JPH06253820A - 細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の形質転換体と、その形質転換体を利用したエチレン製造方法 - Google Patents
細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の形質転換体と、その形質転換体を利用したエチレン製造方法Info
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- JPH06253820A JPH06253820A JP5062699A JP6269993A JPH06253820A JP H06253820 A JPH06253820 A JP H06253820A JP 5062699 A JP5062699 A JP 5062699A JP 6269993 A JP6269993 A JP 6269993A JP H06253820 A JPH06253820 A JP H06253820A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 大気中の二酸化炭素からエチレンを生成する
らん藻の形質転換体を得るとともに、大気中の二酸化炭
素からエチレンを製造する方法を提供する。 【構成】 らん藻にα−ケトグルタール酸(α−ＫＧ)か
らエチレンを生成する細菌のエチレン生成酵素をコード
する遺伝子を導入して形質転換し、その形質転換体を使
ってエチレンを生成させる。
らん藻の形質転換体を得るとともに、大気中の二酸化炭
素からエチレンを製造する方法を提供する。 【構成】 らん藻にα−ケトグルタール酸(α−ＫＧ)か
らエチレンを生成する細菌のエチレン生成酵素をコード
する遺伝子を導入して形質転換し、その形質転換体を使
ってエチレンを生成させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細菌のエチレン生成酵
素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有するベク
ターで形質転換させたらん藻の形質転換体、及び、その
形質転換体を使って二酸化炭素からエチレンを生成させ
るエチレンの製造方法に関する。
素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有するベク
ターで形質転換させたらん藻の形質転換体、及び、その
形質転換体を使って二酸化炭素からエチレンを生成させ
るエチレンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】エチレンは原油や天然ガスから生成されて
いるのであるが、植物や微生物によっても造られること
が古くから知られていた。本発明者らは、α−ケトグル
タール酸(α−ＫＧ)からエチレンを生成する細菌のエチ
レン生成酵素をコードする遺伝子を、大腸菌であるエシ
ェリヒア・コリイ(E.coli)にクローニングし、エチレン
生成酵素蛋白質とエチレン生成活性を発現したポジティ
ブクローンを得て出願した(特願平４−２７５３８７
号)。
いるのであるが、植物や微生物によっても造られること
が古くから知られていた。本発明者らは、α−ケトグル
タール酸(α−ＫＧ)からエチレンを生成する細菌のエチ
レン生成酵素をコードする遺伝子を、大腸菌であるエシ
ェリヒア・コリイ(E.coli)にクローニングし、エチレン
生成酵素蛋白質とエチレン生成活性を発現したポジティ
ブクローンを得て出願した(特願平４−２７５３８７
号)。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、本発明
者らは、無害で取り扱いの容易な大腸菌などの細菌類を
形質転換して、エチレン生成能力の高い細菌を得ること
に成功した。そこで、微生物によりエチレンをより有利
に製造するために、エチレン生成活性を発現する上記大
腸菌のプラスミドを使ってらん藻を形質転換させ、その
形質転換したらん藻を使用して、二酸化炭素からエチレ
ンを生成させる技術を考案し、本発明を完成するに至っ
た。
者らは、無害で取り扱いの容易な大腸菌などの細菌類を
形質転換して、エチレン生成能力の高い細菌を得ること
に成功した。そこで、微生物によりエチレンをより有利
に製造するために、エチレン生成活性を発現する上記大
腸菌のプラスミドを使ってらん藻を形質転換させ、その
形質転換したらん藻を使用して、二酸化炭素からエチレ
ンを生成させる技術を考案し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００４】
【課題を解決するための手段】 上述の目的を達成するために、本発明は、らん藻に Met Thr Asn Leu Gln Thr Phe Glu Leu Pro Thr Glu Val Thr Gly Cys Ala Ala Asp Ile Ser Leu Gly Arg Ala Leu Ile Gln Ala Trp Gln Lys Asp Gly Ile Phe Gln Ile Lys Thr Asp Ser Glu Gln Asp Arg Lys Thr Gln Glu Ala Met Ala Ala Ser Lys Gln Phe Cys Lys Glu Pro Leu Thr Phe Lys Ser Ser Cys Val Ser Asp Leu Thr Tyr Ser Gly Tyr Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Thr Ala Gly Lys Pro Asp Phe Pro Glu Ile Phe Thr Val Cys Lys Asp Leu Ser Val Gly Asp Gln Arg Val Lys Ala Gly Trp Pro Cys His Gly Pro Val Pro Trp Pro Asn Asn Thr Tyr Gln Lys Ser Met Lys Thr Phe Met Glu Glu Leu Gly Leu Ala Gly Glu Arg Leu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Gly Phe Glu Leu Pro Ile Asn Thr Phe Thr Asp Leu Thr Arg Asp Gly Trp His His Met Arg Val Leu Arg Phe Pro Pro Gln Thr Ser Thr Leu Ser Arg Gly Ile Gly Ala His Thr Asp Tyr Gly Leu Leu Val Ile Ala Ala Gln Asp Asp Val Gly Gly Leu Tyr Ile Arg Pro Pro Val Glu Gly Glu Lys Arg Asn Arg Asn Trp Leu Pro Gly Glu Ser Ser Ala Gly Met Phe Glu His Asp Glu Pro Trp Thr Phe Val Thr Pro Thr Pro Gly Val Trp Thr Val Phe Pro Gly Asp Ile Leu Gln Phe Met Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Thr Pro His Lys Val Lys Leu Asn Thr Arg Glu Arg Phe Ala Cys Ala Tyr Phe His Glu Pro Asn Phe Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Phe Glu Pro Ser Ala Asn Glu Arg Ile His Tyr Gly Glu His Phe Thr Asn Met Phe Met Arg Cys Tyr Pro Asp Arg Ile Thr Thr Gln Arg Ile Asn Lys Glu Asn Arg Leu Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala Thr Gly Ser で表されるアミノ酸配列をコードした遺伝子を導入することを特徴と する。
【０００５】
【作用】本発明のエチレン生成酵素をコードする遺伝子
を含むＤＮＡの断片は、本発明者等が先に出願した特願
平４−２７５３８号の明細書にポジティブクローンとし
て記載し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第１３１６１号(ＦＥＲＭ Ｐ−１３１６１)として寄
託したE.coli JM109(pEFE01)〔この菌は、α−ケトグル
タール酸からエチレンを生成する反応を触媒する酵素(E
FE)の遺伝子をもち、しかもエチレン生成活性をもって
いる。〕からプラスミドpEFE01を通常のアルカリ抽出法
等によって抽出して調製することができる。
を含むＤＮＡの断片は、本発明者等が先に出願した特願
平４−２７５３８号の明細書にポジティブクローンとし
て記載し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第１３１６１号(ＦＥＲＭ Ｐ−１３１６１)として寄
託したE.coli JM109(pEFE01)〔この菌は、α−ケトグル
タール酸からエチレンを生成する反応を触媒する酵素(E
FE)の遺伝子をもち、しかもエチレン生成活性をもって
いる。〕からプラスミドpEFE01を通常のアルカリ抽出法
等によって抽出して調製することができる。
【０００６】また、上記ＤＮＡの断片としては、例え
ば、よりエチレン生成活性の高いポジティブクローンE.
coli JM109(pEFE03)〔この菌は、上記E.coli JM109(pEFE
01)から取り出した５.２kbpのプラスミドpEFE01をHind
III で消化し、２.５kbpのEFE遺伝子を含むＤＮＡ断片
を取り出し、さらに１.５kbpのＤＮＡ断片まで欠失させ
たＤＮＡ断片を含むプラスミドpEFE03を保持する菌で、
E.coli JM109(pEFE01)よりも高いエチレン生成活性を有
し、ＰlacがＥＦＥ遺伝子の３’側下流にある。〕、あ
るいは、さらにエチレン生成活性の高いポジティブクロ
ーンなどから通常のアルカリ抽出法などによって抽出し
て調製することができる。
ば、よりエチレン生成活性の高いポジティブクローンE.
coli JM109(pEFE03)〔この菌は、上記E.coli JM109(pEFE
01)から取り出した５.２kbpのプラスミドpEFE01をHind
III で消化し、２.５kbpのEFE遺伝子を含むＤＮＡ断片
を取り出し、さらに１.５kbpのＤＮＡ断片まで欠失させ
たＤＮＡ断片を含むプラスミドpEFE03を保持する菌で、
E.coli JM109(pEFE01)よりも高いエチレン生成活性を有
し、ＰlacがＥＦＥ遺伝子の３’側下流にある。〕、あ
るいは、さらにエチレン生成活性の高いポジティブクロ
ーンなどから通常のアルカリ抽出法などによって抽出し
て調製することができる。
【０００７】さらに、また上記ＤＮＡの断片としては、
例えば、より形質転換効率の高いE.coli ＤＨ５αをE.c
oli JM109の代わりに使用し、常法通りα−ケトグルタ
ール酸からエチレンを生成する反応を触媒する酵素(EF
E)の遺伝子をもち、しかも、エチレン生成活性をもって
いるポジティブクローンE.coli ＤＨ５α(pEFE01)を分
離し、さらにエチレン生成活性の高いポジティブクロー
ンE.coli ＤＨ５α(pEFE10)〔この菌は上記Ｅ.coli Ｄ
Ｈ５α(pEFE01)から取り出した５.２kbpのプラスミドpE
FE01をHind IIIで消化し、２.５kbpのＥＦＥ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を取り出し、さらに１.４５kbpのＤＮＡ断
片まで欠失させたＤＮＡ断片を保持する菌で、pEFE01よ
りも高いエチレン生成活性を有し、Ｐlac側がＥＦＥ遺
伝子の５’側上流にある。〕などを分離し、これらのエ
チレン生成活性の高い変異株から通常のアルカリ抽出法
などによって抽出して調製することができる。
例えば、より形質転換効率の高いE.coli ＤＨ５αをE.c
oli JM109の代わりに使用し、常法通りα−ケトグルタ
ール酸からエチレンを生成する反応を触媒する酵素(EF
E)の遺伝子をもち、しかも、エチレン生成活性をもって
いるポジティブクローンE.coli ＤＨ５α(pEFE01)を分
離し、さらにエチレン生成活性の高いポジティブクロー
ンE.coli ＤＨ５α(pEFE10)〔この菌は上記Ｅ.coli Ｄ
Ｈ５α(pEFE01)から取り出した５.２kbpのプラスミドpE
FE01をHind IIIで消化し、２.５kbpのＥＦＥ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を取り出し、さらに１.４５kbpのＤＮＡ断
片まで欠失させたＤＮＡ断片を保持する菌で、pEFE01よ
りも高いエチレン生成活性を有し、Ｐlac側がＥＦＥ遺
伝子の５’側上流にある。〕などを分離し、これらのエ
チレン生成活性の高い変異株から通常のアルカリ抽出法
などによって抽出して調製することができる。
【０００８】次に、これらのエチレン生成酵素(ＥＦＥ)
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、シャトルベク
ター pUC303〔E.coli由来のプラスミド pACYC184と、ら
ん藻Synechococus PCC7942由来のプラスミド pUC1から
なり、E.coliとらん藻の両者の複製起点をもつ〕にライ
ゲーションする。
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、シャトルベク
ター pUC303〔E.coli由来のプラスミド pACYC184と、ら
ん藻Synechococus PCC7942由来のプラスミド pUC1から
なり、E.coliとらん藻の両者の複製起点をもつ〕にライ
ゲーションする。
【０００９】このようにライゲーションして得られたpU
C303-EFE01、pUC303-EFE03などでE.coli JM109を、また
pUC303-EFE01、pUC303-EFE10などでE.coli ＤＨ５αを
それぞれ形質転換し、ストレプトマイシン耐性(Ｓ
ｍr)、クロランフェニール感受性(Ｃｍs)、アンピシリ
ン耐性(Ａｐr)などの選択培地でpEFE01、pEFE03、pEFE1
0などのエチレン生成酵素(ＥＦＥ)をコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片を含有し、pUC３０３を保持している
ようなE.coli JM109やE.coli ＤＨ５αをスクリーニン
グして形質転換体を得る。
C303-EFE01、pUC303-EFE03などでE.coli JM109を、また
pUC303-EFE01、pUC303-EFE10などでE.coli ＤＨ５αを
それぞれ形質転換し、ストレプトマイシン耐性(Ｓ
ｍr)、クロランフェニール感受性(Ｃｍs)、アンピシリ
ン耐性(Ａｐr)などの選択培地でpEFE01、pEFE03、pEFE1
0などのエチレン生成酵素(ＥＦＥ)をコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片を含有し、pUC３０３を保持している
ようなE.coli JM109やE.coli ＤＨ５αをスクリーニン
グして形質転換体を得る。
【００１０】これらの形質転換体について、エチレン生
成活性を調べ、かつ、これらの菌株のプラスミドＤＮＡ
をアルカリ抽出後、制限酵素Eco RIなどで消化し、０.
７％アガロースゲル電気泳動にかけて目的のキメラpUC3
03を選択する。得られる形質転換体は、E.coli JM109(p
UC303-EFE01)、E.coli JM109(pUC303-EFE03)、E.coliＤ
Ｈ５α(pUC303-EFE01)、E.coli ＤＨ５α(pUC303-EFE1
0)、などである。
成活性を調べ、かつ、これらの菌株のプラスミドＤＮＡ
をアルカリ抽出後、制限酵素Eco RIなどで消化し、０.
７％アガロースゲル電気泳動にかけて目的のキメラpUC3
03を選択する。得られる形質転換体は、E.coli JM109(p
UC303-EFE01)、E.coli JM109(pUC303-EFE03)、E.coliＤ
Ｈ５α(pUC303-EFE01)、E.coli ＤＨ５α(pUC303-EFE1
0)、などである。
【００１１】これらの形質転換E.coliからアルカリ抽出
したキメラプラスミドpUC303-EFE01、pUC303-EFE03、pU
C303-EFE10などを使って、宿主としてのらん藻Synechoc
ocusPCC7942R2-SPc〔このらん藻は、前記Synechococus
PCC7942から内在性プラスミドpUC24(約８kbp)を欠いた
変異株であり、この内在性プラスミドを欠くため、外来
プラスミドを安定に保持しやすい藻株である。なお、こ
れらのらん藻は容易に入手可能な公知の藻株である。〕
を形質転換し、目的の上記キメラプラスミドを保持して
いるSynechococus PCC7942R2-SPc（キメラpUC303)をス
トレプトマイシン耐性(Ｓｍr)、クロランフェニール感
受性(Ｃｍs)、アンピシリン耐性(Ａｐr)などの選択培地
でスクリーニングし、それらの中から、エチレン生成活
性の強い藻株を選出する。
したキメラプラスミドpUC303-EFE01、pUC303-EFE03、pU
C303-EFE10などを使って、宿主としてのらん藻Synechoc
ocusPCC7942R2-SPc〔このらん藻は、前記Synechococus
PCC7942から内在性プラスミドpUC24(約８kbp)を欠いた
変異株であり、この内在性プラスミドを欠くため、外来
プラスミドを安定に保持しやすい藻株である。なお、こ
れらのらん藻は容易に入手可能な公知の藻株である。〕
を形質転換し、目的の上記キメラプラスミドを保持して
いるSynechococus PCC7942R2-SPc（キメラpUC303)をス
トレプトマイシン耐性(Ｓｍr)、クロランフェニール感
受性(Ｃｍs)、アンピシリン耐性(Ａｐr)などの選択培地
でスクリーニングし、それらの中から、エチレン生成活
性の強い藻株を選出する。
【００１２】このようにして得られた目的の形質転換体
について、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタン
ブロッティング、プラスミドの安定性、エチレン生成活
性の安定性などを調べ、最適な候補藻株を選定する。か
くして、細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片を含有するベクターで形質転換したらん
藻を得ることができる。
について、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタン
ブロッティング、プラスミドの安定性、エチレン生成活
性の安定性などを調べ、最適な候補藻株を選定する。か
くして、細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片を含有するベクターで形質転換したらん
藻を得ることができる。
【００１３】この形質転換したらん藻を通常の培養法に
従って、大気中の二酸化炭素と太陽光線、その他の培地
成分などを供給して培養し、大気中の過剰二酸化炭素か
らエチレンを生成させ、地球環境の清浄化に役立てるこ
とができる。また、この形質転換したらん藻を使って、
製鉄プラントや火力発電プラントなどから排出する排ガ
ス中の二酸化炭素と太陽光線から、エチレンを生成させ
ることができる。
従って、大気中の二酸化炭素と太陽光線、その他の培地
成分などを供給して培養し、大気中の過剰二酸化炭素か
らエチレンを生成させ、地球環境の清浄化に役立てるこ
とができる。また、この形質転換したらん藻を使って、
製鉄プラントや火力発電プラントなどから排出する排ガ
ス中の二酸化炭素と太陽光線から、エチレンを生成させ
ることができる。
【００１４】
【発明の効果】本発明では、無害で取り扱いの容易なら
ん藻を形質転換して、エチレン生成能をもつらん藻を得
ることができる。また、この形質転換を行ったらん藻を
使って、大気中の過剰二酸化炭素や、各種排ガスから、
エチレンを製造することができる。
ん藻を形質転換して、エチレン生成能をもつらん藻を得
ることができる。また、この形質転換を行ったらん藻を
使って、大気中の過剰二酸化炭素や、各種排ガスから、
エチレンを製造することができる。
【００１５】
【実施例】大腸菌を形質転換して得たポジティブクロー
ンE.coli JM109(pEFE01)を１.５kbpまで欠失させて形成
したE.coli JM109(pEFE03)から取り出したプラスミドpE
FE03を制限酵素Hind IIIで消化し、Klenow酵素処理して
平滑末端にしたのち、EcoRIリンカーを連結し、Eco RI
で消化した。一方、シャトルベクター pUC303をEcoRIで
消化して線状化し、両者をライゲーションした。このよ
うにして、pUC303-EFE03を含む形質転換用ＤＮＡ溶液を
調製した。
ンE.coli JM109(pEFE01)を１.５kbpまで欠失させて形成
したE.coli JM109(pEFE03)から取り出したプラスミドpE
FE03を制限酵素Hind IIIで消化し、Klenow酵素処理して
平滑末端にしたのち、EcoRIリンカーを連結し、Eco RI
で消化した。一方、シャトルベクター pUC303をEcoRIで
消化して線状化し、両者をライゲーションした。このよ
うにして、pUC303-EFE03を含む形質転換用ＤＮＡ溶液を
調製した。
【００１６】このpUC303-EFE03を用いて常法通り、E.co
li JM109を形質転換し、ストレプトマイシン耐性(Ｓ
ｍr)、クロラムフェニール感受性(Ｃｍs)でスクリーニ
ングした。
li JM109を形質転換し、ストレプトマイシン耐性(Ｓ
ｍr)、クロラムフェニール感受性(Ｃｍs)でスクリーニ
ングした。
【００１７】上記の形質転換したE.coli JM109をチアミ
ン５μg／mlと、ストレプトマイシン１００μg／mlを含
む表１に示した組成のＬＢ培地で、３７℃、一晩培養
し、常法通りのガスクロマトグラフ法でエチレン生成活
性を調べた。また、同時に常法通りのアルカリ抽出法に
よって、プラスミドを抽出し、これをEco RIで消化後、
常法通りの０.７％アガロースゲル電気泳動を行って、
プラスミドの確認を行った。その結果、pUC303-EFE03の
導入された２株のE.coli JM109(pUC303-EFE03)No.Ｃ−
９株とNo.Ｈ−１２株を得た。このNo.Ｃ−９株を使っ
て、常法通りプラスミドpUC303-EFE03を取り出し、次の
らん藻の形質転換用ＤＮＡ溶液を調製した。
ン５μg／mlと、ストレプトマイシン１００μg／mlを含
む表１に示した組成のＬＢ培地で、３７℃、一晩培養
し、常法通りのガスクロマトグラフ法でエチレン生成活
性を調べた。また、同時に常法通りのアルカリ抽出法に
よって、プラスミドを抽出し、これをEco RIで消化後、
常法通りの０.７％アガロースゲル電気泳動を行って、
プラスミドの確認を行った。その結果、pUC303-EFE03の
導入された２株のE.coli JM109(pUC303-EFE03)No.Ｃ−
９株とNo.Ｈ−１２株を得た。このNo.Ｃ−９株を使っ
て、常法通りプラスミドpUC303-EFE03を取り出し、次の
らん藻の形質転換用ＤＮＡ溶液を調製した。
【００１８】
【表１】
【００１９】次に、らん藻 Synechococcus PCC7942R2-S
Pc〔親株のSynechococcus PCC7942から内在性プラスミ
ドpUH24を欠失した変異株で、容易に入手可能な公知の
藻株である。〕に、上記プラスミドpUC303-EFE03を以下
の手順に従って導入した。
Pc〔親株のSynechococcus PCC7942から内在性プラスミ
ドpUH24を欠失した変異株で、容易に入手可能な公知の
藻株である。〕に、上記プラスミドpUC303-EFE03を以下
の手順に従って導入した。
【００２０】らん藻 Synechococcus PCC7942R2-SPcを表
２に示す組成からなるＢＧ−１１培地の入った３００ml
容のマイヤーフラスコに１白金耳植藻後、３０℃、１２
klux蛍光灯下で十分生育するまで前培養した。この前培
養液を５０mlのＢＧ−１１培地の入った３００ml容マイ
ヤーフラスコに２ml植藻し、３０℃、２４時間、１２kl
ux蛍光灯下でゆるく往復振蘯培養した。培養終了後、そ
の培養液を７０００rpmで15分間遠心分離し、沈殿を３m
lのＢＧ−１１培地に懸濁し、その１mlに上記プラスミ
ドpUC303-EFE03のＤＮＡ溶液２０μl(約３μgＤＮＡに
相当)を加え、１２kluxの蛍光灯照射をしながら、３０
℃、１.５時間ゆっくり往復振蘯した。
２に示す組成からなるＢＧ−１１培地の入った３００ml
容のマイヤーフラスコに１白金耳植藻後、３０℃、１２
klux蛍光灯下で十分生育するまで前培養した。この前培
養液を５０mlのＢＧ−１１培地の入った３００ml容マイ
ヤーフラスコに２ml植藻し、３０℃、２４時間、１２kl
ux蛍光灯下でゆるく往復振蘯培養した。培養終了後、そ
の培養液を７０００rpmで15分間遠心分離し、沈殿を３m
lのＢＧ−１１培地に懸濁し、その１mlに上記プラスミ
ドpUC303-EFE03のＤＮＡ溶液２０μl(約３μgＤＮＡに
相当)を加え、１２kluxの蛍光灯照射をしながら、３０
℃、１.５時間ゆっくり往復振蘯した。
【００２１】
【表２】
【００２２】この液を１.０w/v％寒天添加ＢＧ−１１培
地の入ったシャーレ内の平板培地上に塗布植藻し、形質
転換効率をあげるために、最初は光を照射せずに３０
℃、１６時間、次いで１２klux蛍光灯照射下で３０℃、
８時間培養した。次いで、シャーレ内の寒天培地を無菌
的に注意しながら少し持ち上げ、寒天培地の下に１０μ
g/mlのストレプトマイシン溶液０.５mlを一様に流し込
み、再びシャーレの蓋をして３０℃、８日間、１２klux
の蛍光灯下で培養した。
地の入ったシャーレ内の平板培地上に塗布植藻し、形質
転換効率をあげるために、最初は光を照射せずに３０
℃、１６時間、次いで１２klux蛍光灯照射下で３０℃、
８時間培養した。次いで、シャーレ内の寒天培地を無菌
的に注意しながら少し持ち上げ、寒天培地の下に１０μ
g/mlのストレプトマイシン溶液０.５mlを一様に流し込
み、再びシャーレの蓋をして３０℃、８日間、１２klux
の蛍光灯下で培養した。
【００２３】上記寒天平板上に出現したコロニー２５０
個を取り、別のシャーレに用意した１.０w/v％寒天、及
び１０μg／mlストレプトマイシン添加ＢＧ−１１平板
培地にレプリカして、３０℃、１２klux蛍光灯下でコロ
ニーが出現するまで培養した。生育した２５０個のコロ
ニーを再度、上記と同じ条件でレプリカ培養し、最後に
これらのコロニー１個ずつを上記と同じ培地で調製した
マイクロタイタープレートに植藻し、３０℃、１２klux
蛍光灯下で培養した。
個を取り、別のシャーレに用意した１.０w/v％寒天、及
び１０μg／mlストレプトマイシン添加ＢＧ−１１平板
培地にレプリカして、３０℃、１２klux蛍光灯下でコロ
ニーが出現するまで培養した。生育した２５０個のコロ
ニーを再度、上記と同じ条件でレプリカ培養し、最後に
これらのコロニー１個ずつを上記と同じ培地で調製した
マイクロタイタープレートに植藻し、３０℃、１２klux
蛍光灯下で培養した。
【００２４】上記マイクロタイタープレートの２５０個
のコロニーから無作為に４０個のコロニーを選択し、Ｂ
Ｇ−１１液体培地５ml入りの３４ml容試験管に植藻し、
３０℃、７日間、１２klux蛍光灯下でゆるく往復振蘯培
養し、その１mlを直径１８mmの３４ml容試験管にサンプ
リングしてゴム栓で密栓し、３０℃、１時間、１２klux
蛍光灯下でシール反応し、上方の気相部から生成ガス１
mlをシリンジで抜き取り、常法通りガスクロマトグラフ
ィーでエチレン生成活性を測定した。その結果を表３に
示す。
のコロニーから無作為に４０個のコロニーを選択し、Ｂ
Ｇ−１１液体培地５ml入りの３４ml容試験管に植藻し、
３０℃、７日間、１２klux蛍光灯下でゆるく往復振蘯培
養し、その１mlを直径１８mmの３４ml容試験管にサンプ
リングしてゴム栓で密栓し、３０℃、１時間、１２klux
蛍光灯下でシール反応し、上方の気相部から生成ガス１
mlをシリンジで抜き取り、常法通りガスクロマトグラフ
ィーでエチレン生成活性を測定した。その結果を表３に
示す。
【００２５】
【表３】
【００２６】なお、上記処理操作を全く行っていない宿
主のらん藻 Synechococcus PCC7942R2-SPcそのものを、
上記と同様にＢＧ−１１液体培地５ml入りの３４ml容試
験管に植藻し、３０℃、７日間、１２klux蛍光灯下でゆ
るく往復振蘯培養し、その１mlを直径１８mmの３４ml容
試験管にサンプリングして密栓し、３０℃、１時間、１
２klux蛍光灯下でシール反応して、気相部のガスをガス
クロマトグラフィーで測定したが、エチレンの生成は全
く認められなかった。
主のらん藻 Synechococcus PCC7942R2-SPcそのものを、
上記と同様にＢＧ−１１液体培地５ml入りの３４ml容試
験管に植藻し、３０℃、７日間、１２klux蛍光灯下でゆ
るく往復振蘯培養し、その１mlを直径１８mmの３４ml容
試験管にサンプリングして密栓し、３０℃、１時間、１
２klux蛍光灯下でシール反応して、気相部のガスをガス
クロマトグラフィーで測定したが、エチレンの生成は全
く認められなかった。
【００２７】らん藻 Synechococcus PCC7942R2-SPcに上
記のような処理操作を行ってプラスミドpUC303-EFE03を
導入すると、表３に示すように、これらの藻株にはエチ
レン生成活性が発現したが、なお、この事実をさらに確
認するために、サザンブロッティング法によってプラス
ミドのpUC303-EFE03の検出を、また、ウエスタンブロッ
テイング法によってエチレン生成酵素(ＥＦＥ)の蛋白質
の検出を、それぞれ試みた結果、いずれも検出され、pE
FE03のプラスミド、ＥＦＥの蛋白質がらん藻で確かに発
現していることが実証された。
記のような処理操作を行ってプラスミドpUC303-EFE03を
導入すると、表３に示すように、これらの藻株にはエチ
レン生成活性が発現したが、なお、この事実をさらに確
認するために、サザンブロッティング法によってプラス
ミドのpUC303-EFE03の検出を、また、ウエスタンブロッ
テイング法によってエチレン生成酵素(ＥＦＥ)の蛋白質
の検出を、それぞれ試みた結果、いずれも検出され、pE
FE03のプラスミド、ＥＦＥの蛋白質がらん藻で確かに発
現していることが実証された。
【００２８】表３において、最もエチレン生成活性の強
いらん藻 Synechococcus PCC7942R2-SPc(pUC303-EFE03)
-No.23株を用いて、ＢＧ−１１液体培地５０ml入りの３
００mlマイヤーフラスコで３０℃、１２klux蛍光灯下で
ゆるく往復振蘯培養した時の培養経時変化を図３に示
す。ここで使用したＢＧ−１１液体培地は、表２からも
明らかなように、極わずかなｐＨ緩衝用のクエン酸が添
加されているだけで、主炭素源は培地中の炭酸ナトリウ
ム(Na2CO3)と空気中の二酸化炭素だけである。そして、
このときのエチレン生成活性の最大値は４日目の５０nl
／ml培養液／時間であり、６日目までの累計エチレン生
成量は約４０００nl／ml培養液と推定計算した。なお、
ここで使用した形質転換らん藻 Synechococcus PCC7942
R2-SPc(pUC303-EFE03)-No.23株は、工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３４３４として寄託
されている。
いらん藻 Synechococcus PCC7942R2-SPc(pUC303-EFE03)
-No.23株を用いて、ＢＧ−１１液体培地５０ml入りの３
００mlマイヤーフラスコで３０℃、１２klux蛍光灯下で
ゆるく往復振蘯培養した時の培養経時変化を図３に示
す。ここで使用したＢＧ−１１液体培地は、表２からも
明らかなように、極わずかなｐＨ緩衝用のクエン酸が添
加されているだけで、主炭素源は培地中の炭酸ナトリウ
ム(Na2CO3)と空気中の二酸化炭素だけである。そして、
このときのエチレン生成活性の最大値は４日目の５０nl
／ml培養液／時間であり、６日目までの累計エチレン生
成量は約４０００nl／ml培養液と推定計算した。なお、
ここで使用した形質転換らん藻 Synechococcus PCC7942
R2-SPc(pUC303-EFE03)-No.23株は、工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３４３４として寄託
されている。
【図１】クローニングされたエチレン生成酵素遺伝子の
塩基配列及びこれから翻訳されたアミノ酸配列の前半部
分である。
塩基配列及びこれから翻訳されたアミノ酸配列の前半部
分である。
【図２】クローニングされたエチレン生成酵素遺伝子の
塩基配列及びこれから翻訳されたアミノ酸配列の後半部
分である。
塩基配列及びこれから翻訳されたアミノ酸配列の後半部
分である。
【図３】培養経時変化を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年４月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】 次に、これらのエチレン生成酵素（ＥＦ
Ｅ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、シャトル
ベクターｐＵＣ３０３〔Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド
ｐＡＣＹＣ１８４と、らん藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕ
ｓ ＰＣＣ７９４２由来のプラスミドｐＵＣ１からな
り、Ｅ．ｃｏｌｉとらん藻の両者の複製起点をもつ〕に
ライゲーションする。
Ｅ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、シャトル
ベクターｐＵＣ３０３〔Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド
ｐＡＣＹＣ１８４と、らん藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕ
ｓ ＰＣＣ７９４２由来のプラスミドｐＵＣ１からな
り、Ｅ．ｃｏｌｉとらん藻の両者の複製起点をもつ〕に
ライゲーションする。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】 これらの形質転換Ｅ．ｃｏｌｉからアル
カリ抽出したキメラプラスミドｐＵＣ３０３−ＥＦＥ０
１、ｐＵＣ３０３−ＥＦＥ０３、ｐＵＣ３０３−ＥＦＥ
１０などを使って、宿主としてのらん藻Ｓｙｎｅｃｈｏ
ｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４２Ｒ２−ＳＰｃ〔このらん
藻は、前記ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓＰＣＣ７９４２
から内在性プラスミドｐＵＨ２４（約８ｋｂｐ）を欠い
た変異株であり、この内在性プラスミドを欠くため、外
来プラスミドを安定に保持しやすい藻株である。なお、
これらのらん藻は容易に入手可能な公知の藻株であ
る。〕を形質転換し、目的の上記キメラプラスミドを保
持しているＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４
２Ｒ２−ＳＰｃ−（キメラｐＵＣ３０３）をストレプト
マイシン耐性（Ｓｍｒ）、クロランフェニール感受性
（Ｃｍｇ）、アンピシリン耐性（Ａｐｒ）などの選択培
地でスクリーニングし、それらの中から、エチレン生成
活性の強い藻株を選出する。
カリ抽出したキメラプラスミドｐＵＣ３０３−ＥＦＥ０
１、ｐＵＣ３０３−ＥＦＥ０３、ｐＵＣ３０３−ＥＦＥ
１０などを使って、宿主としてのらん藻Ｓｙｎｅｃｈｏ
ｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４２Ｒ２−ＳＰｃ〔このらん
藻は、前記ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓＰＣＣ７９４２
から内在性プラスミドｐＵＨ２４（約８ｋｂｐ）を欠い
た変異株であり、この内在性プラスミドを欠くため、外
来プラスミドを安定に保持しやすい藻株である。なお、
これらのらん藻は容易に入手可能な公知の藻株であ
る。〕を形質転換し、目的の上記キメラプラスミドを保
持しているＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４
２Ｒ２−ＳＰｃ−（キメラｐＵＣ３０３）をストレプト
マイシン耐性（Ｓｍｒ）、クロランフェニール感受性
（Ｃｍｇ）、アンピシリン耐性（Ａｐｒ）などの選択培
地でスクリーニングし、それらの中から、エチレン生成
活性の強い藻株を選出する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｐ 5/02 Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (5)
- 【請求項１】 下記のアミノ酸配列 Met Thr Asn Leu Gln Thr Phe Glu Leu Pro Thr Glu Val Thr Gly Cys Ala Ala Asp Ile Ser Leu Gly Arg Ala Leu Ile Gln Ala Trp Gln Lys Asp Gly Ile Phe Gln Ile Lys Thr Asp Ser Glu Gln Asp Arg Lys Thr Gln Glu Ala Met Ala Ala Ser Lys Gln Phe Cys Lys Glu Pro Leu Thr Phe Lys Ser Ser Cys Val Ser Asp Leu Thr Tyr Ser Gly Tyr Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Thr Ala Gly Lys Pro Asp Phe Pro Glu Ile Phe Thr Val Cys Lys Asp Leu Ser Val Gly Asp Gln Arg Val Lys Ala Gly Trp Pro Cys His Gly Pro Val Pro Trp Pro Asn Asn Thr Tyr Gln Lys Ser Met Lys Thr Phe Met Glu Glu Leu Gly Leu Ala Gly Glu Arg Leu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Gly Phe Glu Leu Pro Ile Asn Thr Phe Thr Asp Leu Thr Arg Asp Gly Trp His His Met Arg Val Leu Arg Phe Pro Pro Gln Thr Ser Thr Leu Ser Arg Gly Ile Gly Ala His Thr Asp Tyr Gly Leu Leu Val Ile Ala Ala Gln Asp Asp Val Gly Gly Leu Tyr Ile Arg Pro Pro Val Glu Gly Glu Lys Arg Asn Arg Asn Trp Leu Pro Gly Glu Ser Ser Ala Gly Met Phe Glu His Asp Glu Pro Trp Thr Phe Val Thr Pro Thr Pro Gly Val Trp Thr Val Phe Pro Gly Asp Ile Leu Gln Phe Met Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Thr Pro His Lys Val Lys Leu Asn Thr Arg Glu Arg Phe Ala Cys Ala Tyr Phe His Glu Pro Asn Phe Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Phe Glu Pro Ser Ala Asn Glu Arg Ile His Tyr Gly Glu His Phe Thr Asn Met Phe Met Arg Cys Tyr Pro Asp Arg Ile Thr Thr Gln Arg Ile Asn Lys Glu Asn Arg Leu Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala Thr Gly Ser で表わされる細菌のエチレン生成酵素をコー ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の形 質転換体。
- 【請求項２】 細菌がシュードモナス属菌である請求項
１に記載した細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片を含有するベクターで形質転換させ
たらん藻の形質転換体。 - 【請求項３】 下記の塩基配列、 ATG ACC AAC CTA CAG ACT TTC GAG TTG CCT ACC GAG GTA ACC GGC TGC GCC GCC GAT ATC TCA TTG GGA AGG GCG CTG ATC CAA GCC TGG CAA AAA GAT GGC ATT TTT CAG ATC AAG ACC GAT AGT GAG CAG GAT CGC AAA ACG CAG GAA GCA ATG GCT GCT AGC AAG CAG TTT TGC AAG GAA CCG CTG ACT TTT AAG AGT AGC TGC GTT AGC GAT CTG ACC TAC AGC GGC TAT GTT GCG TCA GGC GAG GAA GTC ACA GCT GGT AAA CCT GAT TTC CCT GAA ATC TTC ACT GTC TGC AAG GAC TTG TCG GTA GGC GAT CAG CGT GTA AAA GCC GGC TGG CCT TGC CAT GGT CCG GTG CCA TGG CCA AAT AAC ACC TAT CAG AAA AGC ATG AAG ACC TTC ATG GAA GAG CTG GGT TTA GCG GGC GAA CGG TTG CTC AAA CTG ACA GCG CTC GGC TTT GAA CTA CCC ATC AAC ACG TTC ACC GAC TTA ACT CGC GAT GGT TGG CAC CAC ATG CGT GTA TTA CGC TTC CCG CCC CAA ACA TCC ACG CTG TCC CGT GGA ATT GGT GCG CAC ACT GAC TAT GGG TTG TTG GTA ATT GCC GCT CAG GAC GAT GTT GGT GGC TTA TAT ATT CGC CCT CCA GTC GAG GGA GAG AAG CGT AAT CGT AAC TGG TTG CCT GGT GAG AGC TCA GCA GGC ATG TTT GAG CAC GAT GAA CCT TGG ACC TTC GTG ACG CCC ACC CCA GGC GTG TGG ACA GTT TTC CCA GGT GAT ATC TTG CAG TTC ATG ACC GGC GGC CAG CTG CTT TCC ACT CCG CAC AAG GTT AAG CTC AAT ACC CGC GAA CGT TTC GCC TGC GCT TAT TTT CAT GAG CCT AAT TTT GAA GCA TCC GCC TAT CCG TTG TTC GAG CCC AGC GCC AAT GAG CGT ATT CAT TAT GGT GAG CAC TTT ACC AAC ATG TTT ATG CGT TGC TAT CCA GAT CGG ATC ACC ACC CAG AGG ATC AAC AAG GAG AAT CGC CTG GCG CAC TTG GAG GAC TTG AAG AAG TAT TCG GAC ACC CGC GCG ACA GGC TCA で表わされる請求項１又は請求項２に記載 した細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有するベ クターで形質転換させたらん藻の形質転換体。
- 【請求項４】 下記の塩基配列 【化１】 のうち、少なくとも５１９番から１５６８番の塩基配列
を有する請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載
の細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の
形質転換体。 - 【請求項５】 請求項１ないし請求項４のいずれか１項
に記載したらん藻の形質転換体を培養し、二酸化炭素か
らエチレンを生成するエチレンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5062699A JPH06253820A (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の形質転換体と、その形質転換体を利用したエチレン製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5062699A JPH06253820A (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の形質転換体と、その形質転換体を利用したエチレン製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253820A true JPH06253820A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=13207813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5062699A Pending JPH06253820A (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むｄｎａ断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の形質転換体と、その形質転換体を利用したエチレン製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06253820A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019154435A (ja) * | 2018-03-08 | 2019-09-19 | 株式会社熊谷組 | エチレン生産方法およびエチレン製造装置 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0376583A (ja) * | 1989-08-16 | 1991-04-02 | Hagiwara Yoshihide | ヒトタンパク質のラン藻での発現方法 |
| JPH04281793A (ja) * | 1991-03-08 | 1992-10-07 | Hagiwara Yoshihide | 新規プラスミド |
| JPH04330294A (ja) * | 1991-03-13 | 1992-11-18 | Hagiwara Yoshihide | ポリペプチドの発現方法 |
-
1993
- 1993-02-26 JP JP5062699A patent/JPH06253820A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0376583A (ja) * | 1989-08-16 | 1991-04-02 | Hagiwara Yoshihide | ヒトタンパク質のラン藻での発現方法 |
| JPH04281793A (ja) * | 1991-03-08 | 1992-10-07 | Hagiwara Yoshihide | 新規プラスミド |
| JPH04330294A (ja) * | 1991-03-13 | 1992-11-18 | Hagiwara Yoshihide | ポリペプチドの発現方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019154435A (ja) * | 2018-03-08 | 2019-09-19 | 株式会社熊谷組 | エチレン生産方法およびエチレン製造装置 |
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