JPH04330294A - ポリペプチドの発現方法 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】本発明はポリペプチドの発現方法に関し、
さらに詳しくは、ラン藻細胞を宿主として用い、有用生
理活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子を
含有する担体DNAで形質転換することにより、効率よ
く該ポリペプチドを発現させる方法に関する。
さらに詳しくは、ラン藻細胞を宿主として用い、有用生
理活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子を
含有する担体DNAで形質転換することにより、効率よ
く該ポリペプチドを発現させる方法に関する。
【0002】ラン藻(cyanobacteria
シアノバクテリアともいう)は、大腸菌などと同様に、
核膜をもたない原核生物である。しかし、ラン藻は高等
植物、特に紅藻の光合成機構と類似しており、太陽から
の光をエネルギー源として、水及び二酸化炭素とわずか
な無機塩類とから有機物質を生合成し、独立栄養的に大
量に増殖することが可能である。
シアノバクテリアともいう)は、大腸菌などと同様に、
核膜をもたない原核生物である。しかし、ラン藻は高等
植物、特に紅藻の光合成機構と類似しており、太陽から
の光をエネルギー源として、水及び二酸化炭素とわずか
な無機塩類とから有機物質を生合成し、独立栄養的に大
量に増殖することが可能である。
【0003】また、ラン藻は古くから食用とされてきた
種も数多くあり[スピルリナ(Spirulina)、
スイゼンジノリ(Aphanothece)、ネンジユ
モ(Nostoc)など]、動物に対しての病原性及び
寄生性も報告されていない。従つて、ラン藻は遺伝子組
換えのための宿主として適しており、安全性にも優れて
いる。
種も数多くあり[スピルリナ(Spirulina)、
スイゼンジノリ(Aphanothece)、ネンジユ
モ(Nostoc)など]、動物に対しての病原性及び
寄生性も報告されていない。従つて、ラン藻は遺伝子組
換えのための宿主として適しており、安全性にも優れて
いる。
【0004】上記のような特徴を持つラン藻に有用な生
理活性ペプチドをコードする遺伝子を導入し、大量に発
現できれば、農作物のように季節や天候に左右されずに
食料、機能性食品、飼料等をつくることが可能であり、
さらに、低コスト、省エネルギー、省資源的な医薬品、
医薬部外品、化粧品原料等の生産が可能となることが期
待できる。
理活性ペプチドをコードする遺伝子を導入し、大量に発
現できれば、農作物のように季節や天候に左右されずに
食料、機能性食品、飼料等をつくることが可能であり、
さらに、低コスト、省エネルギー、省資源的な医薬品、
医薬部外品、化粧品原料等の生産が可能となることが期
待できる。
【0005】近年、ラン藻を宿主とする宿主−ベクター
系の開発が急速に進展し、Anacystis nid
ulansR2(Synechococcus PCC
7942)、 Agmenellum quadru
plicatum(Synechococcus PC
C 7002)、 Synechocystis PC
C 6803, Anabaena PCC 7120
などの種を用いて、多くの異種タンパク質遺伝子の発現
が報告されている[ヒトのカーボニツク・アンヒドラー
ゼおよび大腸菌lac IQ リプレツサータンパク
質の発現についてはG.D.Price and M.
R. Badger, Plant Physiol
、91:505−513(1989);高等藻類(Cy
anophoraparadoxa)のアロフイコシア
ニンの発現についてはR. de Lorimier
et al., J. Bacterol. 169:
1830−1835(1987);Bacillus
amyloliquefaciens A50のα−ア
ミラーゼの発現についてはI. V. Elanska
ya and I. B. Morzunova, M
ol. Genet. Mikrobiol. Vir
usol. 0(9):7−11(1989);B.
shaericus 1593Mの殺虫タンパク質の発
現についてはN. Tandeau de Marsa
c etal., Mol. Gen. Genet.
209:396−398(1987);B. thu
ringiensis var. israelens
is の130kDa δ−エンドトキシンの発現に
ついてはC. Angsuthanasombat a
nd S. Panyim, Appl. Envir
on. Microbid.55:2428−2430
(1989);B.subtilisのレバンシユクラ
ーゼの発現についてはY. Cai and C.P.
Wolk,J. Bacteriol, 172:31
38−3145(1990);Vibrio harv
eiおよびV. fischeriのルシフエラーゼの
発現についてはG. Schmetterer et
al., J. Bacteriol,167:411
−414(1986);大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ
の発現についてはD. J. Scanlan eta
l., Gene 90:43−49(1990)、M
. R. Schaefer and S. S. G
olden, J. Bacteriol, 171:
3973−3981(1989)及びJ. S. Bu
zby etal., Science 230:80
5−807(1985);大腸菌のグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼの発現についてはD. A. Lightf
oot et al., Plant Mol. Bi
ol.11:335−344(1988);大腸菌のr
ecAタンパク質の発現についてはR. C. Mur
phy et al., J. Bacteriol,
172:967−976(1990);大腸菌のMn
−スーパーオキシドジスムターゼの発現についてはM.
Y. Gruberet al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA87:260
8−2612(1990);光合成細菌Rhodosp
irillum rubrumのRuBisCOの発現
についてはJ. Pierce et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA
86:5753−5757(1989);バクテリオフ
アージーλのcIリプレツサータンパク質の発現につい
てはD.Friedberg and J. Seij
ffers, Mol.Gen. Genet, 20
3:505−510(1986)参照]。
系の開発が急速に進展し、Anacystis nid
ulansR2(Synechococcus PCC
7942)、 Agmenellum quadru
plicatum(Synechococcus PC
C 7002)、 Synechocystis PC
C 6803, Anabaena PCC 7120
などの種を用いて、多くの異種タンパク質遺伝子の発現
が報告されている[ヒトのカーボニツク・アンヒドラー
ゼおよび大腸菌lac IQ リプレツサータンパク
質の発現についてはG.D.Price and M.
R. Badger, Plant Physiol
、91:505−513(1989);高等藻類(Cy
anophoraparadoxa)のアロフイコシア
ニンの発現についてはR. de Lorimier
et al., J. Bacterol. 169:
1830−1835(1987);Bacillus
amyloliquefaciens A50のα−ア
ミラーゼの発現についてはI. V. Elanska
ya and I. B. Morzunova, M
ol. Genet. Mikrobiol. Vir
usol. 0(9):7−11(1989);B.
shaericus 1593Mの殺虫タンパク質の発
現についてはN. Tandeau de Marsa
c etal., Mol. Gen. Genet.
209:396−398(1987);B. thu
ringiensis var. israelens
is の130kDa δ−エンドトキシンの発現に
ついてはC. Angsuthanasombat a
nd S. Panyim, Appl. Envir
on. Microbid.55:2428−2430
(1989);B.subtilisのレバンシユクラ
ーゼの発現についてはY. Cai and C.P.
Wolk,J. Bacteriol, 172:31
38−3145(1990);Vibrio harv
eiおよびV. fischeriのルシフエラーゼの
発現についてはG. Schmetterer et
al., J. Bacteriol,167:411
−414(1986);大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ
の発現についてはD. J. Scanlan eta
l., Gene 90:43−49(1990)、M
. R. Schaefer and S. S. G
olden, J. Bacteriol, 171:
3973−3981(1989)及びJ. S. Bu
zby etal., Science 230:80
5−807(1985);大腸菌のグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼの発現についてはD. A. Lightf
oot et al., Plant Mol. Bi
ol.11:335−344(1988);大腸菌のr
ecAタンパク質の発現についてはR. C. Mur
phy et al., J. Bacteriol,
172:967−976(1990);大腸菌のMn
−スーパーオキシドジスムターゼの発現についてはM.
Y. Gruberet al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA87:260
8−2612(1990);光合成細菌Rhodosp
irillum rubrumのRuBisCOの発現
についてはJ. Pierce et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA
86:5753−5757(1989);バクテリオフ
アージーλのcIリプレツサータンパク質の発現につい
てはD.Friedberg and J. Seij
ffers, Mol.Gen. Genet, 20
3:505−510(1986)参照]。
【0006】しかし、上記報告の多くは、異種タンパク
質をコードする遺伝子の発現のために、その施主の遺伝
子自身の転写開始領域をそのまま用いており、目的のタ
ンパク質の発現量はごく微量である。また、大腸菌のt
acプロモーターやOLPLプロモーターを用いて異種
タンパク質(ヒト−カーボニツク・アンヒドラーゼ、フ
アージ−λcIリプレツサー)を発現させた報告では、
目的タンパク質の発現量を増加させるために、それらの
プロモーターの制御タンパク質をコードする遺伝子も同
一ベクター上に導入するなどの工夫がなされているが、
該報告中に発現量が記載されているヒト−カーボニツク
・アンヒドラーゼでも、その発現量は可溶性タンパク質
の約0.3%という少量であり、期待されるほどの発現
量は得られていない。
質をコードする遺伝子の発現のために、その施主の遺伝
子自身の転写開始領域をそのまま用いており、目的のタ
ンパク質の発現量はごく微量である。また、大腸菌のt
acプロモーターやOLPLプロモーターを用いて異種
タンパク質(ヒト−カーボニツク・アンヒドラーゼ、フ
アージ−λcIリプレツサー)を発現させた報告では、
目的タンパク質の発現量を増加させるために、それらの
プロモーターの制御タンパク質をコードする遺伝子も同
一ベクター上に導入するなどの工夫がなされているが、
該報告中に発現量が記載されているヒト−カーボニツク
・アンヒドラーゼでも、その発現量は可溶性タンパク質
の約0.3%という少量であり、期待されるほどの発現
量は得られていない。
【0007】一方、異種タンパク質(大腸菌のβ−ガラ
クトシダーゼ)の発現のための転写開始領域として宿主
ラン藻の転写開始領域を用いるという報告もなされてい
る[前出のGene 90:43−49(1990)及
びJ.Bacteriol. 171:3973−3
981(1989)]。しかし、いずれの場合にも、ラ
ン藻の構造遺伝子中にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導
入されているため、融合タンパク質として発現されてお
り、目的の異種タンパク質の産生という点で問題がある
。
クトシダーゼ)の発現のための転写開始領域として宿主
ラン藻の転写開始領域を用いるという報告もなされてい
る[前出のGene 90:43−49(1990)及
びJ.Bacteriol. 171:3973−3
981(1989)]。しかし、いずれの場合にも、ラ
ン藻の構造遺伝子中にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導
入されているため、融合タンパク質として発現されてお
り、目的の異種タンパク質の産生という点で問題がある
。
【0008】そこで、本発明者らは、ラン藻細胞を宿主
として、生理活性を有するポリペプチドの効率的発現を
図るべく、まず、アナキステイス・ニデユランス(An
acystisnidulans)のRuBisCO遺
伝子の転写開始領域及び転写終止領域を発現させようと
する構造遺伝子と連結させ、ラン藻細胞中で機能するオ
ペロンの作成について鋭意研究を行った結果、RuBi
sCO転写開始領域及び転写終止領域を用いることによ
り、構造遺伝子が効率よく発現すること、また、作成し
たオペロンを導入するベクターの種類によつても、その
発現量が影響することを見出した。そしてさらに、大腸
菌などで報告のあるSD配列からATG(翻訳開始点)
間の塩基数が構造遺伝子の発現に影響を与えることを見
い出し、塩基数の最適化によつて発現量を著るしく高め
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
として、生理活性を有するポリペプチドの効率的発現を
図るべく、まず、アナキステイス・ニデユランス(An
acystisnidulans)のRuBisCO遺
伝子の転写開始領域及び転写終止領域を発現させようと
する構造遺伝子と連結させ、ラン藻細胞中で機能するオ
ペロンの作成について鋭意研究を行った結果、RuBi
sCO転写開始領域及び転写終止領域を用いることによ
り、構造遺伝子が効率よく発現すること、また、作成し
たオペロンを導入するベクターの種類によつても、その
発現量が影響することを見出した。そしてさらに、大腸
菌などで報告のあるSD配列からATG(翻訳開始点)
間の塩基数が構造遺伝子の発現に影響を与えることを見
い出し、塩基数の最適化によつて発現量を著るしく高め
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【0009】かくして、本発明によれば、生理活性を有
するポリペプチドをコードする構造遺伝子を含有する担
体DNAでラン藻細胞を形質転換することにより、ラン
藻細胞で該ポリペプチドを発現させる方法において、該
担体DNAとして、生理活性を有するポリペプチドをコ
ードする構造遺伝子と、該構造遺伝子の上流側に位置す
るアナキステイス・ニジユランスのRuBisCO遺伝
子の転写開始領域と、該構造遺伝子の下流側に位置する
該RuBisCO遺伝子の転写終止領域を含有する担体
DNAを使用することを特徴とするラン藻細胞での生理
活性を有するポリペプチドの発現方法が提供される。
するポリペプチドをコードする構造遺伝子を含有する担
体DNAでラン藻細胞を形質転換することにより、ラン
藻細胞で該ポリペプチドを発現させる方法において、該
担体DNAとして、生理活性を有するポリペプチドをコ
ードする構造遺伝子と、該構造遺伝子の上流側に位置す
るアナキステイス・ニジユランスのRuBisCO遺伝
子の転写開始領域と、該構造遺伝子の下流側に位置する
該RuBisCO遺伝子の転写終止領域を含有する担体
DNAを使用することを特徴とするラン藻細胞での生理
活性を有するポリペプチドの発現方法が提供される。
【0010】以下、本発明の発現方法についてさらに細
胞に説明する。
胞に説明する。
【0011】[1] 担体DNAの造成生理活性を有
するポリペプチドをコードする構造遺伝子(以下、便宜
上「有用構造遺伝子」ということがある)と、アナキス
テイス・ニデユランスのリブロース−1,5−ジリン酸
カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCO)
の転写開始領域、SD様配列及び転写終止領域[K.
Shinozaki and M. Sugiura
,Mol. Gen. Genet. 200:27−
32(1985)、熊野正信・杉浦昌弘、遺伝38(1
2):26−31(1984)等参照]とが連結した担
体DNAを調整するための具体的な方法は後記実施例に
示すとおりであり、以下、その基本的操作について概説
する。
するポリペプチドをコードする構造遺伝子(以下、便宜
上「有用構造遺伝子」ということがある)と、アナキス
テイス・ニデユランスのリブロース−1,5−ジリン酸
カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCO)
の転写開始領域、SD様配列及び転写終止領域[K.
Shinozaki and M. Sugiura
,Mol. Gen. Genet. 200:27−
32(1985)、熊野正信・杉浦昌弘、遺伝38(1
2):26−31(1984)等参照]とが連結した担
体DNAを調整するための具体的な方法は後記実施例に
示すとおりであり、以下、その基本的操作について概説
する。
【0012】(1) RuBisCOの転写開始(プ
ロモーター)領域の調整 RuBisCOのプロモーターを含むDNA断片は、例
えばK. Shinozagiらの文献[Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 80:
4050−4054(1983)]に記載のプラスミド
pANE18(pBR322のEcoRIサイトにRu
BisCOプロモーター領域を含む約5.6MDaのE
coRI断片が挿入されているもの)を常法(T. M
aniatis et al., Molecular
cloning−A Laboratory Man
ual−Cold Spring Horbor La
boratory刊)に従つて、制限酵素EcoRI、
SacI及びPstIを用いて切り出すことにより調製
することができる。
ロモーター)領域の調整 RuBisCOのプロモーターを含むDNA断片は、例
えばK. Shinozagiらの文献[Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 80:
4050−4054(1983)]に記載のプラスミド
pANE18(pBR322のEcoRIサイトにRu
BisCOプロモーター領域を含む約5.6MDaのE
coRI断片が挿入されているもの)を常法(T. M
aniatis et al., Molecular
cloning−A Laboratory Man
ual−Cold Spring Horbor La
boratory刊)に従つて、制限酵素EcoRI、
SacI及びPstIを用いて切り出すことにより調製
することができる。
【0013】(2) RuBisCOの転写終止(タ
ーミネーター)領域の調製 RuBisCOのターミネーター領域は、例えばK.
Shinozakiらの文献[Proc.Natl.
Acad. Sci. USA 80:4050−40
54(1983)]に記載のプラスミドpANP115
5(pBR322のPstIサイトにRuBisCOタ
ーミネーター領域を含む約1.5MDaのPstI断片
が挿入されているもの)を制限酵素PstI及びEco
52Iを用いて切り出すことにより調製することができ
る。
ーミネーター)領域の調製 RuBisCOのターミネーター領域は、例えばK.
Shinozakiらの文献[Proc.Natl.
Acad. Sci. USA 80:4050−40
54(1983)]に記載のプラスミドpANP115
5(pBR322のPstIサイトにRuBisCOタ
ーミネーター領域を含む約1.5MDaのPstI断片
が挿入されているもの)を制限酵素PstI及びEco
52Iを用いて切り出すことにより調製することができ
る。
【0014】(3) SD様配列の調製本発明におい
て用いる組換えDNAには、リボソーム認識配列として
、有用構造遺伝子の上流側で且つプロモーター領域の下
流側にSD様配列が導入される。SD様配列としては、
宿主のラン藻のリボソーマルRNAと相補的なものを使
用するのが好ましく、ラン藻としてアナキステイス・ニ
ジユランス6301株を用いる場合のSD様配列として
はGGAGなる塩基配列のものが使用できるが、これに
限られるものではなく、SD様配列として知られている
他の塩基配列のものも同様に使用することができる。そ
のようなSD様配列は塩基数が少ないので、通常、合成
によつてつくることが多い。
て用いる組換えDNAには、リボソーム認識配列として
、有用構造遺伝子の上流側で且つプロモーター領域の下
流側にSD様配列が導入される。SD様配列としては、
宿主のラン藻のリボソーマルRNAと相補的なものを使
用するのが好ましく、ラン藻としてアナキステイス・ニ
ジユランス6301株を用いる場合のSD様配列として
はGGAGなる塩基配列のものが使用できるが、これに
限られるものではなく、SD様配列として知られている
他の塩基配列のものも同様に使用することができる。そ
のようなSD様配列は塩基数が少ないので、通常、合成
によつてつくることが多い。
【0015】また、SD様配列は通常ATG(翻訳開始
点)の前に位置し、SD様配列からATGまでの長さ(
塩基数)は有用構造遺伝子の発現に影響を与える可能性
があるので、宿主の種類、構造遺伝子の塩基配列等に応
じて発現量が最適となるように調節することが望ましい
。その長さは宿主ラン藻の種類、構造遺伝子の塩基配列
等により異なるが、一般には3〜10ベース程度であり
、最適の長さは宿主構造遺伝子の塩基配列等に応じて実
験的に決めることができる。
点)の前に位置し、SD様配列からATGまでの長さ(
塩基数)は有用構造遺伝子の発現に影響を与える可能性
があるので、宿主の種類、構造遺伝子の塩基配列等に応
じて発現量が最適となるように調節することが望ましい
。その長さは宿主ラン藻の種類、構造遺伝子の塩基配列
等により異なるが、一般には3〜10ベース程度であり
、最適の長さは宿主構造遺伝子の塩基配列等に応じて実
験的に決めることができる。
【0016】SD様配列を含むDNA断片の調製は通常
ATG(翻訳開始点)の前まで又はATGも含めて行な
うことができ、そのDNA断片の合成はそれ自体既知の
遺伝子操作技術[日本生化学会編「続生化学実験講座1
遺伝子研究法II」東京化学同人刊(1987年)]に
よつて容易に行なうことができる。
ATG(翻訳開始点)の前まで又はATGも含めて行な
うことができ、そのDNA断片の合成はそれ自体既知の
遺伝子操作技術[日本生化学会編「続生化学実験講座1
遺伝子研究法II」東京化学同人刊(1987年)]に
よつて容易に行なうことができる。
【0017】(4) 有用構造遺伝子の調製本発明の
方法により発現しうる生理活性を有するポリペプチド(
以下、便宜上「有用ペプチド」ということがある)は、
特定のものに限定されるものではなく、本発明の方法に
よれば、各種の有用ペプチドを効率よく発現させること
ができる。
方法により発現しうる生理活性を有するポリペプチド(
以下、便宜上「有用ペプチド」ということがある)は、
特定のものに限定されるものではなく、本発明の方法に
よれば、各種の有用ペプチドを効率よく発現させること
ができる。
【0018】しかして、本発明の方法により発現させう
る有用ペプチドとしては、例えばヒト−SOD、インタ
ーロイキン(ヒト、マウスなど)、ヒトインターフエロ
ン−α,−β又は−γ、ヒト−インスリン、ヒト−腫瘍
壊死因子(TNF)、ヒト・コロニー刺激因子(CSF
)、ヒト−組織プラスミノーゲンアクテイベーター(t
PA)、ヒト−プロウロキナーセ、ウロキナーゼ、ヒト
−血液凝固因子(I〜V、VII〜XIII)、ヒト−
エリスロポエチン、ヒト−神経成長因子、ヒト−心房性
ナトリウム利尿ペプチド(α−hANP)、ヒト−膵分
泌性トリプシンインヒビター、成長ホルモン(ヒト、ウ
シ、ブタ、ニワトリ、魚類など)、成長ホルモン放出因
子、抗体(免疫グロブリン)、殺虫タンパク質(BT蛋
白質など)、種子貯蔵タンパク質(フアゼオリン、ゼイ
ン、グルテニン、グリシニン、ホルデインなど)など並
びにこれら有用ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドが挙げられる。
る有用ペプチドとしては、例えばヒト−SOD、インタ
ーロイキン(ヒト、マウスなど)、ヒトインターフエロ
ン−α,−β又は−γ、ヒト−インスリン、ヒト−腫瘍
壊死因子(TNF)、ヒト・コロニー刺激因子(CSF
)、ヒト−組織プラスミノーゲンアクテイベーター(t
PA)、ヒト−プロウロキナーセ、ウロキナーゼ、ヒト
−血液凝固因子(I〜V、VII〜XIII)、ヒト−
エリスロポエチン、ヒト−神経成長因子、ヒト−心房性
ナトリウム利尿ペプチド(α−hANP)、ヒト−膵分
泌性トリプシンインヒビター、成長ホルモン(ヒト、ウ
シ、ブタ、ニワトリ、魚類など)、成長ホルモン放出因
子、抗体(免疫グロブリン)、殺虫タンパク質(BT蛋
白質など)、種子貯蔵タンパク質(フアゼオリン、ゼイ
ン、グルテニン、グリシニン、ホルデインなど)など並
びにこれら有用ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドが挙げられる。
【0019】ここで有用ペプチドと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドとは、有用ペプチドそれ
自体並びにその有用ペプチドが本来もつ活性を実質的に
失なうことがない範囲内で該有用ペプチドのアミノ酸配
列の一部が他のアミノ酸と置き換つた有用ペプチドに類
縁するポリペプチドをも包含する意味で使用するもので
ある。
ノ酸配列を有するポリペプチドとは、有用ペプチドそれ
自体並びにその有用ペプチドが本来もつ活性を実質的に
失なうことがない範囲内で該有用ペプチドのアミノ酸配
列の一部が他のアミノ酸と置き換つた有用ペプチドに類
縁するポリペプチドをも包含する意味で使用するもので
ある。
【0020】従つて、後記実施例で使用されているヒト
−SODを例にとつて言えば、「ヒト−SODと実質的
に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」には、J
abuschら[Biochemistry, 19:
2310−2316(1980)]及びBarraら[
FEBS Letters120;53−55(198
0)]が報告したアミノ酸配列を有するhSODポリペ
プチドの他に、hSODとしての酵素活性を実質的に失
なうことがない範囲内でアミノ酸配列の一部(一般には
5個以下、好ましくは2個以下)が他のアミノ酸と置き
換つたhSODに類縁するポリペプチドをも包含され、
具体的には、 (a) hSOD (b) hSODの6番目のシステイン残基(Cys
)がアラニン残基(Ala)に置き換つたもの(特願昭
63−311013号明細書参照)、 (c) hSODの111番目のシステイン残基(C
ys)がセリン残基(Ser)に置き換つたもの(特公
昭62−130684号明細書参照)、 (d) hSODの6番目のシステイン残基(Cys
)がアラニン残基(Ala)に、そして111番目のシ
ステイン残基(Cys)がセリン残基にそれぞれ置き換
つたもの(特公昭63−273473明細書参照)等が
挙げられる。
−SODを例にとつて言えば、「ヒト−SODと実質的
に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」には、J
abuschら[Biochemistry, 19:
2310−2316(1980)]及びBarraら[
FEBS Letters120;53−55(198
0)]が報告したアミノ酸配列を有するhSODポリペ
プチドの他に、hSODとしての酵素活性を実質的に失
なうことがない範囲内でアミノ酸配列の一部(一般には
5個以下、好ましくは2個以下)が他のアミノ酸と置き
換つたhSODに類縁するポリペプチドをも包含され、
具体的には、 (a) hSOD (b) hSODの6番目のシステイン残基(Cys
)がアラニン残基(Ala)に置き換つたもの(特願昭
63−311013号明細書参照)、 (c) hSODの111番目のシステイン残基(C
ys)がセリン残基(Ser)に置き換つたもの(特公
昭62−130684号明細書参照)、 (d) hSODの6番目のシステイン残基(Cys
)がアラニン残基(Ala)に、そして111番目のシ
ステイン残基(Cys)がセリン残基にそれぞれ置き換
つたもの(特公昭63−273473明細書参照)等が
挙げられる。
【0021】上記の如き有用ペプチドをコードする有用
構造遺伝子の調製は、それ自体既知の遺伝子操作技術[
例えば、日本生化学会編 「続生化学講座1遺伝子研究
法II」 東京化学同人刊(1987年);村松正実
編 「医学における遺伝子工学」東京化学同人刊(1
987年)等の実験書参照]によつて、有用ペプチドを
産生する能力をもつ動物、植物、微生物等の供給源細胞
から抽出クローニングしたり或いは化学的に合成するこ
とにより行なうことができる。
構造遺伝子の調製は、それ自体既知の遺伝子操作技術[
例えば、日本生化学会編 「続生化学講座1遺伝子研究
法II」 東京化学同人刊(1987年);村松正実
編 「医学における遺伝子工学」東京化学同人刊(1
987年)等の実験書参照]によつて、有用ペプチドを
産生する能力をもつ動物、植物、微生物等の供給源細胞
から抽出クローニングしたり或いは化学的に合成するこ
とにより行なうことができる。
【0022】(5) 有用構造遺伝子を含有する発現
可能なオペロンの造成 上記のようにして調製されるRuBisCOプロモータ
ー領域、SD様配列を含むDNA断片及びRuBisC
Oターミネーター領域は、生理活性を有するポリペプチ
ドをコードする有用構造遺伝子と共に、(プロモーター
領域)−(SD様配列を含むDNA断片)−(翻訳開始
コドン、ATG)−(有用構造遺伝子)−(翻訳終止コ
ドン)−ターミネーター領域)の順で、それ自体既知の
方法により連結され、ラン藻細胞中で発現可能なオペロ
ンが造成される。
可能なオペロンの造成 上記のようにして調製されるRuBisCOプロモータ
ー領域、SD様配列を含むDNA断片及びRuBisC
Oターミネーター領域は、生理活性を有するポリペプチ
ドをコードする有用構造遺伝子と共に、(プロモーター
領域)−(SD様配列を含むDNA断片)−(翻訳開始
コドン、ATG)−(有用構造遺伝子)−(翻訳終止コ
ドン)−ターミネーター領域)の順で、それ自体既知の
方法により連結され、ラン藻細胞中で発現可能なオペロ
ンが造成される。
【0023】プロモーター及びSD様配列はそれぞれ単
一である必要はなく、2つ又はそれ以上のプロモーター
を縦列させて用いたり及び/又は2つ又はそれ以上のS
D様配列を縦列させて用いることも可能である。
一である必要はなく、2つ又はそれ以上のプロモーター
を縦列させて用いたり及び/又は2つ又はそれ以上のS
D様配列を縦列させて用いることも可能である。
【0024】上記の有用構造遺伝子を含有するオペロン
は、宿主及び/又はオペロンの種類等によつては実質的
にそのままの状態で宿主を形質転換することも可能であ
るが、通常は宿主に適したベクター(プラスミド)に導
入して形質転換に用いられる。
は、宿主及び/又はオペロンの種類等によつては実質的
にそのままの状態で宿主を形質転換することも可能であ
るが、通常は宿主に適したベクター(プラスミド)に導
入して形質転換に用いられる。
【0025】(6) ベクター
前記の発現可能なオペロンを導入しうるベクターとして
は、ラン藻細胞中で用いられる広範囲の種類のベクター
を使用することができ、例えば、pUC104、pUC
105[C.J.Kuhlemeier et al.
, Mol. Gen. Genet. 184:24
9−254(1981)];pLS103[L. A.
Sherman and P. van de Pu
tte,J. Bacteriol, 150:410
−413(1982)];pDPL13[S. Gen
del et al., J. Bacteriol,
156:148−154(1983)];pUC30
3[C. J. Kuhlemeier et al.
, Plasmid 10:156−163(1983
)];pSG111[S. S. Golden an
d L. A. Sherman, J. Bacte
riol, 155:966−972(1983)];
pPUC29[C. J. Kuhlemeier e
t al., Gene 31:109−116(19
84)];pPLAN Ba1[D. E. Lan
denbach et al., Mol. Gen
Genet, 199:300−305(1985)]
;pBAS18[K. Shinozaki et a
l., Gene19:221−224(1982)]
などが挙げられる。
は、ラン藻細胞中で用いられる広範囲の種類のベクター
を使用することができ、例えば、pUC104、pUC
105[C.J.Kuhlemeier et al.
, Mol. Gen. Genet. 184:24
9−254(1981)];pLS103[L. A.
Sherman and P. van de Pu
tte,J. Bacteriol, 150:410
−413(1982)];pDPL13[S. Gen
del et al., J. Bacteriol,
156:148−154(1983)];pUC30
3[C. J. Kuhlemeier et al.
, Plasmid 10:156−163(1983
)];pSG111[S. S. Golden an
d L. A. Sherman, J. Bacte
riol, 155:966−972(1983)];
pPUC29[C. J. Kuhlemeier e
t al., Gene 31:109−116(19
84)];pPLAN Ba1[D. E. Lan
denbach et al., Mol. Gen
Genet, 199:300−305(1985)]
;pBAS18[K. Shinozaki et a
l., Gene19:221−224(1982)]
などが挙げられる。
【0026】また、そのようなベクターは、プラスミド
及びウイルスから必要に応じて誘導することができ、例
えばアナキステイス・ニデユランス由来のプラスミドp
BA1のOriA領域と、プラスミドpUCのマルチク
ローニング領域と、大腸菌ColE1系プラスミドのO
riE領域とから本発明者らによつて造成された大腸菌
及びラン藻細胞内で複製可能なシヤトルベクターpBA
X18、pBAX19、pBAX20なども有利に使用
することができる(後記実施例及び(平成3年3月8日
付で出願された同一出願人による発明の名称が「新規プ
ラスミド」の特許出願参照)。
及びウイルスから必要に応じて誘導することができ、例
えばアナキステイス・ニデユランス由来のプラスミドp
BA1のOriA領域と、プラスミドpUCのマルチク
ローニング領域と、大腸菌ColE1系プラスミドのO
riE領域とから本発明者らによつて造成された大腸菌
及びラン藻細胞内で複製可能なシヤトルベクターpBA
X18、pBAX19、pBAX20なども有利に使用
することができる(後記実施例及び(平成3年3月8日
付で出願された同一出願人による発明の名称が「新規プ
ラスミド」の特許出願参照)。
【0027】(7) 担体DNAの構築上記(5)で
述べた有用構造遺伝子を含有する発現可能なオペロンは
、それ自体既知の遺伝子操作技術によつて、上記(6)
で述べた如きベクター(プラスミド)に導入することが
できる。
述べた有用構造遺伝子を含有する発現可能なオペロンは
、それ自体既知の遺伝子操作技術によつて、上記(6)
で述べた如きベクター(プラスミド)に導入することが
できる。
【0028】例えばhSODをコードする有用構造遺伝
子を用いて前記(5)に述べた如くして調製されるhS
ODオペロンは、例えばアナキステイス・ニデユランス
細胞中で複製可能なpBAS18又はpBAX18の例
えばEcoRI認識部位を制限酵素EcoRIを用いて
開裂させ、おのおののDNA断片を一緒にし、T4DN
Aリガーゼを作用させることにより挿入され、hSOD
発現用ベクターが得られる。ベクター中に挿入されるオ
ペロンは1つである必要はなく、同一方向であれば、2
、3、4個又はそれ以上縦列させることも可能である。
子を用いて前記(5)に述べた如くして調製されるhS
ODオペロンは、例えばアナキステイス・ニデユランス
細胞中で複製可能なpBAS18又はpBAX18の例
えばEcoRI認識部位を制限酵素EcoRIを用いて
開裂させ、おのおののDNA断片を一緒にし、T4DN
Aリガーゼを作用させることにより挿入され、hSOD
発現用ベクターが得られる。ベクター中に挿入されるオ
ペロンは1つである必要はなく、同一方向であれば、2
、3、4個又はそれ以上縦列させることも可能である。
【0029】このようにして得られるhSOD発現用ベ
クターは大腸菌で常法(T. Maniatiset
al., Molecular Cloning−A
Laboratory Manual−Cold Sp
ring Horbor Laboratory 刊)
従つてクローリングすることができる。
クターは大腸菌で常法(T. Maniatiset
al., Molecular Cloning−A
Laboratory Manual−Cold Sp
ring Horbor Laboratory 刊)
従つてクローリングすることができる。
【0030】[2] 形質転換
前述の如くして造成される担体DNAを用いて形質転換
することのできるラン藻細胞としては、例えば、次にも
のを例示することができる。
することのできるラン藻細胞としては、例えば、次にも
のを例示することができる。
【0031】アナキステイス・ニデユランス6301株
(Synechococcus PCC 6301)、
アナキステイス・ニデユランスR2株(Synecho
coccus PCC 7942)、 Synechococcus PCC 7002、Sy
nechococcus PCC 7418(Ap
hanothece halophitica)、 Synechocystis PCC 6803、Sy
nechocystis PCC 6714、Sp
irulina platensis、Anabaen
a PCC 7120(Nostoc PCC 712
0)、Nostoc PCC 7119(Anabae
na PCC 7119)、Calothrix PC
C 7601など。
(Synechococcus PCC 6301)、
アナキステイス・ニデユランスR2株(Synecho
coccus PCC 7942)、 Synechococcus PCC 7002、Sy
nechococcus PCC 7418(Ap
hanothece halophitica)、 Synechocystis PCC 6803、Sy
nechocystis PCC 6714、Sp
irulina platensis、Anabaen
a PCC 7120(Nostoc PCC 712
0)、Nostoc PCC 7119(Anabae
na PCC 7119)、Calothrix PC
C 7601など。
【0032】前記の担体DNAによるこれら宿主ラン藻
細胞の形質転換はそれ場対既知の方法、例えば、R.
D. Porter[CRC Critical Re
views in Microbiology 13(
2):111−132]、D. A.lightfoo
tら[J. General, Microbiolo
gy 134:1509−1514(1988)]、S
. S. Goldenら[J. Bacteriol
, 158:36−42(1984)]、H. Dan
iellら[Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 83:2546−2550(1986
)]、T. Matsunagaら[Appl. Bi
ochem. Biotechnol. 24/25:
151−160(1990)]などに従つて行なうこと
ができる。
細胞の形質転換はそれ場対既知の方法、例えば、R.
D. Porter[CRC Critical Re
views in Microbiology 13(
2):111−132]、D. A.lightfoo
tら[J. General, Microbiolo
gy 134:1509−1514(1988)]、S
. S. Goldenら[J. Bacteriol
, 158:36−42(1984)]、H. Dan
iellら[Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 83:2546−2550(1986
)]、T. Matsunagaら[Appl. Bi
ochem. Biotechnol. 24/25:
151−160(1990)]などに従つて行なうこと
ができる。
【0033】例えば、hSOD発現ベクターをアナキス
テイス・ニデユランスへD.A.Lightfootら
の方法で導入し形質転換することができる。得られる形
質転換体はアンピシリン耐性などにより選抜した後、イ
ムノブロツテイング法、オクテロニー法、ポリアクリル
アミドゲル中でのSOD活性染色、SOD活性の測定な
どにより、所期の形質転換体が得られていることを確認
することができる。
テイス・ニデユランスへD.A.Lightfootら
の方法で導入し形質転換することができる。得られる形
質転換体はアンピシリン耐性などにより選抜した後、イ
ムノブロツテイング法、オクテロニー法、ポリアクリル
アミドゲル中でのSOD活性染色、SOD活性の測定な
どにより、所期の形質転換体が得られていることを確認
することができる。
【0034】このようにして得られる形質転換は、光の
照射下で宿下細胞の増殖に応じたそれ自体既知の培地で
培養することにより生理活性を有するポリペプチドの発
現を行わせることができる。培地は形質転換体が選択的
に増殖するための適当量の薬剤、例えばアンピシリンな
どを含むことが好ましい。
照射下で宿下細胞の増殖に応じたそれ自体既知の培地で
培養することにより生理活性を有するポリペプチドの発
現を行わせることができる。培地は形質転換体が選択的
に増殖するための適当量の薬剤、例えばアンピシリンな
どを含むことが好ましい。
【0035】形質転換体宿主がアナキステイス・ニデユ
ランスの場合、培地としてはBG−11培地、MDM培
地などが適しており、また、培養条件として、培養温度
は一般に10〜35℃、好ましくは25〜30℃が適し
ている。さらに培地のpHは通常7〜8の範囲内及び照
度は500〜5000ルクスの範囲内が適している。こ
のような条件下に培養は5〜20日程度行なうことがで
きる。また、培養は静置又は撹拌下で行なうことができ
る。
ランスの場合、培地としてはBG−11培地、MDM培
地などが適しており、また、培養条件として、培養温度
は一般に10〜35℃、好ましくは25〜30℃が適し
ている。さらに培地のpHは通常7〜8の範囲内及び照
度は500〜5000ルクスの範囲内が適している。こ
のような条件下に培養は5〜20日程度行なうことがで
きる。また、培養は静置又は撹拌下で行なうことができ
る。
【0036】以上に述べた本発明の方法によれば、有用
ペプチドの発現効率が極めて高く、ラン藻細胞中に産生
される有用ペプチドの分離回収は、培養物からそれ自体
既知の方法で行なうことができる。例えば、培養液から
遠心分離で細胞を集め、破砕したのち、通常知られてい
る方法、例えば塩析、透析、イオン交換クロマトグラフ
イー、ゲルろ過クロマトグラフイー、クロマトフオーカ
ツシング、ハイドロフオービツクインターラクシヨンク
ロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグラフイー
、電気泳動などの操作を適宜組合せることにより分離・
回収することができる。
ペプチドの発現効率が極めて高く、ラン藻細胞中に産生
される有用ペプチドの分離回収は、培養物からそれ自体
既知の方法で行なうことができる。例えば、培養液から
遠心分離で細胞を集め、破砕したのち、通常知られてい
る方法、例えば塩析、透析、イオン交換クロマトグラフ
イー、ゲルろ過クロマトグラフイー、クロマトフオーカ
ツシング、ハイドロフオービツクインターラクシヨンク
ロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグラフイー
、電気泳動などの操作を適宜組合せることにより分離・
回収することができる。
【0037】このようにして製造される生理活性を有す
るポリペプチドは、医薬品、医薬部外品、化粧料等に利
用することができる。
るポリペプチドは、医薬品、医薬部外品、化粧料等に利
用することができる。
【0038】また、光照射下で培養された形質転換ラン
藻は、培養後、遠心分離などで集められ、そのまま食料
・飼料・機能性食品として利用することもできる。
藻は、培養後、遠心分離などで集められ、そのまま食料
・飼料・機能性食品として利用することもできる。
【0039】なお、本発明における組換えDNAに用い
られるRuBisCOプロモーターは、その下流に位置
する有用構造遺伝子の発現を光の制御下で大量に誘導す
ることができ、大腸菌のlac, tac, trp
プロモーターなどを用いて発現を誘導させる場合に通常
用いられる高価な薬剤を使用しなくてもよいなどの利点
がある。
られるRuBisCOプロモーターは、その下流に位置
する有用構造遺伝子の発現を光の制御下で大量に誘導す
ることができ、大腸菌のlac, tac, trp
プロモーターなどを用いて発現を誘導させる場合に通常
用いられる高価な薬剤を使用しなくてもよいなどの利点
がある。
【0040】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【0041】
【実施例1】I.発現調節領域の調製
(I−1) pANE18のクローニングpBR32
2のEcoRIサイトにAnacystis nidu
lans 6301株のリブロース−1,5−ジリン酸
カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ遺伝子のプロモータ
ー領域を含む5600bpの断片が挿入されたpANE
18(K. Shinozakiら、 Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 80:40
50−4054(1983))40ng(1μl)を5
0mM CaCl2処理したEscherichia
coli HB101株の細胞懸濁液100μlに加
え、おだえかに混合した。混合液を氷水中で30分間イ
ンキユベートした後、さらに42℃で3分間インキユベ
ートしてDNAを細胞中にとりこませた。この懸濁液に
1mlのLB medium(10g/lバクトトリプ
トン、5g/l酵母抽出エキス、10g/l NaC
l)を加え、振盪しながら37℃で1時間インキユベー
トした。この細胞懸濁液を100μlおよび200μl
とりLB寒天培地(50μg/mlアンピシリン、1.
5%寒天を含む)上にプレートした。このプレートを3
7℃で24時間インキユベートし、コロニーを単離した
。単離したコロニーを2mlの2YT液体培地(16g
/lバクトトリプトン、10g/l酵母抽出エキス、5
g/l NaClおよび50μg/mlアンピシリン
を含む)に白金耳で植え付け37℃で一晩培養した。培
養液を1mlとり200mlの2YT液体培地(100
μg/mlアンピシリンを含む)に加え、37℃で一晩
培養した。培養した細胞を8000rpm、10分間遠
心して集め、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法(
B. Perbal, A Practical Gu
ide to Molecular Cloning,
p273〜276、John Wileyand S
ons Inc. 刊)により大量に調製した。
2のEcoRIサイトにAnacystis nidu
lans 6301株のリブロース−1,5−ジリン酸
カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ遺伝子のプロモータ
ー領域を含む5600bpの断片が挿入されたpANE
18(K. Shinozakiら、 Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 80:40
50−4054(1983))40ng(1μl)を5
0mM CaCl2処理したEscherichia
coli HB101株の細胞懸濁液100μlに加
え、おだえかに混合した。混合液を氷水中で30分間イ
ンキユベートした後、さらに42℃で3分間インキユベ
ートしてDNAを細胞中にとりこませた。この懸濁液に
1mlのLB medium(10g/lバクトトリプ
トン、5g/l酵母抽出エキス、10g/l NaC
l)を加え、振盪しながら37℃で1時間インキユベー
トした。この細胞懸濁液を100μlおよび200μl
とりLB寒天培地(50μg/mlアンピシリン、1.
5%寒天を含む)上にプレートした。このプレートを3
7℃で24時間インキユベートし、コロニーを単離した
。単離したコロニーを2mlの2YT液体培地(16g
/lバクトトリプトン、10g/l酵母抽出エキス、5
g/l NaClおよび50μg/mlアンピシリン
を含む)に白金耳で植え付け37℃で一晩培養した。培
養液を1mlとり200mlの2YT液体培地(100
μg/mlアンピシリンを含む)に加え、37℃で一晩
培養した。培養した細胞を8000rpm、10分間遠
心して集め、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法(
B. Perbal, A Practical Gu
ide to Molecular Cloning,
p273〜276、John Wileyand S
ons Inc. 刊)により大量に調製した。
【0042】(I−2) SacI−SphI断片の
単離(図1参照) 大量調製したpANE18DNA10μl(10μg)
と10×Low buffer(100mM Tris
−HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、
10mMジチオスレイトール(DTT))10μl及び
SacI(宝酒造(株)製)50unitsに滅菌水を
加えて100μlとしたエツペンドルフチユーブ(1.
5ml容)を37℃で3時間反応させた。反応後、10
×High buffer(500mM Tris−
HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、1
0mM DTT、100mM NaCl)15μl
、SphI(宝酒造(株)製)50units及び滅菌
水30μlを加えてさらに37℃で3時間反応させた。 反応後、1/10容の3M酢酸ナトリウム(pH4.8
)及び2.5容のエタノールを加え、−20℃で2時間
以上放置した。生じた沈殿を15000rpm、4℃で
10分間遠心し、70%エタノールで洗浄後、減圧乾固
させた。残渣を50μlのTE(10mM Tris
−HCl(pH8.0)、1mM EDTA)に溶解
し、1/10容の電気泳動用マーカー(0.25%ブロ
モフエノールブルー、0.25%キシレンシアノール、
30%グリセロール)を加え、1.5%アガロースゲル
にのせTAEbuffer(40mM Tris−a
cetate、2mM EDTA)で50V、1.5
時間電気泳動を行った。泳動後、ゲルを0.5μg/m
lのエチジウムブロマイド溶液(TAE中)に15分間
浸漬し、DNAの染色を行った。染色したゲルをトラン
スイルミネーター上にのせ、紫外線をあて目的とするD
NAを含むバンドを切り出した。目的のDNA断片(約
1200bp)を、DNA精製用キツトGenecie
an(BIO101社製)を用いて精製した。
単離(図1参照) 大量調製したpANE18DNA10μl(10μg)
と10×Low buffer(100mM Tris
−HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、
10mMジチオスレイトール(DTT))10μl及び
SacI(宝酒造(株)製)50unitsに滅菌水を
加えて100μlとしたエツペンドルフチユーブ(1.
5ml容)を37℃で3時間反応させた。反応後、10
×High buffer(500mM Tris−
HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、1
0mM DTT、100mM NaCl)15μl
、SphI(宝酒造(株)製)50units及び滅菌
水30μlを加えてさらに37℃で3時間反応させた。 反応後、1/10容の3M酢酸ナトリウム(pH4.8
)及び2.5容のエタノールを加え、−20℃で2時間
以上放置した。生じた沈殿を15000rpm、4℃で
10分間遠心し、70%エタノールで洗浄後、減圧乾固
させた。残渣を50μlのTE(10mM Tris
−HCl(pH8.0)、1mM EDTA)に溶解
し、1/10容の電気泳動用マーカー(0.25%ブロ
モフエノールブルー、0.25%キシレンシアノール、
30%グリセロール)を加え、1.5%アガロースゲル
にのせTAEbuffer(40mM Tris−a
cetate、2mM EDTA)で50V、1.5
時間電気泳動を行った。泳動後、ゲルを0.5μg/m
lのエチジウムブロマイド溶液(TAE中)に15分間
浸漬し、DNAの染色を行った。染色したゲルをトラン
スイルミネーター上にのせ、紫外線をあて目的とするD
NAを含むバンドを切り出した。目的のDNA断片(約
1200bp)を、DNA精製用キツトGenecie
an(BIO101社製)を用いて精製した。
【0043】(I−3) SacI−SphI断片の
pUC18でのクローニング(図1参照) (1) pUC18のSacI−SphI消化pUC
18DNA10μl(10μg)と10×Low bu
ffer 5μl及びSacI 50unitsに滅菌
水を加えて50μlとしたエツペンドルフチユーブ(1
.5ml容)を37℃で3時間反応させた。反応後、1
0×High buffer7.5μl、SphI 5
0units及び滅菌水37.5μlを加えてさらに3
7℃で3時間反応させた。この反応液に等容のフエノー
ル:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24
:1)を加え激しく撹拌したのち15000rpm、4
℃、で4時間遠心して水層を分取した。この水層に1/
10容の3M酢酸ナトリウム(pH4.8)および2.
5容のエタノールを加え、DNAをエタノール沈殿させ
た。沈殿を15000rpm、4℃、10分間遠心して
集め、70%エタノールで洗浄し、減圧乾固させた。残
渣を20μlのTEに溶解し、次の実験に使用した。
pUC18でのクローニング(図1参照) (1) pUC18のSacI−SphI消化pUC
18DNA10μl(10μg)と10×Low bu
ffer 5μl及びSacI 50unitsに滅菌
水を加えて50μlとしたエツペンドルフチユーブ(1
.5ml容)を37℃で3時間反応させた。反応後、1
0×High buffer7.5μl、SphI 5
0units及び滅菌水37.5μlを加えてさらに3
7℃で3時間反応させた。この反応液に等容のフエノー
ル:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24
:1)を加え激しく撹拌したのち15000rpm、4
℃、で4時間遠心して水層を分取した。この水層に1/
10容の3M酢酸ナトリウム(pH4.8)および2.
5容のエタノールを加え、DNAをエタノール沈殿させ
た。沈殿を15000rpm、4℃、10分間遠心して
集め、70%エタノールで洗浄し、減圧乾固させた。残
渣を20μlのTEに溶解し、次の実験に使用した。
【0044】(2) SacI−SphI断片(12
00bp)のpUC18(SacI−SphI)への挿
入SacI−SphI断片DNA0.1μg(2μl)
およびpUC18(SacI−SphI)0.5μg(
1μl)に24μlのTakara DNA lig
ation Kit A液(宝酒造(株)社製)を加え
、よく撹拌した。この溶液に3μlのTakara D
NA ligation Kit B液を加えよ
く撹拌した後、16℃で1時間インキユベートした。 反応後、この溶液をE. coli JM109株の形
質転換に使用した。
00bp)のpUC18(SacI−SphI)への挿
入SacI−SphI断片DNA0.1μg(2μl)
およびpUC18(SacI−SphI)0.5μg(
1μl)に24μlのTakara DNA lig
ation Kit A液(宝酒造(株)社製)を加え
、よく撹拌した。この溶液に3μlのTakara D
NA ligation Kit B液を加えよ
く撹拌した後、16℃で1時間インキユベートした。 反応後、この溶液をE. coli JM109株の形
質転換に使用した。
【0045】(3) pARup18の大量調製li
gation溶液5μl(100μg)に50mM
CaCl2で処理したE. coliJM109株の細
胞懸濁液100μlを加え、おだやかに混合した。混合
液を氷水中で30分間インキユベートした後、さらに4
2℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中にとり
こませた。この懸濁液に1mlの2YT液体培地を加え
、振盪しながら37℃で1時間インキユベートした。こ
の細胞懸濁液を100および200μlとり2YT寒天
培地(50μg/mlアンピシリン、40mg/l5−
ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−チオガ
ラクトシド(X−gal)、23.83mg/lイソプ
ロピル−β−D−チオガラクトピラノサイド(IPTG
)および1.5%寒天を含む)上にプレートした。この
プレートを37℃で24時間インキユベートし、得られ
た白いコロニーを新しい2YT寒天培地(50μg/m
lアンピシリン、X−gal、IPTG、1.5%寒天
を含む)にスポツトして37℃で一晩培養することによ
り白いコロニーを単離した。
gation溶液5μl(100μg)に50mM
CaCl2で処理したE. coliJM109株の細
胞懸濁液100μlを加え、おだやかに混合した。混合
液を氷水中で30分間インキユベートした後、さらに4
2℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中にとり
こませた。この懸濁液に1mlの2YT液体培地を加え
、振盪しながら37℃で1時間インキユベートした。こ
の細胞懸濁液を100および200μlとり2YT寒天
培地(50μg/mlアンピシリン、40mg/l5−
ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−チオガ
ラクトシド(X−gal)、23.83mg/lイソプ
ロピル−β−D−チオガラクトピラノサイド(IPTG
)および1.5%寒天を含む)上にプレートした。この
プレートを37℃で24時間インキユベートし、得られ
た白いコロニーを新しい2YT寒天培地(50μg/m
lアンピシリン、X−gal、IPTG、1.5%寒天
を含む)にスポツトして37℃で一晩培養することによ
り白いコロニーを単離した。
【0046】単離した白いコロニーを2mlの2YT液
体培地(50μg/mlアンピシリンを含む)に白金耳
で植え付け37℃で一晩培養した。培養液を1mlとり
1.5ml容エツペンドルフチユーブに移し、1500
0rpm、30秒間遠心して細胞を集めた。集めた細胞
を150μlのSET buffer(20%シヨ糖
、50mM Tris−HCl(pH7.6)、50
mM EDTA)に懸濁し、5μlのRNase溶液
(10mg/mlリボヌクレアーゼA、0.1M酢酸ナ
トリウム(pH4.8)、0.3mM EDTA)を
加えポルテツクスミキサーで十分混合した。これに35
0μlの溶菌液(1%SDS、0.2N NaOH)
を加え、チユーブを逆さにすることによりおだやかに撹
拌し、完全に溶菌させた。この溶菌液を氷水中で10分
間インキユベートした後、250μlの3M酢酸ナトリ
ウム(pH4.8)を加え、十分混合し、さらに氷水中
に30分間放置した。この混合液を15000rpm、
4℃で10分間遠心してSDSおよび染色体DNAを沈
殿させた。上清を別のエツペンドルフチユーブに移し、
等量のイソプロピルアルコールを加えよく混合し、15
000rpm、4℃で7分間遠心してプラスミドDNA
を沈殿として集めた。沈殿を滅菌水に溶解し、一部を制
限酵素EcoRI、HindIII(ともに宝酒造(株
)社製)消化し、1.5%アガロースゲル電気泳動を行
い1200bpのSacI−SphI断片がpUC18
に挿入されていることを確認した。
体培地(50μg/mlアンピシリンを含む)に白金耳
で植え付け37℃で一晩培養した。培養液を1mlとり
1.5ml容エツペンドルフチユーブに移し、1500
0rpm、30秒間遠心して細胞を集めた。集めた細胞
を150μlのSET buffer(20%シヨ糖
、50mM Tris−HCl(pH7.6)、50
mM EDTA)に懸濁し、5μlのRNase溶液
(10mg/mlリボヌクレアーゼA、0.1M酢酸ナ
トリウム(pH4.8)、0.3mM EDTA)を
加えポルテツクスミキサーで十分混合した。これに35
0μlの溶菌液(1%SDS、0.2N NaOH)
を加え、チユーブを逆さにすることによりおだやかに撹
拌し、完全に溶菌させた。この溶菌液を氷水中で10分
間インキユベートした後、250μlの3M酢酸ナトリ
ウム(pH4.8)を加え、十分混合し、さらに氷水中
に30分間放置した。この混合液を15000rpm、
4℃で10分間遠心してSDSおよび染色体DNAを沈
殿させた。上清を別のエツペンドルフチユーブに移し、
等量のイソプロピルアルコールを加えよく混合し、15
000rpm、4℃で7分間遠心してプラスミドDNA
を沈殿として集めた。沈殿を滅菌水に溶解し、一部を制
限酵素EcoRI、HindIII(ともに宝酒造(株
)社製)消化し、1.5%アガロースゲル電気泳動を行
い1200bpのSacI−SphI断片がpUC18
に挿入されていることを確認した。
【0047】SacI−SphI断片がpUC18に挿
入されていると確認されたコロニーを400mlの2Y
T液体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)に
移し、一晩培養した。培養した細胞を8000rpm、
4℃で10分間遠心して集め、プラスミドDNAをSD
S−アルカリ法により大量に調製した。
入されていると確認されたコロニーを400mlの2Y
T液体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)に
移し、一晩培養した。培養した細胞を8000rpm、
4℃で10分間遠心して集め、プラスミドDNAをSD
S−アルカリ法により大量に調製した。
【0048】(I−4) EcoRI−PstI断片
の単離(図1参照) (1) EcoRI−HindII断片の単離大量調
製したpARup18DNA溶液10μl(10μg)
と10×K buffer(200mM Tris
−HCl(pH8.5)、100mMMgCl2、10
mM DTT、1000mM KCl)20μl及
びHindIII40unitsに滅菌水を加えて20
0μlとしたエツペンドルフチユーブ(1.5ml容)
を20本用意し、37℃で3時間反応させた。反応後、
フエノール−クロロホルム処理し、DNAをエタノール
沈殿して集め155μlの滅菌水に溶解した。この溶解
に5×EcoRIbuffer(500mM Tri
s−HCl(pH7.5)、35mM MgCl2、
250mM NaCl、35mM 2−メルカプト
エタノール、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)
)40μlとEcoRI 40unitsを加え200
μlとしたエツペンドルフチユーブ(1.5ml容)2
0本を37℃で3時間反応させた。反応後、同様にフエ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿を行いDN
Aを回収した。目的のDNA断片(約1200bp)を
1.5%アガロースゲル電気泳動により分離し、DNA
−精製用キツトGenecleanを用いて精製した。 (2) EcoRI−PstI断片(約350bp)
の単離 精製したDNA断片40μg(86μl)に10×Hi
gh buffer 10μlとPstI(宝酒造(
株)社製)48unitsを加え、100μlとしたエ
ツペンドルフチユーブ(1.5ml容)を37℃で3時
間反応させた。反応後、1.5%アガロースゲル電気泳
動を行い目的のDNA断片(約350bp)を分離した
。DNAをゲルから電気的に溶出し、核酸精製用カート
リツジNensorb20(Dupond社製)を用い
て精製した。 (I−5) PstI−HindIII断片の合成(1
) オリゴヌクレオチドの合成および精製Shine
Dalgarno(S/D)配列を含む発現調節領域
の合成のために10個のオリゴヌクレオチド(図2参照
)をDNAシンセサイザー380A(アプライド・バイ
オシステムズ・ジヤパン社製)を用いてホスホアミダイ
ト法により合成を行った。合成が終了したシリカゲルカ
ラムに2mlのアンモニア水(27%以上)を0.5m
lずつ15分おきに加え、オリゴヌクレオチドをシリカ
支持体より切り出しバイアルに捕集した。このバイアル
にさらに1mlのアンモニア水を加え、キヤツプおよび
パラフイルム等によりシールして55℃で8時間以上加
温し、塩基部分の保護基(アシル基)をはずした。恒温
槽よりバイアルを取り出し室温に戻した後、キヤツプを
はずして減圧下で濃縮乾固した。乾固後、残渣を200
μlの0.01Mトリエチルアミン−酢酸溶液(TEA
A、pH7.5)に溶解し、AM−313−0DS(山
村化学研究所製)カラムを用いてHPLCでアセトニト
リル、0.1M TEAAの濃度勾配による溶出を行
いメインピークを分取した。分取したピークを減圧下で
濃縮乾固した後、80%酢酸(アセトニトリル溶液)1
00μlを加え、混合して室温に30分間放置すること
により、5’未満のジメチルトリチル(DMTr)基を
はずし、OH基に変換した。30分経過後、迅速に乾固
し、残渣を0.01M TEAA(pH7.5)20
0μlに溶解し、等容のジエチルエーテルを加え、DM
Tr基を抽出除去した。この溶液を減圧下で濃縮乾固し
た後、110μlの0.01M TEAA(pH7.
5)に溶解し、再びHPLCを用いて、分取、精製を行
った。分取したオリゴヌクレオチドを含む溶液を減圧下
で乾固した後、TEに溶解し、次の実験に使用した。
の単離(図1参照) (1) EcoRI−HindII断片の単離大量調
製したpARup18DNA溶液10μl(10μg)
と10×K buffer(200mM Tris
−HCl(pH8.5)、100mMMgCl2、10
mM DTT、1000mM KCl)20μl及
びHindIII40unitsに滅菌水を加えて20
0μlとしたエツペンドルフチユーブ(1.5ml容)
を20本用意し、37℃で3時間反応させた。反応後、
フエノール−クロロホルム処理し、DNAをエタノール
沈殿して集め155μlの滅菌水に溶解した。この溶解
に5×EcoRIbuffer(500mM Tri
s−HCl(pH7.5)、35mM MgCl2、
250mM NaCl、35mM 2−メルカプト
エタノール、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)
)40μlとEcoRI 40unitsを加え200
μlとしたエツペンドルフチユーブ(1.5ml容)2
0本を37℃で3時間反応させた。反応後、同様にフエ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿を行いDN
Aを回収した。目的のDNA断片(約1200bp)を
1.5%アガロースゲル電気泳動により分離し、DNA
−精製用キツトGenecleanを用いて精製した。 (2) EcoRI−PstI断片(約350bp)
の単離 精製したDNA断片40μg(86μl)に10×Hi
gh buffer 10μlとPstI(宝酒造(
株)社製)48unitsを加え、100μlとしたエ
ツペンドルフチユーブ(1.5ml容)を37℃で3時
間反応させた。反応後、1.5%アガロースゲル電気泳
動を行い目的のDNA断片(約350bp)を分離した
。DNAをゲルから電気的に溶出し、核酸精製用カート
リツジNensorb20(Dupond社製)を用い
て精製した。 (I−5) PstI−HindIII断片の合成(1
) オリゴヌクレオチドの合成および精製Shine
Dalgarno(S/D)配列を含む発現調節領域
の合成のために10個のオリゴヌクレオチド(図2参照
)をDNAシンセサイザー380A(アプライド・バイ
オシステムズ・ジヤパン社製)を用いてホスホアミダイ
ト法により合成を行った。合成が終了したシリカゲルカ
ラムに2mlのアンモニア水(27%以上)を0.5m
lずつ15分おきに加え、オリゴヌクレオチドをシリカ
支持体より切り出しバイアルに捕集した。このバイアル
にさらに1mlのアンモニア水を加え、キヤツプおよび
パラフイルム等によりシールして55℃で8時間以上加
温し、塩基部分の保護基(アシル基)をはずした。恒温
槽よりバイアルを取り出し室温に戻した後、キヤツプを
はずして減圧下で濃縮乾固した。乾固後、残渣を200
μlの0.01Mトリエチルアミン−酢酸溶液(TEA
A、pH7.5)に溶解し、AM−313−0DS(山
村化学研究所製)カラムを用いてHPLCでアセトニト
リル、0.1M TEAAの濃度勾配による溶出を行
いメインピークを分取した。分取したピークを減圧下で
濃縮乾固した後、80%酢酸(アセトニトリル溶液)1
00μlを加え、混合して室温に30分間放置すること
により、5’未満のジメチルトリチル(DMTr)基を
はずし、OH基に変換した。30分経過後、迅速に乾固
し、残渣を0.01M TEAA(pH7.5)20
0μlに溶解し、等容のジエチルエーテルを加え、DM
Tr基を抽出除去した。この溶液を減圧下で濃縮乾固し
た後、110μlの0.01M TEAA(pH7.
5)に溶解し、再びHPLCを用いて、分取、精製を行
った。分取したオリゴヌクレオチドを含む溶液を減圧下
で乾固した後、TEに溶解し、次の実験に使用した。
【0049】(2) 合成オリゴヌクレオチドのキナ
ーゼによるリン酸化 精製したオリゴヌクレオチド4μgをKinase b
uffer(50mM Tris−HCl(pH7.
6)、10mM MgCl2、0.1mM EDT
A、5mMDTT、0.1mMスペルミジン、1.7μ
M ATP)120μlに混合し、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼ(宝酒造(株)社製)9unitsを添加
し、37℃で15分間インキユベートした。次にATP
を終濃度1mMになるように加え、再度T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ9unitsを添加し、37℃で25分
間インキユベートした。反応後、90℃、5分間熱処理
した酵素を失活させた。リン酸化したオリゴヌクレオチ
ドを核酸精製用カートリツジNensorb20を用い
て精製した。
ーゼによるリン酸化 精製したオリゴヌクレオチド4μgをKinase b
uffer(50mM Tris−HCl(pH7.
6)、10mM MgCl2、0.1mM EDT
A、5mMDTT、0.1mMスペルミジン、1.7μ
M ATP)120μlに混合し、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼ(宝酒造(株)社製)9unitsを添加
し、37℃で15分間インキユベートした。次にATP
を終濃度1mMになるように加え、再度T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ9unitsを添加し、37℃で25分
間インキユベートした。反応後、90℃、5分間熱処理
した酵素を失活させた。リン酸化したオリゴヌクレオチ
ドを核酸精製用カートリツジNensorb20を用い
て精製した。
【0050】(3) PstI−HindIII断片
の作製 4つの塩基数をかえたPstI−HindIII断片を
T4DNAリガーゼによるオリゴヌクレオチドの直結に
よつて行った(図3参照)。PstI−HindIII
断片を構成するオリゴヌクレオチドのうち下段のストラ
ンドの5’未満に位置するオリゴヌクレオチド1.5μ
g、その他のオリゴヌクレオチド1μgに5×liga
tion buffer(250mM Tris−H
Cl(pH7.6)、10mM MgCl2)20μ
lと滅菌水を加えて80μlとした。この溶液を90℃
、5分間加熱した後、2時間かけて4℃まで徐冷し、1
00mM DTTと10mM ATPを10μlず
つ加え、さらにT4 DNAリガーゼ(宝酒造(株)
社製)2.5unitsを添加して4℃で15時間イン
キユベートした。反応液を等容のフエノール−クロロホ
ルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回収し次の
実験に用いた。
の作製 4つの塩基数をかえたPstI−HindIII断片を
T4DNAリガーゼによるオリゴヌクレオチドの直結に
よつて行った(図3参照)。PstI−HindIII
断片を構成するオリゴヌクレオチドのうち下段のストラ
ンドの5’未満に位置するオリゴヌクレオチド1.5μ
g、その他のオリゴヌクレオチド1μgに5×liga
tion buffer(250mM Tris−H
Cl(pH7.6)、10mM MgCl2)20μ
lと滅菌水を加えて80μlとした。この溶液を90℃
、5分間加熱した後、2時間かけて4℃まで徐冷し、1
00mM DTTと10mM ATPを10μlず
つ加え、さらにT4 DNAリガーゼ(宝酒造(株)
社製)2.5unitsを添加して4℃で15時間イン
キユベートした。反応液を等容のフエノール−クロロホ
ルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回収し次の
実験に用いた。
【0051】(I−6) EcoRI−HindII
I断片の作成(図4参照) (1) EcoRI−PstI断片(プロモーター領
域)とPstI−HindIII断片の直結前記(I−
4)で単離したEcoRI−PstI断片1.0μgに
塩基数の異なる4つのPstI−HindIII断片そ
れぞれ0.5μgを5μlの0.3M NaClに混
合し、さらにTakara ligation kit
B液 5μlを加えよく混合した。この溶液を26
℃で1時間以上インキユベートした。反応後、溶液をフ
エノール−クロロホルム処理し、常法どうりエタノール
沈殿してDNAを回収した。
I断片の作成(図4参照) (1) EcoRI−PstI断片(プロモーター領
域)とPstI−HindIII断片の直結前記(I−
4)で単離したEcoRI−PstI断片1.0μgに
塩基数の異なる4つのPstI−HindIII断片そ
れぞれ0.5μgを5μlの0.3M NaClに混
合し、さらにTakara ligation kit
B液 5μlを加えよく混合した。この溶液を26
℃で1時間以上インキユベートした。反応後、溶液をフ
エノール−クロロホルム処理し、常法どうりエタノール
沈殿してDNAを回収した。
【0052】(2) ligation反応物のHi
ndIII−EcoRI消化 回収したDNA残渣を14.5μlの滅菌水に溶解し、
5×HindIII buffer(50mM T
ris−HCl(pH7.5)、35mM MgCl
2、300mM NaCl)4μlおよびHindI
II 12units(1.5μl)を加え、37℃
で1.5時間反応させた。反応後、さらに5×EcoR
I buffer 4μl、EcoRI 12un
its(1.0μl)および滅菌水5μlを加え37℃
で1.5時間反応させた。反応液を等量のフエノール−
クロロホルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回
収した。
ndIII−EcoRI消化 回収したDNA残渣を14.5μlの滅菌水に溶解し、
5×HindIII buffer(50mM T
ris−HCl(pH7.5)、35mM MgCl
2、300mM NaCl)4μlおよびHindI
II 12units(1.5μl)を加え、37℃
で1.5時間反応させた。反応後、さらに5×EcoR
I buffer 4μl、EcoRI 12un
its(1.0μl)および滅菌水5μlを加え37℃
で1.5時間反応させた。反応液を等量のフエノール−
クロロホルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回
収した。
【0053】(I−7) 塩基数の異なる4つの発現
調節領域EcoRI−HindIII断片のpUC18
によるクローニング(図4参照) (1) pUC18のEcoRI−HindIII消
化pUC18 25μgと10×K buffer
(200mM Tris−HCl(pH8.5)、1
00mM MgCl2、10mM DTT、100
mM KCl)10μl及びHindIII 64
units(8μl)に滅菌水を加えて100μlとし
たエツペンドルフチユーブ(1.5ml容)を37℃で
3時間反応させた。この反応液を等容のフエノール−ク
ロロホルムで処理し、エタノール沈殿によりDNAを回
収した。DNA残渣を75μlの滅菌水に溶解し、5×
EcoRI buffer 20μl及びEcoR
I 60units(5μl)を加え、37℃で3時
間反応させた。反応後、同様にフエノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈殿を行った。回収したDNAはT
Eに0.25μg/μlになるように溶解し、次の実験
に用いた。
調節領域EcoRI−HindIII断片のpUC18
によるクローニング(図4参照) (1) pUC18のEcoRI−HindIII消
化pUC18 25μgと10×K buffer
(200mM Tris−HCl(pH8.5)、1
00mM MgCl2、10mM DTT、100
mM KCl)10μl及びHindIII 64
units(8μl)に滅菌水を加えて100μlとし
たエツペンドルフチユーブ(1.5ml容)を37℃で
3時間反応させた。この反応液を等容のフエノール−ク
ロロホルムで処理し、エタノール沈殿によりDNAを回
収した。DNA残渣を75μlの滅菌水に溶解し、5×
EcoRI buffer 20μl及びEcoR
I 60units(5μl)を加え、37℃で3時
間反応させた。反応後、同様にフエノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈殿を行った。回収したDNAはT
Eに0.25μg/μlになるように溶解し、次の実験
に用いた。
【0054】(2) 4つの発現調節領域EcoRI
−HindIII断片のpUC18(EcoRI−Hi
ndIII)への挿入 4つのEcoRI−HindIII断片をそれぞれ60
ng(1μl)とpUC18(EcoRI−HindI
II)500ng(2μl)ずつをそれぞれエツペンド
ルフチユーブに入れ、Takara ligation
kit A液24μlを加えよく混合した。これらの
混合液に、さらにTakara ligation k
it B液3μlを加え、混合した後、16℃で2時
間以上反応させた。この溶液を次の実験に用いた。
−HindIII断片のpUC18(EcoRI−Hi
ndIII)への挿入 4つのEcoRI−HindIII断片をそれぞれ60
ng(1μl)とpUC18(EcoRI−HindI
II)500ng(2μl)ずつをそれぞれエツペンド
ルフチユーブに入れ、Takara ligation
kit A液24μlを加えよく混合した。これらの
混合液に、さらにTakara ligation k
it B液3μlを加え、混合した後、16℃で2時
間以上反応させた。この溶液を次の実験に用いた。
【0055】(3) pARup1、2、3および4
の大量調製 ligation溶液3μl(56ng)に50mM
CaCl2で処理したE. coliJM109株の
細胞懸濁液100μlを加え、おだやかに混合した。混
合液を氷水中で30分間インキユベートした後、さらに
42℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中に取
りこませた。この懸濁液に1mlの2YT液体培地を加
え、37℃、1時間の振盪培養後、2YT寒天培地(5
0μg/mlアンピシリン、40mg/l X−gal
、23.83mg/l IPTGおよび1.5%寒天
を含む)にプレーテした。得られた白いコロニーからプ
ラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することによつ
て目的のプラスミドpARup1、2、3および4)を
保持しているコロニーをスクリーニングした。
の大量調製 ligation溶液3μl(56ng)に50mM
CaCl2で処理したE. coliJM109株の
細胞懸濁液100μlを加え、おだやかに混合した。混
合液を氷水中で30分間インキユベートした後、さらに
42℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中に取
りこませた。この懸濁液に1mlの2YT液体培地を加
え、37℃、1時間の振盪培養後、2YT寒天培地(5
0μg/mlアンピシリン、40mg/l X−gal
、23.83mg/l IPTGおよび1.5%寒天
を含む)にプレーテした。得られた白いコロニーからプ
ラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することによつ
て目的のプラスミドpARup1、2、3および4)を
保持しているコロニーをスクリーニングした。
【0056】プラスミドpARup1、2、3および4
を保持しているそれぞれのコロニーを200mlの2Y
T液体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)で
培養し、それぞれのプラスミドDNAをSDS−アルカ
リ法により大量に調製した。
を保持しているそれぞれのコロニーを200mlの2Y
T液体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)で
培養し、それぞれのプラスミドDNAをSDS−アルカ
リ法により大量に調製した。
【0057】(I−8) EcoRI−HindII
I断片の単離 大量調製したプラスミドDNA(pARup1、2、3
および4)を20μg(20μl)とり、10×K
buffer 20μl、 HindIII 12
0units(15μl)および滅菌水を加えて200
μlとしたエツペンドルフチユーブを各々のプラスミド
で6チユーブずつ用意した。これらのチユーブを37℃
で3時間インキユベートした。反応後、フエノール−ク
ロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め、
それぞれ150μlの滅菌水に溶解した。これらのDN
A溶液にそれぞれ5×EcoRI buffer
40μl及びEcoRI 120units(10μ
l)を加え37℃で3時間インキユベートした。反応後
、DNAをエタノール沈殿して回収した。目的のそれぞ
れのDNA断片を1.5%アガロースゲル電気泳動によ
り分離した。DNAをゲルから電気的に溶出し、核酸精
製用カートリツジNensorb20を用いて精製した
(ARup1、2、3および4)。
I断片の単離 大量調製したプラスミドDNA(pARup1、2、3
および4)を20μg(20μl)とり、10×K
buffer 20μl、 HindIII 12
0units(15μl)および滅菌水を加えて200
μlとしたエツペンドルフチユーブを各々のプラスミド
で6チユーブずつ用意した。これらのチユーブを37℃
で3時間インキユベートした。反応後、フエノール−ク
ロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め、
それぞれ150μlの滅菌水に溶解した。これらのDN
A溶液にそれぞれ5×EcoRI buffer
40μl及びEcoRI 120units(10μ
l)を加え37℃で3時間インキユベートした。反応後
、DNAをエタノール沈殿して回収した。目的のそれぞ
れのDNA断片を1.5%アガロースゲル電気泳動によ
り分離した。DNAをゲルから電気的に溶出し、核酸精
製用カートリツジNensorb20を用いて精製した
(ARup1、2、3および4)。
【0058】II.転写終止(ターミネーター)領域の
調製(図5参照) (II−1) pANP1155のクローニングpB
R322のPstIサイトにAnacystis ni
dulans 6301株のリブロース−1,5−ジリ
ン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ遺伝子のターミ
ネーター領域を含む約1500bpの断片が挿入された
pANP1155(K. Shinozakiら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA
80:4050−4054(1983))500ng(
0.5μl)を50mM CaCl2処理したE.
coli JM109株の細胞懸濁液100μlに加え
、おだやかに混合した。混合液を氷水中で30分間イン
キユベートした後、さらに42℃で2分間インキユベー
トしてDNAを細胞中に取りこませた。この懸濁液に1
mlのLB液体培地を加え、37℃、1時間の振盪培養
後、LB寒天培地(12.5μg/mlテトラサイクリ
ンおよび1.5%寒天を含む)にプレートし、コロニー
を単離した。
調製(図5参照) (II−1) pANP1155のクローニングpB
R322のPstIサイトにAnacystis ni
dulans 6301株のリブロース−1,5−ジリ
ン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ遺伝子のターミ
ネーター領域を含む約1500bpの断片が挿入された
pANP1155(K. Shinozakiら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA
80:4050−4054(1983))500ng(
0.5μl)を50mM CaCl2処理したE.
coli JM109株の細胞懸濁液100μlに加え
、おだやかに混合した。混合液を氷水中で30分間イン
キユベートした後、さらに42℃で2分間インキユベー
トしてDNAを細胞中に取りこませた。この懸濁液に1
mlのLB液体培地を加え、37℃、1時間の振盪培養
後、LB寒天培地(12.5μg/mlテトラサイクリ
ンおよび1.5%寒天を含む)にプレートし、コロニー
を単離した。
【0059】単離したコロニーを2.8リットルの2Y
T液体培地(25μg/mlテトラサイクリンを含む)
で培養し、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法によ
り大量に調製した。
T液体培地(25μg/mlテトラサイクリンを含む)
で培養し、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法によ
り大量に調製した。
【0060】(II−2) Eco52I−PstI
断片の調製 (1) PstI断片の単離 大量調製したpANP1155DNA20μg(20μ
l)と10×Highbuffer 20μl、Ps
tI 120units(10μl)に滅菌水を加え
て200μlとしたエツペンドルフチユーブ(1.5m
l容)6本用意し、37℃で3時間インキユベートした
。反応後、DNAをエタノール沈殿して回収し、目的の
DNA断片(約1500bp)を1.5%アガロースゲ
ル電気泳動により分離した。分離したDNAをGene
cleanにより精製し、次の実験に用いた。
断片の調製 (1) PstI断片の単離 大量調製したpANP1155DNA20μg(20μ
l)と10×Highbuffer 20μl、Ps
tI 120units(10μl)に滅菌水を加え
て200μlとしたエツペンドルフチユーブ(1.5m
l容)6本用意し、37℃で3時間インキユベートした
。反応後、DNAをエタノール沈殿して回収し、目的の
DNA断片(約1500bp)を1.5%アガロースゲ
ル電気泳動により分離した。分離したDNAをGene
cleanにより精製し、次の実験に用いた。
【0061】(2) PstI断片のEco52I消
化PstI断片のDNA溶液64.5μl(約10μg
)に10×Eco52Ibuffer(100mM
Tris−HCl(pH9.0、30mM MgCl
2、1000mM NaCl、0.1% BSA)
7.5μl及びEco52I(東洋紡績(株)社製)1
8units(3μl)を加え37℃で3時間インキユ
ベートした。インキユベート後、フエノール−クロロホ
ルム処理、エタノール沈殿してDNAを回収した。回収
したDNAを8μlの滅菌水に溶解した。
化PstI断片のDNA溶液64.5μl(約10μg
)に10×Eco52Ibuffer(100mM
Tris−HCl(pH9.0、30mM MgCl
2、1000mM NaCl、0.1% BSA)
7.5μl及びEco52I(東洋紡績(株)社製)1
8units(3μl)を加え37℃で3時間インキユ
ベートした。インキユベート後、フエノール−クロロホ
ルム処理、エタノール沈殿してDNAを回収した。回収
したDNAを8μlの滅菌水に溶解した。
【0062】(II−3) pARut13の作製(
1) Eco52I−PstI断片の平滑末端化II
−2で調製したEco52I−PstI断片のDNA溶
液8μlにDNABlunting Kit(宝酒造(
株)社製)の×10 buffer 1μlを加え
、70℃で5分間インキユベートした後、37℃の恒温
槽に移した。この溶液にDNA Blunting
KitのT4DNA polymerase 1μ
lを加え、ピペツテイングによりやだやかに混和し、3
7℃で5分間反応させた。反応後、この溶液にDNA
Blunting Kit のDNA diluti
on buffer 40μlを加え、ボルテツクスで
激しく撹拌することにより酵素を失活させた。
1) Eco52I−PstI断片の平滑末端化II
−2で調製したEco52I−PstI断片のDNA溶
液8μlにDNABlunting Kit(宝酒造(
株)社製)の×10 buffer 1μlを加え
、70℃で5分間インキユベートした後、37℃の恒温
槽に移した。この溶液にDNA Blunting
KitのT4DNA polymerase 1μ
lを加え、ピペツテイングによりやだやかに混和し、3
7℃で5分間反応させた。反応後、この溶液にDNA
Blunting Kit のDNA diluti
on buffer 40μlを加え、ボルテツクスで
激しく撹拌することにより酵素を失活させた。
【0063】(2) pUC13のSmaI消化およ
び脱リン酸化 pUC13 DNA 20μg(20μl)に5×
SmaI buffer(50mM Tris−H
Cl(pH8.0)、35mM MgCl2、100
mM KCl、35mM 2−メルカプトエタノー
ル、0.05% BSA)40μl、SmaI(宝酒
造(株)社製)80units(10μl)および滅菌
水130μlを加え、30℃で4時間反応させた。反応
後、フエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿を
してDNAを回収した。回収したDNAを100μlの
0.1MTris−HCl(pH8.0)に溶解し、1
0μlのアルカリフオスフアターゼ溶液(1.0uni
tsアルカリフオスフアターゼ(AP、宝酒造(株)社
製)、10mM Tris−HCl(pH7.5)、
50mM NaCl、1mM ZnSO4)を加え
、37℃で2時間反応させた。反応後、さらに10μl
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え65℃で30分
間インキユベートした。反応液をフエノール−クロロホ
ルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め0.5μ
g/μlになるようにTEに溶解した。
び脱リン酸化 pUC13 DNA 20μg(20μl)に5×
SmaI buffer(50mM Tris−H
Cl(pH8.0)、35mM MgCl2、100
mM KCl、35mM 2−メルカプトエタノー
ル、0.05% BSA)40μl、SmaI(宝酒
造(株)社製)80units(10μl)および滅菌
水130μlを加え、30℃で4時間反応させた。反応
後、フエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿を
してDNAを回収した。回収したDNAを100μlの
0.1MTris−HCl(pH8.0)に溶解し、1
0μlのアルカリフオスフアターゼ溶液(1.0uni
tsアルカリフオスフアターゼ(AP、宝酒造(株)社
製)、10mM Tris−HCl(pH7.5)、
50mM NaCl、1mM ZnSO4)を加え
、37℃で2時間反応させた。反応後、さらに10μl
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え65℃で30分
間インキユベートした。反応液をフエノール−クロロホ
ルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め0.5μ
g/μlになるようにTEに溶解した。
【0064】(3)平滑化断片のpUC13(SmaI
、AP)への挿入 平滑末端化断片のDNA溶液2μl(約100ng)と
SmaI、アルカリフオスフアターゼ処理したpUC1
3のDNA溶液2μl(1.0μg)にTakaral
igation kit A液32μlを加え、よく
撹拌した。この溶液にTakara ligation
kit B液4μlを加えよく撹拌した後、16℃で
1時間以上インキユベートした。反応後、この溶液をE
. coli JM109株の形質転換に使用した。
、AP)への挿入 平滑末端化断片のDNA溶液2μl(約100ng)と
SmaI、アルカリフオスフアターゼ処理したpUC1
3のDNA溶液2μl(1.0μg)にTakaral
igation kit A液32μlを加え、よく
撹拌した。この溶液にTakara ligation
kit B液4μlを加えよく撹拌した後、16℃で
1時間以上インキユベートした。反応後、この溶液をE
. coli JM109株の形質転換に使用した。
【0065】(II−4) BamHI−EcoRI
断片の調製 (1) pARut13の大量調製 ligation溶液1μl(約40ng)に50mM
CaCl2で処理したE. coliJM109株
の細胞懸濁液100μlを加え、おだやかに混合した。 混合液を氷水中で30分間インキユベートした後、さら
に42℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中に
取りこませた。この懸濁液に1mlの2YT液体培地を
加え、37℃、1時間の振盪培養後、2YT寒天培地(
50μg/mlアンピシリン、40mg/l X−ga
l、23.83mg/l IPTGおよび1.5%寒
天を含む)にプレートした。得られた白いコロニーから
プラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することによ
つて目的のプラスミドpARut13を保持しているコ
ロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコロ
ニーを400mlの2YT液体培地(100μg/ml
アンピシリンを含む)で培養し、プラスミドDNAをS
DS−アルカリ法により大量に調整した。
断片の調製 (1) pARut13の大量調製 ligation溶液1μl(約40ng)に50mM
CaCl2で処理したE. coliJM109株
の細胞懸濁液100μlを加え、おだやかに混合した。 混合液を氷水中で30分間インキユベートした後、さら
に42℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中に
取りこませた。この懸濁液に1mlの2YT液体培地を
加え、37℃、1時間の振盪培養後、2YT寒天培地(
50μg/mlアンピシリン、40mg/l X−ga
l、23.83mg/l IPTGおよび1.5%寒
天を含む)にプレートした。得られた白いコロニーから
プラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することによ
つて目的のプラスミドpARut13を保持しているコ
ロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコロ
ニーを400mlの2YT液体培地(100μg/ml
アンピシリンを含む)で培養し、プラスミドDNAをS
DS−アルカリ法により大量に調整した。
【0066】(2) BamHI−EcoRI断片の
単離 大量調製したプラスミドDNA(pARut13)15
μg(15μl)に10×K buffer 20
μl、BamHI(宝酒造(株)社製)120unit
s(10μl)及び滅菌水を加えて200μlとしたエ
ツペンドルフチユーブ(1.5ml容)を8本用意した
。これらのチユーブを30℃で3時間インキユベートし
た。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、DNA
をエタノール沈殿して集め、それぞれ110μlの滅菌
水に溶解した。これらのDNA溶液に5×EcoRI
buffer 30μl及びEcoRI 120
units(10μl)を加え、37℃で3時間インキ
ユベートした。反応後、DNAをエタノール沈殿して回
収し、目的のDNA断片(約300bp)を1.5%ア
ガロースゲル電気泳動により分離した。ゲルからDNA
を電気的に溶出し、核酸精製用カートリツジNenso
rb20を用いて精製した。
単離 大量調製したプラスミドDNA(pARut13)15
μg(15μl)に10×K buffer 20
μl、BamHI(宝酒造(株)社製)120unit
s(10μl)及び滅菌水を加えて200μlとしたエ
ツペンドルフチユーブ(1.5ml容)を8本用意した
。これらのチユーブを30℃で3時間インキユベートし
た。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、DNA
をエタノール沈殿して集め、それぞれ110μlの滅菌
水に溶解した。これらのDNA溶液に5×EcoRI
buffer 30μl及びEcoRI 120
units(10μl)を加え、37℃で3時間インキ
ユベートした。反応後、DNAをエタノール沈殿して回
収し、目的のDNA断片(約300bp)を1.5%ア
ガロースゲル電気泳動により分離した。ゲルからDNA
を電気的に溶出し、核酸精製用カートリツジNenso
rb20を用いて精製した。
【0067】III.hオペロンの造成(III−1)
h遺伝子への転写終止領域の連結(図5参照) (1) pUC13−h−SODのBamHI−Ec
oRI消化 pUC13のHindIII−BamHIサイトにヒト
−スーパーオキシド・ジスムターゼをコードする完全鎖
長DNA断片(475bp)が挿入されたpUC13−
h−SOD(特願平1−210129号特許出願明細書
の実施例1参照)10μg(20μl)に5×EcoR
I buffer 40μl、EcoRI 12
0units(10μl)及び滅菌水を加えて200μ
lとしたエツペンドルフチユーブを37℃で3時間イン
キユベートした。反応後、フエノール−クロロホルム処
理、エタノール沈殿してDNAを集め、215μlの滅
菌水に溶解した。この溶液に10×K buffer
25μl及びBamHI 100units(1
0μl)を加え、30℃で3時間反応させた。反応後、
DNAをGenecleanを用いて精製した。 (2) 転写終止領域(BamHI−EcoRI)の
pUC13−h−SOD(BamHI−EcoRI)へ
の挿入 pUC13−h−SOD(BamHI−EcoRI)D
NA500ng(1μl)とIIで調製した転写終止領
域60ng(0.4μl)にTakara ligat
ion kit A液11.2μlを加え、よく混合し
た。この溶液にTakara ligation
kitB液1.4μlを加えよく撹拌した後、16℃で
30分間インキユベートした。反応後、この溶液をE.
coli JM109株の形質転換に使用した。
h遺伝子への転写終止領域の連結(図5参照) (1) pUC13−h−SODのBamHI−Ec
oRI消化 pUC13のHindIII−BamHIサイトにヒト
−スーパーオキシド・ジスムターゼをコードする完全鎖
長DNA断片(475bp)が挿入されたpUC13−
h−SOD(特願平1−210129号特許出願明細書
の実施例1参照)10μg(20μl)に5×EcoR
I buffer 40μl、EcoRI 12
0units(10μl)及び滅菌水を加えて200μ
lとしたエツペンドルフチユーブを37℃で3時間イン
キユベートした。反応後、フエノール−クロロホルム処
理、エタノール沈殿してDNAを集め、215μlの滅
菌水に溶解した。この溶液に10×K buffer
25μl及びBamHI 100units(1
0μl)を加え、30℃で3時間反応させた。反応後、
DNAをGenecleanを用いて精製した。 (2) 転写終止領域(BamHI−EcoRI)の
pUC13−h−SOD(BamHI−EcoRI)へ
の挿入 pUC13−h−SOD(BamHI−EcoRI)D
NA500ng(1μl)とIIで調製した転写終止領
域60ng(0.4μl)にTakara ligat
ion kit A液11.2μlを加え、よく混合し
た。この溶液にTakara ligation
kitB液1.4μlを加えよく撹拌した後、16℃で
30分間インキユベートした。反応後、この溶液をE.
coli JM109株の形質転換に使用した。
【0068】(III−2) HindIII−Ec
oRI(hSOD−terminater)断片の調製
(1) pUC13−hSODtの大量調製liga
tion溶液2μl(約70ng)に50mM Ca
Cl2で処理したE. coliJM109株の細胞懸
濁液100μlを加え、おだやかに混合した。この混合
液を氷水中で30分間インキユベートした後、さらに4
2℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中に取り
こませた。この懸濁液に1mlの2YT液体培地を加え
、37℃、1時間の振盪培養後、2YT寒天培地(50
μg/mlアンピシリン、40mg/l X−gal
、23.83mg/l IPTGおよび1.5%寒天
を含む)にプレートした。得られた白いコロニーからプ
ラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することにより
目的のDNA断片を保持しているコロニーをスクリーニ
ングした。スクリーニングしたコロニーを60mlの2
YT液体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)
で培養し、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法によ
り調製した。
oRI(hSOD−terminater)断片の調製
(1) pUC13−hSODtの大量調製liga
tion溶液2μl(約70ng)に50mM Ca
Cl2で処理したE. coliJM109株の細胞懸
濁液100μlを加え、おだやかに混合した。この混合
液を氷水中で30分間インキユベートした後、さらに4
2℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中に取り
こませた。この懸濁液に1mlの2YT液体培地を加え
、37℃、1時間の振盪培養後、2YT寒天培地(50
μg/mlアンピシリン、40mg/l X−gal
、23.83mg/l IPTGおよび1.5%寒天
を含む)にプレートした。得られた白いコロニーからプ
ラスミドを調製し、制限酵素地図を解析することにより
目的のDNA断片を保持しているコロニーをスクリーニ
ングした。スクリーニングしたコロニーを60mlの2
YT液体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)
で培養し、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法によ
り調製した。
【0069】(2) HindIII−EcoRI断
片の単離 調製したpUC13−hSODt DNA溶液50μ
l(25μg)に10×K buffer 20μ
l、HindIII 120units(15μl)
及び滅菌水を加え、200μlとしたエツペンドルフチ
ユーブ(1.5ml容)を2本用意した。これらのチユ
ーブを37℃で3時間インキユベートした。反応後、フ
エノール−クロロホルム処理し、DNAをエタノール沈
殿して集め、それぞれ150μlの滅菌水に溶解した。 これらのDNA溶液に5×EcoRI buffer
40μl及びEcoRI 120units(1
0μl)を加え、37℃で3時間インキユベートした。 反応後、DNAをエタノール沈殿して回収し、目的のD
NA断片(約790bp)を1.5%アガロースゲル電
気泳動により分離した。DNAをGenecleanに
よつて精製した。 (III−3) HindIII−EcoRI(hS
OD−terminater)断片と発現調節 領域ARup1、2、3および4)の連結(図6参照)
発現調節領域(ARup1、2、3および4)1.12
μg(2.1μl)とHindIII−EcoRI断片
2.11μg(2.2μl)に5×ligation
buffer(250mM Tris−HCl(p
H7.6)、50mM MgCl2)4μl、100
mM DTT2μl、10mM ATP2μl、T
4DNA ligase(宝酒造(株)社製)2.5
units(1μl)及び滅菌水を加えて20μlとし
たエツペンドルフチユーブをそれぞれ用意した。これら
のチユーブを15℃で一晩インキユベートした後、60
℃で10分間熱処理して反応を止めた。これらの溶液に
それぞれ5×EcoRI buffer 10μl
、EcoRI 12units(1μl)及び滅菌水
を加え50μlとした。これらの溶液を37℃で3時間
インキユベートした。反応後、目的のそれぞれのDNA
断片(図7参照それぞれ約1200bp)を2%アガロ
ースゲル電気泳動によつて分離し、Geneclean
を用いて精製した。
片の単離 調製したpUC13−hSODt DNA溶液50μ
l(25μg)に10×K buffer 20μ
l、HindIII 120units(15μl)
及び滅菌水を加え、200μlとしたエツペンドルフチ
ユーブ(1.5ml容)を2本用意した。これらのチユ
ーブを37℃で3時間インキユベートした。反応後、フ
エノール−クロロホルム処理し、DNAをエタノール沈
殿して集め、それぞれ150μlの滅菌水に溶解した。 これらのDNA溶液に5×EcoRI buffer
40μl及びEcoRI 120units(1
0μl)を加え、37℃で3時間インキユベートした。 反応後、DNAをエタノール沈殿して回収し、目的のD
NA断片(約790bp)を1.5%アガロースゲル電
気泳動により分離した。DNAをGenecleanに
よつて精製した。 (III−3) HindIII−EcoRI(hS
OD−terminater)断片と発現調節 領域ARup1、2、3および4)の連結(図6参照)
発現調節領域(ARup1、2、3および4)1.12
μg(2.1μl)とHindIII−EcoRI断片
2.11μg(2.2μl)に5×ligation
buffer(250mM Tris−HCl(p
H7.6)、50mM MgCl2)4μl、100
mM DTT2μl、10mM ATP2μl、T
4DNA ligase(宝酒造(株)社製)2.5
units(1μl)及び滅菌水を加えて20μlとし
たエツペンドルフチユーブをそれぞれ用意した。これら
のチユーブを15℃で一晩インキユベートした後、60
℃で10分間熱処理して反応を止めた。これらの溶液に
それぞれ5×EcoRI buffer 10μl
、EcoRI 12units(1μl)及び滅菌水
を加え50μlとした。これらの溶液を37℃で3時間
インキユベートした。反応後、目的のそれぞれのDNA
断片(図7参照それぞれ約1200bp)を2%アガロ
ースゲル電気泳動によつて分離し、Geneclean
を用いて精製した。
【0070】(III−4) 4つのhSOD遺伝子
発現用DNA断片のクローニング (1) pUC18のEcoRI消化、アルカリフオ
スフアターゼ処理 プラスミドpUC18DNA20μg(30μl)に5
×EcoRI buffer40μl、EcoRI
120units(10μl)に滅菌水を加えて20
0μlとしたエツペンドルフチユーブを37℃で3時間
インキユベートした。反応後、フエノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈殿してDNAを集め、100μl
の0.1M Tris−HCl(pH8.0)に溶解
した。この溶液に10μlのアルカリフオスフアターゼ
溶液を加え、37℃で1時間インキユベートした。反応
後、さらに10μlのアルカリフオスフアターゼ溶液を
加え65℃で30分間インキユベートした。反応液をフ
エノール−クロロホルム処理し、DNAをエタノール沈
殿して集め0.16μg/μlになるようにTEに溶解
した。
発現用DNA断片のクローニング (1) pUC18のEcoRI消化、アルカリフオ
スフアターゼ処理 プラスミドpUC18DNA20μg(30μl)に5
×EcoRI buffer40μl、EcoRI
120units(10μl)に滅菌水を加えて20
0μlとしたエツペンドルフチユーブを37℃で3時間
インキユベートした。反応後、フエノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈殿してDNAを集め、100μl
の0.1M Tris−HCl(pH8.0)に溶解
した。この溶液に10μlのアルカリフオスフアターゼ
溶液を加え、37℃で1時間インキユベートした。反応
後、さらに10μlのアルカリフオスフアターゼ溶液を
加え65℃で30分間インキユベートした。反応液をフ
エノール−クロロホルム処理し、DNAをエタノール沈
殿して集め0.16μg/μlになるようにTEに溶解
した。
【0071】(2) hSODオペロン断片のpUC
18(EcoRI、AP処理)への挿入hSODオペロ
ン(Promoter−SOD−terminater
1、2、3および4)DNA100ng(1μl)とE
coRI、アルカリフオスフアターゼ処理したpUC1
8DNA320ng(2μl)にTakara lig
ation kit A液24μlをそれぞれ加え、
よく撹拌した。これらの溶液にTakara lig
ationkit B液3μlずつ加え、よく撹拌し
た後、1℃で一晩インキユベートした。
18(EcoRI、AP処理)への挿入hSODオペロ
ン(Promoter−SOD−terminater
1、2、3および4)DNA100ng(1μl)とE
coRI、アルカリフオスフアターゼ処理したpUC1
8DNA320ng(2μl)にTakara lig
ation kit A液24μlをそれぞれ加え、
よく撹拌した。これらの溶液にTakara lig
ationkit B液3μlずつ加え、よく撹拌し
た後、1℃で一晩インキユベートした。
【0072】(3) pUC18−Rupt−hSO
D1、2、3及び4の大量調製 各々のligation溶液4μl(約50ng)に5
0mM CaCl2で処理したE.coli JM
109株の細胞懸濁液200μlずつ加え、おだやかに
混合した。これらの混合液を氷水中で30分間インキユ
ベートした後、さらに42℃で2分間インキユベートし
てDNAを細胞中に取りこませた。これら懸濁液に1m
lの2YT液体培地を各々加え、37℃、1時間の振盪
培養後、2YT寒天培地(50μg/mlアンピシリン
、40mg/ml X−gal、23.83mg/l
IPTGおよび1.5%寒天を含む)にプレートし
た。得られた白いコロニーからプラスミドを調製し、制
限酵素地図を解析することにより目的の各々のプラスミ
ド(pUC18−Rupt−hSOD1、2、3及び4
を保持しているコロニーをスクリーニングした。スクリ
ーニングした各々のコロニーを200mlの2YT液体
培地(100μg/mlアンピシリンを含む)で培養し
、各々のプラスミドDNAをSDS−アルカリ法により
大量に調製した。
D1、2、3及び4の大量調製 各々のligation溶液4μl(約50ng)に5
0mM CaCl2で処理したE.coli JM
109株の細胞懸濁液200μlずつ加え、おだやかに
混合した。これらの混合液を氷水中で30分間インキユ
ベートした後、さらに42℃で2分間インキユベートし
てDNAを細胞中に取りこませた。これら懸濁液に1m
lの2YT液体培地を各々加え、37℃、1時間の振盪
培養後、2YT寒天培地(50μg/mlアンピシリン
、40mg/ml X−gal、23.83mg/l
IPTGおよび1.5%寒天を含む)にプレートし
た。得られた白いコロニーからプラスミドを調製し、制
限酵素地図を解析することにより目的の各々のプラスミ
ド(pUC18−Rupt−hSOD1、2、3及び4
を保持しているコロニーをスクリーニングした。スクリ
ーニングした各々のコロニーを200mlの2YT液体
培地(100μg/mlアンピシリンを含む)で培養し
、各々のプラスミドDNAをSDS−アルカリ法により
大量に調製した。
【0073】(4) EcoRI断片(約1200b
p)の単離 大量調製したプラスミド(pUC18−Rupt−hS
OD1、2、3及び4)DNA約20μg(20μl)
に5×EcoRI buffer 40μl、Ec
oRI 120units(10μl)及び滅菌水1
30μlを加え200μlとしたエツペンドルフチユー
ブを各々のプラスミドで3本ずつ用意した。これらのチ
ユーブを37℃で3時間インキユベートした。反応後、
DNAをエタノール沈殿して集め、各々のプラスミドご
とに100μlのTEに溶解した。目的の各々のDNA
断片(約1200bp)を1.5%アガロースゲル電気
泳動によつて分離し、Genecleanを用いて精製
した。
p)の単離 大量調製したプラスミド(pUC18−Rupt−hS
OD1、2、3及び4)DNA約20μg(20μl)
に5×EcoRI buffer 40μl、Ec
oRI 120units(10μl)及び滅菌水1
30μlを加え200μlとしたエツペンドルフチユー
ブを各々のプラスミドで3本ずつ用意した。これらのチ
ユーブを37℃で3時間インキユベートした。反応後、
DNAをエタノール沈殿して集め、各々のプラスミドご
とに100μlのTEに溶解した。目的の各々のDNA
断片(約1200bp)を1.5%アガロースゲル電気
泳動によつて分離し、Genecleanを用いて精製
した。
【0074】IV.ラン藻用hSOD遺伝子発現ベクタ
ーの造成(図8参照) (IV−1) pBR322へのマルチクローニング
サイト(pUC18由来)の導入 (1) pBR322のEcoRI−HindIII
消化、アルカリフオスフアターゼ処理 pBR322DNA溶液20μl(10μg)に5×H
indIII buffer(50mM Tris
−HCl(pH7.5)、35mM MgCl2、3
00mMNaCl)40μl、HindIII 80
units(10μl)及び滅菌水130μlを加え、
37℃で2時間インキユベートした。反応後、この溶液
に5×EcoRI buffer 40μl、Ec
oRI 120units(10μl)及び滅菌水5
0μlを加え、さらに37℃で2時間反応させた。反応
後、フエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿し
てDNAを集め、100μlの0.1M Tris−
HCl(pH8.0)に溶解した。この溶液に10μl
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、37℃で1時
間インキユベートした。反応後、10μlのアルカリフ
オスフアターゼ溶液を加え、さらに65℃で30分間イ
ンキユベートした。この溶液をフエノール−クロロホル
ム処理し、エタノール沈殿してDNAを回収した。
ーの造成(図8参照) (IV−1) pBR322へのマルチクローニング
サイト(pUC18由来)の導入 (1) pBR322のEcoRI−HindIII
消化、アルカリフオスフアターゼ処理 pBR322DNA溶液20μl(10μg)に5×H
indIII buffer(50mM Tris
−HCl(pH7.5)、35mM MgCl2、3
00mMNaCl)40μl、HindIII 80
units(10μl)及び滅菌水130μlを加え、
37℃で2時間インキユベートした。反応後、この溶液
に5×EcoRI buffer 40μl、Ec
oRI 120units(10μl)及び滅菌水5
0μlを加え、さらに37℃で2時間反応させた。反応
後、フエノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿し
てDNAを集め、100μlの0.1M Tris−
HCl(pH8.0)に溶解した。この溶液に10μl
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、37℃で1時
間インキユベートした。反応後、10μlのアルカリフ
オスフアターゼ溶液を加え、さらに65℃で30分間イ
ンキユベートした。この溶液をフエノール−クロロホル
ム処理し、エタノール沈殿してDNAを回収した。
【0075】(2) pUC18からマルチクローニ
ングサイト(EcoRI−HindIII)の単離pU
C18DNA溶液30μl(20μg)に10×K
buffer 20μl、HindIII 80u
nits(10μl)及び滅菌水140μlを加えたエ
ツペンドルフチユーブ2本用意し、37℃で3時間イン
キユベートした。 反応後、フエノール−クロロホルム処理し、エタノール
沈殿してDNA集め、112.5μlの滅菌水に溶解し
た。これらの溶液に5×EcoRI buffer
30μl、EcoRI 90units(7.5μ
l)を加え、37℃で3時間インキユベートした。DN
Aをエタノール沈殿して回収し、1.5%アガロースゲ
ル電気泳動を行い目的のDNA断片(約50bp)を分
離した。DNAをゲルから電気的に溶出し、フエノール
−クロロホルム処理、エタノール沈殿して精製した。
ングサイト(EcoRI−HindIII)の単離pU
C18DNA溶液30μl(20μg)に10×K
buffer 20μl、HindIII 80u
nits(10μl)及び滅菌水140μlを加えたエ
ツペンドルフチユーブ2本用意し、37℃で3時間イン
キユベートした。 反応後、フエノール−クロロホルム処理し、エタノール
沈殿してDNA集め、112.5μlの滅菌水に溶解し
た。これらの溶液に5×EcoRI buffer
30μl、EcoRI 90units(7.5μ
l)を加え、37℃で3時間インキユベートした。DN
Aをエタノール沈殿して回収し、1.5%アガロースゲ
ル電気泳動を行い目的のDNA断片(約50bp)を分
離した。DNAをゲルから電気的に溶出し、フエノール
−クロロホルム処理、エタノール沈殿して精製した。
【0076】(3) pBR322(EcoRI−H
indIII消化)とマルチクローニングサイトの連結
pBR322(EcoRI−HindIII、AP処理
)DNA0.2μg(1μl)とマルチクローニングサ
イトDNA0.2μg(1μl)にTE1μl、Tak
ara ligation kit A液24μ
lを加え、よく撹拌した。この溶液にTakarali
gationkit B液3μlを加え16℃で4時
間インキユベートした。
indIII消化)とマルチクローニングサイトの連結
pBR322(EcoRI−HindIII、AP処理
)DNA0.2μg(1μl)とマルチクローニングサ
イトDNA0.2μg(1μl)にTE1μl、Tak
ara ligation kit A液24μ
lを加え、よく撹拌した。この溶液にTakarali
gationkit B液3μlを加え16℃で4時
間インキユベートした。
【0077】(4) プラスミド pBR322M
のクローニング ligation溶液3μl(40ng)に50mM
CaCl2処理したE.coli HB101の細
胞懸濁液200μlを加え、おだやかに混合した。この
混合液を氷水中で30分間インキユベートした後、さら
に42℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中に
とりこませた。この懸濁液に1.8mlの2YT液体培
地を加え、37℃で1時間の振盪培養後、LB寒天培地
(50μg/mlアンピシリンを含む)にプレートした
。得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素
地図を解析することにより目的のプラスミド(pBR3
22M)を保持しているコロニーをスクリーニングした
。スクリーニングしたコロニーを200mlの2YT液
体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)で培養
し、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法により大量
に調製した。
のクローニング ligation溶液3μl(40ng)に50mM
CaCl2処理したE.coli HB101の細
胞懸濁液200μlを加え、おだやかに混合した。この
混合液を氷水中で30分間インキユベートした後、さら
に42℃で2分間インキユベートしてDNAを細胞中に
とりこませた。この懸濁液に1.8mlの2YT液体培
地を加え、37℃で1時間の振盪培養後、LB寒天培地
(50μg/mlアンピシリンを含む)にプレートした
。得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素
地図を解析することにより目的のプラスミド(pBR3
22M)を保持しているコロニーをスクリーニングした
。スクリーニングしたコロニーを200mlの2YT液
体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)で培養
し、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法により大量
に調製した。
【0078】(IV−2) PvuII−Eco47
III断片(2550bp)の単離 前記(IV−1)を調製したBR322MプラスミドD
NA10μg(10μl)に10×M buffer
(100mM Tris−HCl(pH7.5)、1
00mM MgCl2、10mM DTT、500
mM NaCl)20μl、PvuII(宝酒造(株
)社製)120units(10μl)および滅菌水を
加え200μlとしたエツペンドルフチユーブ3本用意
した。これらのチユーブを37℃で3時間インキユベー
トした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、D
NAをエタノール沈殿して集め、174μlの滅菌水に
それぞれ溶解した。これらの溶液に10×H buf
fer 20μlおよびEco47III(宝酒造(
株)社製)24unitsずつ加え、37℃で3時間イ
ンキユベートした。DNAをエタノール沈殿し回収し、
目的のDNA断片(2550bp)を1.5%アガロー
スゲル電気泳動により分離した。分離したDNA断片は
Genecleanを用いて精製し、50μlの0.1
M Tris−HCl(pH8.0)溶液とした。こ
の溶液に5μlのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え
、37℃で1時間インキユベートした。反応後、5μl
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、65℃で30
分間さらにインキユベートした。反応後、フエノール−
クロロホルム処理し、エタノール沈殿してDNAを集め
、20μlのTEに溶解した。
III断片(2550bp)の単離 前記(IV−1)を調製したBR322MプラスミドD
NA10μg(10μl)に10×M buffer
(100mM Tris−HCl(pH7.5)、1
00mM MgCl2、10mM DTT、500
mM NaCl)20μl、PvuII(宝酒造(株
)社製)120units(10μl)および滅菌水を
加え200μlとしたエツペンドルフチユーブ3本用意
した。これらのチユーブを37℃で3時間インキユベー
トした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、D
NAをエタノール沈殿して集め、174μlの滅菌水に
それぞれ溶解した。これらの溶液に10×H buf
fer 20μlおよびEco47III(宝酒造(
株)社製)24unitsずつ加え、37℃で3時間イ
ンキユベートした。DNAをエタノール沈殿し回収し、
目的のDNA断片(2550bp)を1.5%アガロー
スゲル電気泳動により分離した。分離したDNA断片は
Genecleanを用いて精製し、50μlの0.1
M Tris−HCl(pH8.0)溶液とした。こ
の溶液に5μlのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え
、37℃で1時間インキユベートした。反応後、5μl
のアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、65℃で30
分間さらにインキユベートした。反応後、フエノール−
クロロホルム処理し、エタノール沈殿してDNAを集め
、20μlのTEに溶解した。
【0079】(IV−3) pBAS18のA.ni
dulansにおける複製開始点の分離 pBR322のBamHIサイトにA.nidulan
s6301株の内在性プラスミド(pBA1、BamH
I消化)を挿入した大腸菌とA.nidulansとの
間のシヤトルベクターpBAS18(k. Shino
zakiら、 Gene, 19:221−224(1
982))をE.coli HB101に導入し、L
B液体培地(50μg/mlアンピシリンを含む)で培
養し、SDS−アルカリ法を用いて大量に調製した。
dulansにおける複製開始点の分離 pBR322のBamHIサイトにA.nidulan
s6301株の内在性プラスミド(pBA1、BamH
I消化)を挿入した大腸菌とA.nidulansとの
間のシヤトルベクターpBAS18(k. Shino
zakiら、 Gene, 19:221−224(1
982))をE.coli HB101に導入し、L
B液体培地(50μg/mlアンピシリンを含む)で培
養し、SDS−アルカリ法を用いて大量に調製した。
【0080】調製したpBAS18DNA14μg(2
0μl)に10×K buffer 20μl、B
amHI 100units(10μl)および滅菌
水を加えて200μlとしたエツペンドルフチユーブ3
本用意し、30℃で3時間インキユベートした。反応後
、DNAをエタノール沈殿して回収し、目的のDNA断
片(pBA1、約8.0kbp)を1%アガロースゲル
電気泳動を行い分離し、Genecleanにより精製
した。
0μl)に10×K buffer 20μl、B
amHI 100units(10μl)および滅菌
水を加えて200μlとしたエツペンドルフチユーブ3
本用意し、30℃で3時間インキユベートした。反応後
、DNAをエタノール沈殿して回収し、目的のDNA断
片(pBA1、約8.0kbp)を1%アガロースゲル
電気泳動を行い分離し、Genecleanにより精製
した。
【0081】分離・精製したpBA1(BamHI消化
)DNA2μg(5μl)に10×K buffer
5μl、XhoI 24units(2μl)お
よび滅菌水38μlを加え、37℃で3時間インキユベ
ートした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、
エタノール沈殿してDNAを集めた。得られたpBA1
のBamHI−XhoI消化DNAの両末端をTaka
raligation kitを用いて平滑末端化し
た。
)DNA2μg(5μl)に10×K buffer
5μl、XhoI 24units(2μl)お
よび滅菌水38μlを加え、37℃で3時間インキユベ
ートした。反応後、フエノール−クロロホルム処理し、
エタノール沈殿してDNAを集めた。得られたpBA1
のBamHI−XhoI消化DNAの両末端をTaka
raligation kitを用いて平滑末端化し
た。
【0082】(IV−4) 小型化E.coli−A
.nidulansシヤトルベクターpBAX18(6
.9kbp)の造成 (1) pBAX18(約6.9kb)の作成平滑末
端化DNA40ng(2μl)とPvuII−Eco4
7III断片のDNA200ng(4μl)にTaka
ra ligation kit A液48μl
を加え、よく撹拌した後、B液6μlを加え、16℃で
4時間インキユベートした。 この溶液を用いE.coliHB101株を形質転換し
、LB寒天培地(50μg/mlアンピシリン、1.5
%寒天を含む)にプレートしてコロニーを得た。得られ
たコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図を解
析することにより目的のプラスミドpBAX18を保持
するコロニーをスクリーニングした。スクリーニングし
たコロニーを45mlの2YT液体培地(100μg/
mlのアンピシリンを含む)で培養し、プラスミドDN
AをSDS−アルカリ法により調製した。
.nidulansシヤトルベクターpBAX18(6
.9kbp)の造成 (1) pBAX18(約6.9kb)の作成平滑末
端化DNA40ng(2μl)とPvuII−Eco4
7III断片のDNA200ng(4μl)にTaka
ra ligation kit A液48μl
を加え、よく撹拌した後、B液6μlを加え、16℃で
4時間インキユベートした。 この溶液を用いE.coliHB101株を形質転換し
、LB寒天培地(50μg/mlアンピシリン、1.5
%寒天を含む)にプレートしてコロニーを得た。得られ
たコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図を解
析することにより目的のプラスミドpBAX18を保持
するコロニーをスクリーニングした。スクリーニングし
たコロニーを45mlの2YT液体培地(100μg/
mlのアンピシリンを含む)で培養し、プラスミドDN
AをSDS−アルカリ法により調製した。
【0083】(2) pBAX19(約6.4kb)
の作成 上記(1)で調製したpBAX18DNA溶液5μl(
2.5μg)に10×M buffer 5μl、
PvuII(宝酒造(株)社製)2.5μl(30un
its)及び滅菌水37.5μlを加え、37℃で3時
間インキユベートした。この反応液2μl(100ng
DNA)にTE2μl及びTakara lig
ation A液16μlを加えよく撹拌した後、T
akara ligation kit B液4
μlを加え、16℃で10分間インキユベートしたるこ
の溶液を用いE.coli HB101株を形質転換
し、LB寒天培地(50μg/mlアンピシリン、1.
5%寒天を含む)にプレートしてコロニーを得た。得ら
れたコロニーからプラスミド(pBAX19)を保持し
ているコロニーをスクリーニングした。スクリーニング
したコロニーを200mlの2YT液体培地(100μ
g/mlアンピシリンを含む)で培養し、プラスミドD
NAをSDS−アルカリ法により大量に調製した。
の作成 上記(1)で調製したpBAX18DNA溶液5μl(
2.5μg)に10×M buffer 5μl、
PvuII(宝酒造(株)社製)2.5μl(30un
its)及び滅菌水37.5μlを加え、37℃で3時
間インキユベートした。この反応液2μl(100ng
DNA)にTE2μl及びTakara lig
ation A液16μlを加えよく撹拌した後、T
akara ligation kit B液4
μlを加え、16℃で10分間インキユベートしたるこ
の溶液を用いE.coli HB101株を形質転換
し、LB寒天培地(50μg/mlアンピシリン、1.
5%寒天を含む)にプレートしてコロニーを得た。得ら
れたコロニーからプラスミド(pBAX19)を保持し
ているコロニーをスクリーニングした。スクリーニング
したコロニーを200mlの2YT液体培地(100μ
g/mlアンピシリンを含む)で培養し、プラスミドD
NAをSDS−アルカリ法により大量に調製した。
【0084】(3) pBAX20(約5.8kb)
の作成 前記(IV−3)で調製したBamHI−XhoI(平
滑末端化)DNA断片1μg(4μl)に10×M
buffer 2μl、PvuII 1μl(12
units)及び滅菌水13μl)を加え、37℃で3
時間インキユベートした。この反応液2μl(100n
g)に(2)で調製したPvuII−Eco47DNA
断片100ng(2μl)及びTakara lig
ation kit A液16μlを加え、よく撹
拌した後、さらに、B液4μlを加え、16℃で2時間
インキユベートした。反応後、この溶液を用いてE.c
oli HB101株を形質転し、LB寒天培地(5
0μg/mlアンピシリン、1.5%寒天を含む)にプ
レートしてコロニーを得た。得られたコロニーから目的
のプラスミド(pBAX20)を保持しているコロニー
をスクリーニングし、200mlの2YT液体培地(1
00μg/mlアンピシリンを含む)で培養し、プラス
ミドDNAをSDS−アルカリ法により調製した。
の作成 前記(IV−3)で調製したBamHI−XhoI(平
滑末端化)DNA断片1μg(4μl)に10×M
buffer 2μl、PvuII 1μl(12
units)及び滅菌水13μl)を加え、37℃で3
時間インキユベートした。この反応液2μl(100n
g)に(2)で調製したPvuII−Eco47DNA
断片100ng(2μl)及びTakara lig
ation kit A液16μlを加え、よく撹
拌した後、さらに、B液4μlを加え、16℃で2時間
インキユベートした。反応後、この溶液を用いてE.c
oli HB101株を形質転し、LB寒天培地(5
0μg/mlアンピシリン、1.5%寒天を含む)にプ
レートしてコロニーを得た。得られたコロニーから目的
のプラスミド(pBAX20)を保持しているコロニー
をスクリーニングし、200mlの2YT液体培地(1
00μg/mlアンピシリンを含む)で培養し、プラス
ミドDNAをSDS−アルカリ法により調製した。
【0085】(IV−5) hSOD遺伝子発現用ベ
クターのクローニング (1) pBAX18のEcoRI消化、アルカリフ
オスフアターゼ(AP)処理 pBAX18DNA10μg(20μl)に5×Eco
RI buffer40μl、EcoRI 120
units(10μl)および滅菌130μlを加え2
00μlとしたエンペンドルフチユーブ2本を用意した
。これらのチユーブを37℃で3時間インキユベートし
た後、DNAをGenecleanにより精製し、10
0μlの0.1M Tris−HCl(pH8.0)
に溶解した。この溶液に10μlのアルカリフオスフア
ターゼ溶液を加え37℃、1時間インキユベートした後
、さらに10μlのアルカリフオスフアターゼ溶液を加
え65℃で30分間インキユベートした。反応後、フエ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿してDNA
を回収した。
クターのクローニング (1) pBAX18のEcoRI消化、アルカリフ
オスフアターゼ(AP)処理 pBAX18DNA10μg(20μl)に5×Eco
RI buffer40μl、EcoRI 120
units(10μl)および滅菌130μlを加え2
00μlとしたエンペンドルフチユーブ2本を用意した
。これらのチユーブを37℃で3時間インキユベートし
た後、DNAをGenecleanにより精製し、10
0μlの0.1M Tris−HCl(pH8.0)
に溶解した。この溶液に10μlのアルカリフオスフア
ターゼ溶液を加え37℃、1時間インキユベートした後
、さらに10μlのアルカリフオスフアターゼ溶液を加
え65℃で30分間インキユベートした。反応後、フエ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿してDNA
を回収した。
【0086】(2) hSODオペロンとpBAX1
8(EcoRI、AP処理)の連結、大量調製前記(I
II−4)で調製した4つのhSODオペロン(約1.
2kbp)0.25μg(1μl)にEcoRI、AP
処理したpBAX18 0.5μg(1μl)をそれ
ぞれに加え、Takara ligationkit
を用いてligationさせた。これらligati
on溶液を用いE. coli HB101株をそれぞ
れ形質転換し、それぞれLB寒天培地(50μg/ml
アンピシリンを含む)にプレートしてコロニーを得た。 得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地
図を解析することにより目的の各々のプラスミド(pB
AXSOD6、pBAXSOD7、pBAXSOD8、
pBAXSOD9、pBAXSOD6−4、pBAXS
OD7−4及びpBAXSOD8−4)を保持するコロ
ニーをスクリーニングした。スクリーニングした各々の
コロニーを50mlのLB液体培地(100μg/ml
アンピシリンを含む)で培養し、プラスミドDNAをS
DS−アルカリ法により調製した。
8(EcoRI、AP処理)の連結、大量調製前記(I
II−4)で調製した4つのhSODオペロン(約1.
2kbp)0.25μg(1μl)にEcoRI、AP
処理したpBAX18 0.5μg(1μl)をそれ
ぞれに加え、Takara ligationkit
を用いてligationさせた。これらligati
on溶液を用いE. coli HB101株をそれぞ
れ形質転換し、それぞれLB寒天培地(50μg/ml
アンピシリンを含む)にプレートしてコロニーを得た。 得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地
図を解析することにより目的の各々のプラスミド(pB
AXSOD6、pBAXSOD7、pBAXSOD8、
pBAXSOD9、pBAXSOD6−4、pBAXS
OD7−4及びpBAXSOD8−4)を保持するコロ
ニーをスクリーニングした。スクリーニングした各々の
コロニーを50mlのLB液体培地(100μg/ml
アンピシリンを含む)で培養し、プラスミドDNAをS
DS−アルカリ法により調製した。
【0087】(3) pBAS18のEcoRI消化
、アルカリフオスフアターゼ(AP)処理pBAS18
DNA18μg(30μl)に5×EcoRI bu
ffer40μl、EcoRI 12units(1
0μl)および滅菌水120μlを加え200μlとし
たエツペンドルフチユーブを37℃で3時間インキユベ
ートした。反応後、フエノール−クロロホルム処理、ク
ロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して回収し
た。回収したDNAを100μlの0.1M Tri
s−HCl(pH8.0)に溶解し、10μlのアルカ
リフオスフアターゼ溶液(1units/10μl)を
加え、37℃で1時間インキユベートした。1時間後、
10μlのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、65
℃で30分間インキユベートした。反応後、フエノール
−クロロホルム、クロロホルム処理、エタノール沈殿し
てDNAを精製・回収した。
、アルカリフオスフアターゼ(AP)処理pBAS18
DNA18μg(30μl)に5×EcoRI bu
ffer40μl、EcoRI 12units(1
0μl)および滅菌水120μlを加え200μlとし
たエツペンドルフチユーブを37℃で3時間インキユベ
ートした。反応後、フエノール−クロロホルム処理、ク
ロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して回収し
た。回収したDNAを100μlの0.1M Tri
s−HCl(pH8.0)に溶解し、10μlのアルカ
リフオスフアターゼ溶液(1units/10μl)を
加え、37℃で1時間インキユベートした。1時間後、
10μlのアルカリフオスフアターゼ溶液を加え、65
℃で30分間インキユベートした。反応後、フエノール
−クロロホルム、クロロホルム処理、エタノール沈殿し
てDNAを精製・回収した。
【0088】(4) hSODオペロンとpBAS1
8(EcoRI、AP処理)の連結、大量調製前記(I
II−4)で調製した4つのhSODオペロン(約1.
2kb)それぞれ0.25μg(1μg)にEcoRI
、AP処理したpBAS18 1.5μg(2μl)
をそれぞれ加え、Takara ligation k
itを用いてligationさせた。これらの反応液
を用いE.coli HB101株をそれぞれ形質転換
し、それぞれLB寒天培地(50μg/mlアンピシリ
ン−1.5%寒天を含む)にプレートしてコロニーを得
た。得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵
素地図を解析することにより目的のプラスミド(pBA
SOD6、pBASOD7、pBASSOD8、pBA
SOD9)を保持するコロニーをスクリーニングした。 スクリーニングした各々のコロニーを200mlの2Y
T液体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)で
培養し、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法を用い
て調製した。
8(EcoRI、AP処理)の連結、大量調製前記(I
II−4)で調製した4つのhSODオペロン(約1.
2kb)それぞれ0.25μg(1μg)にEcoRI
、AP処理したpBAS18 1.5μg(2μl)
をそれぞれ加え、Takara ligation k
itを用いてligationさせた。これらの反応液
を用いE.coli HB101株をそれぞれ形質転換
し、それぞれLB寒天培地(50μg/mlアンピシリ
ン−1.5%寒天を含む)にプレートしてコロニーを得
た。得られたコロニーからプラスミドを調製し、制限酵
素地図を解析することにより目的のプラスミド(pBA
SOD6、pBASOD7、pBASSOD8、pBA
SOD9)を保持するコロニーをスクリーニングした。 スクリーニングした各々のコロニーを200mlの2Y
T液体培地(100μg/mlアンピシリンを含む)で
培養し、プラスミドDNAをSDS−アルカリ法を用い
て調製した。
【0089】V.hSOD遺伝子のラン藻Anacys
tis nidulans6301、R2による発現(
V−1) A. nidulans6301(Syn
echococcus PCC6301)およびR2株
(Synechococcus PCC7942)の形
質転換 100mlのBG−11液体培地で1〜5日間培養した
細胞を8000rpmで5分間遠心して集め、10ml
の新鮮な液体培地に懸濁した(108〜109cell
s/ml)。この細胞懸濁液を1mlずつポリブロピレ
ンチユーブ(Falcon2059)に分注し、それぞ
れのチユーブに調製したプラスミドDNAを0.1〜1
0μgの濃度で加えた。 これらのチユーブをそれぞれアルミホイルでおおい、3
0℃で一晩培養した後、おおつていたアルミホイルをは
ずし、光照射下(光源:白色光蛍光灯;1000〜20
00ルクス)、30℃でさらに6時間培養した。これら
の細胞懸濁液から100〜500μl取り、BG−11
寒天培地(1mMチオ硫酸ナトリウム、1〜5μg/m
lアンピシリン、1.5%寒天を含む)にプレートした
。 これらのプレートを光照射下(光源;白色光蛍光灯;2
000〜3000ルクス)で4〜10日間培養した。
tis nidulans6301、R2による発現(
V−1) A. nidulans6301(Syn
echococcus PCC6301)およびR2株
(Synechococcus PCC7942)の形
質転換 100mlのBG−11液体培地で1〜5日間培養した
細胞を8000rpmで5分間遠心して集め、10ml
の新鮮な液体培地に懸濁した(108〜109cell
s/ml)。この細胞懸濁液を1mlずつポリブロピレ
ンチユーブ(Falcon2059)に分注し、それぞ
れのチユーブに調製したプラスミドDNAを0.1〜1
0μgの濃度で加えた。 これらのチユーブをそれぞれアルミホイルでおおい、3
0℃で一晩培養した後、おおつていたアルミホイルをは
ずし、光照射下(光源:白色光蛍光灯;1000〜20
00ルクス)、30℃でさらに6時間培養した。これら
の細胞懸濁液から100〜500μl取り、BG−11
寒天培地(1mMチオ硫酸ナトリウム、1〜5μg/m
lアンピシリン、1.5%寒天を含む)にプレートした
。 これらのプレートを光照射下(光源;白色光蛍光灯;2
000〜3000ルクス)で4〜10日間培養した。
【0090】(V−2)培養
このようにして得られたコロニーを2mlのBG−11
(10μg/mlアンピシリンを含む)液体培地に移し
、光照射下(光源:白色光蛍光灯;2000〜3000
ルクス)で10日間培養した。次に、これらの培養液を
100mlのBG−11(10μg/mlアンピシリン
を含む)液体培地に移し、光照射下(2000〜300
0ルクス)で20日間培養した。さらに、これらの培養
液をそれぞれ10mlずつとり、100mlのBG−1
1(50μg/mlアンピシリンを含む)液体培地にそ
れぞれ移し、光照射下で20日間培養した。細胞を80
00rpm、4℃で10分間遠心して集め、1mM
Hepes buffer(pH7.0)に再懸濁し、
遠心することによつて洗浄した。洗浄後、細胞は実験使
用時まで−20℃で保存した。
(10μg/mlアンピシリンを含む)液体培地に移し
、光照射下(光源:白色光蛍光灯;2000〜3000
ルクス)で10日間培養した。次に、これらの培養液を
100mlのBG−11(10μg/mlアンピシリン
を含む)液体培地に移し、光照射下(2000〜300
0ルクス)で20日間培養した。さらに、これらの培養
液をそれぞれ10mlずつとり、100mlのBG−1
1(50μg/mlアンピシリンを含む)液体培地にそ
れぞれ移し、光照射下で20日間培養した。細胞を80
00rpm、4℃で10分間遠心して集め、1mM
Hepes buffer(pH7.0)に再懸濁し、
遠心することによつて洗浄した。洗浄後、細胞は実験使
用時まで−20℃で保存した。
【0091】(V−2)hSODの検出(1) h−
SOD活性染色 リボフラビンを加えた光重合法[蛋白質核酸酵素11:
744(1966)]で作成したアクリルアミドゲルを
用い、電気泳動を行った。泳動後、ゲルを50mMリン
酸カリウム(pH7.8)−0.5mM EDTAで
2〜3回(5分)洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム
(NBT)溶液(2.5mM NBT、50mMリン
酸カリウム、0.5mM EDTA、pH7.8)に
7分間浸した。次にリボフラビン溶液(100μMリボ
フラビン、30mMテトラメチルエチレンジアミン、5
0mMリン酸カリウム、0.5mMEDTA、pH7.
8)に浸し、ゲル中のコントラストができるまで白色光
中で発色させた。その結果を9図に示す。この図におい
てSOD活性のある部分は発色せず、他の部分は紫とな
るが、これからわかるように、アナキステイス・ニデユ
ランス自身が持つFe−SOD以外に、形質転換体では
hSODの活性が検出された。
SOD活性染色 リボフラビンを加えた光重合法[蛋白質核酸酵素11:
744(1966)]で作成したアクリルアミドゲルを
用い、電気泳動を行った。泳動後、ゲルを50mMリン
酸カリウム(pH7.8)−0.5mM EDTAで
2〜3回(5分)洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム
(NBT)溶液(2.5mM NBT、50mMリン
酸カリウム、0.5mM EDTA、pH7.8)に
7分間浸した。次にリボフラビン溶液(100μMリボ
フラビン、30mMテトラメチルエチレンジアミン、5
0mMリン酸カリウム、0.5mMEDTA、pH7.
8)に浸し、ゲル中のコントラストができるまで白色光
中で発色させた。その結果を9図に示す。この図におい
てSOD活性のある部分は発色せず、他の部分は紫とな
るが、これからわかるように、アナキステイス・ニデユ
ランス自身が持つFe−SOD以外に、形質転換体では
hSODの活性が検出された。
【0092】(2) 抗ヒト−SOD抗体による検出
(2−1) ウエスタンブロツテイング20%SDS
−ポリアクリルアミドゲルを用いて、Laemmliら
(Nature、237、680(1970))の条件
下、還元状態で電気泳動を行った。泳動後、ゲル中のタ
ンバク質をニトロセルロース膜(アマシヤム社製、Hy
bond(C)に電気的に移した。この膜を0.3%
H2O2を含む50%メタノールに20分間浸し、内
性のペルオキシダーゼを失活させた後、5%スキムミル
ク、0.1% Tween20を含むTBS(20m
M Tris−HCl、0.9% NaCl、pH
7.4)に37℃で2時間浸した(ブロツキング)。ブ
ロツキング処理した膜を洗浄液(0.05% Twe
en20を含むTBS)で5分間洗い、1/1000抗
体ヒト−SOD(ヤギIgG、Binding Sit
e社製)、0.1% Tween20を含むTBSに
37℃で2時間インキユベートした。膜を洗浄液で20
分間(5分×4)洗浄した後、10mgジアミノベンチ
ジン(DAB)及び15μlの32% H2O2を含
む40mlの0.1M Tris−HCl(pH7.
4)で染色させた。
(2−1) ウエスタンブロツテイング20%SDS
−ポリアクリルアミドゲルを用いて、Laemmliら
(Nature、237、680(1970))の条件
下、還元状態で電気泳動を行った。泳動後、ゲル中のタ
ンバク質をニトロセルロース膜(アマシヤム社製、Hy
bond(C)に電気的に移した。この膜を0.3%
H2O2を含む50%メタノールに20分間浸し、内
性のペルオキシダーゼを失活させた後、5%スキムミル
ク、0.1% Tween20を含むTBS(20m
M Tris−HCl、0.9% NaCl、pH
7.4)に37℃で2時間浸した(ブロツキング)。ブ
ロツキング処理した膜を洗浄液(0.05% Twe
en20を含むTBS)で5分間洗い、1/1000抗
体ヒト−SOD(ヤギIgG、Binding Sit
e社製)、0.1% Tween20を含むTBSに
37℃で2時間インキユベートした。膜を洗浄液で20
分間(5分×4)洗浄した後、10mgジアミノベンチ
ジン(DAB)及び15μlの32% H2O2を含
む40mlの0.1M Tris−HCl(pH7.
4)で染色させた。
【0093】その結果、形質転換体から抽出した抽出液
を泳動したレーン上に、標準試料のhSOD(シグマ社
製)と同じ位置に、褐色に染色されたバンドが検出され
た(図10)。
を泳動したレーン上に、標準試料のhSOD(シグマ社
製)と同じ位置に、褐色に染色されたバンドが検出され
た(図10)。
【0094】(2−2) オクテローニー法(免疫学
実験入門p74〜77、学会出版センター刊)1.2%
agarose溶液(10mMリン酸buffer
(pH7.2)、0.15MNaCl及び0.1%
NaN3を含む)をシヤーレ(Falcon1029)
に厚さ2〜3mmになるように固め、適当な位置に穴を
開ける。中央の穴に抗ヒト−SOD抗体を10μl、そ
の回りの穴には形質転換体の抽出液(10μl)、コン
トロールとしてA. nidulans R2(非形質
転換体)の抽出液(40μl)及び標準試料のhSOD
を入れ、4℃で一晩インキユベートした。インキユベー
ト後、寒天プレートをシヤーレより取り出し、PBS(
10mMリン酸buffer、pH7.2、0.15M
NaCl)に浸し、十分に除タンパクした(PBS
を数回交換、2〜3日間)。このプレートを0.5%ア
ミドプラツク溶液(90mlメタノール、10ml氷酢
酸)に浸し、染色した。その結果、抗ヒト−SOD抗体
と標準試料のhSOD、形質転換体の抽出液(6−4、
8−4)との間に沈降線が形成されるのがわかつた。さ
らに、その沈降線は一本の線(コの字)として現われ、
形質転換体中に標準試料のhSODと同じ抗原(ヒト−
SOD)がつくられていることが確認された(図11)
。
実験入門p74〜77、学会出版センター刊)1.2%
agarose溶液(10mMリン酸buffer
(pH7.2)、0.15MNaCl及び0.1%
NaN3を含む)をシヤーレ(Falcon1029)
に厚さ2〜3mmになるように固め、適当な位置に穴を
開ける。中央の穴に抗ヒト−SOD抗体を10μl、そ
の回りの穴には形質転換体の抽出液(10μl)、コン
トロールとしてA. nidulans R2(非形質
転換体)の抽出液(40μl)及び標準試料のhSOD
を入れ、4℃で一晩インキユベートした。インキユベー
ト後、寒天プレートをシヤーレより取り出し、PBS(
10mMリン酸buffer、pH7.2、0.15M
NaCl)に浸し、十分に除タンパクした(PBS
を数回交換、2〜3日間)。このプレートを0.5%ア
ミドプラツク溶液(90mlメタノール、10ml氷酢
酸)に浸し、染色した。その結果、抗ヒト−SOD抗体
と標準試料のhSOD、形質転換体の抽出液(6−4、
8−4)との間に沈降線が形成されるのがわかつた。さ
らに、その沈降線は一本の線(コの字)として現われ、
形質転換体中に標準試料のhSODと同じ抗原(ヒト−
SOD)がつくられていることが確認された(図11)
。
【0095】(3) h−SOD活性の検出ラン藻ア
ナキステイス・ニデユランスは内性のSOD(Fe−S
OD)をもつているが、hSOD(Cu・Zn−SOD
)とは1mM KCNによつて阻害されるかどうかに
よつて活性を区別して測定することが可能である。光学
セル(1ml用)に50mMリン酸カリウム(pH7.
8)、0.1mM EDTA、0.1mMキサンチン
、10μMチトクロムC(ウマ心臓Type III
シグマ社製)及びサンプル(SOD)を入れ、全容を9
80μlとする。これにキサンチン酸化酵素(ベーリン
ガーマンハイム社製)を20μl加え、反応を開始し、
チトクロームC還元を550nmの吸光度増加の初速(
30〜60秒)を求め、この値をνとする。SODサン
プルを加えないときのチトクロームC還元速度をvとし
た。この条件下でのチトクロームC還元を50%阻害す
るSODを1/3unitとし、(v/ν−1)からサ
ンプル中の総unit数を求めた(植物酵素・蛋白質研
究法p373浅田浩二、共立出版)。またνを測定した
反応液に100mM KCl(10μl)を加え、チ
トクロームC還元速度ν’を求め、unit数を求めた
(v/ν’−1)。アナキステイス・ニデユランスの細
胞中に生成されたhSODの活性{(v/ν−1)−(
v/ν’−1)}を求めた。
ナキステイス・ニデユランスは内性のSOD(Fe−S
OD)をもつているが、hSOD(Cu・Zn−SOD
)とは1mM KCNによつて阻害されるかどうかに
よつて活性を区別して測定することが可能である。光学
セル(1ml用)に50mMリン酸カリウム(pH7.
8)、0.1mM EDTA、0.1mMキサンチン
、10μMチトクロムC(ウマ心臓Type III
シグマ社製)及びサンプル(SOD)を入れ、全容を9
80μlとする。これにキサンチン酸化酵素(ベーリン
ガーマンハイム社製)を20μl加え、反応を開始し、
チトクロームC還元を550nmの吸光度増加の初速(
30〜60秒)を求め、この値をνとする。SODサン
プルを加えないときのチトクロームC還元速度をvとし
た。この条件下でのチトクロームC還元を50%阻害す
るSODを1/3unitとし、(v/ν−1)からサ
ンプル中の総unit数を求めた(植物酵素・蛋白質研
究法p373浅田浩二、共立出版)。またνを測定した
反応液に100mM KCl(10μl)を加え、チ
トクロームC還元速度ν’を求め、unit数を求めた
(v/ν’−1)。アナキステイス・ニデユランスの細
胞中に生成されたhSODの活性{(v/ν−1)−(
v/ν’−1)}を求めた。
【0096】その結果、形質転換体から得られた粗抽出
液の比活性(1A280unitあたりの活性)は0.
7〜12units/A280という高い値を示した(
表1)。
液の比活性(1A280unitあたりの活性)は0.
7〜12units/A280という高い値を示した(
表1)。
【0097】
【表1】
また、これらの比活性は基となるベクターの種類及
びSD様配列とATGと間の塩基数によつて強く影響を
受け、量も比活性が高かったのはpBAXSOD8(p
BAX18を基にし、SD〜ATG間の塩基数が8塩基
)であつた。
びSD様配列とATGと間の塩基数によつて強く影響を
受け、量も比活性が高かったのはpBAXSOD8(p
BAX18を基にし、SD〜ATG間の塩基数が8塩基
)であつた。
【図1】図1はアナキステイス・ニデユランスRuBi
sCO発現調節領域(EcoRI−PstI断片)の調
製のための工程図である。
sCO発現調節領域(EcoRI−PstI断片)の調
製のための工程図である。
【図2】図2はSD様配列を含む領域(PstI−Hi
ndIII断片)を合成するために化学合成した10個
のオリゴヌクレオチドの塩基配列である。
ndIII断片)を合成するために化学合成した10個
のオリゴヌクレオチドの塩基配列である。
【図3】SD様配列を含む領域(PstI−HindI
II断片)の調製のための工程図である。
II断片)の調製のための工程図である。
【図4】RuBisCO発現調節領域(EcoRI−H
indIII断片)の調製のための工程図である。
indIII断片)の調製のための工程図である。
【図5】RuBisCO転写終止領の調製およびpuC
−h SODtプラスミドの構築図である。
−h SODtプラスミドの構築図である。
【図6】hSODオペロンの造成図である。
【図7】hSODオペロン(SOD7)の塩基配列であ
る。
る。
【図8】ベクタープラスミド pBAX18、19お
よび20の構築図である。
よび20の構築図である。
【図9】SODの活性染色の結果を示す図である。
【図10】ウエスタンブロツテングの結果を示す図であ
る。
る。
【図11】オクテロニーの結果を示す図である。
Claims (8)
- 【請求項1】 生理活性を有するポリペプチドをコー
ドする構造遺伝子を含有する担体DNAでラン藻細胞を
形質転換することにより、ラン藻細胞で該ポリペプチド
を発現させる方法において、該担体DNAとして、生理
活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子と、
該構造遺伝子の上流側に位置するアナキステイス・ニジ
ユランスのRuBisCO遺伝子の転写開始領域と、該
構造遺伝子の下流側に位置する該RuBisCO遺伝子
の転写終止領域を含有する担体DNAを使用することを
特徴とするラン藻細胞での生理活性を有するポリペプチ
ドの発現方法。 - 【請求項2】 該担体DNAが、生理活性を有するポ
リペプチドをコードする構造遺伝子と、該構造遺伝子の
上流側に位置するアナキステイス・ニジユランスのRu
BisCO遺伝子の転写開始領域と、該構造遺伝子の下
流側に位置する該RuBisCO遺伝子転写終止領域か
らなるオペロンが導入されたベクタープラスミドである
請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 ベクタープラスミドがプラスミドpB
AS18、pBAX18、pBAX19又はpBAX2
0である請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 生理活性を有するポリペプチドがヒト
−SODと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドである請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 ヒト−SODと実質的に同一のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするヒト−SOD
構造遺伝子と、その上流側に位置するアナキステイス・
ニジユランスのRuBisCO遺伝子の転写開始領域と
、該ヒト−SOD構造遺伝子の下流側に位置する該Ru
BisCO遺伝子の転写終止領域からなるヒト−SOD
オペロン。 - 【請求項6】 請求項2記載のヒト−SODオペロン
が導入されたベクタープラスミドpBAS18又はpB
AX18よりなるヒト−SOD発現ベクター。 - 【請求項7】 請求項6記載のヒト−SOD発現ベク
ターで形質転換されたラン藻細胞。 - 【請求項8】 請求項7記載のラン藻細胞を培地で培
養し、その培養物からヒト−SODを採取することを特
徴とするヒト−SODの製造方法。
Priority Applications (14)
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---|---|---|---|
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IL10118292A IL101182A (en) | 1991-03-13 | 1992-03-09 | Process for the expression of polypeptides |
CA002082802A CA2082802C (en) | 1991-03-13 | 1992-03-11 | Method for expressing polypeptides in cyanobacteria |
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AT92906714T ATE141951T1 (de) | 1991-03-13 | 1992-03-11 | Verfahren zur expression von polypeptiden |
PCT/JP1992/000289 WO1992016641A1 (en) | 1991-03-13 | 1992-03-11 | Process for expressing polypeptide |
KR1019920702851A KR0163062B1 (ko) | 1991-03-13 | 1992-03-11 | 폴리펩타이드의 형질발현 방법 |
TW081101836A TW321686B (ja) | 1991-03-13 | 1992-03-11 | |
AU15659/92A AU650531B2 (en) | 1991-03-13 | 1992-03-11 | Process for expressing polypeptide |
DE69213145T DE69213145T2 (de) | 1991-03-13 | 1992-03-11 | Verfahren zur expression von polypeptiden |
PT100236A PT100236B (pt) | 1991-03-13 | 1992-03-12 | Processo para exprimir polipeptidos em celulas de algas azuis-esverdeadas |
OA60301A OA09713A (en) | 1991-03-13 | 1992-11-12 | A method for expressing polypeptides |
FI925143A FI925143A (fi) | 1991-03-13 | 1992-11-12 | Foerfarande foer expression av polypeptider |
US08/368,236 US5804408A (en) | 1991-03-13 | 1995-01-03 | Expression of human SOD in blue green algae |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3073905A JPH0767393B2 (ja) | 1991-03-13 | 1991-03-13 | ポリペプチドの発現方法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04330294A true JPH04330294A (ja) | 1992-11-18 |
JPH0767393B2 JPH0767393B2 (ja) | 1995-07-26 |
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ID=13531673
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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Country | Link |
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JP (1) | JPH0767393B2 (ja) |
KR (1) | KR0163062B1 (ja) |
AT (1) | ATE141951T1 (ja) |
AU (1) | AU650531B2 (ja) |
CA (1) | CA2082802C (ja) |
DE (1) | DE69213145T2 (ja) |
FI (1) | FI925143A (ja) |
IL (1) | IL101182A (ja) |
OA (1) | OA09713A (ja) |
PT (1) | PT100236B (ja) |
TW (1) | TW321686B (ja) |
WO (1) | WO1992016641A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06253820A (ja) * | 1993-02-26 | 1994-09-13 | Hideo Fukuda | 細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むdna断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の形質転換体と、その形質転換体を利用したエチレン製造方法 |
WO1998022590A1 (fr) * | 1996-11-19 | 1998-05-28 | Hagiwara, Yoshihide | Procede pour preparer des molecules d'anticorps |
JP2013198473A (ja) * | 2011-10-18 | 2013-10-03 | Ibaraki Univ | 自己溶菌能を有するシアノバクテリアを用いたバイオ燃料等有用物質の製造方法 |
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---|---|---|---|---|
JP2574549B2 (ja) * | 1991-03-08 | 1997-01-22 | 萩原 義秀 | 新規プラスミド |
FR2706465B1 (fr) * | 1993-06-11 | 1995-08-25 | Heliosynthese Sa | Procédé de production et d'extraction de superoxyde-dismutases thermostables à partir d'une culture de micro-organismes photosynthétiques. |
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---|---|---|---|---|
CA1216531A (en) * | 1983-03-15 | 1987-01-13 | Neil A. Straus | Cloning vectors for cyanobacterium |
EP0138111B1 (en) * | 1983-10-03 | 1991-11-21 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms |
US5516693A (en) * | 1987-03-04 | 1996-05-14 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Hybrid gene incorporating a DNA fragment containing a gene coding for an insecticidal protein, plasmids, transformed cyanobacteria expressing such protein and method for use as a biocontrol agent |
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1991
- 1991-03-13 JP JP3073905A patent/JPH0767393B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-03-09 IL IL10118292A patent/IL101182A/en not_active IP Right Cessation
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- 1992-03-11 KR KR1019920702851A patent/KR0163062B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-03-11 DE DE69213145T patent/DE69213145T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-11 WO PCT/JP1992/000289 patent/WO1992016641A1/ja active IP Right Grant
- 1992-03-11 AT AT92906714T patent/ATE141951T1/de not_active IP Right Cessation
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Non-Patent Citations (3)
Title |
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NUCLEIC ACIDS RESEARCH=1985 * |
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JPH06253820A (ja) * | 1993-02-26 | 1994-09-13 | Hideo Fukuda | 細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含むdna断片を含有するベクターで形質転換させたらん藻の形質転換体と、その形質転換体を利用したエチレン製造方法 |
WO1998022590A1 (fr) * | 1996-11-19 | 1998-05-28 | Hagiwara, Yoshihide | Procede pour preparer des molecules d'anticorps |
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