JPH04281793A - 新規プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は新規プラスミドに関し、さらに詳
しくは、らん藻アナキステイス・ニジユランス（Ａｎａ
ｃｙｓｔｉｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のプラスミドｐ
ＢＡ１のＯｒｉＡ領域含有ＤＮＡ断片を含む大腸菌及び
ラン藻細胞内で複製可能なシヤトルベクタープラスミド
に関する。

【０００２】ラン藻　Ａｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ　は、高等植物、特に紅藻の光合成機構と類似し
ており、太陽からの光をエネルギー源として、水、二酸
化炭素とわずかな無機塩類とから有機物質を生合成し、
独立栄養的に増殖することが可能である。また、Ａ．ｎ
ｉｄｕｌａｎｓ　は単細胞性で寒天培地上にコロニーを
作り、特にＲ２株は細胞中にＤＮＡを取り込みやすく、
微生物遺伝学的方法により形質転換することが可能であ
る。

【０００３】そこで近年、Ａ．　ｎｉｄｕｌａｎｓ　Ｒ
２株の内在性プラスミド（ｐＵＨ２４、ｐＵＨ２５）を
用いたクローニングベクターが多数開発され［Ｃ．　Ａ
．　Ｍ．　Ｊ．　Ｊ．　ｖｏｎ　ｄｅｒ　Ｈｏｎｄｅｌ
　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ
．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７（３）：　１５７０−１５
７４　（１９８０）；　Ｃ．Ｊ．　Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅ
ｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ
．　１８４：２４９−２５４（１９８１）；　Ｌ．　Ａ
．Ｓｈｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｐ．　ｖａｎ　ｄｅ　Ｐｕ
ｔｔｅ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１５０（１）
：４１０−４１３　（１９８２）；　Ｓ．Ｇｅｎｄｅｌ
　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１５
６（１）：１４８−１５４　（１９８３）；　Ｓ．　Ｓ
．　Ｇｏｌｄｅｎ　ａｎｄＬ．　Ａ．　Ｓｈｅｒｍａｎ
，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１５５（３）：９６
６−９７２　（１９８３）；　Ｃ．　Ｊ．　Ｋｕｈｌｅ
ｍｅｉｅｒｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｓｍｉｄ　１０：１
５６−１６３　（１９８３）；　Ｃ．　Ｊ．　Ｋｕｈｌ
ｅｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　３１；１０
９−１１６　（１９８４）；　Ｄ．　Ｅ．　Ｌａｕｄｅ
ｎｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇ
ｅｎｅｔ．　１９９：３００−３０５（１９８５）；　
Ｍ．　Ｙ．　Ｇｒｕｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒ
．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１５：２６５−２６８　（
１９８７）　など参照］、外来遺伝子の導入や遺伝子の
クローニングなどに用いられてきている。

【０００４】Ｒ２株を用いて異種タンパク質を発現させ
た例としては、ヒトのカーボニツク・アンヒドラーゼお
よび大腸菌ｌａｃＩＱリプレツサータンパク質［Ｇ．　
Ｄ．Ｐｒｉｃｅ　ａｎｄ　Ｍ．　Ｒ．　Ｂａｄｇｅｒ，
　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　９１：５０５−５１
３　（１９８９）］、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉ
ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　Ａ５０のα−アミラーゼ［Ｉ．
Ｖ．　Ｅｌａｎｓｋａｙａ　ａｎｄ　Ｉ．　Ｂ．Ｍｏｒ
ｚｕｎｏｂａ，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．　Ｖｉｒｕｓｏｌ．　０（９）：７−１１　
（１９８９）］、Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　１５９３
Ｍの殺虫タンパク質［Ｎ．　Ｔａｎｄｅａｕ　ｄｅ　Ｍ
ａｒｓａｃ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．　Ｇｅ
ｎｅｔ．　２０９：３９６−３９８　（１９８７）］、
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ［Ｄ．　Ｊ．Ｓｃａｎｌ
ａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ．　９０：４３−４９
　（１９９０）、　Ｍ．　Ｒ．　Ｓｃｈａｅｆｅｒ　ａ
ｎｄ　Ｓ．　Ｓ．　Ｇｏｌｄｅｎ，Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．　１７１（７）：３９７３−３９８１　（１９
８９）］、大腸菌のＭｎ−スーパーオキシドジスムター
ゼ［Ｍ．　Ｙ．　Ｇｒｕｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　
８７：２６０８−２６１２（１９８０）］、ラムダフア
ージのｃＩｔｓリプレツサータンパク質［Ｄ．　Ｆｒｉ
ｅｄｂｅｒｇ　ａｎｄＪ．　Ｓｅｉｉｆｆｅｒｓ，　Ｍ
ｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２０３：５０５−５
１０　（１９８６）］、ラン藻　Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓ
ｔｉｓＰＰＣ　６８０３株のデイサチユレース（ｄｅｓ
　Ａ）［Ｈ．　Ｗａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒ
ｅ　３４７：２００−２０３　（１９９０）］などが知
られている。

【０００５】一方、Ａ．　ｎｉｄｕｌａｎｓ　６３０１
株でも、内在性プラスミド（ｐＢＡ１）を用いてｐＢＡ
Ｓ１８［１２ｋｂ，　Ｋ．　Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　ｅｔ
　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ．　１９：２２１−２２５　（１
９８２）］、　ｐＢＡＳ５［１４ｋｂ、篠崎一雄、「植
物遺伝子操作技術」山口彦之監修ｐ９８−１１０、ＣＭ
Ｃ刊］などのベクター（大腸菌とのシヤトルベクター）
が開発されているが、いずれのベクターも１０ｋｂ以上
の長さを持つことからベクターに挿入できる遺伝子の大
きさが限定されたり、クローニングに用いることのでき
る制限酵素認識部位が少ないことなど遺伝子操作上扱い
にくい点が多い。また、６３０１株はＲ２株に比べ遺伝
子ＤＮＡを細胞中に取り込みにくく、その結果、形質転
換効率もＲ２株に比べ低いという欠点がある。６３０１
株の形質転換効率を向上させる方法として、Ｈ．　Ｄａ
ｎｉｅｌｌ　ら［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．
　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８３：２５４６−２５５０（１９
８６）］は、６３０１株の細胞をＥＤＴＡ−Ｌｙｓｏｚ
ｙｍｅ　処理して　ｐｅｒｍｅａｐｌａｓｔ　化してＤ
ＮＡを取り込みやすくすることを提案している。実際、
この方法を用いて６３０１株の形質転換効率を高めるこ
とに成功しているが、その操作は時間のかかる繁雑なも
のであるとともに、ＥＤＴＡ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　処理
によつて細胞にダメージをあたえるなどの問題がある。

【０００６】そこで、本発明者らは、Ａ．　ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ　６３０１株の形質転換効率の向上、遺伝子操作
上扱いやすいプラスミドの構築等を目的に、まず、プラ
スミドを小型化することについて鋭意研究を行い、６３
０１株の内在性プラスミド（ｐＢＡ１）をベースにして
、その複製開始領域以外の部分をなるべく少なくすると
ともに、これに大腸菌のＣｏｌＥ１系プラスミドの複製
開始領域を含むＤＮＡ断片とｐＵＣ１８で用いられてい
るマルチクローニング領域とを組合せることにより、６
３０１株の形質転換効率を飛躍的に向上させることので
きるプラスミドを創製することに成功し、本発明を完成
するに至つた。

【０００７】かくして、本発明によれば、（ａ）アナキ
ステイス・ニジユランス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎｉｄ
ｕｌａｎｓ）由来のプラスミドｐＢＡ１のＯｒｉＡ領域
と、（ｂ）プラスミドｐＵＣのマルチクローニング領域
と、（ｃ）コリシンＥ１（ＣｏｌＥ１）系プラスミドの
ＯｒｉＥ領域を含有することを特徴とする大腸菌及びラ
ン藻細胞内で複製可能なシヤトルベクタープラスミドが
提供される。

【０００８】以下、本発明のプラスミドについてさらに
詳細に説明する。

【０００９】本発明のプラスミドを構成する「アナキス
テイス・ニデユランス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓｎｉｄｕｌ
ａｎｓ）由来のプラスミドｐＢＡ１のＯｒｉＡ領域」（
以下、「ＯｒｉＡ」と略称することがある）は、ラン藻
クロオコツカス属に属するアナキステイス・ニデユラン
ス６３０１株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＰＣ　
６３０１、　ＡＴＣＣ　２７１４４、　ＵＴＥＸ　６２
５株）の２つの内在性プラスミドのうち分子量が５．０
４±０．２６×１０６（電子顕微鏡分析による）又は５
．２×１０６（アガロースゲル電気泳動分析による）［
Ｋ．　Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ
．　１９：２２１−２２４　（１９８２）］を示すプラ
スミドｐＢＡ１に由来する複製開始領域を含む遺伝子断
片であり、その大きさは一般に２．８〜８．０ｋｂ、好
ましくは２．８〜４．４ｋｂの範囲内にあることができ
る。具体的には、ｐＢＡ１を制限酵素ＸｈｏＩ、Ｂａｍ
ＨＩで切り出すことにより得られる大きさが約４．４ｋ
ｂのＯｒｉＡ領域含有ＤＮＡ断片、ＰｖｕＩＩ、Ｂａｍ
ＨＩで切り出すことにより得られる大きさが約３．９お
よび３．３ｋｂのＯｒｉＡ領域含有ＤＮＡ断片等が挙げ
られる。

【００１０】また、「プラスミドｐＵＣのマルチクロー
ニング領域」（以下「ＭＣ領域」と略称することがある
）は、大腸菌クローニングベクターとして用いられるＣ
ｏｌＥ１系プラスミドｐＵＣの多種の制限酵素認識部位
を持つた配列（ポリリンカーともいう）であり、例えば
、ｐＵＣ１８由来の、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ
、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識部位をもつ５１ｂｐのＤＮ
Ａ断片が包含される。またｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐ
ＵＣ１９等に由来するＭＣ領域も使用可能であり、さら
に、大腸菌のフアージベクターＭ１３由来のＭＣ領域も
使用することができる。

【００１１】さらに、本発明において、ＯｒｉＡとＭＣ
領域と組合せて使用される「ＣｏｌＥ１・系プラスミド
由来のＯｒｉＥ領域」（以下、「ＯｒｉＥ」と略称する
ことがある）は、大腸菌で用いられているコピー数が１
細胞体当り２０〜３０個であるＣｏｌＥ１系プラスミド
の複製開始領域を意味し、そのようなＯｒｉＥの代表例
としてはプラスミドｐＢＲ３２２から制限酵素ＰｖｕＩ
Ｉ、ＡｖａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＶ、ＰｓｔＩなどを用いて切り出すことができる大き
さが１．５〜４．３ｋｂ、好ましくは１．５〜２．５ｋ
ｂのＯｒｉＥ含有ＤＮＡ断片が挙げられ、その他にプラ
スミドｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２５等に由来するＯｒｉＥ
含有ＤＮＡ断片も使用することができる。

【００１２】また、これらのＯｒｉＥ含有ＤＮＡ断片は
クローニングを行なう際のマーカーとなりうるアンピシ
リン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）等の薬剤耐性遺伝子を含む
ことができる。

【００１３】本発明により提供されるプラスミドは、以
上に述べたＯｒｉＡ、ＭＣ領域及びＯｒｉＥの３つの必
須の遺伝子領域をそれぞれ含有するＤＮＡ断片を有する
限り、他の遺伝情報を狙うＤＮＡ断片、例えば抗生物質
耐性マーカーであるアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片、クロラムフエニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ
断片等をさらに含みうるが、典型的な具体例は、Ｏｒｉ
Ａ、ＭＣ領域及びＯｒｉＥの３つの遺伝子領域をそれぞ
れ含有するＤＮＡ断片から実質的になり、分子量がそれ
ぞれ約４．４８メガダルトン（約６．９ｋｂ）、約４．
１５メガダルトン（約６．４ｋｂ）および約３．７６メ
ガダルトン（約５．８ｋｂ）であるプラスミドで、本発
明者らが「プラスミドｐＢＡＸ１８」、「プラスミドｐ
ＢＡＸ１９」及び「プラスミドｐＢＡＸ２０」とそれぞ
れ命名した３種のプラスミドである。

【００１４】なお、本明細書において、プラスミドの分
子量はアガロースゲル電気泳動法により測定した値であ
る。

【００１５】以下、このプラスミドｐＢＡＸ１８、ｐＢ
ＡＸ１９及びｐＢＡＸ２０についてさらに詳細に説明す
る。

【００１６】プラスミドｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＸ１９及
びｐＢＡＸ２０の種々の制限酵素による認識部位の数及
び該制限酵素による分解断片の長さ（ｋｂ）は下記の表
−１に示すとおりである。また、プラスミドｐＢＡＸ１
８、ｐＢＡＸ１９及びｐＢＡＸ２０の制限酵素地図を図
１〜図３に示す。

【００１７】

【表１】

【００１８】以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラ
スミドｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＸ１９及びｐＢＡＸ２０は
、例えば次のようにして製造することができる。まず、
アナキステイス・ニデユランス由来のプラスミドｐＢＡ
１のＯｒｉＡ含有ＤＮＡ断片の調製は、例えば、アナキ
ステイス・ニデユランスと大腸菌とのシヤトルベクター
ｐＢＡＳ１８［Ｋ．　Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ
．，　Ｇｅｎｅ　１９：２２１−２２４　（１９８２）
参照］を大腸菌で常法（Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ
　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　−
　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｏｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
刊）に従つてクローニングし、そのクローニングされた
プラスミドｐＢＡＳ１８を常法（Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉ
ｓｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ
）に従つて、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩの組合わ
せ又は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｖｕＩＩの組合わせを
用いてＤＮＡ断片を切り出すことによつて行なうことが
でき、これにより、大きさがそれぞれ約４．１ｋｂ及び
約３．３ｋｂのＯｒｉＡ含有ＤＮＡ断片が得られる。こ
れらのＤＮＡ断片の５’突出端は場合によりＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼによつて平滑末端化することができる。

【００１９】一方、プラスミドｐＵＣのＭＣ領域は、例
えばプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩを用いて切り出すことにより調製すること
ができる。

【００２０】さらに、ＣｏｌＥ１プラスミドのＯｒｉＥ
領域を含むＤＮＡ断片の供給源としては、ＣｏｌＥ１プ
ラスミドとして代表的なプラスミドｐＢＲ３２２を使用
するのが便利である。

【００２１】上記の如くして調製されたＭＣ領域を制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したプラスミ
ドｐＢＲ３２２と一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用
させて、プラスミドｐＢＲ３２２に上記ＭＣ領域が組み
込まれたプラスミドｐＢＲ３２２Ｍを作成する。次いで
、このプラスミドｐＢＲ３２２Ｍを制限酵素Ｅｃｏ４７
ＩＩＩ及びＰｖｕＩＩ処理して得られるＯｒｉＥ及びＭ
Ｃ領域を含む約２．５ｋｂのＤＮＡ断片と、上記のよう
にして調製されたＯｒｉＡ含有ＤＮＡ断片とを一緒にし
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させることにより、目的と
するプラスミドｐＢＡＸ１８及びｐＢＡＸ２０を得るこ
とができる。また、プラスミドｐＢＡＸ１９は、プラス
ミドｐＢＡＸ１８の２箇所あるＰｖｕＩＩ認識部位に挟
まれた約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＰｖｕＩＩ
を用いて除き、開裂したプラスミドＤＮＡにＴ４ＤＮＡ
リガーゼを作用させることにより造成することができる
。

【００２２】なお、プラスミドｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＸ
１９およびｐＢＡＸ２０の構築図を第４図に示し、その
さらに具体的な調製法については後記実施例でさらに詳
細に説明する。

【００２３】このようにして調製される本発明プラスミ
ドは、大腸菌の細胞中で自律複製可能なＯｒｉＥ領域と
、アナキステイス・ニデユランスの細胞中で自律複製可
能なＯｒｉＡ領域を有するシヤトルベクターである。 従つて、本発明のプラスミドは、増殖の早い大腸菌を用
いて大量に調製することができ、このようにして大量に
調製されるプラスミドＤＮＡを用いればアナキステイス
・ニデユランスなどのラン藻細胞を効率よく形質転換す
ることができる。

【００２４】また、本発明のプラスミドは、マルチクロ
ーニング領域が導入されていることにより、（外来）遺
伝子を挿入するための認識部位としてプラスミドｐＢＡ
Ｓ１８で唯一用いられるＥｃｏＲＩ認識部位以外にＳｍ
ａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳｃａＩ、ＥｃｏＲＶな
どの認識部位が利用可能である。

【００２５】さらに、本発明のプラスミドの大きさは、
プラスミドｐＢＡ１のＯｒｉＡ領域以外のＤＮＡ部分が
除かれていることにより、プラスミドｐＢＡＳ１８（１
２ｋｂ）の約半分（６．９ｋｂ〜５．８ｋｂ）にまで小
型化することができ、これにより、本発明のプラスミド
はプラスミドｐＢＡＳ１８に導入できる。（外来）遺伝
子よりも大きな（外来）遺伝子を導入することが可能と
なる。

【００２６】以上のような遺伝子操作上の特性を有する
本発明のプラスミドの宿主細胞への導入は、それ自体既
知の方法、例えば、Ｄ．　Ａ．　Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ　
ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊ．　ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．　１３４：１５０９−１５１４　（１９８８）
等の文献に記載の方法で行うことができる。このように
して形質転換されたアナキステイス・ニデユランス６３
０１株の形質転換効率は、プラスミドｐＢＡＳ１８を用
いて形質転換したときの値に比べ約１０００倍の効率を
得ることができる。従つて、本発明のプラスミドを用い
れば、（外来）遺伝子を挿入した場合においても、目的
の遺伝子が挿入されたプラスミドを有する細胞を容易に
選抜することが可能である。

【００２７】本発明のプラスミドは組み込み可能な構造
遺伝子としては、アナキステイス・ニデユランス由来の
構造遺伝子、他のラン藻細胞由来の構造遺伝子、他のバ
クテリア由来の構造遺伝子、高等動植物細胞由来の構造
遺伝子などが挙げられ、その起源は何ら限定されるもの
ではない。また、本発明のプラスミドに組み込み可能な
構造遺伝子としては、化学的に合成された構造遺伝子で
あつてもよい。そのような遺伝子の例としては化学合成
ヒト−スーパーオキシド・ジスムターゼ［ｈ−ＳＯＤ、
ｈ−ＳＯＤ−Ａｌａ６（特開平２−１５６８８４号公報
参照）など］が挙げられる。

【００２８】以下、実施例をあげて本発明のプラスミド
についてさらに具体的に説明する。

【００２９】

【実施例１】（ベクターの造成） （１）ｐＢＲ３２２へのマルチクローニングサイト（ｐ
ＵＣ１８由来）の導入 Ａ）ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化、
アルカリフオスフアターゼ処理 ｐＢＲ３２２ＤＮＡ溶液２０μｌ（１０μｇ）に５Ｘ　
ＨｉｎｄＩＩＩ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、３５ｍＭＭｇＣｌ２、３００ｍＭ
ＮａＣｌ）４０μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ［宝酒造（株）社
製］８０ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）及び滅菌水１３０μｌ
を加え、３７℃で２時間インキユベートした。反応後、
この溶液に５Ｘ　ＥｃｏＲＩ　ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５ｍＭＭｇＣｌ
２、２５０ｍＭＮａＣｌ，３５ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、０．０５％ウシ血清アルブミン）４０μｌ、Ｅ
ｃｏＲＩ［宝酒造（株）社製］１２０ｕｎｉｔｓ（１０
μｌ）及び滅菌水５０μｌを加え、さらに３７℃で２時
間反応させた。反応後、フエノール−クロロホルム処理
、エタノール沈殿してＤＮＡを集め、１００μｌの０．
１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。 この溶液に１０μｌのアルカリフオスフアターゼ［宝酒
造（株）社製］溶液（１ｕｎｉｔ／１０μｌアルカリフ
オスフアターゼ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＺｎＳＯ４）を加え、
３７℃で１時間インキユベートした。反応後、１０μｌ
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、さらに６５℃
で３０分間インキユベートした。この溶液をフエノール
−クロロホルム処理し、エタノール沈殿してＤＮＡを回
収した。

【００３０】Ｂ）ｐＵＣ１８からのマルチクローニング
サイト（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）の単離ｐＵＣ１
８ＤＮＡ溶液３０μｌ（２０μｇ）に１０Ｘ　Ｋ　ｂｕ
ｆｆｅｒ（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
、１００ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＭＤＴＴ、１００ｍ
ＭＭＫＣｌ）２０μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ８０ｕｎｉｔｓ
（１０μｌ）及び滅菌水１４０μｌを加えたエツペンド
ルフチユーブ２本用意し、３７℃で３時間インキユベー
トした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、エ
タノール沈殿してＤＮＡ集め、１１２．５μｌの滅菌水
に溶解した。これらの溶液に５ＸＥｃｏＲＩ　ｂｕｆｆ
ｅｒ　３０μｌ、ＥｃｏＲＩ９０ｕｎｉｔｓ（７．５μ
ｌ）を加え、３７℃で３時間インキユベートした。ＤＮ
Ａをエタノール沈殿して回収し、１．５％アガロースゲ
ル電気泳動を行い目的のＤＮＡ断片（約５０ｂｐ）を分
離した。ＤＮＡをゲルから電気的に溶出し、フエノール
−クロロホルム処理、エタノール沈殿して精製した。

【００３１】Ｃ）ｐＢＲ３２２（ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ消化）とマルチクローニングの連結ｐＢＲ３２２
（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡＰ処理）ＤＮＡ０．
２μｇ（１μｌ）とマルチクローニングサイトＤＮＡ０
．２μｇ（１μｌ）にＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）１μｌ、Ｔａｋａｒ
ａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＫｉｔＡ液２４μｌを加え、よ
く撹拌した。この溶液に　Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ　Ｋｉｔ　Ｂ液３μｌを加え１６℃で４時間インキ
ユベートした。

【００３２】Ｄ）プラスミドｐＢＲ３２２Ｍのクローニ
ング ｌｉｇａｔｉｏｎ　溶液３μｌ（４０ｎｇ）に５０ｍＭ
ＣａＣｌ２処理したＥ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１の細胞
懸濁液２００μｌを加え、おだやかに混合した。この混
合液を氷水中で３０分間インキユベートした後、さらに
４２℃で２分間インキユベートしてＤＮＡを細胞中にと
りこませた。この懸濁液に１．８ｍｌの２ＹＴ（１６ｇ
／ｌトリプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出液、５ｇ／ｌＮａ
Ｃｌ）液体培地を加え、３７℃で１時間の振とう培養後
、ＬＢ（１０ｇ／ｌトリプトン、８ｇ／ｌＮａＣｌ、５
ｇ／ｌ酵母抽出エキス）寒天培地（５０μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含む）にプレートした。得られたコロニーか
らプラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することに
より目的のプラスミド（ｐＢＲ３２２Ｍ）を保持してい
るコロニーをスクリーニングした。スクリーニングした
コロニーを２００ｍｌの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／
ｍｌアンピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡ
をＳＤＳ−アルカリ法により大量に調製した。

【００３３】（２）ＰｖｕＩＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片
（２５５０ｂｐ）の単離 前記（１）で調製したｐＢＲ３２２ＭプラスミドＤＮＡ
１０μｇ（１０μｌ）に１０Ｘ　Ｍ　ｂｕｆｆｅｒ（１
００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、５００ｍＭＮａＣｌ）２
０μｌ、ＰｖｕＩＩ［宝酒造（株）社製］１２０ｕｎｉ
ｔｓ（１０μｌ）および滅菌水を加え２００μｌとした
エツペンドルフチユーブ３本用意した。これらのチユー
ブを３７℃で３時間インキユベートした。反応後、フエ
ノール−クロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿
して集め、１７４μｌの滅菌水にそれぞれ溶解した。こ
れらの溶液に１０Ｘ　Ｈ　ｂｕｆｆｅｒ　２０μｌおよ
びＥｃｏ４７ＩＩＩ［宝酒造（株）社製］２４ｕｎｉｔ
ｓずつ加え、３７℃で３時間インキユベートした。ＤＮ
Ａをエタノール沈殿して回収し、目的のＤＮＡ断片（２
５５０ｂｐ）を１．５％アガロースゲル電気泳動により
分離した。分離したＤＮＡ断片は　Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ
　を用いて精製し、５０μｌの０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）溶液とした。この溶液に５μｌのアル
カリフオスフアターゼ溶液を加え、３７℃で１時間イン
キユベートした。反応後、５μｌのアルカリフオスフア
ターゼ溶液を加え、６５℃で３０分間さらにインキユベ
ートした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、
エタノール沈殿してＤＮＡを集め、２０μｌのＴＥに溶
解した。

【００３４】（３）ｐＢＡＳ１８の　Ａ．　ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ　における複製開始点の分離 ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトに　Ａ．　ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ　６３０１株の内在性プラスミド（ｐＢＡ１、Ｂ
ａｍＨＩ消化）を挿入した大腸菌と　Ａ．ｎｉｄｕｌａ
ｎｓ　との間のシヤトルベクターｐＢＡＳ１８（Ｋ．　
Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　ら、Ｇｅｎｅ．　１９：２２１−
２２４　（１９８２））をＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１に
導入し、ＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを
含む）で培養し、ＳＤＳ−アルカリ法を用いて大量に調
製した。調製したｐＢＡＳ１８ＤＮＡ１４μｇ（２０μ
ｌ）に１０Ｘ　Ｋ　　ｂｕｆｆｅｒ　２０μｌ、Ｂａｍ
ＨＩ［宝酒造（株）社製］１００ｕｎｉｔｓ（１０μｌ
）および滅菌水を加えて２００μｌとしたエツペンドル
フチユーブ３本用意し、３０℃で３時間インキユベート
した。反応後、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収し、目
的のＤＮＡ断片（ｐＢＡ１、約８．０Ｋｂｐ）を１％ア
ガロースゲル電気泳動を行い分離し、Ｇｅｎｅｃｌｅａ
ｎ　により精製した。分離・精製したｐＢＡ１（Ｂａｍ
ＨＩ消化）ＤＮＡ２μｇ（５μｌ）に１０Ｘ　Ｋ　ｂｕ
ｆｆｅｒ　５μｌ、ＸｈｏＩ［宝酒造（株）社製］２４
ｕｎｉｔｓ（２μｌ）および滅菌水３８μｌを加え、３
７℃で３時間インキユベートした。反応後、フエノール
−クロロホルム処理し、エタノール沈殿してＤＮＡを集
めた。 得られたｐＢＡ１のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ＤＮＡの
両末端をＴａｋａｒａ　Ｂｌａｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ　を
用いて平滑末端化した。

【００３５】（４）小型化Ｅ．ｃｏｌｉ−Ａ．　ｎｉｄ
ｕｌａｎｓ　シヤトルベクターｐＢＡＸ１８（６．９ｋ
ｂｐ）の造成平滑末端化ＤＮＡ４０ｎｇ（２μｌ）とＰ
ｖｕＩＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片のＤＮＡ２００ｎｇ（
４μｌ）に　Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ
　Ａ液４８μｌを加え、よく撹拌した後、Ｂ液６μｌを
加え、１６℃で４時間インキユベートした。この溶液を
用いＥ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１株を形質転換し、ＬＢ
寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．５％寒天
を含む）にプレートしてコロニーを得た。 得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地
図を解析することにより目的のプラスミドｐＢＡＸ１８
を保持するコロニーをスクリーニングした。スクリーニ
ングしたコロニーを４５ｍｌの２ＹＴ液体培地（１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）で培養し、プラスミ
ドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により調製した。

【００３６】（５）ｐＢＡＸ１９（約６．４ｋｂ）の作
成 （４）で調製したｐＢＡＸ１８ＤＮＡ溶液５μｌ（２．
５μｇ）に１０Ｘ　Ｍ　ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、Ｐｖｕ
ＩＩ［宝酒造（株）社製］２．５μｌ（３０ｕｎｉｔｓ
）及び滅菌水３７．５μｌを加え、３７℃で３時間イン
キユベートした。この反応液２μｌ（１００ｎｇＤＮＡ
）にＴＥ２μｌ及び　Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ
　Ｋｉｔ　Ａ液１６μｌを加えよく撹拌した後、Ｔａｋ
ａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｂ液４μｌを加え
、１６℃で１０分間インキユベートした。この溶液を用
いＥ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１株を形質転換し、ＬＢ寒
天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．５％寒天を
含む）にプレートしてコロニーを得た。得られたコロニ
ーからプラスミド（ｐＢＡＸ１９）を保持しているコロ
ニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコロニ
ーを２００ｍｌの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤ
Ｓ−アルカリ法により大量に調製した。

【００３７】（６）ｐＢＡＸ２０（約５．８ｋｂ）の作
成 （３）で調製したＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端化）
ＤＮＡ断片１μｇ（４μｌ）に１０Ｘ　Ｍ　ｂｕｆｆｅ
ｒ　２μｌ、ＰｖｕＩＩ１μｌ（１２ｕｎｉｔｓ）及び
滅菌水１３μｌを加え、３７℃で３時間インキユベート
した。この反応液２μｌ（１００ｎｇ）に（２）で調製
したＰｖｕＩＩ−Ｅｃｏ４７ＤＮＡ断片１００ｎｇ（２
μｌ）及び　Ｔａｋａｒａｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　
Ａ液１６μｌを加え、よく撹拌した後、さらに、Ｂ液４
μｌを加え、１６℃で２時間インキユベートした。反応
後、この溶液を用いてＥ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１株を
形質転換し、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン、１．５％寒天を含む）にプレートしてコロニーを得
た。得られたコロニーから目的のプラスミド（ｐＢＡＸ
２０）を保持しているコロニーをスクリーニングし、２
００ｍｌの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−ア
ルカリ法により調製した。

【００３８】

【実施例２】Ａ．　ｎｉｄｕｌａｎｓ　６３０１の形質
転換１００ｍｌのＢＧ−１１液体培地で１〜５日間培養
した細胞を８０００ｒｐｍで５分間遠心して集め、１０
ｍｌの新鮮な液体培地に懸濁した（１０８〜１０９　ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ）。この細胞懸濁液を１ｍｌずつポリプ
ロピレンチユーブ（Ｆａｌｃｏｎ　２０５９）に分注し
、それぞれのチユーブに実施例１で調製したプラスミド
ＤＮＡを１μｇ（ｐＢＡＳ１８は１０μｇ）の濃度で加
えた。これらのチユーブをそれぞれアルミホイルでおお
い、３０℃で１晩培養した後、おおつていたアルミホイ
ルをはずし、光照射下（１０００〜２０００ルクス）、
３０℃でさらに６時間培養した。これらの細胞懸濁液を
５倍に希釈し（ｐＢＡＳ１８を加えたものはそのまま）
、１００〜５００μｌずつＢＧ−１１寒天培地（１μｇ
／ｍｌアンピシリン、１ｍＭチオ硫酸ナトリウム、１．
５％寒天を含む）にプレートした。これらのプレートを
光照射下（２０００〜３０００ルクス）で４〜１０日間
培養した。

【００３９】このようにして得られたコロニーの形質転
換効率は、本発明プラスミドを用いた場合１０−３〜１
０−４　ｃｅｌｌｓ／μｇプラスミドＤＮＡという値を
示し、プラスミドｐＢＡＳ１８を用いた場合（１０−７
　ｃｅｌｌｓ／μｇプラスミドＤＮＡ）の約１０００倍
の効率を得ることに成功した。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＢＡＸ１８の制限酵素地図である
。

【図２】プラスミドｐＢＡＸ１９の制限酵素地図である
。

【図３】プラスミドｐＢＡＸ２０の制限酵素地図である
。

【図４】プラスミドｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＸ１９及びｐ
ＢＡＸ２０の構築図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）アナキステイス・ニジユランス（Ａ
   ｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のプラスミ
   ドｐＢＡ１のＯｒｉＡ領域と、（ｂ）プラスミドｐＵＣ
   のマルチクローニング領域と、（ｃ）コリシンＥ１系プ
   ラスミドのＯｒｉＥ領域を含有することを特徴とする大
   腸菌及びラン藻細胞内で複製可能なシヤトルベクタープ
   ラスミド。
2. 【請求項２】　　ＯｒｉＡ領域（ａ）がプラスミドｐＢ
   Ａ１から切り出される大きさが２．８〜８．０ｋｂのＯ
   ｒｉＡ領域含有ＤＮＡ断片である請求項１記載のプラス
   ミド。
3. 【請求項３】　　ＯｒｉＥ領域（ｃ）がプラスミドｐＢ
   Ｒ３２２から切り出される大きさが１．５〜４．３ｋｂ
   のＯｒｉＥ領域含有ＤＮＡ断片である請求項１記載のプ
   ラスミド。
4. 【請求項４】　　ＯｒｉＥ含有ＤＮＡ断片がさらにアン
   ピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を含有する請求項３記
   載のプラスミド。
5. 【請求項５】　　大きさが約６．９ｋｂであり且つ下記
   の制限酵素地図によつて特徴づけられるベクタープラス
   ミドｐＢＡＸ１８。 【化１】
6. 【請求項６】　　大きさが約６．４ｋｂであり且つ下記
   の制限酵素地図によつて特徴づけられるベクタープラス
   ミドｐＢＡＸ１９。 【化２】
7. 【請求項７】　　大きさが約５．８ｋｂであり且つ下記
   の制限酵素地図によつて特徴づけられるベクタープラス
   ミドｐＢＡＸ２０。 【化３】