JPH04330294A - ポリペプチドの発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はポリペプチドの発現方法に関し、
さらに詳しくは、ラン藻細胞を宿主として用い、有用生
理活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子を
含有する担体ＤＮＡで形質転換することにより、効率よ
く該ポリペプチドを発現させる方法に関する。

【０００２】ラン藻（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ　　
シアノバクテリアともいう）は、大腸菌などと同様に、
核膜をもたない原核生物である。しかし、ラン藻は高等
植物、特に紅藻の光合成機構と類似しており、太陽から
の光をエネルギー源として、水及び二酸化炭素とわずか
な無機塩類とから有機物質を生合成し、独立栄養的に大
量に増殖することが可能である。

【０００３】また、ラン藻は古くから食用とされてきた
種も数多くあり［スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、
スイゼンジノリ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ）、ネンジユ
モ（Ｎｏｓｔｏｃ）など］、動物に対しての病原性及び
寄生性も報告されていない。従つて、ラン藻は遺伝子組
換えのための宿主として適しており、安全性にも優れて
いる。

【０００４】上記のような特徴を持つラン藻に有用な生
理活性ペプチドをコードする遺伝子を導入し、大量に発
現できれば、農作物のように季節や天候に左右されずに
食料、機能性食品、飼料等をつくることが可能であり、
さらに、低コスト、省エネルギー、省資源的な医薬品、
医薬部外品、化粧品原料等の生産が可能となることが期
待できる。

【０００５】近年、ラン藻を宿主とする宿主−ベクター
系の開発が急速に進展し、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎｉｄ
ｕｌａｎｓＲ２（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＣＣ
　７９４２）、　Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ　ｑｕａｄｒｕ
ｐｌｉｃａｔｕｍ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＣ
Ｃ　７００２）、　Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ＰＣ
Ｃ　６８０３，　Ａｎａｂａｅｎａ　ＰＣＣ　７１２０
などの種を用いて、多くの異種タンパク質遺伝子の発現
が報告されている［ヒトのカーボニツク・アンヒドラー
ゼおよび大腸菌ｌａｃ　ＩＱ　　リプレツサータンパク
質の発現についてはＧ．Ｄ．Ｐｒｉｃｅ　ａｎｄ　Ｍ．
　Ｒ．　Ｂａｄｇｅｒ，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ
、９１：５０５−５１３（１９８９）；高等藻類（Ｃｙ
ａｎｏｐｈｏｒａｐａｒａｄｏｘａ）のアロフイコシア
ニンの発現についてはＲ．　ｄｅ　Ｌｏｒｉｍｉｅｒ　
ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｏｌ．　１６９：
１８３０−１８３５（１９８７）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　Ａ５０のα−ア
ミラーゼの発現についてはＩ．　Ｖ．　Ｅｌａｎｓｋａ
ｙａ　ａｎｄ　Ｉ．　Ｂ．　Ｍｏｒｚｕｎｏｖａ，　Ｍ
ｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．　Ｖｉｒ
ｕｓｏｌ．　０（９）：７−１１（１９８９）；Ｂ．　
ｓｈａｅｒｉｃｕｓ　１５９３Ｍの殺虫タンパク質の発
現についてはＮ．　Ｔａｎｄｅａｕ　ｄｅ　Ｍａｒｓａ
ｃ　ｅｔａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．
　２０９：３９６−３９８（１９８７）；Ｂ．　ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．　ｉｓｒａｅｌｅｎｓ
ｉｓ　の１３０ｋＤａ　　δ−エンドトキシンの発現に
ついてはＣ．　Ａｎｇｓｕｔｈａｎａｓｏｍｂａｔ　ａ
ｎｄ　Ｓ．　Ｐａｎｙｉｍ，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒ
ｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｄ．５５：２４２８−２４３０
（１９８９）；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンシユクラ
ーゼの発現についてはＹ．　Ｃａｉ　ａｎｄ　Ｃ．Ｐ．
Ｗｏｌｋ，Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７２：３１
３８−３１４５（１９９０）；Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖ
ｅｉおよびＶ．　ｆｉｓｃｈｅｒｉのルシフエラーゼの
発現についてはＧ．　Ｓｃｈｍｅｔｔｅｒｅｒ　ｅｔ　
ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６７：４１１
−４１４（１９８６）；大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ
の発現についてはＤ．　Ｊ．　Ｓｃａｎｌａｎ　ｅｔａ
ｌ．，　Ｇｅｎｅ　９０：４３−４９（１９９０）、Ｍ
．　Ｒ．　Ｓｃｈａｅｆｅｒ　ａｎｄ　Ｓ．　Ｓ．　Ｇ
ｏｌｄｅｎ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７１：
３９７３−３９８１（１９８９）及びＪ．　Ｓ．　Ｂｕ
ｚｂｙ　ｅｔａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：８０
５−８０７（１９８５）；大腸菌のグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼの発現についてはＤ．　Ａ．　Ｌｉｇｈｔｆ
ｏｏｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉ
ｏｌ．１１：３３５−３４４（１９８８）；大腸菌のｒ
ｅｃＡタンパク質の発現についてはＲ．　Ｃ．　Ｍｕｒ
ｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，
　１７２：９６７−９７６（１９９０）；大腸菌のＭｎ
−スーパーオキシドジスムターゼの発現についてはＭ．
　Ｙ．　Ｇｒｕｂｅｒｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎ
ａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ８７：２６０
８−２６１２（１９９０）；光合成細菌Ｒｈｏｄｏｓｐ
ｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍのＲｕＢｉｓＣＯの発現
についてはＪ．　Ｐｉｅｒｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　
８６：５７５３−５７５７（１９８９）；バクテリオフ
アージーλのｃＩリプレツサータンパク質の発現につい
てはＤ．Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｊ．　Ｓｅｉｊ
ｆｆｅｒｓ，　Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ，　２０
３：５０５−５１０（１９８６）参照］。

【０００６】しかし、上記報告の多くは、異種タンパク
質をコードする遺伝子の発現のために、その施主の遺伝
子自身の転写開始領域をそのまま用いており、目的のタ
ンパク質の発現量はごく微量である。また、大腸菌のｔ
ａｃプロモーターやＯＬＰＬプロモーターを用いて異種
タンパク質（ヒト−カーボニツク・アンヒドラーゼ、フ
アージ−λｃＩリプレツサー）を発現させた報告では、
目的タンパク質の発現量を増加させるために、それらの
プロモーターの制御タンパク質をコードする遺伝子も同
一ベクター上に導入するなどの工夫がなされているが、
該報告中に発現量が記載されているヒト−カーボニツク
・アンヒドラーゼでも、その発現量は可溶性タンパク質
の約０．３％という少量であり、期待されるほどの発現
量は得られていない。

【０００７】一方、異種タンパク質（大腸菌のβ−ガラ
クトシダーゼ）の発現のための転写開始領域として宿主
ラン藻の転写開始領域を用いるという報告もなされてい
る［前出のＧｅｎｅ　９０：４３−４９（１９９０）及
びＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　　１７１：３９７３−３
９８１（１９８９）］。しかし、いずれの場合にも、ラ
ン藻の構造遺伝子中にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導
入されているため、融合タンパク質として発現されてお
り、目的の異種タンパク質の産生という点で問題がある
。

【０００８】そこで、本発明者らは、ラン藻細胞を宿主
として、生理活性を有するポリペプチドの効率的発現を
図るべく、まず、アナキステイス・ニデユランス（Ａｎ
ａｃｙｓｔｉｓｎｉｄｕｌａｎｓ）のＲｕＢｉｓＣＯ遺
伝子の転写開始領域及び転写終止領域を発現させようと
する構造遺伝子と連結させ、ラン藻細胞中で機能するオ
ペロンの作成について鋭意研究を行った結果、ＲｕＢｉ
ｓＣＯ転写開始領域及び転写終止領域を用いることによ
り、構造遺伝子が効率よく発現すること、また、作成し
たオペロンを導入するベクターの種類によつても、その
発現量が影響することを見出した。そしてさらに、大腸
菌などで報告のあるＳＤ配列からＡＴＧ（翻訳開始点）
間の塩基数が構造遺伝子の発現に影響を与えることを見
い出し、塩基数の最適化によつて発現量を著るしく高め
ることに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００９】かくして、本発明によれば、生理活性を有
するポリペプチドをコードする構造遺伝子を含有する担
体ＤＮＡでラン藻細胞を形質転換することにより、ラン
藻細胞で該ポリペプチドを発現させる方法において、該
担体ＤＮＡとして、生理活性を有するポリペプチドをコ
ードする構造遺伝子と、該構造遺伝子の上流側に位置す
るアナキステイス・ニジユランスのＲｕＢｉｓＣＯ遺伝
子の転写開始領域と、該構造遺伝子の下流側に位置する
該ＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子の転写終止領域を含有する担体
ＤＮＡを使用することを特徴とするラン藻細胞での生理
活性を有するポリペプチドの発現方法が提供される。

【００１０】以下、本発明の発現方法についてさらに細
胞に説明する。

【００１１】［１］　　担体ＤＮＡの造成生理活性を有
するポリペプチドをコードする構造遺伝子（以下、便宜
上「有用構造遺伝子」ということがある）と、アナキス
テイス・ニデユランスのリブロース−１，５−ジリン酸
カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）
の転写開始領域、ＳＤ様配列及び転写終止領域［Ｋ．　
　Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　ａｎｄ　Ｍ．　Ｓｕｇｉｕｒａ
，Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２００：２７−
３２（１９８５）、熊野正信・杉浦昌弘、遺伝３８（１
２）：２６−３１（１９８４）等参照］とが連結した担
体ＤＮＡを調整するための具体的な方法は後記実施例に
示すとおりであり、以下、その基本的操作について概説
する。

【００１２】（１）　　ＲｕＢｉｓＣＯの転写開始（プ
ロモーター）領域の調整 ＲｕＢｉｓＣＯのプロモーターを含むＤＮＡ断片は、例
えばＫ．　Ｓｈｉｎｏｚａｇｉらの文献［Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８０：
４０５０−４０５４（１９８３）］に記載のプラスミド
ｐＡＮＥ１８（ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトにＲｕ
ＢｉｓＣＯプロモーター領域を含む約５．６ＭＤａのＥ
ｃｏＲＩ断片が挿入されているもの）を常法（Ｔ．　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ
ｕａｌ−Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｏｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ刊）に従つて、制限酵素ＥｃｏＲＩ、
ＳａｃＩ及びＰｓｔＩを用いて切り出すことにより調製
することができる。

【００１３】（２）　　ＲｕＢｉｓＣＯの転写終止（タ
ーミネーター）領域の調製 ＲｕＢｉｓＣＯのターミネーター領域は、例えばＫ．　
Ｓｈｉｎｏｚａｋｉらの文献［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　
Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０：４０５０−４０
５４（１９８３）］に記載のプラスミドｐＡＮＰ１１５
５（ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩサイトにＲｕＢｉｓＣＯタ
ーミネーター領域を含む約１．５ＭＤａのＰｓｔＩ断片
が挿入されているもの）を制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏ
５２Ｉを用いて切り出すことにより調製することができ
る。

【００１４】（３）　　ＳＤ様配列の調製本発明におい
て用いる組換えＤＮＡには、リボソーム認識配列として
、有用構造遺伝子の上流側で且つプロモーター領域の下
流側にＳＤ様配列が導入される。ＳＤ様配列としては、
宿主のラン藻のリボソーマルＲＮＡと相補的なものを使
用するのが好ましく、ラン藻としてアナキステイス・ニ
ジユランス６３０１株を用いる場合のＳＤ様配列として
はＧＧＡＧなる塩基配列のものが使用できるが、これに
限られるものではなく、ＳＤ様配列として知られている
他の塩基配列のものも同様に使用することができる。そ
のようなＳＤ様配列は塩基数が少ないので、通常、合成
によつてつくることが多い。

【００１５】また、ＳＤ様配列は通常ＡＴＧ（翻訳開始
点）の前に位置し、ＳＤ様配列からＡＴＧまでの長さ（
塩基数）は有用構造遺伝子の発現に影響を与える可能性
があるので、宿主の種類、構造遺伝子の塩基配列等に応
じて発現量が最適となるように調節することが望ましい
。その長さは宿主ラン藻の種類、構造遺伝子の塩基配列
等により異なるが、一般には３〜１０ベース程度であり
、最適の長さは宿主構造遺伝子の塩基配列等に応じて実
験的に決めることができる。

【００１６】ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片の調製は通常
ＡＴＧ（翻訳開始点）の前まで又はＡＴＧも含めて行な
うことができ、そのＤＮＡ断片の合成はそれ自体既知の
遺伝子操作技術［日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法ＩＩ」東京化学同人刊（１９８７年）］に
よつて容易に行なうことができる。

【００１７】（４）　　有用構造遺伝子の調製本発明の
方法により発現しうる生理活性を有するポリペプチド（
以下、便宜上「有用ペプチド」ということがある）は、
特定のものに限定されるものではなく、本発明の方法に
よれば、各種の有用ペプチドを効率よく発現させること
ができる。

【００１８】しかして、本発明の方法により発現させう
る有用ペプチドとしては、例えばヒト−ＳＯＤ、インタ
ーロイキン（ヒト、マウスなど）、ヒトインターフエロ
ン−α，−β又は−γ、ヒト−インスリン、ヒト−腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）、ヒト・コロニー刺激因子（ＣＳＦ
）、ヒト−組織プラスミノーゲンアクテイベーター（ｔ
ＰＡ）、ヒト−プロウロキナーセ、ウロキナーゼ、ヒト
−血液凝固因子（Ｉ〜Ｖ、ＶＩＩ〜ＸＩＩＩ）、ヒト−
エリスロポエチン、ヒト−神経成長因子、ヒト−心房性
ナトリウム利尿ペプチド（α−ｈＡＮＰ）、ヒト−膵分
泌性トリプシンインヒビター、成長ホルモン（ヒト、ウ
シ、ブタ、ニワトリ、魚類など）、成長ホルモン放出因
子、抗体（免疫グロブリン）、殺虫タンパク質（ＢＴ蛋
白質など）、種子貯蔵タンパク質（フアゼオリン、ゼイ
ン、グルテニン、グリシニン、ホルデインなど）など並
びにこれら有用ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドが挙げられる。

【００１９】ここで有用ペプチドと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドとは、有用ペプチドそれ
自体並びにその有用ペプチドが本来もつ活性を実質的に
失なうことがない範囲内で該有用ペプチドのアミノ酸配
列の一部が他のアミノ酸と置き換つた有用ペプチドに類
縁するポリペプチドをも包含する意味で使用するもので
ある。

【００２０】従つて、後記実施例で使用されているヒト
−ＳＯＤを例にとつて言えば、「ヒト−ＳＯＤと実質的
に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」には、Ｊ
ａｂｕｓｃｈら［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９：
２３１０−２３１６（１９８０）］及びＢａｒｒａら［
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ１２０；５３−５５（１９８
０）］が報告したアミノ酸配列を有するｈＳＯＤポリペ
プチドの他に、ｈＳＯＤとしての酵素活性を実質的に失
なうことがない範囲内でアミノ酸配列の一部（一般には
５個以下、好ましくは２個以下）が他のアミノ酸と置き
換つたｈＳＯＤに類縁するポリペプチドをも包含され、
具体的には、 （ａ）　　ｈＳＯＤ （ｂ）　　ｈＳＯＤの６番目のシステイン残基（Ｃｙｓ
）がアラニン残基（Ａｌａ）に置き換つたもの（特願昭
６３−３１１０１３号明細書参照）、 （ｃ）　　ｈＳＯＤの１１１番目のシステイン残基（Ｃ
ｙｓ）がセリン残基（Ｓｅｒ）に置き換つたもの（特公
昭６２−１３０６８４号明細書参照）、 （ｄ）　　ｈＳＯＤの６番目のシステイン残基（Ｃｙｓ
）がアラニン残基（Ａｌａ）に、そして１１１番目のシ
ステイン残基（Ｃｙｓ）がセリン残基にそれぞれ置き換
つたもの（特公昭６３−２７３４７３明細書参照）等が
挙げられる。

【００２１】上記の如き有用ペプチドをコードする有用
構造遺伝子の調製は、それ自体既知の遺伝子操作技術［
例えば、日本生化学会編　「続生化学講座１遺伝子研究
法ＩＩ」　　東京化学同人刊（１９８７年）；村松正実
編　　「医学における遺伝子工学」東京化学同人刊（１
９８７年）等の実験書参照］によつて、有用ペプチドを
産生する能力をもつ動物、植物、微生物等の供給源細胞
から抽出クローニングしたり或いは化学的に合成するこ
とにより行なうことができる。

【００２２】（５）　　有用構造遺伝子を含有する発現
可能なオペロンの造成 上記のようにして調製されるＲｕＢｉｓＣＯプロモータ
ー領域、ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片及びＲｕＢｉｓＣ
Ｏターミネーター領域は、生理活性を有するポリペプチ
ドをコードする有用構造遺伝子と共に、（プロモーター
領域）−（ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片）−（翻訳開始
コドン、ＡＴＧ）−（有用構造遺伝子）−（翻訳終止コ
ドン）−ターミネーター領域）の順で、それ自体既知の
方法により連結され、ラン藻細胞中で発現可能なオペロ
ンが造成される。

【００２３】プロモーター及びＳＤ様配列はそれぞれ単
一である必要はなく、２つ又はそれ以上のプロモーター
を縦列させて用いたり及び／又は２つ又はそれ以上のＳ
Ｄ様配列を縦列させて用いることも可能である。

【００２４】上記の有用構造遺伝子を含有するオペロン
は、宿主及び／又はオペロンの種類等によつては実質的
にそのままの状態で宿主を形質転換することも可能であ
るが、通常は宿主に適したベクター（プラスミド）に導
入して形質転換に用いられる。

【００２５】（６）　　ベクター 前記の発現可能なオペロンを導入しうるベクターとして
は、ラン藻細胞中で用いられる広範囲の種類のベクター
を使用することができ、例えば、ｐＵＣ１０４、ｐＵＣ
１０５［Ｃ．Ｊ．Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．
，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　１８４：２４
９−２５４（１９８１）］；ｐＬＳ１０３［Ｌ．　Ａ．
　Ｓｈｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｐ．　ｖａｎ　ｄｅ　Ｐｕ
ｔｔｅ，Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１５０：４１０
−４１３（１９８２）］；ｐＤＰＬ１３［Ｓ．　Ｇｅｎ
ｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，
　１５６：１４８−１５４（１９８３）］；ｐＵＣ３０
３［Ｃ．　Ｊ．　Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．
，　Ｐｌａｓｍｉｄ　１０：１５６−１６３（１９８３
）］；ｐＳＧ１１１［Ｓ．　Ｓ．　Ｇｏｌｄｅｎ　ａｎ
ｄ　Ｌ．　Ａ．　Ｓｈｅｒｍａｎ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ，　１５５：９６６−９７２（１９８３）］；
ｐＰＵＣ２９［Ｃ．　Ｊ．　Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　３１：１０９−１１６（１９
８４）］；ｐＰＬＡＮ　　Ｂａ１［Ｄ．　Ｅ．　Ｌａｎ
ｄｅｎｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ　
Ｇｅｎｅｔ，　１９９：３００−３０５（１９８５）］
；ｐＢＡＳ１８［Ｋ．　Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　ｅｔ　ａ
ｌ．，　Ｇｅｎｅ１９：２２１−２２４（１９８２）］
などが挙げられる。

【００２６】また、そのようなベクターは、プラスミド
及びウイルスから必要に応じて誘導することができ、例
えばアナキステイス・ニデユランス由来のプラスミドｐ
ＢＡ１のＯｒｉＡ領域と、プラスミドｐＵＣのマルチク
ローニング領域と、大腸菌ＣｏｌＥ１系プラスミドのＯ
ｒｉＥ領域とから本発明者らによつて造成された大腸菌
及びラン藻細胞内で複製可能なシヤトルベクターｐＢＡ
Ｘ１８、ｐＢＡＸ１９、ｐＢＡＸ２０なども有利に使用
することができる（後記実施例及び（平成３年３月８日
付で出願された同一出願人による発明の名称が「新規プ
ラスミド」の特許出願参照）。

【００２７】（７）　　担体ＤＮＡの構築上記（５）で
述べた有用構造遺伝子を含有する発現可能なオペロンは
、それ自体既知の遺伝子操作技術によつて、上記（６）
で述べた如きベクター（プラスミド）に導入することが
できる。

【００２８】例えばｈＳＯＤをコードする有用構造遺伝
子を用いて前記（５）に述べた如くして調製されるｈＳ
ＯＤオペロンは、例えばアナキステイス・ニデユランス
細胞中で複製可能なｐＢＡＳ１８又はｐＢＡＸ１８の例
えばＥｃｏＲＩ認識部位を制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて
開裂させ、おのおののＤＮＡ断片を一緒にし、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを作用させることにより挿入され、ｈＳＯＤ
発現用ベクターが得られる。ベクター中に挿入されるオ
ペロンは１つである必要はなく、同一方向であれば、２
、３、４個又はそれ以上縦列させることも可能である。

【００２９】このようにして得られるｈＳＯＤ発現用ベ
クターは大腸菌で常法（Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　
ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈｏｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　刊）
従つてクローリングすることができる。

【００３０】［２］　　形質転換 前述の如くして造成される担体ＤＮＡを用いて形質転換
することのできるラン藻細胞としては、例えば、次にも
のを例示することができる。

【００３１】アナキステイス・ニデユランス６３０１株
（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＣＣ　６３０１）、
アナキステイス・ニデユランスＲ２株（Ｓｙｎｅｃｈｏ
ｃｏｃｃｕｓ　　ＰＣＣ　７９４２）、 Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＣＣ　７００２、Ｓｙ
ｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　　ＰＣＣ　　７４１８（Ａｐ
ｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｈａｌｏｐｈｉｔｉｃａ）、 Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ＰＣＣ　６８０３、Ｓｙ
ｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　　ＰＣＣ　　６７１４、Ｓｐ
ｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｎａｂａｅｎ
ａ　ＰＣＣ　７１２０（Ｎｏｓｔｏｃ　ＰＣＣ　７１２
０）、Ｎｏｓｔｏｃ　ＰＣＣ　７１１９（Ａｎａｂａｅ
ｎａ　ＰＣＣ　７１１９）、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ　ＰＣ
Ｃ　７６０１など。

【００３２】前記の担体ＤＮＡによるこれら宿主ラン藻
細胞の形質転換はそれ場対既知の方法、例えば、Ｒ．　
Ｄ．　Ｐｏｒｔｅｒ［ＣＲＣ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１３（
２）：１１１−１３２］、Ｄ．　Ａ．ｌｉｇｈｔｆｏｏ
ｔら［Ｊ．　Ｇｅｎｅｒａｌ，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　１３４：１５０９−１５１４（１９８８）］、Ｓ
．　Ｓ．　Ｇｏｌｄｅｎら［Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
，　１５８：３６−４２（１９８４）］、Ｈ．　Ｄａｎ
ｉｅｌｌら［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓ
ｃｉ．　ＵＳＡ　８３：２５４６−２５５０（１９８６
）］、Ｔ．　Ｍａｔｓｕｎａｇａら［Ａｐｐｌ．　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２４／２５：
１５１−１６０（１９９０）］などに従つて行なうこと
ができる。

【００３３】例えば、ｈＳＯＤ発現ベクターをアナキス
テイス・ニデユランスへＤ．Ａ．Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔら
の方法で導入し形質転換することができる。得られる形
質転換体はアンピシリン耐性などにより選抜した後、イ
ムノブロツテイング法、オクテロニー法、ポリアクリル
アミドゲル中でのＳＯＤ活性染色、ＳＯＤ活性の測定な
どにより、所期の形質転換体が得られていることを確認
することができる。

【００３４】このようにして得られる形質転換は、光の
照射下で宿下細胞の増殖に応じたそれ自体既知の培地で
培養することにより生理活性を有するポリペプチドの発
現を行わせることができる。培地は形質転換体が選択的
に増殖するための適当量の薬剤、例えばアンピシリンな
どを含むことが好ましい。

【００３５】形質転換体宿主がアナキステイス・ニデユ
ランスの場合、培地としてはＢＧ−１１培地、ＭＤＭ培
地などが適しており、また、培養条件として、培養温度
は一般に１０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃が適し
ている。さらに培地のｐＨは通常７〜８の範囲内及び照
度は５００〜５０００ルクスの範囲内が適している。こ
のような条件下に培養は５〜２０日程度行なうことがで
きる。また、培養は静置又は撹拌下で行なうことができ
る。

【００３６】以上に述べた本発明の方法によれば、有用
ペプチドの発現効率が極めて高く、ラン藻細胞中に産生
される有用ペプチドの分離回収は、培養物からそれ自体
既知の方法で行なうことができる。例えば、培養液から
遠心分離で細胞を集め、破砕したのち、通常知られてい
る方法、例えば塩析、透析、イオン交換クロマトグラフ
イー、ゲルろ過クロマトグラフイー、クロマトフオーカ
ツシング、ハイドロフオービツクインターラクシヨンク
ロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグラフイー
、電気泳動などの操作を適宜組合せることにより分離・
回収することができる。

【００３７】このようにして製造される生理活性を有す
るポリペプチドは、医薬品、医薬部外品、化粧料等に利
用することができる。

【００３８】また、光照射下で培養された形質転換ラン
藻は、培養後、遠心分離などで集められ、そのまま食料
・飼料・機能性食品として利用することもできる。

【００３９】なお、本発明における組換えＤＮＡに用い
られるＲｕＢｉｓＣＯプロモーターは、その下流に位置
する有用構造遺伝子の発現を光の制御下で大量に誘導す
ることができ、大腸菌のｌａｃ，　ｔａｃ，　ｔｒｐ　
プロモーターなどを用いて発現を誘導させる場合に通常
用いられる高価な薬剤を使用しなくてもよいなどの利点
がある。

【００４０】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。

【００４１】

【実施例１】Ｉ．発現調節領域の調製 （Ｉ−１）　　ｐＡＮＥ１８のクローニングｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩサイトにＡｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎｉｄｕ
ｌａｎｓ　６３０１株のリブロース−１，５−ジリン酸
カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子のプロモータ
ー領域を含む５６００ｂｐの断片が挿入されたｐＡＮＥ
１８（Ｋ．　Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、　Ｐｒｏｃ．　Ｎ
ａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０：４０
５０−４０５４（１９８３））４０ｎｇ（１μｌ）を５
０ｍＭ　　ＣａＣｌ２処理したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１株の細胞懸濁液１００μｌに加
え、おだえかに混合した。混合液を氷水中で３０分間イ
ンキユベートした後、さらに４２℃で３分間インキユベ
ートしてＤＮＡを細胞中にとりこませた。この懸濁液に
１ｍｌのＬＢ　ｍｅｄｉｕｍ（１０ｇ／ｌバクトトリプ
トン、５ｇ／ｌ酵母抽出エキス、１０ｇ／ｌ　　ＮａＣ
ｌ）を加え、振盪しながら３７℃で１時間インキユベー
トした。この細胞懸濁液を１００μｌおよび２００μｌ
とりＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．
５％寒天を含む）上にプレートした。このプレートを３
７℃で２４時間インキユベートし、コロニーを単離した
。単離したコロニーを２ｍｌの２ＹＴ液体培地（１６ｇ
／ｌバクトトリプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出エキス、５
ｇ／ｌ　　ＮａＣｌおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリン
を含む）に白金耳で植え付け３７℃で一晩培養した。培
養液を１ｍｌとり２００ｍｌの２ＹＴ液体培地（１００
μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に加え、３７℃で一晩
培養した。培養した細胞を８０００ｒｐｍ、１０分間遠
心して集め、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法（
Ｂ．　Ｐｅｒｂａｌ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕ
ｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，
　ｐ２７３〜２７６、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　Ｓ
ｏｎｓ　Ｉｎｃ．　刊）により大量に調製した。

【００４２】（Ｉ−２）　　ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片の
単離（図１参照） 大量調製したｐＡＮＥ１８ＤＮＡ１０μｌ（１０μｇ）
と１０×Ｌｏｗ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、
１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））１０μｌ及び
ＳａｃＩ（宝酒造（株）製）５０ｕｎｉｔｓに滅菌水を
加えて１００μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１．
５ｍｌ容）を３７℃で３時間反応させた。反応後、１０
×Ｈｉｇｈ　ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１
０ｍＭ　　ＤＴＴ、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ）１５μｌ
、ＳｐｈＩ（宝酒造（株）製）５０ｕｎｉｔｓ及び滅菌
水３０μｌを加えてさらに３７℃で３時間反応させた。 反応後、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８
）及び２．５容のエタノールを加え、−２０℃で２時間
以上放置した。生じた沈殿を１５０００ｒｐｍ、４℃で
１０分間遠心し、７０％エタノールで洗浄後、減圧乾固
させた。残渣を５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に溶解
し、１／１０容の電気泳動用マーカー（０．２５％ブロ
モフエノールブルー、０．２５％キシレンシアノール、
３０％グリセロール）を加え、１．５％アガロースゲル
にのせＴＡＥｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ａ
ｃｅｔａｔｅ、２ｍＭ　　ＥＤＴＡ）で５０Ｖ、１．５
時間電気泳動を行った。泳動後、ゲルを０．５μｇ／ｍ
ｌのエチジウムブロマイド溶液（ＴＡＥ中）に１５分間
浸漬し、ＤＮＡの染色を行った。染色したゲルをトラン
スイルミネーター上にのせ、紫外線をあて目的とするＤ
ＮＡを含むバンドを切り出した。目的のＤＮＡ断片（約
１２００ｂｐ）を、ＤＮＡ精製用キツトＧｅｎｅｃｉｅ
ａｎ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した。

【００４３】（Ｉ−３）　　ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片の
ｐＵＣ１８でのクローニング（図１参照） （１）　　ｐＵＣ１８のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ消化ｐＵＣ
１８ＤＮＡ１０μｌ（１０μｇ）と１０×Ｌｏｗ　ｂｕ
ｆｆｅｒ　５μｌ及びＳａｃＩ　５０ｕｎｉｔｓに滅菌
水を加えて５０μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１
．５ｍｌ容）を３７℃で３時間反応させた。反応後、１
０×Ｈｉｇｈ　ｂｕｆｆｅｒ７．５μｌ、ＳｐｈＩ　５
０ｕｎｉｔｓ及び滅菌水３７．５μｌを加えてさらに３
７℃で３時間反応させた。この反応液に等容のフエノー
ル：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４
：１）を加え激しく撹拌したのち１５０００ｒｐｍ、４
℃、で４時間遠心して水層を分取した。この水層に１／
１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）および２．
５容のエタノールを加え、ＤＮＡをエタノール沈殿させ
た。沈殿を１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心して
集め、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾固させた。残
渣を２０μｌのＴＥに溶解し、次の実験に使用した。

【００４４】（２）　　ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片（１２
００ｂｐ）のｐＵＣ１８（ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ）への挿
入ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片ＤＮＡ０．１μｇ（２μｌ）
およびｐＵＣ１８（ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ）０．５μｇ（
１μｌ）に２４μｌのＴａｋａｒａ　ＤＮＡ　　ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ａ液（宝酒造（株）社製）を加え
、よく撹拌した。この溶液に３μｌのＴａｋａｒａ　Ｄ
ＮＡ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ　　Ｋｉｔ　　Ｂ液を加えよ
く撹拌した後、１６℃で１時間インキユベートした。 反応後、この溶液をＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株の形
質転換に使用した。

【００４５】（３）　　ｐＡＲｕｐ１８の大量調製ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ溶液５μｌ（１００μｇ）に５０ｍＭ　　
ＣａＣｌ２で処理したＥ．　ｃｏｌｉＪＭ１０９株の細
胞懸濁液１００μｌを加え、おだやかに混合した。混合
液を氷水中で３０分間インキユベートした後、さらに４
２℃で２分間インキユベートしてＤＮＡを細胞中にとり
こませた。この懸濁液に１ｍｌの２ＹＴ液体培地を加え
、振盪しながら３７℃で１時間インキユベートした。こ
の細胞懸濁液を１００および２００μｌとり２ＹＴ寒天
培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌ５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、２３．８３ｍｇ／ｌイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ
）および１．５％寒天を含む）上にプレートした。この
プレートを３７℃で２４時間インキユベートし、得られ
た白いコロニーを新しい２ＹＴ寒天培地（５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ、１．５％寒天
を含む）にスポツトして３７℃で一晩培養することによ
り白いコロニーを単離した。

【００４６】単離した白いコロニーを２ｍｌの２ＹＴ液
体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に白金耳
で植え付け３７℃で一晩培養した。培養液を１ｍｌとり
１．５ｍｌ容エツペンドルフチユーブに移し、１５００
０ｒｐｍ、３０秒間遠心して細胞を集めた。集めた細胞
を１５０μｌのＳＥＴ　　ｂｕｆｆｅｒ（２０％シヨ糖
、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０
ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に懸濁し、５μｌのＲＮａｓｅ溶液
（１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ、０．１Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４．８）、０．３ｍＭ　　ＥＤＴＡ）を
加えポルテツクスミキサーで十分混合した。これに３５
０μｌの溶菌液（１％ＳＤＳ、０．２Ｎ　　ＮａＯＨ）
を加え、チユーブを逆さにすることによりおだやかに撹
拌し、完全に溶菌させた。この溶菌液を氷水中で１０分
間インキユベートした後、２５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ４．８）を加え、十分混合し、さらに氷水中
に３０分間放置した。この混合液を１５０００ｒｐｍ、
４℃で１０分間遠心してＳＤＳおよび染色体ＤＮＡを沈
殿させた。上清を別のエツペンドルフチユーブに移し、
等量のイソプロピルアルコールを加えよく混合し、１５
０００ｒｐｍ、４℃で７分間遠心してプラスミドＤＮＡ
を沈殿として集めた。沈殿を滅菌水に溶解し、一部を制
限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（ともに宝酒造（株
）社製）消化し、１．５％アガロースゲル電気泳動を行
い１２００ｂｐのＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片がｐＵＣ１８
に挿入されていることを確認した。

【００４７】ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片がｐＵＣ１８に挿
入されていると確認されたコロニーを４００ｍｌの２Ｙ
Ｔ液体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に
移し、一晩培養した。培養した細胞を８０００ｒｐｍ、
４℃で１０分間遠心して集め、プラスミドＤＮＡをＳＤ
Ｓ−アルカリ法により大量に調製した。

【００４８】（Ｉ−４）　　ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片
の単離（図１参照） （１）　　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片の単離大量調
製したｐＡＲｕｐ１８ＤＮＡ溶液１０μｌ（１０μｇ）
と１０×Ｋ　　ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭＭｇＣｌ２、１０
ｍＭ　　ＤＴＴ、１０００ｍＭ　　ＫＣｌ）２０μｌ及
びＨｉｎｄＩＩＩ４０ｕｎｉｔｓに滅菌水を加えて２０
０μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１．５ｍｌ容）
を２０本用意し、３７℃で３時間反応させた。反応後、
フエノール−クロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール
沈殿して集め１５５μｌの滅菌水に溶解した。この溶解
に５×ＥｃｏＲＩｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、
２５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、３５ｍＭ　　２−メルカプト
エタノール、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
）４０μｌとＥｃｏＲＩ　４０ｕｎｉｔｓを加え２００
μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１．５ｍｌ容）２
０本を３７℃で３時間反応させた。反応後、同様にフエ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿を行いＤＮ
Ａを回収した。目的のＤＮＡ断片（約１２００ｂｐ）を
１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡ
−精製用キツトＧｅｎｅｃｌｅａｎを用いて精製した。 （２）　　ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片（約３５０ｂｐ）
の単離 精製したＤＮＡ断片４０μｇ（８６μｌ）に１０×Ｈｉ
ｇｈ　　ｂｕｆｆｅｒ　１０μｌとＰｓｔＩ（宝酒造（
株）社製）４８ｕｎｉｔｓを加え、１００μｌとしたエ
ツペンドルフチユーブ（１．５ｍｌ容）を３７℃で３時
間反応させた。反応後、１．５％アガロースゲル電気泳
動を行い目的のＤＮＡ断片（約３５０ｂｐ）を分離した
。ＤＮＡをゲルから電気的に溶出し、核酸精製用カート
リツジＮｅｎｓｏｒｂ２０（Ｄｕｐｏｎｄ社製）を用い
て精製した。 （Ｉ−５）　ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の合成（１
）　　オリゴヌクレオチドの合成および精製Ｓｈｉｎｅ
　Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ／Ｄ）配列を含む発現調節領域
の合成のために１０個のオリゴヌクレオチド（図２参照
）をＤＮＡシンセサイザー３８０Ａ（アプライド・バイ
オシステムズ・ジヤパン社製）を用いてホスホアミダイ
ト法により合成を行った。合成が終了したシリカゲルカ
ラムに２ｍｌのアンモニア水（２７％以上）を０．５ｍ
ｌずつ１５分おきに加え、オリゴヌクレオチドをシリカ
支持体より切り出しバイアルに捕集した。このバイアル
にさらに１ｍｌのアンモニア水を加え、キヤツプおよび
パラフイルム等によりシールして５５℃で８時間以上加
温し、塩基部分の保護基（アシル基）をはずした。恒温
槽よりバイアルを取り出し室温に戻した後、キヤツプを
はずして減圧下で濃縮乾固した。乾固後、残渣を２００
μｌの０．０１Ｍトリエチルアミン−酢酸溶液（ＴＥＡ
Ａ、ｐＨ７．５）に溶解し、ＡＭ−３１３−０ＤＳ（山
村化学研究所製）カラムを用いてＨＰＬＣでアセトニト
リル、０．１Ｍ　　ＴＥＡＡの濃度勾配による溶出を行
いメインピークを分取した。分取したピークを減圧下で
濃縮乾固した後、８０％酢酸（アセトニトリル溶液）１
００μｌを加え、混合して室温に３０分間放置すること
により、５’未満のジメチルトリチル（ＤＭＴｒ）基を
はずし、ＯＨ基に変換した。３０分経過後、迅速に乾固
し、残渣を０．０１Ｍ　　ＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）２０
０μｌに溶解し、等容のジエチルエーテルを加え、ＤＭ
Ｔｒ基を抽出除去した。この溶液を減圧下で濃縮乾固し
た後、１１０μｌの０．０１Ｍ　　ＴＥＡＡ（ｐＨ７．
５）に溶解し、再びＨＰＬＣを用いて、分取、精製を行
った。分取したオリゴヌクレオチドを含む溶液を減圧下
で乾固した後、ＴＥに溶解し、次の実験に使用した。

【００４９】（２）　　合成オリゴヌクレオチドのキナ
ーゼによるリン酸化 精製したオリゴヌクレオチド４μｇをＫｉｎａｓｅ　ｂ
ｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ、５ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭスペルミジン、１．７μ
Ｍ　　ＡＴＰ）１２０μｌに混合し、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造（株）社製）９ｕｎｉｔｓを添加
し、３７℃で１５分間インキユベートした。次にＡＴＰ
を終濃度１ｍＭになるように加え、再度Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ９ｕｎｉｔｓを添加し、３７℃で２５分
間インキユベートした。反応後、９０℃、５分間熱処理
した酵素を失活させた。リン酸化したオリゴヌクレオチ
ドを核酸精製用カートリツジＮｅｎｓｏｒｂ２０を用い
て精製した。

【００５０】（３）　　ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
の作製 ４つの塩基数をかえたＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの直結に
よつて行った（図３参照）。ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片を構成するオリゴヌクレオチドのうち下段のストラ
ンドの５’未満に位置するオリゴヌクレオチド１．５μ
ｇ、その他のオリゴヌクレオチド１μｇに５×ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２）２０μ
ｌと滅菌水を加えて８０μｌとした。この溶液を９０℃
、５分間加熱した後、２時間かけて４℃まで徐冷し、１
００ｍＭ　　ＤＴＴと１０ｍＭ　　ＡＴＰを１０μｌず
つ加え、さらにＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）
社製）２．５ｕｎｉｔｓを添加して４℃で１５時間イン
キユベートした。反応液を等容のフエノール−クロロホ
ルムで処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収し次の
実験に用いた。

【００５１】（Ｉ−６）　　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片の作成（図４参照） （１）　　ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片（プロモーター領
域）とＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の直結前記（Ｉ−
４）で単離したＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片１．０μｇに
塩基数の異なる４つのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片そ
れぞれ０．５μｇを５μｌの０．３Ｍ　　ＮａＣｌに混
合し、さらにＴａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ
　Ｂ液　　５μｌを加えよく混合した。この溶液を２６
℃で１時間以上インキユベートした。反応後、溶液をフ
エノール−クロロホルム処理し、常法どうりエタノール
沈殿してＤＮＡを回収した。

【００５２】（２）　　ｌｉｇａｔｉｏｎ反応物のＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ消化 回収したＤＮＡ残渣を１４．５μｌの滅菌水に溶解し、
５×ＨｉｎｄＩＩＩ　　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２、３００ｍＭ　　ＮａＣｌ）４μｌおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩ　　１２ｕｎｉｔｓ（１．５μｌ）を加え、３７℃
で１．５時間反応させた。反応後、さらに５×ＥｃｏＲ
Ｉ　　ｂｕｆｆｅｒ　４μｌ、ＥｃｏＲＩ　　１２ｕｎ
ｉｔｓ（１．０μｌ）および滅菌水５μｌを加え３７℃
で１．５時間反応させた。反応液を等量のフエノール−
クロロホルムで処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して回
収した。

【００５３】（Ｉ−７）　　塩基数の異なる４つの発現
調節領域ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片のｐＵＣ１８
によるクローニング（図４参照） （１）　　ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消
化ｐＵＣ１８　　２５μｇと１０×Ｋ　　ｂｕｆｆｅｒ
（２００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１
００ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１００
ｍＭ　　ＫＣｌ）１０μｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ　　６４
ｕｎｉｔｓ（８μｌ）に滅菌水を加えて１００μｌとし
たエツペンドルフチユーブ（１．５ｍｌ容）を３７℃で
３時間反応させた。この反応液を等容のフエノール−ク
ロロホルムで処理し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回
収した。ＤＮＡ残渣を７５μｌの滅菌水に溶解し、５×
ＥｃｏＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ　　２０μｌ及びＥｃｏＲ
Ｉ　　６０ｕｎｉｔｓ（５μｌ）を加え、３７℃で３時
間反応させた。反応後、同様にフエノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈殿を行った。回収したＤＮＡはＴ
Ｅに０．２５μｇ／μｌになるように溶解し、次の実験
に用いた。

【００５４】（２）　　４つの発現調節領域ＥｃｏＲＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片のｐＵＣ１８（ＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ）への挿入 ４つのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をそれぞれ６０
ｎｇ（１μｌ）とｐＵＣ１８（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）５００ｎｇ（２μｌ）ずつをそれぞれエツペンド
ルフチユーブに入れ、Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ
　ｋｉｔ　Ａ液２４μｌを加えよく混合した。これらの
混合液に、さらにＴａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋ
ｉｔ　　Ｂ液３μｌを加え、混合した後、１６℃で２時
間以上反応させた。この溶液を次の実験に用いた。

【００５５】（３）　　ｐＡＲｕｐ１、２、３および４
の大量調製 ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液３μｌ（５６ｎｇ）に５０ｍＭ　
　ＣａＣｌ２で処理したＥ．　ｃｏｌｉＪＭ１０９株の
細胞懸濁液１００μｌを加え、おだやかに混合した。混
合液を氷水中で３０分間インキユベートした後、さらに
４２℃で２分間インキユベートしてＤＮＡを細胞中に取
りこませた。この懸濁液に１ｍｌの２ＹＴ液体培地を加
え、３７℃、１時間の振盪培養後、２ＹＴ寒天培地（５
０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌ　Ｘ−ｇａｌ
、２３．８３ｍｇ／ｌ　　ＩＰＴＧおよび１．５％寒天
を含む）にプレーテした。得られた白いコロニーからプ
ラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することによつ
て目的のプラスミドｐＡＲｕｐ１、２、３および４）を
保持しているコロニーをスクリーニングした。

【００５６】プラスミドｐＡＲｕｐ１、２、３および４
を保持しているそれぞれのコロニーを２００ｍｌの２Ｙ
Ｔ液体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で
培養し、それぞれのプラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカ
リ法により大量に調製した。

【００５７】（Ｉ−８）　　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片の単離 大量調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＡＲｕｐ１、２、３
および４）を２０μｇ（２０μｌ）とり、１０×Ｋ　　
ｂｕｆｆｅｒ　　２０μｌ、　ＨｉｎｄＩＩＩ　　１２
０ｕｎｉｔｓ（１５μｌ）および滅菌水を加えて２００
μｌとしたエツペンドルフチユーブを各々のプラスミド
で６チユーブずつ用意した。これらのチユーブを３７℃
で３時間インキユベートした。反応後、フエノール−ク
ロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して集め、
それぞれ１５０μｌの滅菌水に溶解した。これらのＤＮ
Ａ溶液にそれぞれ５×ＥｃｏＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ　　
４０μｌ及びＥｃｏＲＩ　　１２０ｕｎｉｔｓ（１０μ
ｌ）を加え３７℃で３時間インキユベートした。反応後
、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収した。目的のそれぞ
れのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動によ
り分離した。ＤＮＡをゲルから電気的に溶出し、核酸精
製用カートリツジＮｅｎｓｏｒｂ２０を用いて精製した
（ＡＲｕｐ１、２、３および４）。

【００５８】ＩＩ．転写終止（ターミネーター）領域の
調製（図５参照） （ＩＩ−１）　　ｐＡＮＰ１１５５のクローニングｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔＩサイトにＡｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ　６３０１株のリブロース−１，５−ジリ
ン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子のターミ
ネーター領域を含む約１５００ｂｐの断片が挿入された
ｐＡＮＰ１１５５（Ｋ．　Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　
８０：４０５０−４０５４（１９８３））５００ｎｇ（
０．５μｌ）を５０ｍＭ　　ＣａＣｌ２処理したＥ．　
ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株の細胞懸濁液１００μｌに加え
、おだやかに混合した。混合液を氷水中で３０分間イン
キユベートした後、さらに４２℃で２分間インキユベー
トしてＤＮＡを細胞中に取りこませた。この懸濁液に１
ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１時間の振盪培養
後、ＬＢ寒天培地（１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリ
ンおよび１．５％寒天を含む）にプレートし、コロニー
を単離した。

【００５９】単離したコロニーを２．８リットルの２Ｙ
Ｔ液体培地（２５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む）
で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法によ
り大量に調製した。

【００６０】（ＩＩ−２）　　Ｅｃｏ５２Ｉ−ＰｓｔＩ
断片の調製 （１）　　ＰｓｔＩ断片の単離 大量調製したｐＡＮＰ１１５５ＤＮＡ２０μｇ（２０μ
ｌ）と１０×Ｈｉｇｈｂｕｆｆｅｒ　　２０μｌ、Ｐｓ
ｔＩ　　１２０ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）に滅菌水を加え
て２００μｌとしたエツペンドルフチユーブ（１．５ｍ
ｌ容）６本用意し、３７℃で３時間インキユベートした
。反応後、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収し、目的の
ＤＮＡ断片（約１５００ｂｐ）を１．５％アガロースゲ
ル電気泳動により分離した。分離したＤＮＡをＧｅｎｅ
ｃｌｅａｎにより精製し、次の実験に用いた。

【００６１】（２）　　ＰｓｔＩ断片のＥｃｏ５２Ｉ消
化ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液６４．５μｌ（約１０μｇ
）に１０×Ｅｃｏ５２Ｉｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０、３０ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２、１０００ｍＭ　　ＮａＣｌ、０．１％　　ＢＳＡ）
７．５μｌ及びＥｃｏ５２Ｉ（東洋紡績（株）社製）１
８ｕｎｉｔｓ（３μｌ）を加え３７℃で３時間インキユ
ベートした。インキユベート後、フエノール−クロロホ
ルム処理、エタノール沈殿してＤＮＡを回収した。回収
したＤＮＡを８μｌの滅菌水に溶解した。

【００６２】（ＩＩ−３）　　ｐＡＲｕｔ１３の作製（
１）　　Ｅｃｏ５２Ｉ−ＰｓｔＩ断片の平滑末端化ＩＩ
−２で調製したＥｃｏ５２Ｉ−ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶
液８μｌにＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ（宝酒造（
株）社製）の×１０　　ｂｕｆｆｅｒ　　１μｌを加え
、７０℃で５分間インキユベートした後、３７℃の恒温
槽に移した。この溶液にＤＮＡ　　Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　
　ＫｉｔのＴ４ＤＮＡ　　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１μ
ｌを加え、ピペツテイングによりやだやかに混和し、３
７℃で５分間反応させた。反応後、この溶液にＤＮＡ　
　Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ　のＤＮＡ　ｄｉｌｕｔｉ
ｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　４０μｌを加え、ボルテツクスで
激しく撹拌することにより酵素を失活させた。

【００６３】（２）　　ｐＵＣ１３のＳｍａＩ消化およ
び脱リン酸化 ｐＵＣ１３　　ＤＮＡ　　２０μｇ（２０μｌ）に５×
ＳｍａＩ　　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、３５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１００
ｍＭ　　ＫＣｌ、３５ｍＭ　　２−メルカプトエタノー
ル、０．０５％　　ＢＳＡ）４０μｌ、ＳｍａＩ（宝酒
造（株）社製）８０ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）および滅菌
水１３０μｌを加え、３０℃で４時間反応させた。反応
後、フエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿を
してＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを１００μｌの
０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、１
０μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液（１．０ｕｎｉ
ｔｓアルカリフオスフアターゼ（ＡＰ、宝酒造（株）社
製）、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１ｍＭ　　ＺｎＳＯ４）を加え
、３７℃で２時間反応させた。反応後、さらに１０μｌ
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え６５℃で３０分
間インキユベートした。反応液をフエノール−クロロホ
ルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して集め０．５μ
ｇ／μｌになるようにＴＥに溶解した。

【００６４】（３）平滑化断片のｐＵＣ１３（ＳｍａＩ
、ＡＰ）への挿入 平滑末端化断片のＤＮＡ溶液２μｌ（約１００ｎｇ）と
ＳｍａＩ、アルカリフオスフアターゼ処理したｐＵＣ１
３のＤＮＡ溶液２μｌ（１．０μｇ）にＴａｋａｒａｌ
ｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　　Ａ液３２μｌを加え、よく
撹拌した。この溶液にＴａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ
　ｋｉｔ　Ｂ液４μｌを加えよく撹拌した後、１６℃で
１時間以上インキユベートした。反応後、この溶液をＥ
．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株の形質転換に使用した。

【００６５】（ＩＩ−４）　　ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ
断片の調製 （１）　　ｐＡＲｕｔ１３の大量調製 ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液１μｌ（約４０ｎｇ）に５０ｍＭ
　　ＣａＣｌ２で処理したＥ．　ｃｏｌｉＪＭ１０９株
の細胞懸濁液１００μｌを加え、おだやかに混合した。 混合液を氷水中で３０分間インキユベートした後、さら
に４２℃で２分間インキユベートしてＤＮＡを細胞中に
取りこませた。この懸濁液に１ｍｌの２ＹＴ液体培地を
加え、３７℃、１時間の振盪培養後、２ＹＴ寒天培地（
５０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌ　Ｘ−ｇａ
ｌ、２３．８３ｍｇ／ｌ　　ＩＰＴＧおよび１．５％寒
天を含む）にプレートした。得られた白いコロニーから
プラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することによ
つて目的のプラスミドｐＡＲｕｔ１３を保持しているコ
ロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコロ
ニーを４００ｍｌの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳ
ＤＳ−アルカリ法により大量に調整した。

【００６６】（２）　　ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片の
単離 大量調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＡＲｕｔ１３）１５
μｇ（１５μｌ）に１０×Ｋ　　ｂｕｆｆｅｒ　　２０
μｌ、ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）社製）１２０ｕｎｉｔ
ｓ（１０μｌ）及び滅菌水を加えて２００μｌとしたエ
ツペンドルフチユーブ（１．５ｍｌ容）を８本用意した
。これらのチユーブを３０℃で３時間インキユベートし
た。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、ＤＮＡ
をエタノール沈殿して集め、それぞれ１１０μｌの滅菌
水に溶解した。これらのＤＮＡ溶液に５×ＥｃｏＲＩ　
　ｂｕｆｆｅｒ　　３０μｌ及びＥｃｏＲＩ　　１２０
ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）を加え、３７℃で３時間インキ
ユベートした。反応後、ＤＮＡをエタノール沈殿して回
収し、目的のＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）を１．５％ア
ガロースゲル電気泳動により分離した。ゲルからＤＮＡ
を電気的に溶出し、核酸精製用カートリツジＮｅｎｓｏ
ｒｂ２０を用いて精製した。

【００６７】ＩＩＩ．ｈオペロンの造成（ＩＩＩ−１）
ｈ遺伝子への転写終止領域の連結（図５参照） （１）　　ｐＵＣ１３−ｈ−ＳＯＤのＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ消化 ｐＵＣ１３のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩサイトにヒト
−スーパーオキシド・ジスムターゼをコードする完全鎖
長ＤＮＡ断片（４７５ｂｐ）が挿入されたｐＵＣ１３−
ｈ−ＳＯＤ（特願平１−２１０１２９号特許出願明細書
の実施例１参照）１０μｇ（２０μｌ）に５×ＥｃｏＲ
Ｉ　　ｂｕｆｆｅｒ　　４０μｌ、ＥｃｏＲＩ　　１２
０ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）及び滅菌水を加えて２００μ
ｌとしたエツペンドルフチユーブを３７℃で３時間イン
キユベートした。反応後、フエノール−クロロホルム処
理、エタノール沈殿してＤＮＡを集め、２１５μｌの滅
菌水に溶解した。この溶液に１０×Ｋ　　ｂｕｆｆｅｒ
　　２５μｌ及びＢａｍＨＩ　　１００ｕｎｉｔｓ（１
０μｌ）を加え、３０℃で３時間反応させた。反応後、
ＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎを用いて精製した。 （２）　　転写終止領域（ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ）の
ｐＵＣ１３−ｈ−ＳＯＤ（ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ）へ
の挿入 ｐＵＣ１３−ｈ−ＳＯＤ（ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ）Ｄ
ＮＡ５００ｎｇ（１μｌ）とＩＩで調製した転写終止領
域６０ｎｇ（０．４μｌ）にＴａｋａｒａ　ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ　ｋｉｔ　Ａ液１１．２μｌを加え、よく混合し
た。この溶液にＴａｋａｒａ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ　　
ｋｉｔＢ液１．４μｌを加えよく撹拌した後、１６℃で
３０分間インキユベートした。反応後、この溶液をＥ．
　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株の形質転換に使用した。

【００６８】（ＩＩＩ−２）　　ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ（ｈＳＯＤ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ）断片の調製
（１）　　ｐＵＣ１３−ｈＳＯＤｔの大量調製ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ溶液２μｌ（約７０ｎｇ）に５０ｍＭ　　Ｃａ
Ｃｌ２で処理したＥ．　ｃｏｌｉＪＭ１０９株の細胞懸
濁液１００μｌを加え、おだやかに混合した。この混合
液を氷水中で３０分間インキユベートした後、さらに４
２℃で２分間インキユベートしてＤＮＡを細胞中に取り
こませた。この懸濁液に１ｍｌの２ＹＴ液体培地を加え
、３７℃、１時間の振盪培養後、２ＹＴ寒天培地（５０
μｇ／ｍｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌ　　Ｘ−ｇａｌ
、２３．８３ｍｇ／ｌ　　ＩＰＴＧおよび１．５％寒天
を含む）にプレートした。得られた白いコロニーからプ
ラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することにより
目的のＤＮＡ断片を保持しているコロニーをスクリーニ
ングした。スクリーニングしたコロニーを６０ｍｌの２
ＹＴ液体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）
で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法によ
り調製した。

【００６９】（２）　　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断
片の単離 調製したｐＵＣ１３−ｈＳＯＤｔ　　ＤＮＡ溶液５０μ
ｌ（２５μｇ）に１０×Ｋ　　ｂｕｆｆｅｒ　　２０μ
ｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ　　１２０ｕｎｉｔｓ（１５μｌ）
及び滅菌水を加え、２００μｌとしたエツペンドルフチ
ユーブ（１．５ｍｌ容）を２本用意した。これらのチユ
ーブを３７℃で３時間インキユベートした。反応後、フ
エノール−クロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈
殿して集め、それぞれ１５０μｌの滅菌水に溶解した。 これらのＤＮＡ溶液に５×ＥｃｏＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ
　　４０μｌ及びＥｃｏＲＩ　　１２０ｕｎｉｔｓ（１
０μｌ）を加え、３７℃で３時間インキユベートした。 反応後、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収し、目的のＤ
ＮＡ断片（約７９０ｂｐ）を１．５％アガロースゲル電
気泳動により分離した。ＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎに
よつて精製した。 （ＩＩＩ−３）　　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ（ｈＳ
ＯＤ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ）断片と発現調節 領域ＡＲｕｐ１、２、３および４）の連結（図６参照）
発現調節領域（ＡＲｕｐ１、２、３および４）１．１２
μｇ（２．１μｌ）とＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片
２．１１μｇ（２．２μｌ）に５×ｌｉｇａｔｉｏｎ　
　ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２）４μｌ、１００
ｍＭ　　ＤＴＴ２μｌ、１０ｍＭ　　ＡＴＰ２μｌ、Ｔ
４ＤＮＡ　　ｌｉｇａｓｅ（宝酒造（株）社製）２．５
ｕｎｉｔｓ（１μｌ）及び滅菌水を加えて２０μｌとし
たエツペンドルフチユーブをそれぞれ用意した。これら
のチユーブを１５℃で一晩インキユベートした後、６０
℃で１０分間熱処理して反応を止めた。これらの溶液に
それぞれ５×ＥｃｏＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ　　１０μｌ
、ＥｃｏＲＩ　　１２ｕｎｉｔｓ（１μｌ）及び滅菌水
を加え５０μｌとした。これらの溶液を３７℃で３時間
インキユベートした。反応後、目的のそれぞれのＤＮＡ
断片（図７参照それぞれ約１２００ｂｐ）を２％アガロ
ースゲル電気泳動によつて分離し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ
を用いて精製した。

【００７０】（ＩＩＩ−４）　　４つのｈＳＯＤ遺伝子
発現用ＤＮＡ断片のクローニング （１）　　ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ消化、アルカリフオ
スフアターゼ処理 プラスミドｐＵＣ１８ＤＮＡ２０μｇ（３０μｌ）に５
×ＥｃｏＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ４０μｌ、ＥｃｏＲＩ　
　１２０ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）に滅菌水を加えて２０
０μｌとしたエツペンドルフチユーブを３７℃で３時間
インキユベートした。反応後、フエノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈殿してＤＮＡを集め、１００μｌ
の０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解
した。この溶液に１０μｌのアルカリフオスフアターゼ
溶液を加え、３７℃で１時間インキユベートした。反応
後、さらに１０μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を
加え６５℃で３０分間インキユベートした。反応液をフ
エノール−クロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈
殿して集め０．１６μｇ／μｌになるようにＴＥに溶解
した。

【００７１】（２）　　ｈＳＯＤオペロン断片のｐＵＣ
１８（ＥｃｏＲＩ、ＡＰ処理）への挿入ｈＳＯＤオペロ
ン（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＳＯＤ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ
１、２、３および４）ＤＮＡ１００ｎｇ（１μｌ）とＥ
ｃｏＲＩ、アルカリフオスフアターゼ処理したｐＵＣ１
８ＤＮＡ３２０ｎｇ（２μｌ）にＴａｋａｒａ　ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　　Ａ液２４μｌをそれぞれ加え、
よく撹拌した。これらの溶液にＴａｋａｒａ　　ｌｉｇ
ａｔｉｏｎｋｉｔ　　Ｂ液３μｌずつ加え、よく撹拌し
た後、１℃で一晩インキユベートした。

【００７２】（３）　　ｐＵＣ１８−Ｒｕｐｔ−ｈＳＯ
Ｄ１、２、３及び４の大量調製 各々のｌｉｇａｔｉｏｎ溶液４μｌ（約５０ｎｇ）に５
０ｍＭ　　ＣａＣｌ２で処理したＥ．ｃｏｌｉ　　ＪＭ
１０９株の細胞懸濁液２００μｌずつ加え、おだやかに
混合した。これらの混合液を氷水中で３０分間インキユ
ベートした後、さらに４２℃で２分間インキユベートし
てＤＮＡを細胞中に取りこませた。これら懸濁液に１ｍ
ｌの２ＹＴ液体培地を各々加え、３７℃、１時間の振盪
培養後、２ＹＴ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン
、４０ｍｇ／ｍｌ　　Ｘ−ｇａｌ、２３．８３ｍｇ／ｌ
　　ＩＰＴＧおよび１．５％寒天を含む）にプレートし
た。得られた白いコロニーからプラスミドを調製し、制
限酵素地図を解析することにより目的の各々のプラスミ
ド（ｐＵＣ１８−Ｒｕｐｔ−ｈＳＯＤ１、２、３及び４
を保持しているコロニーをスクリーニングした。スクリ
ーニングした各々のコロニーを２００ｍｌの２ＹＴ液体
培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で培養し
、各々のプラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により
大量に調製した。

【００７３】（４）　　ＥｃｏＲＩ断片（約１２００ｂ
ｐ）の単離 大量調製したプラスミド（ｐＵＣ１８−Ｒｕｐｔ−ｈＳ
ＯＤ１、２、３及び４）ＤＮＡ約２０μｇ（２０μｌ）
に５×ＥｃｏＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ　　４０μｌ、Ｅｃ
ｏＲＩ　　１２０ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）及び滅菌水１
３０μｌを加え２００μｌとしたエツペンドルフチユー
ブを各々のプラスミドで３本ずつ用意した。これらのチ
ユーブを３７℃で３時間インキユベートした。反応後、
ＤＮＡをエタノール沈殿して集め、各々のプラスミドご
とに１００μｌのＴＥに溶解した。目的の各々のＤＮＡ
断片（約１２００ｂｐ）を１．５％アガロースゲル電気
泳動によつて分離し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎを用いて精製
した。

【００７４】ＩＶ．ラン藻用ｈＳＯＤ遺伝子発現ベクタ
ーの造成（図８参照） （ＩＶ−１）　　ｐＢＲ３２２へのマルチクローニング
サイト（ｐＵＣ１８由来）の導入 （１）　　ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
消化、アルカリフオスフアターゼ処理 ｐＢＲ３２２ＤＮＡ溶液２０μｌ（１０μｇ）に５×Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ　　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、３
００ｍＭＮａＣｌ）４０μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ　　８０
ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）及び滅菌水１３０μｌを加え、
３７℃で２時間インキユベートした。反応後、この溶液
に５×ＥｃｏＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ　　４０μｌ、Ｅｃ
ｏＲＩ　　１２０ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）及び滅菌水５
０μｌを加え、さらに３７℃で２時間反応させた。反応
後、フエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿し
てＤＮＡを集め、１００μｌの０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。この溶液に１０μｌ
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、３７℃で１時
間インキユベートした。反応後、１０μｌのアルカリフ
オスフアターゼ溶液を加え、さらに６５℃で３０分間イ
ンキユベートした。この溶液をフエノール−クロロホル
ム処理し、エタノール沈殿してＤＮＡを回収した。

【００７５】（２）　　ｐＵＣ１８からマルチクローニ
ングサイト（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）の単離ｐＵ
Ｃ１８ＤＮＡ溶液３０μｌ（２０μｇ）に１０×Ｋ　　
ｂｕｆｆｅｒ　　２０μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ　　８０ｕ
ｎｉｔｓ（１０μｌ）及び滅菌水１４０μｌを加えたエ
ツペンドルフチユーブ２本用意し、３７℃で３時間イン
キユベートした。 反応後、フエノール−クロロホルム処理し、エタノール
沈殿してＤＮＡ集め、１１２．５μｌの滅菌水に溶解し
た。これらの溶液に５×ＥｃｏＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ　
　３０μｌ、ＥｃｏＲＩ　　９０ｕｎｉｔｓ（７．５μ
ｌ）を加え、３７℃で３時間インキユベートした。ＤＮ
Ａをエタノール沈殿して回収し、１．５％アガロースゲ
ル電気泳動を行い目的のＤＮＡ断片（約５０ｂｐ）を分
離した。ＤＮＡをゲルから電気的に溶出し、フエノール
−クロロホルム処理、エタノール沈殿して精製した。

【００７６】（３）　　ｐＢＲ３２２（ＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ消化）とマルチクローニングサイトの連結
ｐＢＲ３２２（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡＰ処理
）ＤＮＡ０．２μｇ（１μｌ）とマルチクローニングサ
イトＤＮＡ０．２μｇ（１μｌ）にＴＥ１μｌ、Ｔａｋ
ａｒａ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ　　ｋｉｔ　　Ａ液２４μ
ｌを加え、よく撹拌した。この溶液にＴａｋａｒａｌｉ
ｇａｔｉｏｎｋｉｔ　　Ｂ液３μｌを加え１６℃で４時
間インキユベートした。

【００７７】（４）　　プラスミド　　ｐＢＲ３２２Ｍ
のクローニング ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液３μｌ（４０ｎｇ）に５０ｍＭ　
　ＣａＣｌ２処理したＥ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１の細
胞懸濁液２００μｌを加え、おだやかに混合した。この
混合液を氷水中で３０分間インキユベートした後、さら
に４２℃で２分間インキユベートしてＤＮＡを細胞中に
とりこませた。この懸濁液に１．８ｍｌの２ＹＴ液体培
地を加え、３７℃で１時間の振盪培養後、ＬＢ寒天培地
（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にプレートした
。得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素
地図を解析することにより目的のプラスミド（ｐＢＲ３
２２Ｍ）を保持しているコロニーをスクリーニングした
。スクリーニングしたコロニーを２００ｍｌの２ＹＴ液
体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で培養
し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により大量
に調製した。

【００７８】（ＩＶ−２）　　ＰｖｕＩＩ−Ｅｃｏ４７
ＩＩＩ断片（２５５０ｂｐ）の単離 前記（ＩＶ−１）を調製したＢＲ３２２ＭプラスミドＤ
ＮＡ１０μｇ（１０μｌ）に１０×Ｍ　　ｂｕｆｆｅｒ
（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１
００ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、５００
ｍＭ　　ＮａＣｌ）２０μｌ、ＰｖｕＩＩ（宝酒造（株
）社製）１２０ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）および滅菌水を
加え２００μｌとしたエツペンドルフチユーブ３本用意
した。これらのチユーブを３７℃で３時間インキユベー
トした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、Ｄ
ＮＡをエタノール沈殿して集め、１７４μｌの滅菌水に
それぞれ溶解した。これらの溶液に１０×Ｈ　　ｂｕｆ
ｆｅｒ　　２０μｌおよびＥｃｏ４７ＩＩＩ（宝酒造（
株）社製）２４ｕｎｉｔｓずつ加え、３７℃で３時間イ
ンキユベートした。ＤＮＡをエタノール沈殿し回収し、
目的のＤＮＡ断片（２５５０ｂｐ）を１．５％アガロー
スゲル電気泳動により分離した。分離したＤＮＡ断片は
Ｇｅｎｅｃｌｅａｎを用いて精製し、５０μｌの０．１
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液とした。こ
の溶液に５μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え
、３７℃で１時間インキユベートした。反応後、５μｌ
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、６５℃で３０
分間さらにインキユベートした。反応後、フエノール−
クロロホルム処理し、エタノール沈殿してＤＮＡを集め
、２０μｌのＴＥに溶解した。

【００７９】（ＩＶ−３）　　ｐＢＡＳ１８のＡ．ｎｉ
ｄｕｌａｎｓにおける複製開始点の分離 ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトにＡ．ｎｉｄｕｌａｎ
ｓ６３０１株の内在性プラスミド（ｐＢＡ１、ＢａｍＨ
Ｉ消化）を挿入した大腸菌とＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓとの
間のシヤトルベクターｐＢＡＳ１８（ｋ．　Ｓｈｉｎｏ
ｚａｋｉら、　Ｇｅｎｅ，　１９：２２１−２２４（１
９８２））をＥ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１に導入し、Ｌ
Ｂ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で培
養し、ＳＤＳ−アルカリ法を用いて大量に調製した。

【００８０】調製したｐＢＡＳ１８ＤＮＡ１４μｇ（２
０μｌ）に１０×Ｋ　　ｂｕｆｆｅｒ　　２０μｌ、Ｂ
ａｍＨＩ　　１００ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）および滅菌
水を加えて２００μｌとしたエツペンドルフチユーブ３
本用意し、３０℃で３時間インキユベートした。反応後
、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収し、目的のＤＮＡ断
片（ｐＢＡ１、約８．０ｋｂｐ）を１％アガロースゲル
電気泳動を行い分離し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎにより精製
した。

【００８１】分離・精製したｐＢＡ１（ＢａｍＨＩ消化
）ＤＮＡ２μｇ（５μｌ）に１０×Ｋ　　ｂｕｆｆｅｒ
　　５μｌ、ＸｈｏＩ　　２４ｕｎｉｔｓ（２μｌ）お
よび滅菌水３８μｌを加え、３７℃で３時間インキユベ
ートした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、
エタノール沈殿してＤＮＡを集めた。得られたｐＢＡ１
のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ＤＮＡの両末端をＴａｋａ
ｒａｌｉｇａｔｉｏｎ　　ｋｉｔを用いて平滑末端化し
た。

【００８２】（ＩＶ−４）　　小型化Ｅ．ｃｏｌｉ−Ａ
．ｎｉｄｕｌａｎｓシヤトルベクターｐＢＡＸ１８（６
．９ｋｂｐ）の造成 （１）　　ｐＢＡＸ１８（約６．９ｋｂ）の作成平滑末
端化ＤＮＡ４０ｎｇ（２μｌ）とＰｖｕＩＩ−Ｅｃｏ４
７ＩＩＩ断片のＤＮＡ２００ｎｇ（４μｌ）にＴａｋａ
ｒａ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ　　ｋｉｔ　　Ａ液４８μｌ
を加え、よく撹拌した後、Ｂ液６μｌを加え、１６℃で
４時間インキユベートした。 この溶液を用いＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１株を形質転換し
、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．５
％寒天を含む）にプレートしてコロニーを得た。得られ
たコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図を解
析することにより目的のプラスミドｐＢＡＸ１８を保持
するコロニーをスクリーニングした。スクリーニングし
たコロニーを４５ｍｌの２ＹＴ液体培地（１００μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤＮ
ＡをＳＤＳ−アルカリ法により調製した。

【００８３】（２）　　ｐＢＡＸ１９（約６．４ｋｂ）
の作成 上記（１）で調製したｐＢＡＸ１８ＤＮＡ溶液５μｌ（
２．５μｇ）に１０×Ｍ　　ｂｕｆｆｅｒ　　５μｌ、
ＰｖｕＩＩ（宝酒造（株）社製）２．５μｌ（３０ｕｎ
ｉｔｓ）及び滅菌水３７．５μｌを加え、３７℃で３時
間インキユベートした。この反応液２μｌ（１００ｎｇ
　　ＤＮＡ）にＴＥ２μｌ及びＴａｋａｒａ　　ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ　　Ａ液１６μｌを加えよく撹拌した後、Ｔ
ａｋａｒａ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ　　ｋｉｔ　　Ｂ液４
μｌを加え、１６℃で１０分間インキユベートしたるこ
の溶液を用いＥ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１株を形質転換
し、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．
５％寒天を含む）にプレートしてコロニーを得た。得ら
れたコロニーからプラスミド（ｐＢＡＸ１９）を保持し
ているコロニーをスクリーニングした。スクリーニング
したコロニーを２００ｍｌの２ＹＴ液体培地（１００μ
ｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤ
ＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により大量に調製した。

【００８４】（３）　　ｐＢＡＸ２０（約５．８ｋｂ）
の作成 前記（ＩＶ−３）で調製したＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ（平
滑末端化）ＤＮＡ断片１μｇ（４μｌ）に１０×Ｍ　　
ｂｕｆｆｅｒ　　２μｌ、ＰｖｕＩＩ　　１μｌ（１２
ｕｎｉｔｓ）及び滅菌水１３μｌ）を加え、３７℃で３
時間インキユベートした。この反応液２μｌ（１００ｎ
ｇ）に（２）で調製したＰｖｕＩＩ−Ｅｃｏ４７ＤＮＡ
断片１００ｎｇ（２μｌ）及びＴａｋａｒａ　　ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ　　ｋｉｔ　　Ａ液１６μｌを加え、よく撹
拌した後、さらに、Ｂ液４μｌを加え、１６℃で２時間
インキユベートした。反応後、この溶液を用いてＥ．ｃ
ｏｌｉ　　ＨＢ１０１株を形質転し、ＬＢ寒天培地（５
０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．５％寒天を含む）にプ
レートしてコロニーを得た。得られたコロニーから目的
のプラスミド（ｐＢＡＸ２０）を保持しているコロニー
をスクリーニングし、２００ｍｌの２ＹＴ液体培地（１
００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で培養し、プラス
ミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により調製した。

【００８５】（ＩＶ−５）　　ｈＳＯＤ遺伝子発現用ベ
クターのクローニング （１）　　ｐＢＡＸ１８のＥｃｏＲＩ消化、アルカリフ
オスフアターゼ（ＡＰ）処理 ｐＢＡＸ１８ＤＮＡ１０μｇ（２０μｌ）に５×Ｅｃｏ
ＲＩ　　ｂｕｆｆｅｒ４０μｌ、ＥｃｏＲＩ　　１２０
ｕｎｉｔｓ（１０μｌ）および滅菌１３０μｌを加え２
００μｌとしたエンペンドルフチユーブ２本を用意した
。これらのチユーブを３７℃で３時間インキユベートし
た後、ＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎにより精製し、１０
０μｌの０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
に溶解した。この溶液に１０μｌのアルカリフオスフア
ターゼ溶液を加え３７℃、１時間インキユベートした後
、さらに１０μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を加
え６５℃で３０分間インキユベートした。反応後、フエ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿してＤＮＡ
を回収した。

【００８６】（２）　　ｈＳＯＤオペロンとｐＢＡＸ１
８（ＥｃｏＲＩ、ＡＰ処理）の連結、大量調製前記（Ｉ
ＩＩ−４）で調製した４つのｈＳＯＤオペロン（約１．
２ｋｂｐ）０．２５μｇ（１μｌ）にＥｃｏＲＩ、ＡＰ
処理したｐＢＡＸ１８　　０．５μｇ（１μｌ）をそれ
ぞれに加え、Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ　
を用いてｌｉｇａｔｉｏｎさせた。これらｌｉｇａｔｉ
ｏｎ溶液を用いＥ．　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１株をそれぞ
れ形質転換し、それぞれＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含む）にプレートしてコロニーを得た。 得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地
図を解析することにより目的の各々のプラスミド（ｐＢ
ＡＸＳＯＤ６、ｐＢＡＸＳＯＤ７、ｐＢＡＸＳＯＤ８、
ｐＢＡＸＳＯＤ９、ｐＢＡＸＳＯＤ６−４、ｐＢＡＸＳ
ＯＤ７−４及びｐＢＡＸＳＯＤ８−４）を保持するコロ
ニーをスクリーニングした。スクリーニングした各々の
コロニーを５０ｍｌのＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含む）で培養し、プラスミドＤＮＡをＳ
ＤＳ−アルカリ法により調製した。

【００８７】（３）　　ｐＢＡＳ１８のＥｃｏＲＩ消化
、アルカリフオスフアターゼ（ＡＰ）処理ｐＢＡＳ１８
ＤＮＡ１８μｇ（３０μｌ）に５×ＥｃｏＲＩ　　ｂｕ
ｆｆｅｒ４０μｌ、ＥｃｏＲＩ　　１２ｕｎｉｔｓ（１
０μｌ）および滅菌水１２０μｌを加え２００μｌとし
たエツペンドルフチユーブを３７℃で３時間インキユベ
ートした。反応後、フエノール−クロロホルム処理、ク
ロロホルム処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿して回収し
た。回収したＤＮＡを１００μｌの０．１Ｍ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、１０μｌのアルカ
リフオスフアターゼ溶液（１ｕｎｉｔｓ／１０μｌ）を
加え、３７℃で１時間インキユベートした。１時間後、
１０μｌのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、６５
℃で３０分間インキユベートした。反応後、フエノール
−クロロホルム、クロロホルム処理、エタノール沈殿し
てＤＮＡを精製・回収した。

【００８８】（４）　　ｈＳＯＤオペロンとｐＢＡＳ１
８（ＥｃｏＲＩ、ＡＰ処理）の連結、大量調製前記（Ｉ
ＩＩ−４）で調製した４つのｈＳＯＤオペロン（約１．
２ｋｂ）それぞれ０．２５μｇ（１μｇ）にＥｃｏＲＩ
、ＡＰ処理したｐＢＡＳ１８　　１．５μｇ（２μｌ）
をそれぞれ加え、Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋ
ｉｔを用いてｌｉｇａｔｉｏｎさせた。これらの反応液
を用いＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１株をそれぞれ形質転換
し、それぞれＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン−１．５％寒天を含む）にプレートしてコロニーを得
た。得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵
素地図を解析することにより目的のプラスミド（ｐＢＡ
ＳＯＤ６、ｐＢＡＳＯＤ７、ｐＢＡＳＳＯＤ８、ｐＢＡ
ＳＯＤ９）を保持するコロニーをスクリーニングした。 スクリーニングした各々のコロニーを２００ｍｌの２Ｙ
Ｔ液体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で
培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法を用い
て調製した。

【００８９】Ｖ．ｈＳＯＤ遺伝子のラン藻Ａｎａｃｙｓ
ｔｉｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ６３０１、Ｒ２による発現（
Ｖ−１）　　Ａ．　ｎｉｄｕｌａｎｓ６３０１（Ｓｙｎ
ｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＣＣ６３０１）およびＲ２株
（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ＰＣＣ７９４２）の形
質転換 １００ｍｌのＢＧ−１１液体培地で１〜５日間培養した
細胞を８０００ｒｐｍで５分間遠心して集め、１０ｍｌ
の新鮮な液体培地に懸濁した（１０８〜１０９ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌ）。この細胞懸濁液を１ｍｌずつポリブロピレ
ンチユーブ（Ｆａｌｃｏｎ２０５９）に分注し、それぞ
れのチユーブに調製したプラスミドＤＮＡを０．１〜１
０μｇの濃度で加えた。 これらのチユーブをそれぞれアルミホイルでおおい、３
０℃で一晩培養した後、おおつていたアルミホイルをは
ずし、光照射下（光源：白色光蛍光灯；１０００〜２０
００ルクス）、３０℃でさらに６時間培養した。これら
の細胞懸濁液から１００〜５００μｌ取り、ＢＧ−１１
寒天培地（１ｍＭチオ硫酸ナトリウム、１〜５μｇ／ｍ
ｌアンピシリン、１．５％寒天を含む）にプレートした
。 これらのプレートを光照射下（光源；白色光蛍光灯；２
０００〜３０００ルクス）で４〜１０日間培養した。

【００９０】（Ｖ−２）培養 このようにして得られたコロニーを２ｍｌのＢＧ−１１
（１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）液体培地に移し
、光照射下（光源：白色光蛍光灯；２０００〜３０００
ルクス）で１０日間培養した。次に、これらの培養液を
１００ｍｌのＢＧ−１１（１０μｇ／ｍｌアンピシリン
を含む）液体培地に移し、光照射下（２０００〜３００
０ルクス）で２０日間培養した。さらに、これらの培養
液をそれぞれ１０ｍｌずつとり、１００ｍｌのＢＧ−１
１（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）液体培地にそ
れぞれ移し、光照射下で２０日間培養した。細胞を８０
００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して集め、１ｍＭ　　
Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、
遠心することによつて洗浄した。洗浄後、細胞は実験使
用時まで−２０℃で保存した。

【００９１】（Ｖ−２）ｈＳＯＤの検出（１）　　ｈ−
ＳＯＤ活性染色 リボフラビンを加えた光重合法［蛋白質核酸酵素１１：
７４４（１９６６）］で作成したアクリルアミドゲルを
用い、電気泳動を行った。泳動後、ゲルを５０ｍＭリン
酸カリウム（ｐＨ７．８）−０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡで
２〜３回（５分）洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム
（ＮＢＴ）溶液（２．５ｍＭ　　ＮＢＴ、５０ｍＭリン
酸カリウム、０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）に
７分間浸した。次にリボフラビン溶液（１００μＭリボ
フラビン、３０ｍＭテトラメチルエチレンジアミン、５
０ｍＭリン酸カリウム、０．５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．
８）に浸し、ゲル中のコントラストができるまで白色光
中で発色させた。その結果を９図に示す。この図におい
てＳＯＤ活性のある部分は発色せず、他の部分は紫とな
るが、これからわかるように、アナキステイス・ニデユ
ランス自身が持つＦｅ−ＳＯＤ以外に、形質転換体では
ｈＳＯＤの活性が検出された。

【００９２】（２）　　抗ヒト−ＳＯＤ抗体による検出
（２−１）　　ウエスタンブロツテイング２０％ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルを用いて、Ｌａｅｍｍｌｉら
（Ｎａｔｕｒｅ、２３７、６８０（１９７０））の条件
下、還元状態で電気泳動を行った。泳動後、ゲル中のタ
ンバク質をニトロセルロース膜（アマシヤム社製、Ｈｙ
ｂｏｎｄ（Ｃ）に電気的に移した。この膜を０．３％　
　Ｈ２Ｏ２を含む５０％メタノールに２０分間浸し、内
性のペルオキシダーゼを失活させた後、５％スキムミル
ク、０．１％　　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（２０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．９％　　ＮａＣｌ、ｐＨ
７．４）に３７℃で２時間浸した（ブロツキング）。ブ
ロツキング処理した膜を洗浄液（０．０５％　　Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＴＢＳ）で５分間洗い、１／１０００抗
体ヒト−ＳＯＤ（ヤギＩｇＧ、Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔ
ｅ社製）、０．１％　　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳに
３７℃で２時間インキユベートした。膜を洗浄液で２０
分間（５分×４）洗浄した後、１０ｍｇジアミノベンチ
ジン（ＤＡＢ）及び１５μｌの３２％　　Ｈ２Ｏ２を含
む４０ｍｌの０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）で染色させた。

【００９３】その結果、形質転換体から抽出した抽出液
を泳動したレーン上に、標準試料のｈＳＯＤ（シグマ社
製）と同じ位置に、褐色に染色されたバンドが検出され
た（図１０）。

【００９４】（２−２）　　オクテローニー法（免疫学
実験入門ｐ７４〜７７、学会出版センター刊）１．２％
　　ａｇａｒｏｓｅ溶液（１０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ
（ｐＨ７．２）、０．１５ＭＮａＣｌ及び０．１％　　
ＮａＮ３を含む）をシヤーレ（Ｆａｌｃｏｎ１０２９）
に厚さ２〜３ｍｍになるように固め、適当な位置に穴を
開ける。中央の穴に抗ヒト−ＳＯＤ抗体を１０μｌ、そ
の回りの穴には形質転換体の抽出液（１０μｌ）、コン
トロールとしてＡ．　ｎｉｄｕｌａｎｓ　Ｒ２（非形質
転換体）の抽出液（４０μｌ）及び標準試料のｈＳＯＤ
を入れ、４℃で一晩インキユベートした。インキユベー
ト後、寒天プレートをシヤーレより取り出し、ＰＢＳ（
１０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．２、０．１５Ｍ
　　ＮａＣｌ）に浸し、十分に除タンパクした（ＰＢＳ
を数回交換、２〜３日間）。このプレートを０．５％ア
ミドプラツク溶液（９０ｍｌメタノール、１０ｍｌ氷酢
酸）に浸し、染色した。その結果、抗ヒト−ＳＯＤ抗体
と標準試料のｈＳＯＤ、形質転換体の抽出液（６−４、
８−４）との間に沈降線が形成されるのがわかつた。さ
らに、その沈降線は一本の線（コの字）として現われ、
形質転換体中に標準試料のｈＳＯＤと同じ抗原（ヒト−
ＳＯＤ）がつくられていることが確認された（図１１）
。

【００９５】（３）　　ｈ−ＳＯＤ活性の検出ラン藻ア
ナキステイス・ニデユランスは内性のＳＯＤ（Ｆｅ−Ｓ
ＯＤ）をもつているが、ｈＳＯＤ（Ｃｕ・Ｚｎ−ＳＯＤ
）とは１ｍＭ　　ＫＣＮによつて阻害されるかどうかに
よつて活性を区別して測定することが可能である。光学
セル（１ｍｌ用）に５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．
８）、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１ｍＭキサンチン
、１０μＭチトクロムＣ（ウマ心臓Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　
シグマ社製）及びサンプル（ＳＯＤ）を入れ、全容を９
８０μｌとする。これにキサンチン酸化酵素（ベーリン
ガーマンハイム社製）を２０μｌ加え、反応を開始し、
チトクロームＣ還元を５５０ｎｍの吸光度増加の初速（
３０〜６０秒）を求め、この値をνとする。ＳＯＤサン
プルを加えないときのチトクロームＣ還元速度をｖとし
た。この条件下でのチトクロームＣ還元を５０％阻害す
るＳＯＤを１／３ｕｎｉｔとし、（ｖ／ν−１）からサ
ンプル中の総ｕｎｉｔ数を求めた（植物酵素・蛋白質研
究法ｐ３７３浅田浩二、共立出版）。またνを測定した
反応液に１００ｍＭ　　ＫＣｌ（１０μｌ）を加え、チ
トクロームＣ還元速度ν’を求め、ｕｎｉｔ数を求めた
（ｖ／ν’−１）。アナキステイス・ニデユランスの細
胞中に生成されたｈＳＯＤの活性｛（ｖ／ν−１）−（
ｖ／ν’−１）｝を求めた。

【００９６】その結果、形質転換体から得られた粗抽出
液の比活性（１Ａ２８０ｕｎｉｔあたりの活性）は０．
７〜１２ｕｎｉｔｓ／Ａ２８０という高い値を示した（
表１）。

【００９７】

【表１】 　　また、これらの比活性は基となるベクターの種類及
びＳＤ様配列とＡＴＧと間の塩基数によつて強く影響を
受け、量も比活性が高かったのはｐＢＡＸＳＯＤ８（ｐ
ＢＡＸ１８を基にし、ＳＤ〜ＡＴＧ間の塩基数が８塩基
）であつた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はアナキステイス・ニデユランスＲｕＢｉ
ｓＣＯ発現調節領域（ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片）の調
製のための工程図である。

【図２】図２はＳＤ様配列を含む領域（ＰｓｔＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片）を合成するために化学合成した１０個
のオリゴヌクレオチドの塩基配列である。

【図３】ＳＤ様配列を含む領域（ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片）の調製のための工程図である。

【図４】ＲｕＢｉｓＣＯ発現調節領域（ＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片）の調製のための工程図である。

【図５】ＲｕＢｉｓＣＯ転写終止領の調製およびｐｕＣ
−ｈ　　ＳＯＤｔプラスミドの構築図である。

【図６】ｈＳＯＤオペロンの造成図である。

【図７】ｈＳＯＤオペロン（ＳＯＤ７）の塩基配列であ
る。

【図８】ベクタープラスミド　　ｐＢＡＸ１８、１９お
よび２０の構築図である。

【図９】ＳＯＤの活性染色の結果を示す図である。

【図１０】ウエスタンブロツテングの結果を示す図であ
る。

【図１１】オクテロニーの結果を示す図である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　生理活性を有するポリペプチドをコー
   ドする構造遺伝子を含有する担体ＤＮＡでラン藻細胞を
   形質転換することにより、ラン藻細胞で該ポリペプチド
   を発現させる方法において、該担体ＤＮＡとして、生理
   活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子と、
   該構造遺伝子の上流側に位置するアナキステイス・ニジ
   ユランスのＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子の転写開始領域と、該
   構造遺伝子の下流側に位置する該ＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子
   の転写終止領域を含有する担体ＤＮＡを使用することを
   特徴とするラン藻細胞での生理活性を有するポリペプチ
   ドの発現方法。
2. 【請求項２】　　該担体ＤＮＡが、生理活性を有するポ
   リペプチドをコードする構造遺伝子と、該構造遺伝子の
   上流側に位置するアナキステイス・ニジユランスのＲｕ
   ＢｉｓＣＯ遺伝子の転写開始領域と、該構造遺伝子の下
   流側に位置する該ＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子転写終止領域か
   らなるオペロンが導入されたベクタープラスミドである
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　ベクタープラスミドがプラスミドｐＢ
   ＡＳ１８、ｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＸ１９又はｐＢＡＸ２
   ０である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】　　生理活性を有するポリペプチドがヒト
   −ＳＯＤと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペ
   プチドである請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】　　ヒト−ＳＯＤと実質的に同一のアミノ
   酸配列を有するポリペプチドをコードするヒト−ＳＯＤ
   構造遺伝子と、その上流側に位置するアナキステイス・
   ニジユランスのＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子の転写開始領域と
   、該ヒト−ＳＯＤ構造遺伝子の下流側に位置する該Ｒｕ
   ＢｉｓＣＯ遺伝子の転写終止領域からなるヒト−ＳＯＤ
   オペロン。
6. 【請求項６】　　請求項２記載のヒト−ＳＯＤオペロン
   が導入されたベクタープラスミドｐＢＡＳ１８又はｐＢ
   ＡＸ１８よりなるヒト−ＳＯＤ発現ベクター。
7. 【請求項７】　　請求項６記載のヒト−ＳＯＤ発現ベク
   ターで形質転換されたラン藻細胞。
8. 【請求項８】　　請求項７記載のラン藻細胞を培地で培
   養し、その培養物からヒト−ＳＯＤを採取することを特
   徴とするヒト−ＳＯＤの製造方法。