CN102924605B - Telkp和lkp融合免疫毒素、原核表达载体及制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表达载体及其制备方法，采用RT-PCR克隆丝瓜毒素Luffin-β基因，经引物延伸法构建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a（+）中，该表达载体经诱导获48.8KDa含Trx标签蛋白的融合免疫毒素TELKP，肠激酶EK酶切TELKP获16.9KDa的融合免疫毒素LKP；LKP免疫毒素可被uPA酶裂解释放具活性的小分子毒素Luffin-β杀伤肺癌细胞，为让带uPA裂解位点序列的低活性或无活性的Luffin-β在高表达uPA的肿瘤组织细胞局部其活性被释放而发挥局部杀瘤作用奠定基础，为肿瘤的治疗提供新策略。

Description

TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表达载体及制备

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表达载体及制备方法。

背景技术

肿瘤生物治疗近年来迅猛发展，因其高效低毒、目标明确而成为继手术、放、化疗以来的又一重要治疗策略。生物毒素是肿瘤生物治疗重要内容之一，但因生物毒素对靶细胞的作用不具特异性，限制了其在临床的广泛应用。近年，有研究者尝试将特异性抗体与生物毒素分子偶联开发出第二代免疫毒素，但由于偶联分子的分子量增大，其应用效果也不理想。因此，开发具细胞靶向性小分子毒素是未来免疫毒素研究的主要方向。

丝瓜毒素(Luffin-β)，是从丝瓜籽中分离到的I型核糖体失活蛋白(ribosomeinactivating protein,RIP)，丝瓜RIP有多种类型，主要为Luffin-a,Luffin-β,Luffin-Ss，Luffin-cylin,Luffin-P1，其中Luffin-β含278个氨基酸,分子质量30.583KD，等电点9.5，能特异水解真核细胞核糖体28srRNA4324位的腺嘌呤，使真核细胞核糖体60s大亚基失活，显著抑制其蛋白合成，属目前单链RIP中活性最高者之一，是近年备受关注的新型强效免疫毒素弹头小分子（Poma,A.,G.Marcozzi,et al.(1999)."Antiproliferative effect and apoptotic response in vitro ofhuman melanoma cells to liposomes containing the ribosome-inactivating proteinluffin."Biochim Biophys Acta1472(1-2):197-205.Poma,A.,M.Miranda,et al.(1998)."Differential response of human melanoma and Ehrlich ascites cells in vitroto the ribosome-inactivating protein luffin."Melanoma Res8(5):465-467。Ma,Q.J.,J.H.Li,et al.(2003)."Crystal structure of beta-luffin,a ribosome-inactivatingprotein,at2.0A resolution."Acta Crystallogr D Biol Crystallogr59(Pt8):1366-1370.），具较强抗瘤活性。

尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase plasminogen activator，uPA）是含431个氨基酸残基，分子质量为50～60kD的一糖蛋白。在正常组织、细胞uPA及其uPAR表达极低，而几乎所有的肿瘤，两者明显高表达。uPA与肿瘤的生长、浸润与转移等均密切相关( B,Renk I,Oruzio DV，and et al.Tumour budding,uPA and PAI-1are associated with aggressive behaviour in colon cancer[J].J SurgOncol.2010,102(3):235-41.FongY，Shen KH,Chiang TA,and et al.Acacetin inhibitsTPA-induced MMP-2and u-PA expressions of human lung cancer cells throughinactivating JNK signaling pathway and reducing binding activities of NF-kappaBand AP-1[J].J Food Sci,2010,75(1):H30-8）。因此，uPA被视为重要的肿瘤标志物和极具吸引力的肿瘤治疗靶标。

将尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase plasminogen activator，uPA）裂解位点（也称uPA识别位点，简写为uPAcs，氨基酸序列为SGRSA）和丝瓜毒素分子(Luffin-β)构建融合基因表达载体，诱导并纯化其表达的融合免疫毒素。该融合免疫毒素在体内高表达uPA的肿瘤组织细胞局部，经uPA酶切割裂解位点序列将释放具杀瘤活性的小分子毒素Luffin-β，以发挥其杀瘤作用。

发明内容

鉴于Luffin-β的抗肿瘤生物学特性及uPA与肿瘤的密切关系，本发明的目的之一是提供一种融合免疫毒素TELKP，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述TELKP融合免疫毒素的氨基酸序列从N端至C端依次为Trx标签、EK识别序列、Luffin-β肽段、KDEL驻留信号序列、uPA识别序列（uPAcs），由此命名为TELKP。TELKP融合免疫毒素为进一步制备下述LKP融合免疫毒素奠定了基础。

本发明的目的之二是提供一种融合免疫毒素LKP，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述融合免疫毒素的氨基酸序列从N端至C端依次为Luffi n-β肽段、KDEL驻留信号序列、uPAcs（SGRSA），由此所述融合免疫毒素命名为LKP。C末端修饰KDEL的融合免疫毒素可增强其细胞毒性，还能刺激有效的淋巴细胞增殖和特异性淋巴细胞效应增强，融合免疫毒素在体内高表达uPA的肿瘤组织细胞局部，经uPA酶切割裂解位点序列将释放具杀瘤活性的小分子毒素Luffin-β，以发挥其对瘤细胞的杀伤作用。

本发明的目的之三是提供含所述LKP融合免疫毒素基因的重组表达载体pET-32a（+）/Luffin-β-KDEL-uPAcs，所述重组表达载体包括pET-32a（+）载体序列和LKP（即Luffin-β-KDEL-uPAcs）融合免疫毒素的基因序列。

本发明的目的之四是提供所述重组表达载体pET-32a（+）/Luffin-β-KDEL-uPAcs的构建方法，包括如下步骤：

（1）采用RT-PCR法，以植物丝瓜籽（物种名为Luffa acutangula）总RNA为模板，以上游SEQ ID NO3和下游SEQ ID NO4为引物对，扩增得到PCR产物I，即为Luffin-β肽段的cDNA序列，并克隆入载体pTA2中得到阳性重组载体pTA2/Luffin-β，

SEQ ID NO3：5’-ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，

SEQ ID NO4：5’-GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’；

（2）采用引物延伸法，以所述载体pTA2/Luffin-β为模板，以上游SEQ IDNO5和下游SEQ ID NO6为引物对，扩增得到PCR产物II，即为包括Luffin-β肽段、KDEL驻留信号序列和uPA识别序列的cDNA序列，再用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切所述PCR产物II和pET-32a（+）载体，分别回收含Luffin-β-KDEL-uPAcs的cDNA序列的片段和pET-32a（+）骨架片段，纯化后连接，得到阳性重组表达载体pET-32a（+）/Luffin-β-KDEL-uPAcs，SEQ ID NO5：5’-CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID NO6：5’-CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3’。

本发明的目的之五是提供TELKP融合免疫毒素的制备方法，包括如下步骤：

（1）将所述表达载体pET-32a（+）/Luffin-β-KDEL-uPAcs转化表达菌BL21(DE3)；

（2）挑取克隆转种于含50μg/ml Amp的LB培养基中，37℃，220r/min振摇培养至对数生长期，加入0.4mmol/L IPTG，于30℃过夜诱导使表达TELKP融合免疫毒素；

（3）于4℃，6000r/min离心15min收集菌体，弃上清液，加入10倍体积的pH7.3的PBS溶液重悬菌体，再加入PMSF和DTT，超声破碎菌体，破菌完全后于4℃，10000r/min离心15min，将上清以0.45μm微孔滤膜过滤，再上样于金属螯合Ni2+柱，最后以Elution Buffer洗脱得到TELKP融合免疫毒素溶液。

本发明的目的之六是提供LKP融合免疫毒素的制备方法，包括如下步骤：

（1）向所述TELKP融合免疫毒素溶液中加入EK酶过夜酶切；

（2）EK酶酶切后的蛋白用阳离子交换柱Pharmacia HiTrap SP Fast Flowcolumn(26/20)洗脱纯化得LKP融合免疫毒素溶液。

本发明中，本发明采用基因工程技术将KDEL序列与uPA裂解位点序列引入Luffin-β的C端，获得Luffin-β-KDEL-uPAcs（LKP）融合免疫毒素，KDEL序列和uPA裂解位点序列使Luffin-β蛋白分子构象发生改变，使之成为受KDEL肽与uPA裂解位点封闭的暂无活性（或低活性）的融合免疫毒素分子，肿瘤细胞标志物uPA酶可裂解Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素释放具活性的Luffin-β以杀伤肺癌细胞。LKP融合免疫毒素的表达与纯化为其后续抗瘤生物学活性研究和抗瘤药物的制备奠定坚实基础。

附图说明

图1为本发明丝瓜籽Luffin-β基因PCR扩增的电泳图；

图2为本发明重组载体pTA2/Luffin-β经酶切验证的电泳图；

图3为本发明重组表达载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs经酶切验证的电泳图；

图4为本发明融合免疫毒素TELKP的诱导表达与纯化后的电泳图；

图5为本发明融合免疫毒素TELKP经酶切EK酶酶切后的电泳图；

图6为本发明LKP融合免疫毒素经uPA体外裂解的杀瘤活性检测结果图；

图7为本发明LKP融合免疫毒素对H460细胞生长的影响曲线图；

图8为本发明LKP蛋白影响H460细胞caspase-3基因mRNA表达的电泳图。

图9为本发明LKP蛋白影响H460细胞caspase-3基因编码蛋白表达的电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。

实施例1：

1材料与方法

1.1材料

RT-PCR试剂、克隆载体pTA2、限制性内切酶、高保真聚合酶、T4DNA连接酶、质粒抽提及CCK-8等试剂购自TOYOBO公司；蛋白纯化Ni柱及填料等购自GE公司；表达载体pET-32a(+)、大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)表达菌、EK酶等购自上海捷瑞生物工程有限公司；人肺癌细胞株NCI-H460购自武汉大学细胞库；测序由上海生工公司完成。

1.2方法

1.2.1重组载体pTA2/Luffin-β的构建和鉴定

以植物丝瓜籽总RNA为模板，用上游引物SEQ ID NO3：5’-ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’和下游引物SEQ ID NO4：5’-GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’PCR扩增Luffin-β基因的全长编码序列，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示，其中M为DNA标准(DL2000)，1为PCR产物。电泳图显示目的条带大小与预期大小的834bp一致，初步说明扩增到目的基因Luffin-β的全长编码序列。

将扩增的Luffin-β基因克隆入载体pTA2中，并通过BamHⅠ与XhoI双酶切后0.8%琼脂糖凝胶电泳验证如图2所示，其中M为DNA标准(DL2000)，1为酶切后的产物。电泳图显示1中两个条带分别为pTA2骨架片段序列和Luffin-β基因序列，分别与预期大小的2916bp和900bp（含Luffin-β的全长编码序列和少部分载体序列）一致。另外将酶切验证正确的载体送去测序，测序结果显示与GenBank发布的Luffin-β基因序列（GenBank登录号：X62372.1）完全一致，由此，成功构建了重组载体pTA2/Luffin-β。

1.2.2重组pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素载体的构建和鉴定

自行设计构建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因引物，引物中引入NcoI酶切位点、XhoI酶切位点、KDEL驻留信号序列、uPA识别序列（uPAcs），使获得的基因序列为：NcoI+Luffin-β-KDEL-uPAcs+XhoI，具体如下：SEQ ID NO5：5’-CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’；SEQ ID NO6：5’-CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3’；

SEQ ID NO5序列从5’端开始的碱基依次为酶切位点保护碱基（CATG）、NcoI酶切位点（CCATGG），防止移码突变而人为加入的碱基（CT）、SEQ ID NO3序列（ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT）；

SEQ ID NO6序列从5’端开始的碱基依次为酶切位点保护碱基（CCG）、XhoI酶切位点（CTCGAG），终止密码子（TTA），编码uPA识别位点序列（TGCTGATCGTCCGCT），编码KDEL序列（TAGCTCATCTTT）、SEQ ID NO4序列（GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC）。

以重组载体pTA2/Luffin-β为模板,上游引物SEQ ID NO5和下游引物SEQID NO6进行PCR扩增得到含NcoI,XhoI酶切位点的Luffin-β-KDEL-uPAcs片段。用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切该PCR产物和pET-32a(+)载体，分别回收酶切后的Luffin-β-KDEL-uPAcs片段和pET-32a(+)骨架片段，纯化后连接，得重组pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素载体，将所得的重组载体用NcoI和XhoI双酶切验证，酶切后的电泳图如图3所示，其中，M为DNA标准(DL2000)，1为NcoI与XhoI酶切pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs后的产物，2为pET-32a(+)载体。电泳图显示1中的两个条带分别为pET-32a骨架片段和Luffin-β-KDEL-uPAcs目的片段，分别与预期大小的5852bp和866bp一致，经测序鉴定正确，因此，成功构建了重组pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素载体。

1.2.3TELKP融合免疫毒素的诱导表达与纯化

将重组载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs转化表达菌BL21(DE3)大肠杆菌，次日挑3个克隆，分别放于盛5ml LB培养基的螺纹管中，培养（37℃，220r/min振摇）至对数生长期，加入0.4mmol/L IPTG，于30℃过夜诱导。各取1ml培养物，14000r/min离心1min，弃上清，100μl蒸馏水重悬沉淀，加34μl4xloading buffer，混匀，沸水浴3～5min，SDS-PAGE检测融合免疫毒素TELKP的表达情况。

表达菌经大量诱导后，4℃，6000r/min离心诱导后的细菌15min，10倍体积的PBS（pH7.3）重悬菌体，超声破碎（300W，工作10s，间隙10s，15次，循环3轮），破菌时加入PMSF和DTT，防蛋白降解。镜检破菌效果。破菌完全后于4℃，10000r/min离心15min，留取上清及沉淀，上清以0.45μm微孔滤膜过滤。

金属螯合Ni²⁺柱中装入约10ml Ni²⁺填料，His binding buffer平衡。将已过滤的上清上样Ni²⁺柱，收集穿透液，复平衡，分别用5%、10%和100%ElutionBuffer(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，8M尿素，0.5M咪唑，pH7.4)洗脱，100%组分透析于Tris（9.0）缓冲液中得到TELKP融合免疫毒素溶液。

SDS-PAGE电泳鉴定未经IPTG诱导和经IPTG诱导的转化菌中融合免疫毒素TELKP的表达情况以及鉴定经IPTG诱导的转化菌再经破菌离心后的上清和沉底中的融合免疫毒素TELKP的表达情况，如图4所示，其中M为蛋白Marker，1为未经IPTG诱导的，2为经IPTG诱导的，3为诱导后的转化菌经破菌离心后的上清，4为诱导后的转化菌经破菌离心后的沉淀。电泳图显示在43KDa和55KDa之间有条带，与预期大小的48.8KDa的目的蛋白TELKP一致。

1.2.4LKP融合免疫毒素的制备和检测

向1.2.3中获得的TELKP融合免疫毒素溶液中加入适量肠激酶（EK酶），过夜，留取约1ml未酶切样品作对照，SDS-PAGE电泳检测酶切效果，如图5所示，其中M为蛋白Marker，1为TELKP，2为EK酶切TELKP。电泳图显示2中EK酶切TELKP后得到31.8kD的目的蛋白LKP，16.9KD大小的蛋白条带为EK酶切去的Trx标签蛋白，与预期结果一致。

酶切后的蛋白用阳离子交换柱Pharmacia HiTrap SP Fast Flow column(26/20)洗脱纯化,洗脱纯化获得的目的蛋白LKP再用SDS-PAGE电泳检测后行高效液相色谱（high performance liquid chromatogram，HPLC）分析，色谱柱为discovery(250mm×4.6mm,5μm)，归一法计算其纯度达98.8%。

1.2.5.LKP融合免疫毒素经uPA体外裂解的杀瘤IC50计算

将人肺癌细胞株NCI-H460细胞接种于96孔板(3000个细胞/150μl/孔)，5％CO2、37℃与饱和湿度培养24h，加入不同浓度(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)纯化的LKP蛋白与uPA酶，分别以仅加蛋白LKP、uPA酶及不处理的细胞做对照，作用24h后，加入CCK-8(cell counting kit-8)试剂，相同条件下继续培养4h，酶标仪测定450nm波长处光密度值，并计算其IC50。

LKP经uPA体外裂解的杀瘤活性检测结果如图6所示，其中A为正常人肺癌NCI-H460细胞，B为50ng/ml的LKP蛋白在100ng/ml uPA酶存在条件下24h时致H460细胞不同程度的死亡，C为200ng/ml的LKP蛋白在400ng/ml uPA酶存在条件下24h时致H460细胞不同程度的死亡。可见200ng/ml的LKP蛋白经400ng/ml的uPA酶体外裂解24h致大部分H460细胞贴壁能力降低，部分细胞死亡、崩裂，而50ng/ml的LKP蛋白经100ng/ml的uPA酶体外裂解相同的时间后致少部分H460细胞贴壁能力降低，较少部分细胞死亡。因此，LKP蛋白经uPA酶体外裂解可释放具杀瘤活性的免疫毒素Luffin-β，且其杀瘤活性呈明显剂量-效应关系，其IC50为40ng/ml。

1.2.6LKP融合免疫毒素对非小细胞肺癌细胞生长的影响-增殖曲线绘制

将H460细胞接种至4个96孔板(3000个细胞/150μl/孔)，5％CO2，37℃与饱和湿度培养24h后加入目的蛋白LKP与uPA酶，分别以单纯目的蛋白LKP、单纯uPA酶作用于H460细胞及单纯H460细胞作对照，单纯培养液为空白对照，分别于1d、2d、3d、4d取出一96孔板，每孔加换新培养基与CCK-8，相同条件下继续培养4h，振荡30秒混匀，酶标仪测定450nm波长处光密度值，以光密度值为Y轴，时间为X轴绘制增值曲线如图7所示，LKP蛋白经uPA酶体外裂解释放具杀瘤活性的Luffin-β对人肺癌H460细胞生长具显著杀伤作用（与对照细胞和uPA酶处理的细胞比较，P<0.01）,LKP蛋白经uPA酶裂解后肿瘤杀伤能力显著增强（在处理后培养2－4天，与LKP蛋白单独处理的细胞比较，P<0.05）。

1.2.7融合免疫毒素LKP对H460细胞促凋亡基因caspase-3表达的影响

分别根据人caspase-3与GAPDH基因序列，设计其特异性扩增引物。caspase-3上游：5′-TCCTGAGATGGGTTTATGTA-3′,下游：5′-CACGTGTAAGATCATTTT-3′；GAPDH上游：5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′,下游：5′-TTGGCCAGGGGTGCTAAGC-3′。采用RT-PCR法，以蛋白LKP（50ng/ml）与uPA酶（100ng/ml）作用的H460细胞的总RNA为模板检测caspase-3基因的表达情况，分别以单纯目的蛋白LKP（50ng/ml）、单纯uPA酶（100ng/ml）作用的H460细胞及单纯H460细胞的相同检测作对照，同时检测的GAPDH基因作内参。反转录(RT)反应条件:30℃10min;42℃，30min,99℃5min,5℃，5min,1个循环。PCR反应条件:94℃1min；94℃30s,45℃，1min，72℃，5min,30个循环。反应结束后取PCR反应液(5～10μl)行电泳检测如图8所示，其中M为DNA标准(DL2000)，1为H460细胞，2为uPA作用的H460细胞，3为LKP作用的H460细胞，4为LKP与uPA作用的H460细胞。电泳图显示，以蛋白LKP与uPA酶作用的H460细胞总RNA为模板能检测到caspase-3基因的较强表达，以单纯目的蛋白LKP作用的H460细胞总RNA为模板能检测到caspase-3基因的较弱表达，单纯uPA酶作用的H460细胞及单纯H460细胞的总RNA为模板所检测到的caspase-3基因的表达最弱。提示蛋白LKP可致H460细胞凋亡。

1.2.8融合免疫毒素LKP对H460细胞促凋亡蛋白caspase-3表达的影响

采用Western blot技术，分别将1.2.7的各组细胞总蛋白转移至硝酸纤维膜，浸泡于含caspase-3兔多抗(1∶500)封闭液中，4℃过夜孵育，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶300)，室温孵育1h，25℃,与化学发光底物结合5～10min，保存图片。β-actin（43KD）作内参。Western blot结果如图9所示，其中1为H460细胞，2为uPA作用的H460细胞，3为LKP作用的H460细胞，4为LKP与uPA作用的H460细胞。Western blot结果显示，蛋白LKP与uPA酶作用的H460细胞检测在约17kDa处出现较强caspase-3抗原染色带，单纯目的蛋白LKP作用的H460细胞在相同位置出现该条带则较弱，单纯uPA酶作用的H460细胞及单纯H460细胞在相同位置出现该条带则最弱，提示蛋白LKP可致H460细胞凋亡。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.TELKP融合免疫毒素，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的TELKP融合免疫毒素，其特征在于：氨基酸序列从N端至C端依次为Trx标签、EK识别序列、Luffin-β肽段、KDEL驻留信号序列、uPA识别序列。

3.LKP融合免疫毒素，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的LKP融合免疫毒素，其特征在于：氨基酸序列从N端至C端依次为Luffin-β肽段、KDEL驻留信号序列、uPA识别序列。

5.含权利要求4所述LKP融合免疫毒素的基因的重组表达载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs，其特征在于，包括pET-32a(+)载体序列和LKP融合免疫毒素的基因序列。

6.权利要求5所述表达载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用RT-PCR法，以植物丝瓜籽总RNA为模板，以上游SEQ ID NO3和下游SEQ ID NO4为引物对，扩增得到PCR产物I，即为Luffin-β肽段的cDNA序列，并克隆入载体pTA2中得到阳性重组载体pTA2/Luffin-β，

SEQ ID NO3：5’-ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，

SEQ ID NO4：5’-GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’；

(2)采用引物延伸法，以所述载体pTA2/Luffin-β为模板，以上游SEQ IDNO5和下游SEQ ID NO6为引物对，扩增得到PCR产物II，即为包括Luffin-β肽段、KDEL驻留信号序列和uPA识别序列的cDNA序列，再用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切所述PCR产物II和pET-32a(+)载体，分别回收含Luffin-β-KDEL-uPAcs的cDNA序列片段和pET-32a(+)骨架片段，纯化后连接，得阳性载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs，

SEQ ID NO5：5’-CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，

SEQ ID NO6：5’-CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3’。

7.权利要求1或2所述TELKP融合免疫毒素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将表达载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs转化表达菌BL21DE3；所述表述载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs包括pET-32a(+)载体序列和LKP融合免疫毒素的基因序列；

(2)挑取克隆转种于含50μg/ml Amp的LB培养基中，37℃，220r/min振摇培养至对数生长期，加入0.4mmol/L IPTG，于30℃过夜诱导使其表达TELKP融合免疫毒素；

(3)于4℃，6000r/min离心15min收集菌体，弃上清液，加入10倍体积的pH 7.3的PBS溶液重悬菌体，再加入PMSF和DTT，超声破碎菌体，破菌完全后于4℃，10000r/min离心15min，将上清以0.45μm微孔滤膜过滤，再上样于金属螯合Ni²⁺柱，最后以洗脱液洗脱得到TELKP融合免疫毒素溶液。

8.权利要求3或4所述LKP融合免疫毒素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)向所述TELKP融合免疫毒素溶液加入EK酶过夜酶切；

(2)酶切后的蛋白用阳离子交换柱Pharmacia HiTrap SP Fast Flow column26/20洗脱纯化得LKP融合免疫毒素溶液。