理学检测表明接受293细胞的动物与接受293-mda-7细胞的动物相比没有明显差异(图27B)。
实施例27:AD-MDA7通过细胞内的MDA-7蛋白诱导肿瘤细胞特异性的生长停滞和凋亡
为了确定MDA-7的亚细胞定位对其功能的影响,构建能表达靶向性MDA-7蛋白的腺病毒载体。购自Invitrogen的靶向性腺病毒载体经改造后可以使其表达的MDA-7定位到胞浆、线粒体或内质网(ER)内。每种载体都在表达的蛋白C末端添加一个myc尾巴。能将蛋白定位到胞浆的载体含有一个标准的表达骨架,能将蛋白定位到线粒体和ER的载体除了含有与胞浆载体一样的骨架外,还含有与其亚细胞结构相适应的信号序列。线粒体靶向性载体带有一个N端线粒体靶向性信号,而ER靶向性载体带有一个N端ER信号肽序列和一个C端固位序列。全长mda-7 cDNA经PCR删除终止密码子和作为分泌信号的前48位氨基酸编码序列后亚克隆到这些载体内。PCR还可用于提供与Invitrogen靶向性载体相匹配的限制性酶切位点,这些位点与载体内的C端尾巴处于同一框架内。上游PCR引物(含SalI位点)为ttttttGTCGACatggcccagggccaagaattcc(SEQ ID NO:3),下游PCR引物(含NotI位点)为ttttttGCGGCCGCgagcttgtagaatttctgc(SEQ ID NO:4)。这些质粒已被证明可以将MDA-7蛋白成功地定位到适当的亚细胞结构。用限制性内切酶PmlI和XbaI从这些靶向性质粒中切下mda-7基因及其信号序列,这两个序列为腺病毒构建体,然后用标准方法将其亚克隆到腺病毒穿梭载体内。
MDA-7蛋白最初被认为是核蛋白(Jiang等)。通过对预测的一级序列的分析发现MDA-7蛋白含有一个信号序列,这个信号序列可能负责蛋白的分泌。翻译的蛋白产物表明其在N端有一个强疏水区(图28)。据预测MDA-7蛋白可在48位氨基酸处裂解,含49-206位氨基酸的剩余蛋白产物可从细胞内分泌出来。为了进一步分析分泌型MDA-7蛋白产物,利用HEK 293细胞构建稳定表达mda-7的细胞系。这些细胞的培养上清液在约40kD处有一条明显的免疫应答性MDA-7条带(图28)。将主要的分泌型MDA-7蛋白条带测序,结果表明49位的氨基酸是胞外蛋白的第一个氨基酸。用Ad-mda7处理细胞可是肿瘤细胞和正常细胞分泌MDA-7蛋白。Ad-mda7处理后,MDA-7从肿瘤细胞中释放的动力学要稍迟于胞内MDA-7表达的动力学。但是,肿瘤细胞和正常细胞内的释放动力学稍有不同。肿瘤细胞在转染后24小时内就可以分泌MDA-7蛋白,而正常细胞中MDA-7蛋白的释放要缓慢一些。然而肿瘤细胞和正常细胞所释放的MDA-7的绝对水平是一样的。
已知Ad-mda7的存在可以活化应激基因(图29A)。非小细胞肺癌细胞系H1299用Ad-mda7或Ad-Luc(500vp/cell或1000vp/cell),然后通过Western印迹分析应激相关蛋白的表达情况。图29A显示Ad-mda7可引起应激蛋白BiP/GRP78、GADD34、PP2A和胱冬酶7的显著增加。这些应激蛋白参与哺乳动物应激反应的活化,被称为解折叠蛋白效应(UPR)。为了确证这一结果,进一步分析了UPR通路中的其他成员,包括胱冬酶7、12和XBP-1。如图29B所示,这些UPR相关蛋白也可因Ad-mda7的转导而上调,说明UPR是MDA-7杀伤肿瘤细胞的机制。另一种UPR活化的特征性蛋白PERK的表达也进行了分析,结果发现H1299细胞内没有检测到PERK。以前的试验表明PERK只表达于分泌型的细胞,如胰岛β细胞。因此,NSCLC细胞内缺乏PERK的表达是不奇怪的。
免疫组化试验表明Ad-mda7也可以阻断钙离子流、破坏线粒体的稳定性(图30)。分析试验在Ad-mda7或Ad-Luc转导的H1299肿瘤细胞上进行。通过共聚焦显微镜观察钙离子流和线粒体的完整性。如图30所示,Ad-mda7的转导可引起线粒体内钙离子浓度增加,从而破坏了线粒体的稳定性。这种不稳定性与几种应激蛋白的升高一起可以解释为何存在Ad-mda7时会导致凋亡增加。
实施例28:MDA-7是高度糖基化的
如图28所示,分泌型MDA-7蛋白的分子量较高,这说明它是糖基化的,与以前所预测的MDA-7序列中存在3个N糖基化位点相一致。用不同的糖苷酶如糖肽酶F(glycoF)、唾液酸酶和内切糖苷酶H(EndoH)处理稳定表达分泌型MDA-7蛋白的293-mda7细胞,如图31B所示,用能裂解糖-蛋白质键的glycoF消化分泌型蛋白可使MDA-7的分子量下降。用唾液酸酶和EndoH消化可得到同样的结果,只是分子量下降的程度较小。这种结果可被各种组合的去糖苷酶试验所证实(图31B)。另外,试验结果还表明分泌型MDA-7蛋白有各种形式的糖基化,因为未处理的样品能出现多个条带,而去糖基化的蛋白出现的条带要少的多。
实施例29:分泌型MDA-7不能诱导细胞死亡
由于糖基化的蛋白在内质网和高尔基体内被加工的过程中通常需要糖,因此我们评价了糖基化及分泌抑制因子对MDA-7在胞内的处理和分泌的影响。衣霉素可抑制蛋白质在内质网内添加糖链,而布雷菲德菌素A可抑制蛋白从内质网向高尔基体的转运。二者都可阻断蛋白的分泌。在这些糖基化及分泌抑制因子存在的条件下评价了Ad-mda7所引起的细胞毒性。不断增加衣霉素和布雷菲德菌素A的水平直到MDA-7蛋白分泌的抑制可被检测到。如图26A和26B所示,用2μg/ml衣霉素处理H1299细胞就可以完全阻断MDA-7蛋白的分泌,而1μg/ml以下的布雷菲德菌素A就可以达到这种效应。值得注意的是用任何一种药物阻断分泌都可以导致细胞内MDA-7蛋白的积聚。但是用台盼蓝染色分析细胞毒性时却发现糖基化抑制因子不会抑制Ad-mda7的细胞杀伤活性。虽然2μg/ml衣霉素不能诱导细胞死亡,但是Ad-mda7和2μg/ml衣霉素联合使用时可导致细胞死亡的增加。这种死亡的增加可能是由于衣霉素可使细胞对凋亡敏感而造成的。值得注意的是Ad-Luc/衣霉素对照样品与Ad-Luc和衣霉素处理样品表现出相似的细胞毒性。因此,分泌型MDA-7蛋白不能诱导肿瘤细胞的死亡,不是Ad-mda7介导的凋亡并最终杀伤肿瘤细胞所必须的(图32B)。
这个结果说明是胞内MDA-7而不是分泌型MDA-7主要负责激发细胞死亡。这个假说可通过在肿瘤细胞内加入分泌型MDA-7并检测细胞死亡来进一步确证。初步试验表明加入Ad-mda7转导细胞的上清液可以导致细胞死亡;但是,仔细分析发现细胞的死亡是由培养上清液中残存的Ad-mda7引起的。如果培养上清液经处理后使Ad-mda7的污染降到最低,则含MDA-7的上清液所诱导的细胞死亡是可以忽略的。将293细胞的上清液加到肿瘤细胞培养物中只观测到很低水平的细胞死亡(约在背景水平之上10-15%),这说明分泌型MDA-7至少在这些细胞所释放的浓度上不足以导致肿瘤细胞的实质性死亡。同时给予抗MDA-7抗体可抑制MDA-7引起的细胞死亡,而对照的IgG没有这种作用。当抗MDA-7抗体加入到Ad-mda7感染培养物中,只观察到很微弱的细胞杀伤效应,说明Ad-mda7处理培养物所产生的杀伤效应主要来自胞内蛋白。
实施例30:细胞混合旁观者分析
以前的研究发现Ad-mda7在H460细胞内有很强的旁观者效应(Mhashilkar等,2001)。在这个试验中,H460细胞用Ad-mda7转染,然后用抗MDA-7抗体和AnnexinV进行免疫染色。在共聚焦显微镜下可观察到有些细胞是Annexin V阳性的,但是却不表达MDA-7。Annexin V阳性/MDA-7阴性细胞发生的几率很低,在许多细胞系中都没有观察到。因此,为了进一步评价分泌型MDA-7对临近细胞凋亡诱导的影响,进行了一系列的旁观者试验。Ad-mda7转导细胞与Ad-GFP转导的天然细胞混合,分析GFP阳性细胞的凋亡情况。发生凋亡的GFP阳性细胞很少。这些结果进一步说明分泌型MDA-7不能诱导肿瘤细胞发生如Ad-mda7转导肿瘤细胞那样的高水平凋亡,还说明细胞-细胞的接触不能增强旁观者效应。
实施例31:MDA-7的亚细胞结构靶向性
如果MDA-7的分泌不是Ad-mda7介导的凋亡所必须的,那么MDA-7的表达怎么导致细胞死亡呢?这个问题可以通过将MDA-7蛋白靶向性地定位到不同的亚细胞结构中并且分析对MDA-7介导的细胞毒性的影响来回答。还有一个需要解答的问题是Ad-mda7感染细胞内上述生理表达期间释放到细胞质或细胞核的MDA-7是否负责诱导细胞死亡。为了了解MDA-7的亚细胞结构定位对细胞存活能力的影响,构建了能使其表达的MDA-7靶向性地定位到不同亚细胞结构的表达载体。在构建这些载体的过程中,首先删除了mda-7 cDNA上的分泌信号序列。如图33A所示,细胞核靶向性载体含有三个细胞核定位信号,内质网靶向性载体含有内质网信号序列和定位信号,细胞浆靶向性载体不含靶向性信号,蛋白质默认表达在细胞浆内。全长质粒使用细胞浆靶向性载体骨架但是含有全长的mda-7 cDNA。这些质粒表达的所有蛋白在其C端都含有一个myc尾巴。图33B显示每个载体都可以成功地促进细胞内的MDA-7蛋白的表达,而只有包含N端分泌信号的全长mda-7 cDNA可以使MDA-7蛋白分泌到培养基中。
蛋白印迹试验用于检测H1299细胞的裂解物和上清液中MDA-7蛋白的表达,H1299细胞转染了图33A所示的各种mda-7构建体。添加myc尾巴不会影响MDA-7蛋白的稳定性,因为全长mda-7对照表达质粒(无myc尾巴)可以表达相同水平的MDA-7蛋白。myc尾巴也不会干扰蛋白的处理或分泌,因为含myc尾巴的全长蛋白与全长质粒或Ad-mda7表达的全长MDA-7蛋白一样出现两条带,这两条带中较大的一条是由于myc尾巴(图33B)。含myc尾巴的MDA-7蛋白与全长MDA-7和Ad-mda7处理细胞来源天然MDA-7一样是分泌型的并且是糖基化的。
实施例32:MDA-7的亚细胞结构定位影响其细胞毒性
将载体瞬时转染到H1299细胞内,然后利用免疫组化试验确定蛋白表达的靶向性。如图34所示,每个载体都可以成功地将表达的MDA-7靶向性定位到预定的亚细胞结构内。全长质粒所表达的MDA-7蛋白可见于细胞内的分泌颗粒,与Ad-mda7转导后所观察到的结果一致。通过与其他已知的定位于这些细胞器的分子的表达模式比较可以确定这些靶向性质粒的精确亚细胞定位。例如,全长MDA-7显示共同定位于分泌小泡内。细胞核靶向性MDA-7与Hoescht共同定位,内质网靶向性MDA-7与BiP共同定位。
分析靶向性MDA-7蛋白的抗肿瘤效应以确定其对细胞存活能力的影响。这可以通过克隆形成试验进行分析。如图35所示,细胞核或细胞浆mda-7表达构建体对稳定转染子克隆的形成都没有影响。但是,全长的分泌型MDA-7蛋白和靶向性定位到内质网的MDA-7蛋白都可以导致形成的克隆减少,说明MDA-7在这些环境中具有致死性。
如图36所示利用试验进一步分析Ad-mda7对细胞的细胞毒效应。H1299细胞用mda-7靶向性质粒转染并用活细胞/死细胞试验来检测。靶向性定位到内质网的MDA-7蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖,因为可以看到死细胞数量增加(红色,溴乙啶染色)。对照蛋白、细胞浆靶向性MDA-7以及细胞核靶向性MDA-7蛋白的细胞杀伤活性很弱。另外,利用Hoescht染色来评价靶向性MDA-7表达的细胞毒效应(图37)。结果发现细胞核活细胞浆表达的MDA-7对细胞核的形态没有影响。但是,含分泌型或ER定位的MDA-7蛋白的细胞其细胞核形态出现变化,显示发生了凋亡。
实施例33:线粒体靶向性MDA-7的亚细胞定位
PC3前列腺癌细胞分别用编码GFP对照、全长MDA-7或线粒体靶向性MDA-7的质粒转导,分析其克隆形成能力。与对照组相比,全长MDA-7可使形成的克隆减少35%,而线粒体靶向性MDA-7还可以使形成的克隆及PC细胞的存活能力进一步降低。因此,靶向性定位到线粒体的MDA-7还可以增强其抗肿瘤效应和凋亡诱导效应(图38)。
实施例34:抑制AD-MDA7介导的NF-KB活化可在人肺癌细胞中产生协同治疗效应
利用试验来确定转基因MDA-7的表达是否能导致NF-κB的活化,以及分析NF-κB在保护肿瘤细胞以免发生MDA-7诱导的凋亡中的作用。mda-7基因的腺病毒表达载体(Ad-mda7)转染两株NSCLC细胞系(H1299和A549)可导致NF-κB的活化,这可被电子流动性漂移试验(EMSA)确定(图39A)。用Ad-mda7转染细胞后20-36小时可以观察到NF-κB的明显活化,而用PBS处理的对照细胞或用Ad-luc(表达荧光素酶的载体)转染的细胞没有观察到NF-κB的活化(图39A)。另外,NF-κB的活化是剂量依赖性的,增加Ad-mda7的浓度可使活化的NF-κB增多。NF-κB的活化与NF-κB抑制因子(I-κBα)的降解相一致。与Ad-luc转染的对照细胞相比,用过量表达决定域负突变I-κB的腺病毒载体(Ad-mIkB)转染H1299细胞可显著抑制Ad-mda7诱导的NF-κB转录及其DNA结合活性,导致凋亡的肿瘤细胞增多(图39B)。
另外,利用非甾体抗炎药舒林酸抑制MDA-7介导的NF-κB活化可产生协同治疗效应(图40)。舒林酸而不是吲哚美辛可抑制NF-κB通路的活化。舒林酸可以剂量依赖的方式抑制TNF介导的NF-κB活化(图41)。另外,Ad-mda7可与舒林酸协同诱导H1299细胞的凋亡(图42)。利用舒林酸和Ad-mda7联合治疗可显著增加处于亚G1期的细胞群(图43)。这些结果说明MDA-7在肺癌细胞内的表达可诱导NF-κB的活化,利用Ad-mIkB或舒林酸抑制其活化可增强治疗效果(图44)。
实施例35:AD-MDA-7可活化晚期肿瘤患者的免疫系统
在正在进行的剂量升级I期临床试验中,利用非复制型腺病毒构建体(Ad-mda7)将mda-7导入到晚期腺癌患者的肿瘤内。患者经组织学检测确定是腺癌,至少有一个肿瘤可进行针头注射,该肿瘤可通过手术切除,Karnofsky表现状况≥70%,血液学指标、肾功能及肝功能指标都合适。存在活动的CNS转移瘤的患者、长期使用免疫抑制剂的患者、或者已经使用过腺病毒治疗的患者都排除在本试验之外。手术切除晚期肿瘤的患者在瘤内单次注射2×1010到2×1012病毒颗粒(vp)(图45)。到目前为止已经完成了8个试验(18个患者)。
为了确定瘤内注射MDA-7的治疗效果,通过检测血清细胞因子的浓度和淋巴细胞亚群的含量来分析对Ad-mda7的全身免疫应答。大多数患者都出现全身细胞因子的瞬时升高(18个患者中有14个出现IL-6升高、15个出现IL-10升高、8个出现γIFN升高、10个出现TNFα升高)(图46,图47)。注射高剂量病毒的某些患者其瘤内的IL-6、IFN和IL-10mRNA表达水平也有升高。另外,在mda-7处理后15天CD3+CD8+T细胞增加30+13%(图48,图49)。这些结果说明MDA-7可增加全身TH1细胞因子的产生、动员CD8+T细胞。图46表明注射Ad-mda7后,循环中的IL-6、IFN-γ、IL-10和TNF-α显著升高,然后在30天时回落到基线水平。细胞因子的升高与CD+T细胞的增多和CD4/CD8比例的反转相一致。因此,这些结果表明Ad-mda7可活化免疫,并且与rhMDA-7在培养物中的原TH1活性相一致。
实施例36:分泌型Mda-7抑制内皮细胞的分化和迁移
材料和方法
1.细胞培养
人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549(腺癌)和人胚胎肾细胞(293)得自美国典型培养物收集中心(ATCC;Rockville,MD),用添加10%胎牛血清(GIBCO-BRL,GrandIsland,NY)的Hams/F12培养基(A549)和DMEM(293)培养基培养。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人皮肤毛细血管内皮细胞(HMVEC)购自Clonetics(Walkerville,,MD),用添加5%胎牛血清的内皮细胞基础培养基培养,再添加厂商提供的“弹头试剂盒”内的试剂。本试验中所用的内皮细胞是3-9代的细胞。
2.分泌型MDA-7蛋白的制备和纯化
通过携带全长mda-7cDNA的真核表达载体转染293细胞制备MDA-7蛋白。转染后细胞在潮霉素(0.4μg/ml)中筛选14天。稳定表达的细胞系(293-mda-7)通过Western印迹试验和ELISA来检测其产生可溶性MDA-7的情况。通过ELISA分析发现以每孔1×106细胞接种后24小时,293-mda-7细胞大约可产生30-50ng/mlsMDA-7。为了大规模纯化MDA-7蛋白,使293-mda-7细胞在150mm组织培养板中生长到90%的细胞汇合。收集组织培养上清液,用以前所描述的亲和层析方法纯化蛋白(Blumberg等,2001)。sMDA-7蛋白的大小和纯度通过银染凝胶电泳和Western印迹分析确定。
3.内皮细胞分析
内皮细胞分化(微管形成)分析利用体外血管形成分析试剂盒(Chemicon,Temecula,CA)完成。简言之,HUVEC和HMVEC细胞生长到80%汇合后,收集细胞,重悬到生长介质中,然后以每孔2×104细胞的量接种到包被基质胶的96孔板内(Chemicon,Temecula,CA)。在孔内加入不同浓度的MDA-7蛋白,37℃孵育24小时。以未加MDA-7蛋白的孔作为阴性对照。通过在光学显微镜下计数微管的数目来确定sMDA-7抑制微管形成的能力。所有的样品都设双复孔。以MDA-7和内皮抑制素(Calbiochem)作为对照试验,细胞按照上述方法接种并用各种浓度的蛋白处理。微管形成分析前24小时,进行中和试验的HUVEC细胞在6孔板内用IL-22R中和抗体(5ng/ml)预处理。其他所有的试验过程都与上面所描述的一样。
4.内皮细胞迁移试验
用HUVEC细胞进行迁移试验。细胞在含5%胎牛血清(FBS)的基础培养基中饥饿过夜,然后收集细胞并重悬于同样的培养基中,以每孔1×105个细胞的浓度接种到带8μm滤膜(Millipore,Cambridge,MA)的24孔穿孔插入物的上表面。将插入物放到6孔板中,6孔板的孔中含有添加VEGF(100ng/ml)或VEGF+MDA-7(10ng/ml)的培养基。含穿孔(transwell)的培养板在37℃孵育过夜使细胞迁移。在后面的时间中,拆开孔,膜用结晶紫固定,迁移到孔的下层的细胞在高倍显微镜(×40)下计数。
5.检测产生的IP-10和IFN-γ
HUVEC细胞接种到6孔板内(每孔1×106个细胞)并用sMDA-7(10ng/ml)处理。在处理后6、24和48小时分别收集细胞培养上清液,1200rpm理性,然后用购买的ELISA试剂盒分析其中的IP-10和IFN-γ蛋白。试验按照厂商(R&D Systems,Minneapolis,MN)的说明书进行。以重组IFN-γ处理的细胞作为IP-10的阳性对照,以Ad-mda7(3000vp/cell)处理的细胞作为IFN-γ的阳性对照,未处理的细胞作为本试验的阴性对照。样品设四复孔,对于每个浓度的sMDA-7来说,数据为四复孔的平均值。
6.Western印迹分析
为了确定加入sMDA-7后pSTAT-3表达的变化,按照以前描述的方法进行Western印迹分析(Wang等,2002)。简言之,胰酶消化后收集细胞,重悬到裂解缓冲液中(62.5mM Tris-HCl、2%SDS、10%甘油、4M尿素)。每种蛋白样品(50μg)都稀释到20μl含5%2-巯基乙醇(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)的裂解缓冲液中,在95℃的水浴中加热5分钟。蛋白提取物通过在垂直板凝胶电泳仪(Bio-Rad)上进行10%SDS-PAGE而分开。分开的蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜(Hybond-ECL;Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,England)上,然后用封闭液(5%奶粉和0.3%Tween 20,溶于PBS中)封闭1小时。膜与抗pSTAT-3的一抗(1∶1000)和抗β-肌动蛋白的一抗(1∶10000)共孵育,然后与辣根过氧化物酶标记的二抗(Amersham)共孵育。最后,利用Amersham的增强型化学发光蛋白印迹检测系统在增强型化学发光胶片(Hyperfilm,Amersham)上观察蛋白。
7.免疫荧光分析
利用免疫荧光分析试验检测STAT-3的活化。HUVEC接种到双孔波片上,每孔1×104个细胞,然后用sMDA-7(10ng/ml)处理4小时,PBS洗涤,与冷乙酸混合,然后用图抗人pSTAT-3抗体(1∶1000,Cell Signaling Technology,Beverly,MA)和罗丹明标记的抗兔二抗(1∶5000;Molecular Probes,Eugene,OR)染色以检测磷酸化的STAT-3(pSTAT-3)。波片用抗褪色的计数试剂(Vector Laboratories)计数。染色后1-2小时用荧光显微镜拍照。
8.利用基质胶和测定法分析体内的血管形成
为了确定sMDA-7的抗血管形成活性,进行体内血管形成试验。简言之,sMDA-7和bFGF与500μl基质胶(Beckton and Dickenson)在冰上混合,然后注射到无胸腺裸鼠的皮下。注射只含bFGF(60ng)的基质胶的动物作为阳性对照,注射不含生长因子的基质胶的动物作为阴性对照。每组5只动物。试验在第10天终止,收获基质胶,拍照后按照以前描述的方法进行血红蛋白分析(Caudel等,2002)
9.体内试验
在试验开始前,将106亲本293细胞和293-mda-7细胞注射到裸鼠皮下以观察其在体内形成肿瘤的能力,观察期为1个月。以这种浓度的细胞接种没有观察到肿瘤形成。为了进行体内混合试验,人肺癌细胞(A549)生长到90%汇合时收集起来,重悬到无菌PBS中,浓度为5×106个细胞/毫升。这些肿瘤悬液与等量的亲本293细胞或293-mda-7细胞(5×106个细胞/毫升)混合,温和振荡后注射到无胸腺的BALB/c雌裸鼠皮下(每只动物注射106个细胞)。每组含8只动物。如前所述监测和测量肿瘤的生长情况(Maheshwari等,1991)。试验结束时通过CO2吸入麻醉动物,取出肿瘤进行下一步的试验。
为了评价sMDA-7对远端肿瘤的影响,在裸鼠右下腹部皮下注射A549肿瘤细胞(5×106细胞)以建立皮下肿瘤。当肿瘤长到50-60mm3时,将动物分成两组(每组10只)。一组接受含亲本293细胞(1×106)的基质胶,一组接受293-mda-7细胞(1×106)。将含细胞的基质胶皮下注射到荷瘤小鼠的右上腹部。按照上面描述的方法测量肿瘤,观察sMDA-7对肿瘤生长的影响。在试验结束时麻醉动物,取出肿瘤进行下一步的试验。
10.免疫组化分析
按照以前描述的方法(Wang等,2002)将组织染色以检测CD31和TUNEL。阴性对照是不用一抗染色或用同型抗体染色的组织切片。组织切片进行定量分析,用双盲的方式解释结果。
11.统计学分析
斯氏t-检验用于计算试验结果的统计学意义。
实施例37:分泌型MDA-7(SMDA-7)可抑制内皮细胞的分化
分泌型MDA-7(sMDA-7)可抑制内皮细胞的分化。用HUVEC细胞和HMVEC细胞评价sMDA-7抑制内皮细胞分化的能力(图22A)。加入sMDA-7蛋白可显著抑制内皮细胞微管的形成。抑制效应是剂量依赖性的,在10ng/ml时可完全抑制微管的形成(图22A)。而未处理的细胞没有出现对微管形成的抑制(图22A)。去除试验表明所观察到的对内皮细胞微管形成的抑制是由于sMDA-7蛋白而不是制备物中不相关的蛋白。在与HUVEC细胞接触前利用免疫方法使sMDA-7的活性丧失会导致对内皮细胞微管形成的抑制功能丢失(图22B)。而且,相同浓度的sMDA-7对HUVEC细胞和HMVEC细胞的抑制效应是重组人血管他丁的25倍(图22A)。sMDA-7对内皮细胞微管形成的这种抑制活性说明sMDA-7具有较高的抗血管形成活性。
为了确定sMDA-7是否能抑制内皮细胞的迁移,在血管内皮细胞生长因子(VEGF)存在的条件下进行迁移试验。sMDA-7(10ng/ml)可阻断血管形成诱导因子诱导的内皮细胞迁移,而在对照组中没有观察到抑制效应(图22C)。这种抑制作用是剂量依赖性的,浓度为50ng时达到最大抑制效应。利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为诱导因子也可以观察到相似的抑制活性。
利用试验来验证sMDA-7对血管形成的抑制是否是通过IFN-γ和IP-10的产生来介导的。在不同时间点收集sMDA-7处理的HUVEC细胞的培养上清液,通过ELISA检测IFN-γ和IP-10的含量。IP-10而不是IFN-γ可被sMDA-7诱导。但是所产生的IP010量(15-32pg/ml)没有显著增加,不足以解释sMDA-7所产生的显著抑制效应。
实施例38:SMDA-7活化内皮细胞内STAT-3的表达
sMDA-7与内皮细胞接触后所激发的信号转导机制用实施例1所描述的材料和方法进行研究。利用Western印迹来分析HUVEC细胞和HMVEC细胞内STAT-3的活化(图23A)。内皮细胞培养基中加入sMDA-7可使磷酸化形式的STAT-3(pSTAT-3)蛋白表达显著升高,最早在加入sMDA-7 4小时后就可以观察到。pSTAT-3表达的增加是时间依赖性的,在处理后24小时达到最高值(图23A)。经sMDA-7处理后HUVEC细胞内定位到细胞核内的pSTAT-3蛋白增多,而未处理的细胞未出现这种变化也说明了sMDA-7对pSTAT-3的激活作用(图23B)。
实施例39:MDA-7对内皮细胞分化成毛细管样结构(微管形成)的抑制作用是由STAT-3的活化介导的,并且可通过阻断IL-22R1部分恢复
sMDA-7对内皮细胞分化的抑制效应是受体介导的。利用实施例19的材料和方法进行试验以确定sMDA-7对内皮细胞分化的抑制效应是否是由受体介导的,试验方法是在sMDA-7存在或不存在的情况下加入抗白细胞介素22的受体1(IL-22R1)的封闭抗体(图24)。与对照组相比,经sMDA-7(5ng)处理的HUVEC细胞微管形成能力被完全抑制(图24)。但是,用IL-22R1封闭抗体预处理HUVEC细胞可完全消除MDA-7对微管形成的抑制效应(图24)。IL-22R1抗体的这种消除作用是剂量依赖性的。加入1ng封闭抗体(1∶5的比例)只能部分恢复细胞的微管形成能力(<60%,图24),而加入5ng封闭抗体(1∶1的比例)就可以完全恢复HNVEC细胞的微管形成能力(>90%,图24)。加入中和性抗体对HUVEC细胞的微管形成能力没有显著影响(图24)。
为了进一步确定IL-22R1抗体的特异性,利用抗IL-10受体(IL-10R)的中和性抗体进行下一步的试验。在存在IL-10R中和性抗体的情况下,未处理的对照组与sMDA-7处理组一样可以抑制HUVEC细胞形成的微管(图24)。这些结果说明sMDA-7通过IL-22R1介导对内皮细胞的特异性抑制效应。半定量分析试验表明与对照组相比,sMDA-7可显著抑制sMDA-7/IL-24和IL-22R1抗体处理细胞所形成的微管数量(p=0.001)(图24)。
HUVEC细胞内pSTAT-3蛋白表达的活化也可以证明sMDA-7的抑制效应是由受体介导的。加入sMDA-7后HUVEC细胞内的磷酸化形式的STAT-3(pSTAT-3)蛋白的表达明显增高(图24)。但是在存在IL-22R1抗体的情况下sMDA-7不能介导pSTAT-3表达的增高(图24)。这些结果说明sMDA-7的抗内皮细胞活性是由IL-22R1介导的。
实施例40:包裹SMDA-7蛋白的基质胶可抑制体内的血管生成
为了确定sMDA-7是否能在体内抑制血管形成,按照实施例19所描述的方法进行基质胶分析试验。SMDA-7蛋白(10ng)包裹到含bFGF的基质胶内,然后植入小鼠的皮下。在植入后10天检查基质胶,结果发现与对照组相比,bFGF诱导的血管形成被sMDA-7所抑制(图25A)。基质胶内血红蛋白含量的测定结果表明与不含bFGF的、只含bFGF的以及含重组人内皮抑制素的对照相比,sMDA-7可明显抑制bFGF诱导的血管形成(p=0.0001)(图25B)。尤其令人吃惊的是,sMDA-7导致的血红蛋白含量减少比无bFGF的对照组还要明显。
实施例40:分泌MDA-7的293-MDA7细胞与肿瘤细胞在体内混合可抑制皮下的人肺癌异种移植物。
通过实施例19描述的体内混合试验检测sMDA-7抑制肿瘤生长的能力。A549肿瘤细胞与亲本293细胞或293-mda-7细胞混合(1∶1的比例)后注射到小鼠右下腹部的皮下。在可触摸到肿瘤时开始测量肿瘤的大小。与注射A549细胞和亲本293细胞混合物的动物相比,注射A549细胞和293-mda-7细胞混合物的动物体内的肿瘤生长明显受到抑制(p=0.001)(图26A)。裸鼠体内单独注射293细胞或293-mda-7细胞不能形成肿瘤。
移植后22天处死动物,取出肿瘤进行下一步的试验。Western印迹分析表明MDA-7蛋白在含A549肿瘤细胞和293-mda-7细胞混合物的肿瘤内的表达水平与含A549肿瘤细胞和293细胞混合物的肿瘤内的表达水平一样(图26B)。肿瘤组织的组织病理学检测表明对照组和试验组动物的肿瘤细胞增殖指数或肿瘤细胞的浸润没有显著区别(图26C)。但是,通过CD31染色发现含293-mda-7细胞的肿瘤血管化水平比含293细胞的对照肿瘤明显减少(图26C)。肿瘤血管化的降低与肿瘤内血红蛋白含量的下降成正相关关系,接受A549肿瘤细胞和293-mda-7细胞混合物的动物与接受A549肿瘤细胞和亲本293细胞混合物的动物相比所收获的肿瘤内血红蛋白的含量减少(图26D)。试验组动物肿瘤组织的TUNEL染色显示内皮细胞和内皮细胞周围的肿瘤细胞发生了凋亡,如棕色区域所显示(图26C)。而对照组的肿瘤组织没有出现TUNEL阳性染色。
实施例41:包裹分泌MDA-7的293细胞的基质胶可抑制皮下人肺癌移植物的生长
如实施例19所描述,在小鼠右下腹部皮下接种A549细胞。当肿瘤长到50mm3时,将产生sMDA-7的293细胞(293-mda-7)或亲本293细胞(对照)包裹到基质胶中,然后皮下植入到离肿瘤较远的位置(右上腹部),监测肿瘤的生长情况。与对照组相比,分泌MDA-7的293细胞可显著抑制A549肺癌异种移植物的生长(p=0.001)(图27A)。与对照组相比,植入包裹的分泌MDA-7蛋白的293细胞可使肿瘤的生长抑制到50%。为了确定抑制效应来自于sMDA-7,取动物的血清样品通过Western印迹和ELISA检测血清内的MDA-7蛋白。通过Western印迹分析发现植入分泌MDA-7的293细胞的动物血清在40Kd处出现sMDA-7的致密条带(图27A)。而对照组只出现很浅的条带,这些条带可能是与血清蛋白的交叉反应造成。通过ELISA检测到sMDA-7的血清水平约为50ng/ml。
在试验结束时,收获肿瘤和含293-mda-7细胞的基质胶,然后进行染色。利用抗MDA-7的单克隆抗体对来源于接受293-mda-7细胞的动物的基质胶进行免疫组化分析,结果发现有MDA-7蛋白的表达,这些区域呈棕色(图27B)。而来源于接受亲本293细胞的动物的基质胶中没有检测到MDA-7蛋白的表达(图27B)。另外,通过CD31染色发现经293-mda-7处理的肿瘤与亲本293细胞处理的肿瘤相比血管化程度降低(图27B)。肿瘤组织的组织病理学检测表明接受293细胞的动物与接受293-mda-7细胞的动物相比没有明显差异(图27B)。
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本说明书和权利要求书中所描述的和所要求的所有组合物和方法按照本说明书的描述通过适当的试验都可以制备和实施。虽然本发明的组合物和方法是以某些实施方案的形式来描述的,但是,本领域的技术人员在本发明的概念、精神和范围内,可对本发明的组合物和方法,或者本文所描述的方法的步骤以及步骤的顺序作出调整。另外,某些化学和生理相关的试剂可替代本文所描述的试剂,也可以得到相同或相似的结果。本领域技术人员所熟知的这些相似的替代或调整都被认为是包含在权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
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序列表
<110>S.查达(CHADA,SUNIL)
A.帕塔尔(PATAER,ABUJIANG)
A.马西尔卡(MHASHILKAR,ABNER)
R.拉梅西(RAJAGOPAL RAMESH)
J.罗斯(ROTH,JACK)
S.斯维舍尔(SWISHER,STEVE)
<120>利用MDA-7增强免疫诱导的方法
<130>INGN:099US
<140>未知
<141>2003-03-03
<150>60/404,932
<151>2002-08-21
<150>60/370,335
<151>2002-04-05
<150>60/361,755
<151>2002-03-05
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>718
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
acaagacatg actgtgatga ggagctgctt tcgccaattt aacaccaaga agaattgagg 60
ctgcttggga ggaaggccag gaggaacacg agactgagag atgaattttc aacagaggct 120
gcaaagcctg tggactttag ccagaccctt ctgccctcct ttgctggcga cagcctctca 180
aatgcagatg gttgtgctcc cttgcctggg ttttaccctg cttctctgga gccaggtatc 240
aggggcccag ggccaagaat tccactttgg gccctgccaa gtgaaggggg ttgttcccca 300
gaaactgtgg gaagccttct gggctgtgaa agacactatg caagctcagg ataacatcac 360
gagtgcccgg ctgctgcagc aggaggttct gcagaacgtc tcggatgctg agagctgtta 420
ccttgtccac accctgctgg agttctactt gaaaactgtt ttcaaaaact accacaatag 480
aacagttgaa gtcaggactc tgaagtcatt ctctactctg gccaacaact ttgttctcat 540
cgtgtcacaa ctgcaaccca gtcaagaaaa tgagatgttt tccatcagag acagtgcaca 600
caggcggttt ctgctattcc ggagagcatt caaacagttg gacgtagaag cagctctgac 660
caaagccctt ggggaagtgg acattcttct gacctggatg cagaaattct acaagctc 718
<210>2
<211>206
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Asn Phe Gln Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Arg Pro
1 5 10 15
Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val Val
20 25 30
Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser Gly
35 40 45
Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val
50 55 60
Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met
65 70 75 80
Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val
85 90 95
Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu
100 105 110
Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr
115 120 125
Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe
130 135 140
Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe
145 150 155 160
Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala
165 170 175
Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu
180 185 190
Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu
195 200 205
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:合成引物
<400>3
ttttttgtcg acatggccca gggccaagaa ttcc 34
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:合成引物
<400>4
ttttttgcgg ccgcgagctt gtagaatttc tgc 33
Claims (76)
1.一种免疫原性组合物,该组合物含有:(a)免疫原性分子或编码免疫原性分子的核酸;以及(b)重组MDA-7多肽或表达MDA-7多肽的游离核酸。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物存在于药用稀释液中。
3.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述免疫原性分子是抗原。
4.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述抗原是肿瘤抗原。
5.如权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述肿瘤抗原是PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。
6.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述抗原是微生物抗原、病毒抗原或真菌抗原。
7.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述免疫原性分子至少是一种多肽。
8.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述免疫原性分子是T细胞活化分子。
9.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述MDA-7多肽含有SEQ ID NO:2的49到206位氨基酸。
10.如权利要求14所述的组合物,其特征在于,所述MDA-7多肽含有SEQ ID NO:2的序列。
11.如权利要求1所述的组合物,该组合物含有重组MDA-7多肽。
12.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述核酸分子是表达载体。
13.如权利要求12所述的组合物,其特征在于,所述表达载体是病毒载体。
14.如权利要求13所述的组合物,其特征在于,所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、甲病毒载体、弹状病毒载体或疱疹病毒载体。
15.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述MDA-7多肽含有分泌信号。
16.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物还含有胶体载体。
17.如权利要求1所述的免疫原性组合物,其特征在于,所述组合物还含有细胞因子或编码细胞因子的游离核酸。
18.一种促进患者免疫应答的方法,所述方法包括给予患者有效量的MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸,其中,所述MDA-7多肽可促进患者的免疫应答。
19.如权利要求18所述的方法,该方法还包括给予患者免疫原性分子或编码免疫原性分子的核酸。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述免疫应答是抗免疫原性分子的免疫应答。
21.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述免疫原性分子是抗原。
22.如权利要求21所述的方法,其特征在于,所述抗原是肿瘤抗原。
23.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述肿瘤抗原是PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。
24.如权利要求22所述的方法,其特征在于,i)免疫原性分子和ii)MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸是在化疗、放疗或手术前给予患者的。
25.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述免疫原性分子和MDA-7多肽是在化疗、放疗或手术过程中给予患者的。
26.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述免疫原性分子和MDA-7多肽是在化疗、放疗或手术后给予患者的。
27.如权利要求21所述的方法,其特征在于,所述抗原是微生物抗原、病毒抗原或真菌抗原。
28.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述免疫原性分子至少含有一种多肽。
29.如权利要求18所述的方法,该方法还包括确定需要促进免疫应答的患者。
30.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述MDA-7是通过给予含编码MDA-7多肽的游离核酸的载体而提供给患者的。
31.如权利要求30所述的方法,其特征在于,所述载体是表达载体。
32.如权利要求31所述的方法,其特征在于,所述表达载体是病毒载体。
33.如权利要求32所述的方法,其特征在于,所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、甲病毒载体、弹状病毒载体或疱疹病毒载体。
34.如权利要求30所述的方法,其特征在于,所述载体还含有编码免疫原性分子的核酸序列。
35.如权利要求18所述的方法,所述方法还包括检测免疫应答。
36.如权利要求35所述的方法,其特征在于,所述免疫应答包括提高T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突状细胞的活性。
37.如权利要求35所述的方法,其特征在于,所述免疫应答包括提高患者体内细胞因子浓度或诱导树突状细胞成熟。
38.如权利要求37所述的方法,其特征在于,所述细胞因子是干扰素或白细胞介素。
39.如权利要求38所述的方法,其特征在于,所述干扰素是IFN-α、IFN-β或IFN-γ。
40.如权利要求38所述的方法,其特征在于,所述白细胞介素是IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10或IL-12。
41.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述MDA-7多肽含有SEQ ID NO:2的49到206位氨基酸。
42.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述MDA-7多肽含有SEQ ID NO:2的序列。
43.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述MDA-7多肽还含有分泌信号。
44.如权利要求43所述的方法,其特征在于,所述分泌信号还被定义为与一个疏水核相连的带正电荷的N末端区域。
45.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述MDA-7多肽通过持续灌注或静脉注射全身性给予患者。
46.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述MDA-7多肽被直接注射到免疫应答减弱的部位。
47.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述免疫原性分子是结核杆菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性调节素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外壳-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨针抗原、风疹抗原、流行性腮腺炎抗原、α甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2或WT1。
48.如权利要求48所述的方法,其特征在于,所述编码免疫原性分子的核酸序列还包括表达载体。
49.一种治疗肿瘤患者的方法,所述方法包括给予患者肿瘤抗原;以及有效量的MDA-7多肽,其中,所述MDA-7多肽为患者提供治疗效果。
50.如权利要求49所述的方法,其特征在于,所述肿瘤抗原是PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。
51.一种治疗肿瘤患者的方法,所述方法包括(a)给予患者免疫原性分子以诱导抗该免疫原性分子的免疫应答;以及(b)给予患者有效量的MDA-7多肽,其中,与单独使用免疫原性分子治疗相比,所述MDA-7多肽可增强所诱导的免疫应答并可抑制肿瘤生长。
52.如权利要求51所述的方法,其特征在于,所述免疫原性分子是肿瘤抗原。
53.如权利要求52所述的方法,其特征在于,所述肿瘤抗原是PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。
54.如权利要求51所述的方法,其特征在于,所述抑制是肿瘤大小的下降或肿瘤生长速度的降低。
55.一种治疗性组合物,所述组合物含有重组MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的游离核酸以及至少一种细胞因子或编码细胞因子的游离核酸。
56.如权利要求55所述的组合物,其特征在于,所述细胞因子被进一步限定为干扰素α、β或γ。
57.如权利要求56所述的组合物,其特征在于,所述细胞因子被进一步限定为干扰素γ。
58.如权利要求55所述的组合物,其特征在于,所述MDA-7多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:2的序列。
59.如权利要求55所述的组合物,其特征在于,所述MDA-7多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:2的49到206位氨基酸组成。
60.如权利要求55所述的组合物,其特征在于,所述编码MDA-7多肽的核酸的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
61.一种增强抗免疫原的免疫应答的方法,所述方法包括(a)给予患者一种含有免疫原氨基酸序列的多肽;以及(b)给予患者有效量的第一组合物和第二组合物,其中,所述第一组合物含有MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸,第二组合物含有干扰素或编码干扰素的核酸。
62.如权利要求61所述的方法,其特征在于,所述干扰素是干扰素α、β或γ。
63.如权利要求62所述的方法,其特征在于,所述干扰素是干扰素γ。
64.如权利要求61所述的方法,其特征在于,所述第一和第二组合物包含在同一个药物制剂中。
65.如权利要求61所述的方法,其特征在于,所述第一和第二组合物包含在不同的药物制剂中。
66.一种在患者体内诱导肿瘤产生抗血管形成作用的方法,所述方法包括给予患者体内的IL-22受体阳性细胞有效量的MDA-7多肽,该多肽可与IL-22受体结合并诱导肿瘤的抗血管形成作用。
67.如权利要求66所述的方法,其特征在于,所述IL-22受体阳性细胞是内皮细胞。
68.如权利要求67所述的方法,其特征在于,所述内皮细胞不是临近肿瘤的。
69.如权利要求66所述的方法,其特征在于,所述MDA-7多肽是分泌型MDA-7多肽,并且是糖基化的。
70.一种诱导细胞发生死亡的方法,所述方法包括获得MDA-7靶向性构建体,其中,所述MDA-7靶向性构建体包含一个编码MDA-7多肽的核酸和一个启动子控制下的靶向性序列,并使细胞与一定量的MDA-7靶向性构建体接触以使MDA-7靶向性构建体进入细胞内,其中,细胞的死亡被诱导。
71.如权利要求70所述的方法,其特征在于,所述靶向性构建体包含编码MDA-7的DNA,其中,所述DNA不编码功能性MDA-7信号序列。
72.如权利要求70所述的方法,其特征在于,所述靶向性构建体包含编码MDA-7的DNA和核定位信号肽。
73.如权利要求70所述的方法,其特征在于,所述靶向性构建体包含编码MDA-7的DNA和内质网信号肽。
74.如权利要求70所述的方法,其特征在于,所述靶向性构建体包含编码MDA-7的DNA和线粒体信号肽。
75.一种诱导肿瘤细胞发生死亡的方法,所述方法包括给予细胞i)MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸以及ii)NF-κB、COX-2、Hsp90或蛋白激酶的抑制剂。
76.一种诱导肿瘤细胞发生细胞死亡的方法,所述方法包括给予细胞i)MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸以及ii)抗炎剂。
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