DK175537B1 - Ekspressionsplasmider indeholdende deo-P1-P2-promotoren, og bakterielle værter, der indeholder plasmiderne - Google Patents

Description

i DK 175537 B1

Ekspressionsvektorer, herunder ekspressionsplasmider, anvendes kommercielt til at fremstille genprodukter på en mere effektiv måde end ved de tidligere tilgængelige metoder såsom ekstraktion fra naturlige kilder og organisk syntese.

Escherichia coli anvendes i vid udstrækning som en vært, i hvilken sådanne 5 genprodukter kan fremstilles under anvendelse af ekspressionsplasmider. En omfattende omtale af ekspressionsvektorer findes i P.H. Pouwels, B.E. Enger-Valk og W.J. Brammer, Cloning Vectors, Elsevier, pubis (1985).

Et antal kontrolmekanismer, som regulerer genekspressionsniveauet i prokaryote 10 vektorer, er beskrevet. Den regulerende proces kan virke på det transkriptionelle eller translationelle niveau. På det transkriptionelle niveau er genekspressionskontrol associeret med inhibering eller stimulering af mRNA-syntese.

Én metode til at forøge ekspressionsniveauet for et ønsket genprodukt er at 15 anvende en vektor, i hvilken det gen, der skal udtrykkes, er under kontrol af en stærk promotor, og dette er den måde, der overvejende er blevet anvendt i den bioteknologiske industri til at udtrykke genprodukter i store mængder.

Det transkriptionelle kontrolsystem består af en DNA-sekvens, der er indeholdt i 20 eller beliggende ved siden af en promotor, der er i stand til at binde et repressor-molekyle. Når repressormolekylet binder til en specifik DNA-streng, forhindres transkription af DNA til mRNA. For at starte transkription af DNA til mRNA skal repressormolekylet fjernes eller frigives fra sit bindingssted, og dette opnås ved en specifik kemisk eller fysisk påvirkning. I mange tilfælde af transkriptionel kontrol er 25 en yderligere komponent nødvendig, for at transkriptionen kan forløbe med sin højeste kapacitet. Et eksempel på en sådan komponent er cyklisk AMP-receptor-protein (CRP), som er involveret i reguleringen af mange gener i kataboliske reaktionsveje. 1 35

Ekspressionsplasmider, der indeholder de regulerbare promotorer λ PL, trp eller lac, har været meget anvendt inden for teknikken. Andre promotorer, der har været anvendt, omfatter de regulerbare rec A- og λ PR-promotorer, de konstitutive ampog lpp-promotorer og kunstige promotorer, der er skabt ved fusion af 2 forskellige DNA-sekvenser eller ved kemisk syntese af DNA-sekvenser.

I DK 175537 B1 I

I I

I Escherichia coli deo-operonet er blevet undersøgt af Hammer-Jesperson og I

medarbejdere. [K. Hammer-Jesperson og A. Munch-Peterson, Molec. gen. Genet. I

I 137: 327-335 (1975); R. S. Buxton, H. Albrechtsen og K. Hammer-Jesperson, J. I

I Mol. Biol. 114: 287-300 (1977); R. S. Buxton, K. Hammer-Jesperson og T. D. I

I 5 Hansen, J. Bacteriol. 136: 668-681 (1978); P. Valentin-Hansen og K. Hammer- I

I Jesperson, J. Mol. Biol. 133: 1-17 (1979); og P. Valentin-Hansen, H. Aiba og D. - I

I Schumperli, The EMBO Journal 1: 317-322 (1982)). I

I Som illustreret i fig. 20 består deo-operonet af 4 nært beslægtede gener, der koder I

I 10 for enzymer, der er involveret i nudeotid- og deoxynucleotidkatabolisme, nemlig I

I deoxyriboaldolase (deo C), thymidinphosphorylase (deo A), phosphodeoxyribomu- I

I tase (deo B) og purin-nudeotidphosphorylase (deo D). Transkription af alle 4 nært I

I beslægtede deo-gener reguleres ved 2 promotor/—operatorregioner, deo PI og deo I

I P2 (eller PI og P2). Nar transkriptionen af genet kontrolleres af deo PI- og deo P2- I

I 15 promotorerne virkende i tandem, anvendes udtrykket deo PI-P2-promotor eller I

I deo promotor/-operatorregion. I

I Initiering af transkription fra PI er negativt kontrolleret af deo R-repressoren og I

I aktiveres af induceren deoxyribose-5-phosphat. Initiering af transkription fra P2 er I

I 20 negativt kontrolleret af cyt R-repressoren, hvor induceren er cytidin. Aktivering af I

I P2 afhænger af cyklisk AMP/cyklisk AMP-receptorproteinkomplekset, cAMP/CRP, I

I selv om P2 også kan kontrolleres af deo R-repressoren. De 2 distale gener B og C i I

I c/eo-operonet er underkastet en yderligere transkriptionel kontrol: en indre promo- I

I tor/-operatorregion P3, der reguleres af ukendte kontrolproteiner og påvirkes ved I

I 25 inosin- eller guanosininduktion. Deo Pl-P2-promotor/-operatorregionens sekvens I

I kendes, og hele deo Pl-P2-promotor/-operatorregionen er ca. 760 bp lang, idet de I

I 2 promotorer er adskilt med en længde på ca. 600 bp. (P. Valentin-Hansen et al., I

I The EMBO Journal 1: 317-322 (1982)). I

I 30 Genproduktekspression under en deo P2-styret transkription er meget lille i nær- I

I værelse af glucose og meget høj i nærværelse af andre energiproducerende kilder. I

I Transkription, der styres af deo PI, er ikke underkastet glucoseeffekten (katabo- I

I litrepression), og deo PI er også en meget svagere promotor end deo P2. Derfor I

I kan man manipulere genproduktekspression styret af deo PI-promotoren bide ved I

3 DK 175537 B1 eksterne midler og ved at vælge Escherichia coli-ceIler, som ikke har nogen funktionel deo R-repressor.

Hele deo-operonet er blevet klonet fra λ-bakteriofag, der indeholder deo-operonet, 5 og deo-enzymerne er blevet udtrykt i Escherichia co//-værtsceller [M. Fischer og A.

Short, Gene 17: 291-298 (1982)]. Det har vist sig, at enzymaktiviteterne fra bakterier, der indeholder det klonede deo-operon, blev forstærkede 500-50.000 gange i forhold til det niveau, der er fundet i vildtypeceller. Amplifikationsgraden afhænger af værtsgenotype. I værtsceller, der både besidder deo R- og cyt R-repressorer, 10 er ampiifikation af enzymet thymidinphosphorylase ca. 500 gange; i værtsceller, der ikke indeholder nogle funktionelle deo R- og cyt R-repressorer, er thymidin-phosphorylaseamplifikation ca. 50.000 gange.

G. Dandanell og I. K. Hammer, The EMBO Journal 4: 3333-3338 (1985), beskriver 15 transkriptionel fusion af deo PI - og deo P2-promotorfrag-menter til Escherichia coli-galaktokinasegenet. Dandanell et al. undersøgte ekspressionen af galakto-kinase, dvs. et prokaryotisk genprodukt, under kontrol af deo Pl-P2-promotorerne, der var integreret i bakteriekromosomet. I modsætning hertil beskriver den foreliggende opfindelse anvendelsen af deo Pl-P2-promotoren på multikopiplasmider til 20 at styre ekspressionen af eukaryotiske genprodukter.

Dandanell et al. anfører, at λ PL-promotoren er 2-3 gange så stærk som deo P2-promotoren (side 3326, søjle 2). I modsætning hertil nærmer eller overskrider de ekspressionsniveauer, der opnås under anvendelse af de specifikke polypeptider og 25 de særlige regulatoriske elementer ifølge den foreliggende opfindelse den, der opnås under anvendelse af en λ PL-promotor.

Ved at foreslå at λ PL-promotoren er 2-3 gange stærkere end deo P2-promotoren, som igen er stærkere end deo PI-promotoren, viser Dandanell et al. væk fra an-30 vendeisen af deo Pl-P2-promotor som en stærk promotor. Som bemærket ovenfor har nærværende ansøger fundet, at når der anvendes de plasmider ifølge den foreliggende opfindelse, som indeholder deo Pl-P2-promotoren sammen med de andre regulatoriske komponenter, produceres polypeptider i uventede store mængder.

Η Η

I DK 175537 B1 I

I I

I PCT patentpublikationen nr. WO 84 01171, offentliggjort 29. marts 1984, beskri- I

I ver, men ikke på en måde, der gør det muligt at eftergøre anvendelsen af en deo- I

I promotor til udtrykkefse af meget små mængder af det protein, der kontrollerer I

I Escherichia co//'-reptikation, dvs. et ikke-eukaryotisk protein. I

I I

I Plasmider, der udtrykker genprodukter under kontrol af λ PL-promotor, og igen er I

I uafhængig af λ-gener på værtskromosomet, er i nærværende sammenhæng beteg- I

I net som "uafhængige" plasmidekspressionsvektorer. M. Mieschendahl, T. Petri og I

I Urs Hanggi, Biotechnology 4: 802-808 (1986), omhandler fx et uafhængigt plas- I

I 10 mid, i hvilket λ cl-repressorgenet er kontrolleret af tryptophanoperatoren/-promo- I

I toren. Det er imidlertid ikke et temperaturreguleret system.

I M. Zabeau og K. K. Stanley, the EMBP Journal 1: 1217-1224 (1982) placerede I

I genet for en temperatursensitiv cl-repressor på et lavkopiplasmid, som er kompa- I

I 15 tibelt med pBR322-vektorer. Denne løsning kræver imidlertid, at 2 plasmider skal I

I anvendes, og at cl-plasmidet bevares i cellerne ved selektion. I

I A. S. Waldman, E. Haeusslein og G. Milman, J. Biol. Chem. 258: 11571-11575 I

I (1983) klonede genet og den autentiske promotor for en temperatursensitiv cl I

I 20 857-repressor direkte ind på et plasmid. Der blev imidlertid ikke opnået god eks- I

I pression af klonede gener i sådanne konstruktioner på grund af cl-genets ampli- I

I fikation og den medfølgende forøgelse i antallet af cl-molekyler. I disse forsøg I

I udgjorde det klonede genprodukt kun ca. 4% af samlet, opløseligt cellulært I

I protein. I

I 25 I

I Der er ikke nogen steder beskrevet et effektivt temperatursensitivt ekspressions- I

I system, hvor den varmeinducerbare ekspression af gener, der er båret på eks-

I pressionsvektorer, er uafhængig af ekspression af gener pi værtkromosomet. Der H

I er således ingen beskrivelse af effektive, temperatursensitive "uafhængige" plas- I

I 30 midekspressionsvektorer. I

I Den foreliggende opfindelse angår et dobbeltstrenget DNA-plasmid, som efter I introduktion i en egnet Escherichia coli-værtscelle gør værtscellen i stand til at I udvirke ekspression af DNA, der koder for et ønsket, naturligt forekommende

I 35 eukaryotisk polypeptid eller en polypeptidanalog deraf med det naturligt forekom- I

5 DK 175537 B1 mende polypeptids biologiske aktivitet og en amionsyresekvens, som i det væsentlige er den samme som og alligevel forskellig fra den, som det naturligt forekommende polypeptid har, og derved udvirke produktion af polypeptidet eller polypep-tidanalogen, hvilket plasmid i 5'-3’ orden omfatter følgende: 5 a) DNA, som i 5'-3' orden omfatter tandempromotorerne deo PI og deo P2; b) DNA, som omfatter et ribosombindingssted for at gøre mRNA, der transkriberes fra DNA, der koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen, i 10 stand til at binde til ribosomer i værtscellen; c) en ATG startkodon; og d) DNA, der koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen i fase med 15 startkodonen; og som yderligere omfatter en DNA-sekvens, der omfatter et replikationsorigin fra et bakterielt plasmid, der er i stand til autonom replikation i værtscellen, og en DNA-sekvens, som indeholder et gen, der er forbundet med et selekterbart eller 20 identificerbart phenotypisk træk, som giver sig til kende, nir vektoren er til stede i værtscellen.

Hensigtsmæssige naturligt forekommende poiypeptider produceret af plasmiderne ifølge opfindelsen omfatter human kobber/zinksuperoxiddismutase, human 25 mangansuperoxiddismutase, human glutathionperoxidase, humant væksthormon, bovint væksthormon, porcint væksthormon, humant apolipoprotein E eller forskellige domæner af fibronektin. Det vil naturligvis være klart for gennemsnitsfagmanden, at plasmiderne ifølge opfindelsen kan indeholde DNA, der koder for andre ønskede naturligt forekommende poiypeptider og polypeptidanaloger deraf.

30

Opfindelsen angår yderligere værtsplasmidsystemer til fremstilling af et naturligt forekommende eukaryotisk polypeptid eller en polypeptidanalog deraf, hvilke systemer omfatter de forskellige plasmider ifølge opfindelsen i en hensigtsmæssig Escherichia co//'-vært.

35

DK 175537 B1 I

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et naturligt forekom- I

mende polypeptid eller en polypeptidanalog deraf, hvilken fremgangsmåde er ejen- I

dommelig ved, at den omfatter dyrkning af værtsplasmidsystemet ifølge opfindel- I

sen under betingelser, som tillader produktion af polypeptidet eller analogen, og I

5 isolering af det resulterende polypeptid eller den resulterende analog. Foretrukne I

betingelser til fremstilling af de ønskede naturligt forekommende polypeptider og I

polypeptider ifølge opfindelsen er også tilvejebragt. I

Endelig angår den foreliggende opfindelse dobbeltstrengede DNA-plasmider, der I

10 omfatter tandempromotorer deo PI og deo P2 og en AT-rig sekvenstranslations- I

fremmer. Translationsfremmersekvensen forøger produktionsniveauet for poly- I

peptider, der fremstilles af plasmiderne ifølge opfindelsen. I

BESKRIVELSE AF TEGNINGER I

15 I

Restriktionskortene for hvert af de plasmider, der er vist i fig. 1-52, identificerer I

ikke alle de restriktionssteder, der er til stede på hvert plasmid. I nogle tilfælde er I

restriktionssteder vist i én figur, men ikke i en anden. I alle tilfælde er de restrik- I

tionssteder, der er nødvendige for at gøre det muligt for en gennemsnitsfagmand I

20 at udøve opfindelsen, imidlertid vist. De forskellige plasmiders relative størrelser er

ikke anført i målestok, og der kan ikke drages nogen konklusioner fra figurerne, I

hvad angår plasmidernes størrelse. Øeo-promotorerne er blevet mærket deo PI- I

P2, deo PI eller deo P2. I 1 2 3 4 5 6

Alle plasmiderne, der er deponeret i forbindelse med denne ansøgning, undtagen I

2

de, for hvilke det specifikt er angivet på anden måde, er blevet deponeret hos the I

3

American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland 20852, U.S.A. i I

4

overensstemmelse med Budapest-traktaten vedrørende den internationale aner- I

5

kendelse af deponering af mikroorganismer med henblik på patent procedure I

6

("Budapest Treaty"). I

Fig. 1: Konstruktion af pJBF-5401 (kloning af deo P1-P2) I

λ cl 857: DNA indeholdende hele deo-operonet (fremstillet som beskrevet i eksem- I

35 pel 1) blev skåret med Avail og fyldt ud (Klenow-reaktion). BamHI-linkere blev til- I

7 DK 175537 B1 sat, og Avall-fragmentet med BamHI-linkere blev ligeret med T4-ligase til BamHI-skåret pBR322 (ATCC deponeringsnr. 37017 - ikke deponeret i henhold til Buda-pesttraktaten). Det resulterende plasmid pJBF-5401A blev skåret med BamHI, og det 900 bp store fragment indeholdende deo Pl-P2-promotorerne blev religeret til 5 pBR322 (også skåret med BamHI). Det resulterende plasmid, der er betegnet pJBF-5401, består af pBR322-DNA og deo Pl-P2-promotorregions DNA. Plasmidet pJBF-5401 er blevet deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktaten hos the American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland under ATCC deponeringsnr. 67359.

10 1 Fig. 2: Steddirigeret mutagenese af pJBF-5401

Vektoren pJBF-5401 indeholdende deo Pl-P2-promotoren blev modificeret for at introducere et Ndel-restriktionssted mellem det ribosombindingssteds (RBS) Shine-15 Dalgarno-sekvens og den første ATG i det kodende DNA. Dette blev udført ved steddirigeret mutagenese under anvendelse af den metode, der er beskrevet af Y.

Morinaga et al., Biotechnology 2: 636-639 (1984). pJBF-5401 blev skåret med PstI til dannelse af et lineært DNA-fragment og fik lov til at hæfte til det store fragment, der er fremstillet ved BssHI/Sall-skæring af pJBF-5401.

20

Et 20 bp stort syntetisk DNA-fragment, som strækker sig over nucleotider 750-770 fra deo Pl-P2-promotorsekvensen, blev kemisk syntetiseret, således at et Ndel-sted dannes i den rigtige afstand fra RBS'et; denne 20 bp lange sekvens blev betegnet BTG-sekvens #2015. Den oprindelige sekvens og det nykonstruerede 25 sted er vist nedenfor, hvor de understregede baser viser de 2 nucleotider, som blev substitueret.

Oprindelig sekvens - GAGAATGAAATGACTGATCT “ BTG-sekvens #2015 - GAGAATCATATGACTGATCT - 30 Ndel-sted

Det syntetiske DNA-fragment blev hæftet på den enkeltstrengede region på for-ældrestrengen, og det tilbageværende hul blev fyldt op med T4 DNA-polymerase til 35 dannelse af plasmidet pMF-5416 (plasmid D), som indeholder deo P1-P2 (opera-

I DK 175537 B1 I

I I

I tor/promotorsekvens) og det ny Ndel-restriktionssted; sekvensanalyse viste imid- I

I lertid en 48 bp stor deletion i deo P2-regionen (se eksempel 1). I

I Fig. 3: Konstruktion af pMF-5516 I

I 5 I

I Plasmidet pSODal3 (konstrueret som vist i fig. 30 fra pSODa2 (ATCC I

I deponeringsnr. 39786)) indeholdende genet for human kobber/zinksuperoxiddis- I

I mutase (hSOD), som udtrykkes under λ PL-promotorens og cll-ribosombindings- I

I stedets kontrol. Aatll-Ndel-skæring af pSODal3 giver et stort fragment, som I

I 10 indeholder SOD-genet, men ikke λ Pl-promotoren og RBS'et. Aatll-Ndel skæring af I

I pMF-5416 gav et 900 bp langt dobbeltstrenget segment indeholdende deo P1-P2- I

I promotoren (med 48 bp-deletionen i P2-regionen). Ligering af disse 2 fragmenter I

I gav et plasmid, betegnet pMF-5516, som indeholder en modificeret deo P1-P2- I

I promotor (med 48 bp-deletionen) og hSOD-genet med Nde-restriktionsstedet foran I

I 15 sig. I

I Fig. 4: Konstruktion af pMF-5531 I

I pMF-5516 blev modificeret til genindsættelse af det deleterede 48 bp-segment. For I

I 20 at nå dette mål, blev følgende 6 enkeltstrengede syntetiske DNA-sekvenser hæftet I

I sammen til dannelsen af en tredobbeltstrenget sekvens strækkende sig fra bp 678 I

I til bp 760 i P2-regionen, dvs. den region, der strækker sig fra Taql-stedet til det I

I nykonstruerede Ndel-sted. (Deo Pl-P2-promotor/-operatorregionens fuldstændige I

I sekvens er givet af P. Valentin-Hansen, H. Aiba og D. Schumperli, the EMBO I

I 25 Journal 1: 317-322 (1982)). I

I Taq I

I Sekvens #2912 - 5' CGAAGTGTGTTGCGGAGTAGATGTTAGAA I

I Sekvens #3107 - TTCACACAACGCCTCATCTACAATCTTATGA5 I

I 30 Sekvens #3604 - 5' TACTAACAAACTCGCAAGGTGAATTTTATTGGCGAC I

I Sekvens #2913 - TTGTTTGAGCGTTCCACTTAAAATAACCG I

I - 5/aagccaggagaatca I

I Sekvens #1511 5' I

I - CTGTTCGGTCCTCTTAGTAT

I Sekvens #2019 Ndel I

I 35 I

9 DK 175537 B1

Strengnumre 3107, 3604, 2913 og 1511 blev phosphoryleret med polynucleotid-kinase, og derefter blev hver streng hæftet til sin komplementære streng, dvs. streng #2912 til #3107, #3604 til #2913 og #1511 tii #2019. De 3 dobbelt-5 strengede sekvenser blev samlet ved ligering til dannelse af en 80 bp lang sekvens, der indeholder Taql's og Ndel's kohæsive ender.

Det store Bglll-Ndel fragment af pMF-5516 og BglH-Taq-fragmentet af pJBF-5401 blev isoleret. Det 80 bp store syntetiske fragment blev ligeret til BglH-Taq-frag-10 mentet fra pJBF-5401, som derefter blev ligeret til det Bglll-Ndel store fragment fra pMF-5516. Den resulterende ekspressionsvektor, pMF-5531, indeholder det fuldstændige deo Pl-P2-system (omfattende det autentiske RBS), Ndel-restrik-tionsstedet og hSOD-genet. Det dirigerer lavniveauekspression af et hSOD-analogt protein.

15

Fig. 5: Konstruktion af pMF-5519 - forlængelse af ribosombindingsstedet

Plasmidet pMF-5531 blev behandlet med Ndel, fyldt ud med T4 DNA-polymerase og selvligeret. Det har den effekt, at afstanden mellem ribosombindingsstedet og den 20 første ATG øges med 2 basepar. Dette ny plasmid, betegnet pMF-5519, indeholder i 5'-3' orden deo Pl-P2-promotoren, den forlængede RBS-ATG-afstand og hSOD-genet. Det dirigerer højniveauekspression af et hSOD-analogt protein.

Fig. 6: Yderligere forlængelser af deo PI -P2-ribosombindingssted 25

Plasmidet pMF-5519 blev skåret med Stul og BamHI, og et 1000 bp stort fragment indeholdende deo Pl-P2-operator/promotorregionen blev isoleret og inkuberet med BglH og Hinfl til fremstilling af et 540 bp Bglll-Hinfl-fragment. 4 forskellige syntetiske linkere blev fremstillet til at blive bundet til dette Bglll-Hinfl-fragment til 30 fremstilling af en serie af 4 plasmider, som adskiller sig fra hinanden ved den afstand, der er mellem ribosombindingsstedet og den første ATG.

For at opnå dette mål blev følgende 8 enkeltstrengede syntetiske DNA-sekvenser syntetiseret. Komplementære strenge blev hæftet sammen til fremstilling af 4 syn- 35 tetiske dobbeltstrengede DNA-linkere betegnet I, II, III og IV.

I DK 175537 B1 I

I 10 I

I Hinfl I

I AATATACA Syntetisk linker I I

TATGTAT I

N<jel (7-8 bp forlængelse)

I I

I Hinfl I

I AATATATCA Syntetisk linker 11 I

I TATAGTAT t ., I

”Ndel (8*9 bp forlænBelse) I

I 10 Hinfl I

AATATCA Syntetisk linker III

I TAGTAT (6-7 bp forlængelse) I

I Ndel I

I Hinfl I

AATCTAGACA Syntetisk linker IV I

I GATCTGTAT .. .Λ , c , , N I

—Ndel (9*10 bP forlængelse) I

B

I De 4 syntetiske linkere, I, II, III og IV har alle "hæfte-ender" ("sticky ends") I

I 20 bestående af et Hinfl-sted og et Ndel-sted. I

I Hver linker fik lov til at hæfte separat til Bglll-Hinfl-fragmentet fra pMF-5519 og I

I blev derefter ligeret, hvilket i hvert tilfælde fremstillede et nyt BgM-Ndel-frag- I

I ment. Derefter blev hvert fragment separat hæftet til det store Bglll-Ndel- I

I 25 fragment fra pMF-5531 og ligeret. De resulterende plasmider indeholder et for- I

I længet RBS. På nuværende tidspunkt er det kun 2 af disse 4 konstruktioner, under I

I anvendelse af linker I og IV, der er blevet sekventeret, og sekvensen verificeret. I

I De tilsvarende plasmider, henholdsvis betegnet pMF-558-26 (linker 1) og pMF-5536 I

I (linker IV), er blevet transformeret i Sq>732, hvor de begge dirigerer lavniveaueks- I

30 pression af et hSOD-analogt protein. I

Fig. 7: Konstruktion af pMF-5520 I

I pMF-5519 (som bærer ampicillinresistensgenet) blev skåret med Aatll og PstI, og I

35 3’ enderne gjort stumpe ved skæring med T4 DNA-polymerase. Denne skæring I

11 DK 175537 B1 fjerner ampicillinresistensgenet. Et 1450 bp stort fragment indeholdende tetra-cyclinresistensgenét fra pBR322 blev isoleret ved skæring med EcoRI- og Aval-restriktionsendonucleaser og 5'-enderne fyldt ud med T4 DNA-polymerase til dannelse af stumpeender. Det 1450 bp store fragment blev ligeret til det opren-5 sede pMF-5519-fragment, hvilket producerede et nyt tetracyclinresistent plasmid betegnet pMF-5520, som i 5’-3' orden indeholder deo-p romotoren og hSOD-genet.

Dette plasmid dirigerer højniveauekspression af et hSOD-analogt protein.

Fig. 8: Konstruktion af pMF-2001 10

Plasmidet ρΟΡίΔβ er et højkopitalsplasmid konstrueret som beskrevet af D. H.

Gelfand et al.f PNAS 15: 5869-5873 (1978) og af M. Muesing et al., Cell 24: 235 (1981). Det blev skåret med Clal og EcoRI, fyldt ud med T4 DNA-polymerase, og det resulterende store fragment blev ligeret til 1450 bp-fragmentet (indeholdende 15 tetracyclinresistensgenet) fra pBR322 ved skæring med EcoRI og Aval og udfyldning med T4-polymerase.

Dette erstatter effektivt ampicillinresistensgenet fra ρΟΡίΔδ med tetracyclinresistensgenet. Dette fremstillede ny højkopitalstetracyklinresistente plasmid blev 20 betegnet pMF-2001.

Fig. 9: Konstruktion af pMF-2005

Plasmidet 5519 blev skåret med BamHI, fyldt ud med T4 DNA-polymerase, og det 25 resulterende lille fragment (indeholdende deo Pl-P2-operator/promotorregionen og hSOD-genet) blev ligeret til det store fragment opnået fra plasmidet pMF-2001 efter Pstl-skæring og T4 DNA-polymerasefjernelse af 3’-ender. Dette overførte hele hSOD-genet under deo Pl-P2-operator/promotorregionens kontrol til højkopitals-plasmidet. Det resulterende plasmid, betegnet pMF-2005, er et højkopitalsplasmid, 30 som dirigerer et ekstremt højt ekspressionsniveau af en hSOD-proteinanalog under kontrol af deo Pl-P2-operator/promotoren. Plasmidet pMF-2005 er blevet deponeret hos ATCC i Rockville, Maryland 20852 U.S.A. under ATCC deponeringsnr. 67362 i henhold til Budapest-traktatens bestemmelser. 1

Fig. 10: Konstruktion af pDGE4-3

I DK 175537 B1 I

I 12 I

I Plasmidet pE4GPX blev fremstillet fra plasmid pMSE4 (ATCC deponeringsnr. 53250) I

I som vist i fig. 39. Dette plasmid udtrykker et NlnSOD-GPX-fusionsprotein under I

I kontrol af λ PL-promotoren og cll-ribosombindingsstedet. Det blev skåret med Nsil, I

I 5 3'-enderne blev fjernet med T4 DNA-polymerase, og derefter skåret med SspI til I

I fjernelse af λ PL-promotoren. Det store fragment (4000 bp) blev isoleret og blev I

I ligeret til den 1300 bp store deo-promotor opnået fra pMF-5531 (fig. 4) ved Ndel· I

I skæring, Klenow-udfyldning og Sspl-skæring). Det ny plasmid, betegnet pDGE4-3, I

I indeholder i 5'-3’ orden deo Pl-P2~operator/promotorsekvensen, ca. 50 bp fra ell- I

I 10 ribosombindingsstedet, ca. 450 bp af MnSOD-sekvensen og GPX-sekvensen. I

I pDGE4-3 dirigerer syntesen af en stor mængde MnSOD-GPX-fusionsprotein under I

I kontrol af deo Pl-P2-promotoren og cII-RBS'et. I

I 15 Fig. 11: Konstruktion af pTVR 568-4 I

I Plasmidet pTV104(2) (ATCC deponeringsnr. 39384) blev skåret med Ndel og Smal I

I til opnåelse af det lille Ndel-Smal-fragment, som indeholder hele hGH-sekvensen. I

I Dette blev ligeret til det store Ndel-PvuII-fragment opnået fra pDGE4*3. Det ny I

I 20 plasmid, betegnet pTVR 568-4, indeholder i 5’-3' orden deo Pl-P2-promotoren, ca. I

I 50 bp af cll-ribosombindingsstedet og den hGH-kodede sekvens. pTVR 568-4

I dirigerer syntesen af store mængder af en hGH-analog under kontrol af deo P1-P2- I

I pro-motoren og cII-RBS. I

I 25 Fig. 12: Konstruktion af pMFS-5600 - et plasmid producerende bGH I

I under kontrol af deo P1-P2-operator/promotorregion I

I Plasmidet pDGE4-3 (fig. 10) blev skåret med Ndel og PvuII, det store Ndel-PvuII- I

I fragment blev isoleret og ligeret med T4-ligase til en 750 bp bGH-sekvens opnået I

I 30 som følger. Plasmidet pSAL 440-11 er identisk med plasmidet pSAL 440-22 (fig. I

I 38), nemlig et andet isolat fra den samme transformation. bGH-sekvensen blev I

I opnået fra pSAL 440-11 ved behandling med Hindlll, fyldt ud med Klenow DNA- I

I polymerase stort fragment efterfulgt af skæring med Ndel. I

13 DK 175537 B1

Det resulterende plasmid, betegnet pMFS-5600, indeholder i 5'-3‘ orden deo P1-P2-promotoren, det autentiske deo-RBS, ca. 50 bp af cII-RBS'et, bGH-genet, en del af GPX-genet og Cu-Zn hSOD-genet. Plasmidet pMFS-5600 dirigerer syntesen af et bGH-analogt protein under kontrol af deo Pl-P2’en og det modificerede cII-RBS.

5

Fig. 13: Konstruktion af pARB

Plasmidet pSODl^Tll (ATCC deponeringsnr. 53468) dirigerer ekspression af en human. Cu-Zn SOD-analog. (Konstruktionen af dette plasmid blev beskrevet i US 10 4,742,004 og i EP 173,280, til hvilke, der henvises). Det indeholder i 5'-3’ orden λ PL-promotoren, β-lactamasepromotoren, β-lactamase ribosombindingsstedet og Cu-Zn hSOD-genet. Det store fragment, der er fremstillet efter EcoRI- og partiel BamHI-skæring, deleteres bide for β-lactamasepromotor-ribosombindingsstedet og SOD-genet. En syntetisk linker blev konstrueret for at introducere nye restriktions-15 steder og blev ligeret til det ovenfor beskrevne fragment. Dette producerede pARB, som indeholder λ PL-promotoren umiddelbart opstrøms for EcoRI-, Smal-, Xbal- og Bglll-stederne i 5'-3’ orden.

Fig. 14: Konstruktion af ρβίΙΝ - en ekspressionsvektor til almene

20 formåI

Plasmidet pSODPiTll blev skåret med Aval, Sspl og Stul, og det 1910 bp store . Aval-SspI-fragment blev isoleret. Dette fragment blev ligeret med det viste syntetiske SspI-EcoRI-fragment og til det 1270 bp store EcoRI-Aval-fragment fra 25 pARB. Den syntetiske linkersekvens adskiller sig fra den "naturlige" β-lactamase-RBS-sekvens ved 3 nudeotidsteder. De 3 nudeotider, der er angivet i den syntetiske linker, viser baseparudskiftningerne ved β-lactamase RBS'ets 3'-ende (CCA erstatter GAC). Dette eliminerer den først mulige ATG (C erstatter G), og de 2 andre baseparændringer danner et Ndel-sted (CA erstatter AG). Ellers er det 30 syntetiske RBS identisk med β-lactamase RBS’et. Denne konstruktion fremstillede det ny plasmid ρβυΝ, som i 5'-3’ orden indeholder λ PL-promotoren, β-lactamasepromotoren, det syntetiske β-lactamase RBS med det unikke Ndel-sted efterfulgt af Smal-, Xbal- og Bglll-stederne.

I DK 175537 B1 I

I I

I Fig. 15: Konstruktion af ρβΜA I

I Ndel-BamHI-fragmentet fra pS0Dal3 (se fig. 3 - beskrivelse) indeholdende et I

I hSOD-cDNA blev indsat i det store Ndel-BgIII-fragment fra ppUN som vist. Det I

I 5 fremstillede plasmid, betegnet ρβΜΑ, udtrykte hSOD-analogen i lave niveauer. Den I

I eneste forskel i DNA-sekvens mellem pSODPiTll og det nyligt opnåede plasmid I

I ρβΜΑ er i 3 basepar ved ribosombindingsstedet 3’-ende (se beskrivelser til fig. 14 I

I og 16)· I

I 10 Fig. 16: Konstruktion af pSODpMAX-12 I

I Plasmidet ρβΜΑ blev skåret med Sspl og Ndel til fjernelse af det syntetiske β-lac- I

I tamase RBS, og det store SspI-Ndel-fragment blev ligeret til den viste syntetiske

I linker til dannelse af det nye plasmid pSODpMAX-12. Den syntetiske linker består I

I 15 af β-lactamase RBS med en baseparmodifikation ved 3’-enden. Denne modifikation I

I skaber et syntetisk (sil) β-lactamase RBS med én baseændret (A erstatter G) fra I

I det autentiske β-lactamase RBS, hvorved den første mulige ATG-startkodon såle- I

I des elimineres. Baseparudskiftningerne kan opsummeres som følger: I

I 2Q Autentisk sekvens i pSOD^Tll AAGGAAGAGTATGAGTATG I

I Syntetisk sekvens i p£MA AAGGAAGAGTATCCATATG I

I Ndel-sted I

I Syntetisk (sil) sekvens i AAGGAAGAGTATAAGTATG I

25 pSOD/9MAX-12

I Plasmidet ρ500βΜΑΧ-12 er dermed kun forskelligt fra plasmidet pSODpTll med I

I hensyn til ét basepar og bevirker høje niveauer af ekspression af et SOD- I

I analogprotein. Plasmidet pSODpMAX-12 er deponeret i Escherichia coli stammen I

I 30 A4255 under deponeringsnummeret ATCC 67177. I

I Fig. 17. Konstruktion af pMFS-5533A I

I Plasmidet pMF-5531 (vist i fig. 4) blev skåret med Aatll og PstI og derefter be- I

I 35 handlet med Klenow for at fjerne 3'-ender. Denne skæring fjerner ampicillin- I

15 DK 175537 B1 resistensgenet. Det fremstillede store fragment blev ligeret til det lille pBR322-fragment, hvilket bærer tetracyclinresistensgenet, og som er produceret ved at skære pBR322 med EcoRI og Aval og ved at fylde ud med Klenow-enzym.

5 Det resulterende plasmid, betegnet pMFS-5533A, er identisk med pMF-5531 med undtagelse af, at ampicillinresistensgenet er blevet erstattet med tetracyclinresistensgenet; det indeholder i 5’-3' orden deo Pl-P2-promotoren, Ndel-stedet og hSOD-genet.

10 Fig. 18: Konstruktion af pMFS-5538

Plasmidet pSODpMAX-12 (opnået som vist i fig. 13-16) blev skåret med Sall og Sspl, det 2625 bp store fragment indeholdende det syntetiske β-lactamase RBS og Cu-Zn SOD-genet blev opnået. Det blev ligeret til et fragment indeholdende deo 15 P1-P2, der er opnået ved skæring af pMFS-5533A med Ndel, efterfulgt af Klenow-udfyldning og yderligere skæring med Sall.

Det resulterende plasmid, betegnet pMFS-5538, indeholder i 5’-3' orden deo P1-P2-promotoren, det autentiske deo RBS, det syntetiske β-lactamase ribosombindings-20 sted og hSOD-genet. Det udtrykker et hSOD-analogt protein i et moderat niveau.

Fig. 19: Konstruktion af pTVR 580-35

Plasmidet pSAL-160-5 (konstrueret som vist i fig. 22-25) udtrykker et hGH-apoli-25 poprotein E-fusionsprotein, hvor N-terminalen består af de første 45 aminosyrer fra hGH fusioneret til ApoE3, der mangler de første 11 aminosyrer. Det lille hGH-ApoE-fragment produceret ved skæring af dette plasmid med PvuII og Smal blev ligeret til det store fragment fremstillet ved PvuII-skæring af pTVR 568-4 (fig. 11). Dette erstatter effektivt hGH-sekvensen i pTVR 568-4 med hGH-ApoE-fusionssekvensen.

30 Det resulterende plasmid, betegnet pTVR 580-35, indeholder i 5'-3' orden deo Pl-P2-operator/promotorregionen, cll-ribosombindingsstedet og hGH-ApoE fusionssekvens; det udtrykker store mængder af et hGH-ApoE-fusionsprotein under kontrol af deo P1-P2 og cII-RBS.

I DK 175537 B1 I

I I

I Fig. 20: Skematisk kort over deo-operonet I

I Denne figur illustrerer et skematisk kort over hele c/eo-operonet. De forskellige I

I deo-gener koder for følgende enzymer: deo C, deoxyriboaldolase; deo A, thymidin- I

I 5 phosphorylase, deo B, deoxyribomutase; og deo D, purinnucleotidphosphorylase. 3 I

I operator/promotorregioner er blevet beskrevet: ved deo PI represseres transkrip- I

I tion af deo R-repressoren og induceres af deoxyribpse-5-P; ved deo P2 represseres I

transkription af cyt R-repressoren, induceres af cytidin eller adenosin og afhænger I

I af CAMP og CRP; ved deo P3 kontrolleres transkription af ukendte proteinfaktorer I

I 10 og induceres af inosin eller guanosin. Cyt R- og deo R-generne er ikke bundet til I

I deo-operonet. I

I Fig. 38: Konstruktion af pFSAL-B27 I

I il

I 15 Plasmidet pHG 44 (ATCC deponeringsnr. 39806) er blevet beskrevet i US-patent- I

I ansøgning serie nr. 644,671 og EPO-publikationsnr. 173,280. Det er et plasmid, I

I der er afledt af pBR322, og som indeholder λ PL-promotoren, cll-ribosombindings- I

I stedet, der kontrollerer bGH-genet, og TjT2-transkriptionstermineringssekvenser. I

I cll-ribosombindingsstedet blev modificeret ved skæring med Nsil og fjernelse af 3’- I

I 20 ender til fremstilling af plasmidet pSAL 440-22. (cll’ RBS angiver modifikation af I

I cII-RBS, som nu er N-proteinuafhængigt). Plasmidet pSAL 440-22 blev skåret med I

I Clal og 5'-enderne fyldt ud med Escherichia coli DNA-polymerase (Klenow- I

I fragment). Hellængdens lineærformen af det fremstillede DNA blev ligeret til det I

I fragment (1300-1350 bp langt) indeholdende deo PI og cl 857, som var blevet I

I 25 isoleret fra plasmidet pMF-54DC efter partiel Accl- og BamHI-skæring efterfulgt af I

I Klenow-udfyldning. I

I Dette fremstillede plasmider pFSAL-B27 og pFSAL-A5. Plasmidet pFSAL-B27 inde- I

I holder i orientering med uret deo Pl’en og λ cl 857-repressoren, hvorimod de er i I

I 30 en orientering mod uret i pFSAL-A5. Sekvensanalyse viste efterfølgende, at deo I

I Pl-promotorsekvensen til stede i plasmidet pFSAL-B27 er afskårne ved 5'-enden, I

I hvorimod den fuldstændige deo PI-promotorsekvens er til stede i pFSAL-A5. Den I

I afskårne deo PI-promotorsekvens indeholder ikke længere EcoRI-restriktions- I

I stedet. Begge plasmider indeholder i orientering mod uret λ PL'et, det modificerede I

I 35 cll-ribosombindingssted (cif), bGH-genet og TiTz-terminatorsekvensen. Disse I

17 DK 175537 B1 plasmider udtrykker kun ét bGH-analogt protein, når de varmeinduceres (ved 42°C), hvilket viser, at deo Pl-operator/-pro-»motorregionen dirigerer ekspressionen af et funktionelt termolabilt cl 857-repressorprotein (se eksempel 9).

Plasmidet pFSAL-B27 er blevet deponeret i ATCC som pFSAL-130-B27 (ATCC 5 deponeringsnr. 67071). Et diagram af pFSAL-A5 er vist i fig. 25.

Fig. 39: Fremstilling af pE4GPX

Plasmidet pMSE4 (ATCC deponeringsnr. 53250) indeholder cDNA, som koder for 10 den fuldstændige kodende sekvens for MnSOD (human mangansuperoxiddismu-tase) under kontrol af λ PL-promotoren og cll-ribosombindingsstedet. Det blev skåret med Stul, som fjernede et 67 bp stort fragment ved ca. 450 bp fra MnSOD-sekvensens 5’-ende. Fragmentet indeholdende GPX-sekvensen opnået fra plasmidet pl8UL-l (ATCC deponeringsnr. 67361) ved Ndel-skæring, Klenowudfyldning 15 og Sspl-skæring blev indsat mellem de 2 Stul-steder inde i MnSOD cDNA’et.

Plasmidet pl8UL-l er blevet deponeret hos ATCC i Rockville, Maryland under ATCC deponeringsnr. 6?361. Det resulterende plasmid pE4GPX udtrykker et MnSOD-GPX-fusionsprotein under λ PL’s og cll-ribosombindingsstedets kontrol.

20

Fig. 21: Konstruktion af pSODal 3 og pSODpl

Plasmidet pSODa2 (ATCC deponeringsnr. 39786) blev partielt skåret med EcoRI, og det resulterende lineære DNA blev isoleret fra en agarosegel. Det oprensede 25 DNA blev udfyldt med DNA-polymerase I (Klenow) og religeret. Den resulterende klon pSODal3 indeholder ét EcoRI-sted placeret ved ribosombindingsstedets 5’-ende. Et fragment indeholdende β-lactamasepromotoren og ribosombindingsstedet blev isoleret fra plasmidet pBLAll (ATCC deponeringsnr. 39788), som var blevet skåret med EcoRI og Alul. Det 200 basepar store fragment blev ligeret til det store 30 fragment isoleret fra pSODal3, som var blevet skåret med Ndel, udfyldt med DNA-polymerase I (Klenow) og derefter skåret med EcoRI. Det resulterende plasmid pSODal indeholder β-lactamasegenets ribosombindingssted og λ PL-promotoren.

I DK 175537 B1 I

I I

I Fig. 22: Konstruktion af pR0211 og pROl 2 I

I Plasmidet pJH200 (ATCC deponeringsnr. 39783) blev partielt skåret med Ndel, I

I behandlet med DNA-polymerase I (Klenow) til udfyldning af enderne, og det I

I 5 resulterende DNA blev religeret til dannelse af ekspressionsvektoren pR0211.

I Ekspressionsvektoren pR0211 blev skåret med Ndel og Hindlll, og det store I

I fragment blev isoleret og ligeret til et Ndel-Hindlll bGH-fragment isoleret fra

I pAL500 (ATCC deponeringsnr. 39782) til fremstilling af pR012. (Ndel-Hindlll- I

I fragmentet blev fremstillet fra pAL500, ved at skære den med EcoRI og ligere I

I 10 syntetiske linkere med sekvensen: I

I tatggatc I

I ACCTAGTTAA I

I I

I til skæringsproduktets ender.

I Ligeringsblandingen blev skåret med Ndel og Hindlll, og det resulterende Ndel- I

I Hindlll bGH-fragment blev isoleret.

I 20 I

I Fig. 23: Konstruktion af p579 I

I rRNA-operon T^-transkriptionstermineringsfragmentet blev isoleret fra plasmidet I

I pPSl (ATCC deponeringsnr. 39807), som var blevet skåret med Hindlll. TjT2-frag- I

I 25 mentet blev indsat i det unikke Hindlll-sted i pR0211 (fig. 22), som var blevet I

I skåret med Hindlll. I

I Den resulterende ekspressionsvektor p579 indeholder 7. PL-promotoren, cll-ribo- I

I sombindingsstedet efterfulgt af T^-transkriptionstermineringssignalerne. I

I 30 I

I Fig. 24: Konstruktion af pTV-170 I

I Ndel-Ndel ApoE-fragmentet blev isoleret fra plasmidet pApoE-EX2 (ATCC depo- I

I neringsnr. 39787) og indsat i det unikke Ndel-sted af ekspressionsvektoren p579 I

I 35 (fig. 23), som var blevet skåret med Ndel. Det resulterende plasmid pTV-170 ud- I

19 DK 175537 B1 trykker en analog af naturligt humant ApoE-protein med en methioninrest tilføjet ved N-terminalen.

Fig. 25: Konstruktion af pSAL 160-5 5

Et Aval-Aval fragment indeholdende ApoE-DNA-sekvensen blev isoleret fra pTV-170 (fig. 24), som var blevet skåret med Aval. Fragmentet blev udfyldt med DNA-polymerase I (Klenow) og isoleret på agarosegel. Det oprensede ApoE-fragment blev indsat i Pstl-stedet af pTV 104(2)-p!asmidet (ATCC deponeringsnr. 39384), 10 som var blevet partielt skåret med PstI efterfulgt af skæring af 3’-ender med DNA-polymerase I (Klenow). Det resulterende plasmid blev betegnet pSAL 160-5.

Fig. 26: Konstruktion af pTV-194 15 β-lactamasepromotor- og ribosombindingsstedfragmentet blev isoleret fra plasmidet pBLAll (ATCC deponeringsnr. 39788) efter skæring med EcoRI og Alul.

Dette fragment blev ligeret til det store fragment af pTV-170 (fig. 24) plasmidet, som var blevet partielt skåret med Ndel, udfyldt med DNA-polymerase I (Klenow) og derefter skåret med EcoRI.

20

Fig. 27: Konstruktion af pEFF-905 - et deo P1-P2 plasmid, der udtrykker pGH- analog

Det fragment, der i 5'-3’ orden indeholder cll-ribosombindingsstedet, pGH-analog 25 DNA-sekvens og de TiT2-transkriptionsterminationssekvenser blev opnået fra plasmidet pEFF-902 ved skæring med EcoRI, Dral og PstI, efterfulgt af isolering af EcoRI-Dral-fragmentet og efterfølgende fjernelse af EcoRI- 5’-enderne med Mungbønnenudease. Dette fragment blev ligeret til det store fragment, der var opnået fra plasmidet pMF 5531 (fig. 4), fra hvilket en del af den hSOD-kodende 30 sekvens var blevet fjernet ved Ndel- og Stul-skæring efterfulgt af Mungbønneskæ-ring på det fremstillede store fragment for at fjerne NdeI-5'-enderne. Det resulterende plasmid, betegnet pEFF-905, indeholder i 5’-3* orden deo PI ^-promotor-sekvensen, cll-ribosombindingsstedet, pGH-analog-DNA-sekvensen og TjT2-transkription-istermi-neringssekvenser-ine. Dette plasmid udtrykker pGH-analog-35 proteinet, særdeles godt, men konstruktionen viste sig at være ustabil.

I DK 175537 B1 I

I 20 I

I Fig. 28: Konstruktion af pEFF-920 - et deo Pl-P2-plasmid (PAR+), der I

I udtrykker pGH-anaiog I

I 5 Et fragment indeholdende PAR (delings) sekvensen blev isoleret fra plasmidet I

I pSCIOl (ATCC deponeringsnr. 37032) ved at skære plasmidet med Sspl, PvuII og I

I EcoRl, isolere det fremstillede store fragment og skære det med Hindi. Et 350 bp I

I stort SspI-HincII-fragment blev isoleret og blev indsat i EcoRV-stedet i plasmidet I

I pEFF-905; det resulterende plasmid blev betegnet pEFF-920. Dette plasmid inde- I

I 10 holder PAR-sekvensen og i 5*-3' orden deo Pl-P2-promotoren, cll-ribosom- I

I bindingsstedet, pGH-analog-DNA-sekvensen og TiT2-transkriptionsterminerings- I

I sekvenserne. Plasmidet pEFF-920 udtrykker pGH-analogproteinet meget godt, og I

I er blevet deponeret i Escherichia coli-stamme S<p930 i ATCC under deponeringsnr. I

I 67706. I

I 15 I

I Fig. 29: Konstruktion af pMFS-5627 - et deo Pl-P2-plasmid, der I

I udtrykker bGH-analog I

I Det fragment, der i 5'-3' orden indeholder den analoge DNA-sekvens for bovint I

I 20 væksthormon (bGH), og de sekvenser, der koder for TiT2-transkriptionstermine- I

I ring, blev isoleret fra pFSAL-130-B27 (ATCC deponeringsnr. 67071; se fig. 24) ved I

I skæring med Ndel, Dral og Bglll. Fragmentet blev ligeret til det store fragment, I

I der blev opnået fra pMF 558-26 (Fig. 6) efter Ndel- og Stul-skæring. Det resulte- I

I rende plasmid, betegnet pMFS-5627, indeholder i 5’-3' orden deo Pl-P2-promo- I

I 25 toren, deo ribosombindingsstedet, pGH-analog-DNA-sekvensen og de sekvenser, I

I der koder for TiT2-transkriptionstermineringen. Dette plasmid udtrykker bGH- I

I analogproteinet dårligt. I

I Fig. 30: Konstruktion af pMFS-5603 - et andet deo PI-P2-ptasmid, I

I 30 der udtrykker bGH-analog I

I Det lille fragment, der indeholder en del af deo Pl-P2-promotorerne og ell- I

I ribosombindingsstedet, og som er isoleret fra plasmidet pEFF-905 ved skæring I

I med Bglll og Ndel, blev ligeret til det store fragment opnået fra pMFS-5627 skåret I

I 35 med Bglll og Ndel. Det resulterende plasmid, betegnet pMFS-5603, indeholder i 5'- I

21 DK 175537 B1 3' orden deo Pl-P2-promotoren, cll-ribosombindingsstedet, bGH-analog-DNA-sekvensen og de sekvenser, der koder for T^-transkriptionsterminering. Det udtrykker bGH-analogproteinet i et mellemniveau.

5 Fig. 31: Konstruktion af pMFS-5605 - et deo Pl-P2-plasmid (PAR+), der udtrykker bGH-analog

Det lille fragment, der indeholder PAR (delings) sekvensen fra plasmidet pEFF-920 (fig. 39), blev isoleret fra plasmidet pEFF-920 efter skæring med Aatll og Bglll.

10 Dette fragment blev ligeret til det store fragment fra plasmidet pMFS-5603, som var blevet skåret med Aatll og Bglll. Det resulterende plasmid, betegnet pNIFS-^ 5605, indeholder PAR-sekvensen og i 5’-3’ orden deo Pl-P2-promotoren, cll-ribosombindingsstedet, pGH-analog-DNA-sekvensen og de sekvenser, der koder for TiT2-transkription-iSter-.minering. Det udtrykker det bGH-analoge protein særdeles 15 godt.

Plasmidet pMFS-5607 (TetR) blev konstrueret fra plasmidet pMFS-5605 (AmpR) under anvendelse af den metode, der er vist i fig. 7. Plasmid pMFS-5607 er blevet deponeret i Escherichia coli-stamme S<p930 (F) i ATCC under deponeringsnr.

20 67704. (Escherichia coli F'-stammer er yderligere beskrevet i eksempel 15.)

Fig. 32: Konstruktion af plasmidet pMF-5534 - et plasmid, der indeholder en translationel fremmer, og som udtrykker hSOD-analog 25 Plasmidet pJBF5401 (fig. 1) blev spaltet med BamHI og det lille (900 bp) fragment isoleret og oprenset fra lavsmelteagarose. BamHI-fragmentet blev derefter skåret med restriktionsenzymerne Bglll og Taql og det dannede 440 bp store fragment blev isoleret og oprenset. Syntetiske linkere nr. 2912, 3604, 3107, 2913 (detaljeret i beskrivelse af fig. 4), som er identiske med del af den publiserede deo nucleotid-30 sekvens, der dækker deo P2-promotoroperatoren (Valentine-Hansen et al., EMBO 1: 317 (1982)) blev hæftet sammen, ligeret til hinanden og derefter ligeret til det 440 bp store Bglll-Taql-fragment.

Korte oligonudeotidsekvenser på længder på 34 og 39 baser blev syntetiseret ke-35 misk. Disse sekvenser er som vist.

I DK 175537 B1 I

I 22 I

I AT-rig I

I 5' AAGCCTAGGTTTGTTTAACTrTAAGGAGAAATCA #3413 I

I 5 3 · CTGTTCGGATCCAAACAAATTGAAATTCCTCTTTAGTAT #3913 I

I Efter samling af oligonucleotider nr. 3413 og 3913, blev duplexen ligeret til det I

I forlængede Bglll-Taql-fragment. Denne sidste ligering gav et fragment, der er I

I 10 flankeret ved Bglll-Ndel-restriktionssteder, og som omfatter en AT-rig region (den I

I translationelle "fremmer" - se eksempel 13). Dette fragment blev ligeret til det I

I store fragment fra pMF-5531, som var blevet fremstillet ved at skære med Bglll- I

I Ndel. Det resulterende plasmid, betegnet pMF-5534, udtrykker hSOD-analog- I

I protein i et højt niveau. Det indeholder i 5’-3’ orden deo Pl-P2-promotorerne, det I

I 15 modificerede deo ribosombindingssted med fremmersekvensen og den sekvens, I

I der koder for hSOD-analog. I

I Plasmidet pMF-5534 blev deponeret i Escherichia co//-stammen S(p930(F) i ATCC I

I under deponeringsnr. 67703. I

I 20 I

I Fig. 33: Konstruktion af plasmidet pMF-5541 I

I Plasmidet pMF-5534 (fig. 32) blev skåret med Bglll og AvrII. Det største fragment, I

I der blev observeret på agarosegel, blev isoleret og oprenset, og de kohæsive ender I

I 25 blev udfyldt med Klenow-enzym og ligeret og genskabte således AvrII-stedet. I

I Dette fremstillede plasmid pMF-5540, som i 5*-3‘-sekvens indeholder deo PI- I

I promotoren, det modificerede deo ribosombindingssted (RBS) med fremmer- I

sekvensen og sekvensen, der koder for hSOD-analogen. Plasmidet pMF-5540 I

I fremstiller et højt niveau af hSOD-analogprotein under kontrol af deo PI-promo- I

30 toren og translationsfremmeren. I

I Plasmidet pMF-5540 blev skåret med EcoRI og AvrII; de kohæsive ender blev I

I udfyldt med Klenow-enzym, og det store fragment blev isoleret og ligeret med I

TVW-ligase. Disse procedurer fjernede deo PI- og P2-pro-motorsekvenserne med I

I 35 undtagelse af deo-ribosombindingsstedet (RBS) og resulterede i dannelse af plas- I

23 DK 175537 B1 midet pMF-5541, som i 5'-3' orden indeholder det modificerede deo RBS med fremmersekvensen og den sekvens, der koder for hSOD-analog. Dette plasmid fremstiller et ekstremt lavt niveau af hSOD-analogprotein.

5 Fig. 34: Konstruktion af plasm idet pMF-945

Plasmidet pEFF-920 (fig. 39 og ATCC deponeringsnr. 67706) blev skåret med Bglll og Ndel, og det store fragment blev isoleret. Dette fragment blev ligeret til det lille 540 bp fragment fremstillet ved at skære plasmidet pMF-5534 (fig. 32) med Bglll 10 og Ndel. Dette fremstiller plasmidet pMF-945, som indeholder PAR-sekvensen og i 5’-3' orden deo Pl-P2-promotorsekvenserne, det modificerede deo RBS med fremmersekvensen, den sekvens, der koder for pGH-analog, og T1T2-transkrip-tionsterminerinssekvenserne. Plasmidet pMF-945 udtrykker bGH-analogprotein i et højt niveau.

15

Fig. 35: Konstruktion af plasmidet pMF-5608

Plasmidet pMFS-5607 (ATCC deponeringsnr. 67704) svarer til plasmidet pMFS-5605 (fig. 31) med undtagelse af, at ampicillinresistensgenet er blevet erstattet 20 med et, der koder for tetracyclinresistens, under anvendelse af den samme metode, som beskrevet i fig. 7. Plasmidet pMFS-5607 blev skåret med Ndel og Bglll, og det resulterende store fragment blev ligeret til det lille (540 bp) fragment, der blev fremstillet ved at skære pMF-5534 (fig. 32) ved Ndel og Bglll. Det resulterende plasmid, betegnet pMF-5608, indeholder PAR-sekvensen og i 5’-3’ orden deo Pl-25 P2-promotorsekvensen, modificeret deo-RBS med den AT-rig sekvens (fremmeren), den bGH-analogkodende sekvens og T,T2-franskriptionstermineringssekven-serne. Det udtrykker bGH-analogprotein i et lavt niveau.

Fig. 36: Konstruktion af plasmidet pMF-5513-1 30

Stedspecifikt mutagenese af plasmidet pJBR-5401 blev udført som beskrevet i fig.

2 og resulterede i fremstillingen af plasmidet pMF-5416-2, som indeholder deo Pl-P2-promotorernes fuldstændige sekvens. Dette plasmid blev skåret med Ndel og Aatll, og det lille deo Pl-P2-frag-iment blev isoleret og ligeret til det store frag-35 ment, der er opnået ved skæring af plasmidet pSODal3 ved Ndel og Aatll (se fig.

I DK 175537 B1 I

I 24 I

I 3)· I

I Det resulterende plasmid, pMF-5513-1, indeholder i 5'-3’ orden den fuldstændige I

I deo Pl-P2-promotorsekvens og den sekvens, der koder for hSOD-analogen. Dette I

I 5 plasmid menes at være identisk med plasmidet pMF-5531 på basis af restriktions- I

I enzymanalyse. I

I Fig. 37: Konstruktion af plasmidet pMFS-2006 I

I 10 Det store fragment fra plasmidet pMF-2005 (fig. 9) skåret med Bglll og Styl blev I

I ligeret med T4-ligase. til det lille fragment, der er opnået fra plasmidet pMFS-5605 I

I (fig. 42) skåret med Bglll og Styl. I

Det resulterende plasmid, betegnet pMFS-2006, indeholder tetracydinresistens- I

I 15 genet og indeholder i 5'-3' orden deo Pl-P2-promotorsekven-sen, cll-ribosom- I

I bindingsstedet, den bGH-analogkodende sekvens og den sekvens, der koder for I

I TiT2-transknptionsterminering. Dette plasmid giver højtniveausekspression af bGH- I

I analogprotein (met-asp-gln-bGH). I

I 20 Der er blevet udviklet et dobbeltstrenget DNA-plasmid, som efter introduktion i en I

hensigtsmæssig bakteriel værtscelle, fx Escherichia coli, gør værtscellen i stand til I

at udvirke ekspression af et ønsket, naturligt forekommende eukaryotisk polypep- I

tid eller en polypeptidanalog deraf med det naturligt forekommende polypeptids I

biologiske aktivitet, og en amionsyresekvens, som i det væsentlige er den samme I

25 som og alligevel forskellig fra den, som det naturlige forekommende polypeptid I

har, og derved at udvirke fremstilling af polypeptidet eller polypeptidanalogen, der I

i 5'-3’ orden omfatter følgende: I

a) DNA, som i 5’-3‘ orden omfatter tandempromotorerne deo PI og deo P2; I

30 I

b) DNA, som omfatter et ribosombindingssted for at gøre mRNA, der er I

transkriberet fra det DNA, der koder for polypeptidet eller polypeptid- I

analogen, i stand til at binde til ribosomer i værtscellen; I 1

c) en ATG-startkodon; og I

25 DK 175537 B1 d) det DNA, der koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen, i fase med ATG-startkodonen; 5 og som yderligere omfatter en DNA-sekvens, der omfatter et replikationsorigin fra det bakterielle plasmid, der er i stand til autonom replikation i værtscellen, og en DNA-sekvens, som indeholder et gen, der er associeret med et selekterbart eller identificerbart phenotypisk træk, som kommer til udtryk, når plasmidet er til stede i værtscellen.

10

Egnede Escherichia coli-værtsceller, i hvilket det dobbeltstrengede DNA kan introduceres, omfatter S(p732, Scp744, MC1061, Sq>540, S<p928, Scp929, Sq>930 eller vildtype Escherichia coli (ATCC deponeringsnr. 12435). Foretrukne Escherichia coli-værtsceller er celler, som ikke indeholder en funktionel deo R- og cyt R-repressor 15 såsom Escherichia coli-stammer S<p744 ogSq>732.

Escherichia coli-celle Sq>732, som indeholder plasmidet pMF-2005, er blevet deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. under ATCC deponeringsnr. 67362. Escherichia co/i-vildtypestamme (ATCC depo-20 neringsnr. 12435) er frit tilgængeligt fra den offentlige samling hos ATCC "The Public Collection af the ATCC". Andre værtsceller er kendte inden for teknikken. Se tabel 1 nedenfor. Disse cellers phenotype er også beskrevet i tabel 1A. Escherichia coli-stamme MC1061 er blevet beskrevet af M. Casadaban og S. N. Cohen, J. Mol.

Biol. 138: 179-207 (1980).

25

Opfindelsen angår også forskellige F'-Escherichia coli-værtsceller, som kan anvendes som værtsceller for plasmiderne. Mens anvendte specifikke F-værtsstammer er mere detaljeret beskrevet i eksempel 15, vil det være klart for fagmanden, at en hvilken som helst egnet F-Escherichia coli-værtsstamme kan anvendes. Specifikke 30 eksempler på Escherichia co//-værter, som kan anvendes, omfatter F'MG1655, FW3110, FW2637, FMM294, F1000 og F1100. Disse stammer er nærmere beskrevet i eksempel 15.

Egnede naturligt forekommende polypeptider, som kan fremstilles af plasmidet 35 ifølge opfindelsen, omfatter human kobber/zinksuperoxiddismutase, human man-

DK 175537 B1 I

26 I

gansuperoxiddismutase, human glutathionperoxidase, humant væktshormon, I

bovint væksthormon, porcint væksthormon, humant apolipoprotein E eller I

forskellige domæner fra fibronektinmolekylet. Det vil naturligvis være klart for I

fagmanden, at plasmiderne også kan indeholde DNA, der koder for andre ønskede

5 naturligt forekommende polypeptider. I

Det dobbeltstrengede DNA-plasmid ifølge opfindelsen kan også omfatte tandem- I

promotorerne deo PI og deo P2. Som det er mere detaljeret beskrevet i eksempel I

1, var det for at klone deo Pl-P2-operator/promotorregionen først nødvendigt at I

10 isolere og oprense deo-operonet. Deo-operonet blev isoleret fra Escherichia coli I

S<pl084, som er beskrevet i Buxton et al., J. Bacteriol. 136: 668-681 (1979). I

Fremgangsmåden til oprensning af deo-operonet og til konstruktion af et plasmid, I

der indeholder tandempromotoreme deo PI og deo P2, er beskrevet i yderligere I

detaljer i eksempel 1.

Forskellige ribosombindingssteder medvirkende til at mRNA transkriberes fra DNA, I

der koder for et ønsket polypeptid eller en polypeptidanalog, hvilke ribosom- I

bindingssteder er i stand til at binde til ribosomværtscellen, forudses også i I

forbindelse med opfindelsen. Ét ribosombindingssted, som kan anvendes, er det

20 naturlige deo ribosombindingssted, der er afledt fra deo-operonet. Et foretrukket I

ribosombindingssted, som er blevet anvendt, er afledt fra deo-operonet og har en , I

to-base ændring i sekvensen nedstrøms for Shine-Dalgarno-sekvensen ved nucleo- I

tider -1 og -3 i forhold til A'et i startkodonen. Dette ribosombindingssted er I

beskrevet nærmere i fig. 2’s forklaring. I

25 I

Et andet foretrukket ribosombindingssted, som er blevet anvendt, er cll-ribosom- I

bindingsstedet fra λ-bakteriofag med følgende sekvens: I 1

TAAGGAAATACTTACAT

attcctttatgaatgta.

27 DK 175537 B1

Andre egnede ribosombindingssteder, som kan anvendes, omfatter et muteret cll-ribosombindingssted fra λ-bakteriofag med sekvensen:

TAAGGAAGTACTTACAT

5 ATT CCTT CATGAATGTA; det naturlige β-lactamase-ribosombindingssted afledt fra pBR322; 10 et syntetisk oligonukleotid med sekvensen: AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA 25 GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT; og; et syntetisk oligonukleotid med sekvensen: , 20 aattcaataatattgaaaaaggaagag gttattataactttttccttctcat .

25 Et andet ribosombindingssted, som er blevet anvendt i den foreliggende opfindelse, er et syntetisk nucleotid med sekvensen: gacaagcctagctttgtttaactttaaggagaaatcata ctgttcggatccaaacaaattgaaattcctctttagtat.

30

Ekspressionsplasmider ifølge opfindelsen indeholder også en ATG-startkodon. Det DNA, der koder for det ønskede naturligt forekommende eukaryotiske polypeptid éller polypeptidanalog, er i fase med ATG-startkodonen.

i

I DK 175537 B1 I

I 28 I

I Ekspressionsplasmidet ifølge opfindelsen omfatter også en DNA-sekvens, der I

I omfatter et replikationsorigin fra et bakterielt plasmid, der er i stand til autonom I

I replikation i værtscellen. Egnede replikationoriginer kan fås fra et utal af kilder. Én I

I sådan kilde, plasmidet pBR.322, er frit tilgængelig fra den offentlige samling ved I

I 5 "The American Type Culture Collection" som ATCC deponeringsnr. 37017. I

I Replikationsoriginet kan også afledes fra ρΟΡΙΔδ. Dette plasmid er velkendt inden

I for området og er be-skrevet af D. H. Gelfand et al., PNAS 15: 5869-5873 (1978) I

I og af M. Muessing et al., Cell 24: 235 (1981). I

I 10 En DNA-sekvens, som indeholder et gen, der er associeret med et selektertbart I

I eller identificerbart phenotypisk træk, som giver sig til udtryk, når plasmidet er til I

I stede i værtscellen, er også en bestanddel af plasmidet. Egnede gener omfatter I

I dem, der er associeret med temperatursensitivitet eller medikamentresistens, fx

I resistens mod ampicillin, chloramphenicol eller tetracyclin. I

I 15 I

I Ekspressionsplasmidet ifølge opfindelsen er fortrinsvis et cirkulært lukket plasmid. I

I Som beskrevet ovenfor kan plasmiderne ifølge opfindelsen anvendes til at fremstil- I

I le adskillige naturligt forekommende polypeptider eller polypeptidanaloger deraf. I

I 20 Blandt de plasmider, der forudses ved den foreliggende opfindelse, er plasmider,

I som producerer human kobber/-zinksuperoxiddismutase, human mangansuper- I

I oxiddismutase, human glutathionperoxidase, humant vaektshormon, bovint I

I væksthormon, porcint væksthormon, humant apolipoprotein E eller fibronektins I

I forskellige domæner.

I 25 I

I Ekspressionsplasmiderne ifølge opfindelsen kan også anvendes til at producere I

I eukaryotiske polypeptidanaloger, der har det naturligt forekommende polypeptids I

I biologiske aktivitet og en aminosyresekvens, som i det væsentlige er den samme I

I som og alligevel forskellig fra det naturligt forekommende polypeptids sekvens, · I

I 30 eller analoger, som har en aminosyresekvens, der er identisk med det naturligt I

I fore-kommende polypeptids sekvens, men som fx adskiller sig ved, at polypeptidet I

I er acetyleret eller ikke-glycosyleret. I

I Ekspressionsplasmiderne ifølge opfindelsen er blevet anvendt til at fremstille en I

I 35 analog af naturligt forekommende human kobber/zinksuperoxiddismutase, der I

29 DK 175537 B1 omfatter en dimer af 2 polypeptidunderenheder, der hver især har en aminosyresekvens, der er identisk med det naturligt forekommende humane kobber/zinksuperoxiddismutases aminosyresekvens, men som ikke er acetyleret ved dens aminoterminale ende. Plasmidet pMF 5531, med restriktionskortet vist i 5 fig. 4, producerer sådan en ana-log af human kobber/zinksuperoxiddismutase.

Andre plasmider, som producerer humane kobber/zinksuperoxiddismutasean aloger, som defineret ovenfor, omfatter plasmidet pMF 5519, der har det restriktionskort, der er vist i fig. 5; plasmidet pMF 558-26, der har det restriktionskort, der er vist i fig. 6; plasmidet pMF 5534, der 10 har det restriktionskort, der er vist i fig. 32; plasmidet pMF-5520, der har det restriktionskort, der er vist i fig. 7; plasmidet pMF 2005, der har det restriktionskort, der er vist i fig. 9; plasmidet pMFS 5533A, der har det restriktionskort, der er vist i fig. 17; og plasmidet pMFS-5538, der har det restriktionskort, der er vist i fig.

18.

15

Ekspressionsplasmiderne ifølge opfindelsen er også blevet anvendt til at fremstille en polypep-tidanalog af humant væksthormon, der har aminosyren methionin bundet til N-terminalen af den naturligt forekommende humane væksthormon polypeptid-sekvens. Et eksempel på et sådant plasmid er plasmidet pTVR 568-4, 20 der har det restriktionskort, der er vist i fig. 11.

Ekspressionsplasmiderne ifølge opfindelsen er også blevet anvendt til at fremstille en analog af bovint væksthormon, der har aminosyreme methionin, asparaginsyre og glutamin bundet til N-terminalen af naturligt forekommende bovint 25 væksthormons polypep-tidsekvens. Eksempler på plasmider til fremstilling af bovint væksthormonanaloger som defineret ovenfor omfatter plasmidet pMFS-5600, der har restriktionskortet som er vist i fig. 12; plasmidet pMFS-5627, der har restriktionskortet som er vist i fig. 29; plasmidet pMFS-5603, der har restriktionskortet som er vist i fig. 30; plasmidet pMFS-5605, der har 30 restriktionskortet, som er vist i fig. 31; og plasmidet pMFS-2006, der har restriktionskortet, som er vist i fig. 37.

Plasmiderne ifølge opfindelsen er også blevet anvendt til at fremstille en analog af porcint væksthormon, der har aminosyreme methionin, asparaginsyre og glutamin 35 bundet til N-terminalen af naturligt forekommende porcint væksthormons polypep-

I DK 175537 B1 I

I 30 I

I tidsekvens. Eksempler pi plasmider til fremstilling af analoger af porcint væksthor- I

I mon som defineret ovenfor omfatter plasmidet pEFF-905, der har restriktionskor- I

I tet, som er vist i fig. 27; og plasmidet pEFF-920, der har restriktionskortet, som er I

I vist i fig. 28. I

I 5 I

I Ekspressionsplasmiderne ifølge opfindelsen er også blevet anvendt til at fremstille I

I adskillige fusionerede polypeptider. Eksempler på fusionerede polypeptider, som er I

I blevet fremstillet af plasmiderne ifølge opfindelsen, omfatter plasmidet pDGE4-3, I

I der har det i fig. 10 viste restriktionskort, og anvendt til at fremstille et I

I 10 mangansuper-oxiddismutase-glutathionperoxidase fusionspolypeptid; og plasmidet I

I pTVR 580-35, der har det i fig. 19 viste restriktionskort, og som er anvendt til at I

I fremstille et humant væksthormon-apolipoprotein E fusionspolypeptid. I

I Den foreliggende opfindelse angår også værtsplasmidsystemer til fremstilling af et I

I 15 naturligt forekommende eukaryotisk polypeptid eller en polypeptidanalog deraf, I

I hvilke systemer omfatter de forskellige plasmider ifølge opfindelsen i en egnet I

I Escherichia co//-vært. Escherichia co//-værten, der indeholder plasmidet er valgt fra I

I gruppen af Escherichia coli-værter bestående af S<p744, S<{>732, vildtype (ATCC I

I deponeringsnr. 12435), S<p540, S<p928, S<p929, MC1061 og S<p930. I

I 20 I

I Escherichia coli-værten i værtsplasmidsystemet kan også være en F-stamme. I

I Mens værten kan være en hvilken som helst F*-stamme, der er kendt af fagman- I

I den, omfatter specifikke F‘-stammer, som kan anvendes i værtsplasmidsystemet, I

I følgende F'-stammer: FMG1655; FW3110; FW2637; FMM294; F1000 og F1100. I

I 25 I

I Opfindelsen angår også et værtsplasmidsystem til fremstilling af en analog af na- I

I turligt forekommende human kobber/zinksuperoxiddismutase, der omfatter en I

I dimer af de polypeptid underen heder, der hver har en aminosyresekvens, der er I

I identisk med den naturligt forekommende humane kobber/zinksuperoxiddismu- I

I 30 tases aminosyresekvens, men som ikke er acetyleret ved den aminoterminale

I ende, hvilke systemer omfatter et plasmid, der indeholder DNA, der koder for I

I human kobber/zinksuperoxiddismutaseanalogen, såsom plasmiderne omtalt I

I ovenfor i en egnet Escherichia co//-vært. I

31 DK 175537 B1

Opfindelsen angår også et værtsplasmidsystem til fremstilling af et superoxid-dismutase-glutathionperoxidase-fusionspolypeptid, der omfatter et plasmid, der indeholder DNA, der koder for fusionspolypeptidet, dvs. pDGE4*3, i en egnet Escherichia co//-vært.

5

Opfindelsen angår også et værtsplasmidsystem til fremstilling af en polypeptid-analog af humant væksthormon med aminosyren methionin bundet til N-terminalen af det naturligt forekommende humane væksthormon, hvilket system omfatter et plasmid, der indeholder DNA, der koder for en analog af humant 10 væksthormon, dvs. pTVR 568-4, i en egnet Escherichia eoli-vært.

Opfindelsen angår også et værtsplasmidsystem til fremstilling af en bovin væksthormonanalog med aminosyrerne methionin, asparaginsyre og glutamin bundet ti) N-terminalen af det naturligt forekommende bovine væksthormon-15 polypeptid, hvilket system omfatter et plasmid, der indeholder DNA, der koder for en analog af bovint væksthormon, dvs. plasmiderne pMFS-5600, pMFS-5627, pMFS-5603, pMFS-5605 eller pMFS-2006, i en egnet Escherichia co/i-vært.

Opfindelsen angår også et værtsplasmidsystem til fremstilling af en analog af 20 pørcint væksthormon med aminosyrerne methionin, asparaginsyre og glutamin bundet til N-terminalen af det naturligt forekommende porcine væksthormonpoly-peptid, hvilket system omfatter et plasmid, der indeholder DNA, der koder for en analog af porcint væksthormon, dvs. plasmidet pEFF-905 eller pEFF-920, i en egnet Escherichia coll·vært.

25

Opfindelsen angår også et værtsplasmidsystem til fremstilling af et humant vækst-hormon-apolipoprotein-fusioneret polypeptid, hvilket system omfatter et plasmid, der indeholder DNA, der koder for fusionspolypeptidet, dvs. plasmidet pTVR 580-34, i en egnet Escherichia co//-vært.

30 I et andet aspekt angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et naturligt forekommende polypeptid eller en polypeptidanalog deraf såsom de analoger, der er defineret ovenfor, hvilken fremgangsmåde omfatter, at værtsplas-midsystemet ifølge opfindelsen dyrkes under betingelser, der tillader fremstilling af

I DK 175537 B1 I

I 32 I

I polypeptidet eller analogen, og at det resulterende polypeptid eller den resulteren- I

de analog isoleres. I

I Under anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er der fremstillet en ana- I

I 5 log af naturligt forekommende human kobber/zinksuperoxiddismutase omfattende I

I en dimer af 2 polypeptidunderenheder, der hver har en aminosyresekvens, der er I

identisk med det naturligt forekommende polypeptids aminosyresekvens, men som I

I ikke er acetyleret ved N-terminalen, et mangansuperoxiddismutase-glutathionper- I

I oxidasefusionspolypeptid, en methionin polypeptidanalog af humant væksthormon, I

I 10 en met-asp-gln polypeptidanalog af bovint væksthormon, en met-asp-gln poly- I

I peptidanalog af porcint væksthormon og et humant væksthormon-apolipoprotein E I

fusionspolypeptid ved at dyrke værtsplasmidsystemer omfattende plasmider, der I

I indeholder DNA, der koder for hver af disse polypeptider, analoger eller fusions- I

I polypeptider og en egnet Escherichia co//-vært under passende betingelser, der

I 15 tillader produktion af polypeptiderne, analogeme eller fusionspolypeptiderne og ved I

I at isolere det resulterende polypeptid, den resulterende analog eller det resulteren- I

I de fusionspolypeptid. I

I Fremgangsmåden til fremstilling at et naturligt forekommende polypeptid eller en I

I 20 polypeptidanalog omfatter lave beluftningstilstande, som beskrevet i detaljer i I

I eksempler 2, 11 og 12. Eksempel 2 beskriver optimale vækstbetingelser til frem- I

I stilling af en analog af human kobber/zinksuperoxiddismutase såsom den ovenfor

I definerede analog. Eksempel 11 og 12 beskriver optimale betingelser til fremstilling I

I af analoger af porcine og bovine væktshormoner. I

I 25 I

I Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til konstitutiv fremstilling af et ønsket I

I naturligt forekommende polypeptid eller en ønsket naturligt forekommende poly- I

I peptidanalog, hvor en carbonkilde, der er forskellig fra glucose, anvendes i vækst- I

I mediet. Idet det ikke ønskes at blive begrænset af en bestemt teori, menes det, at I

I 30 DNA transkriberes i lavere niveauer, når det DNA, der skal udtrykkes, kontrolleres I

I af en deo P2-promotor/-operatorregion, og glucose er til stede i mediet. Glucose I

I synes at være impliceret i at reducere transkriptionsniveauer. Egnede ikke-glucose I

I carbonkilder, som kan anvendes i vækstmediet, omfatter glycerol, fructose, succi- I

I nat, natriumlactat og natriummalat, idet det vil være klart for fagmanden, at andre I

I 35 kilder kan anvendes. I

33 DK 175537 B1

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af ønskede polypeptider eller analoger, hvilken fremgangsmåde omfatter at Escherichia co//-cellerne indledende dyrkes i glucose, hvorved transkriptionsniveauet at det DNA, der koder for 5 det ønskede polypeptid reduceres mens Escherichia coihcelierne vokser, og at der dereftertilsaettes en ikke-glucose carbonkilde efter at glucosen er opbrugt.

Ikke-glucose carbonkilder, som kan anvendes ved dette aspekt af opfindelsen, omfatter glycerol, succinat, natriumlactat, fructose og natriummalat. Andre ikke-10 glucose carbonkilder, der kan anvendes, vil være klare for fagmanden.

Egnede vækstmedier, som kan anvendes, omfatter LB eller minimal saltmedier.

Den type medium, der anvendes, og elementer, der er indeholdt i opløsningen, er beskrevet i detaljer i eksempel 2. Andre elementer, som kan anvendes i opløsning-15 en, vil være klare for fagmanden.

En anden faktor, der er blevet påvist at øge produktion af ønskede polypeptider, er lav beluftning af vækstmediet.

20 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde, hvor polypeptidet eller polypeptidana-logen, der produceres i værtsplasmidsystemet, udskilles i det medium, hvor værts-plasmidsystemet dyrkes, ved tilsætning af en divalent metalion til vækstmediet.

Mens foretrukne divalene metalioner omfatter Cu+2 og Zn+2, vil det være klart for 25 fagmanden, at en hvilken som helst egnet divalent metalion kan anvendes. Der forudses yderligere en fremgangsmåde i forbindelse med opfindelsen, hvor den divalente ion er en blanding af Cu+Z og Zn+2 metalioner. En fagmand vil igen forstå, at en blanding af hvilke som helst egnede divalene metalioner kan anvendes. Det skal også bemærkes, at polypeptidet udskilles i mediet og ikke i det periplasmiske 30 rum.

Det skal yderligere bemærkes, at når det plasmid, der udtrykker det ønskede polypeptid, indeholder en translationsfremmer såsom beskrevet nedenfor, har det vist sig, at polypeptidudbytter er uventet højere, når Escherichia coli-celierne dyrkes 35 ved ca. 30°C.

DK 175537 B1 I

I en anden udførelsesform angår opfindelsen et dobbeltstrenget DNA-plasmid, der I

ved introduktion i en egnet Escherichia colt-værtscelle, gør værtscellen i stand til at I

udvirke ekspression af DNA, der koder for et ønsket polypeptid eller en polypeptid- I

S analog deraf med det naturligt forekommende polypeptids biologiske aktivitet, og I

en aminosyresekvens, som i det væsentlige er det samme som, men dog forskellig

fra, det naturligt forekommende polypeptids aminosyresekvens, og derved at ud- I

virke fremstilling af polypeptidet eller polypeptidanalogen, hvilket plasmid i 5’-3’ I

orden omfatter følgende: I

a) DNA, der i 5!-3' orden omfatter tandempromotorerne deo PI og

deo P2; I

b) en AT-rig sekvenstranslationsfremmer; I

c) et Ndel-restriktionsenzymsted;

d) en ATG-startkodon; og I

20 e) DNA, der koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen i fase

med ATG-startkodonen; I

og som yderligere omfatter en DNA-sekvens omfattende et replikationsorigin fra et I

bakterielt plasmid, der er i stand til autonom replikation i værtscellen, og en DNA- I

25 sekvens, der indeholder et gen, der er associeret med en selekterbar eller identifi- I

cerbar phenotypisk egenskab, der kommer til udtryk, når plasmidet er til stede i I

værtscellen. I

Den yderligere translationsfremmer øger produktionsniveauet af polypeptider pro- I

30 duceret af plasmiderne ifølge opfindelsen. Det har vist sig, at tilsætning af disse I

AT-rige regioner i stort omfang fremmer ekspression af DNA, der koder for ønskede

polypeptider (se eksempel 13 for nærmere detaljer). I en foretrukken udførelses- I

form har det vist sig, at når Escherichia coii-celler og plasmider indeholdende de

AT-rige regioner dyrkes i produktionsmedier ved ca. 30°C i stedet for 37°C, frem- I

35 mes produktionsniveauet yderligere. I

35 DK 175537 B1

Mens det vil forstås af fagmanden, at plasmiderne kan fremstille et hvilket som helst ønsket naturligt forekommende polypeptid eller analogen deraf, producerer plasmidet ifølge opfindelsen fortrinsvis human kobber/zinksuperoxiddismutase. I en 5 foretrukken udførelsesform betegnes plasmidet ifølge opfindelsen pMF 5534 og er blevet deponeret i Escherichia coli-stamme S(p930 (F') under ATCC deponeringsnr.

67703.

Opfindelsen angår også et værtsplasmidsystem til fremstilling af en analog af 10 naturligt forekommende human kobber/zinksuperoxiddismutase omfattende en dimer af 2 polypeptidunderenheder, der hver især har en am'mosyresekvens, der er identisk med naturligt forekommende kobber/zinksuperoxiddismutases aminosyresekvens, men som ikke er acetyleret ved dens aminoterminal, hvilket system omfatter et plasmid indeholdende DNA, der koder for en analog af human 15 kobber/zinksuperoxiddismutase, dvs. plasmidet pMF 5534, i en egnet Escherichia co//-vært.

Egnede værter for værtsplasmidsystemet omfatter S<p744, S<p732, vildtype (ATCC deponeringsnr. 12435), Sq>928, Sq>929, MC1061 og S<p930. Værten kan også være 20 en F'-stamme.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling afen polypeptidanalog af kobber/zinksuperoxiddismutase som defineret ovenfor, hvilken fremgangsmåde omfatter, at værtsplasmidsystemet dyrkes under egnede betingelser, der tillader 25 produktion af analogen, og at den resulterende kobber/zinksuperoxiddismutase-analog isoleres.

1 en foretrukken udførelsesform omfatter sådanne egnede betingelser, at værts-plasmidet dyrkes ved ca. 30°C.

30

EKSEMPLER

Opfindelsen beskrives yderligere under henvisning til de følgende ikke begrænsende eksempler. Eksemplerne omfatter ikke detaljerede beskrivelser af konven-35 tionelle fremgangsmåder, der anvendes i konstruktionen af vektorer, indsætning af

36 I

DK 175537 B1 I

gener, der koder for polypeptider, i sådanne vektorer til dannelse af plasmider eller I

introduktionen af de resulterende plasmider i værter. Eksemplerne omfatter heller I

ikke detaljerede beskrivelser af konventionelle fremgangsmåder, der anvendes til I

at analysere de polypeptider, der produceres af sådanne værtsplasmidsystemer. I

5 Sådanne fremgangsmåder er velkendte af fagmanden og er beskrevet i talrige I

publikationer, herunder fx følgende: T. Maniatis, E. F. Fritsch og J. Sombrook, I

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York I

(1982). I

10 I

EKSEMPEL 1 I

Konstruktion af deo Pl-P2-vektor, der udtrykker et hSOD-analogt protein I

15 For at klone deo P1-P2 operator/promotorregionen var det først nødvendigt at I

isolere og oprense deo-operonet. I

λ cl 857: DNA, der koder for deo-operonet, blev isoleret fra Escherichia coli I

S<pl084, der bærer en deo-transducerende fag i en lysogen tilstand, Buxton et al.,

20 j. Bacteriol. 136: 668-681 (1978). Fremgangsmåden til oprensning af DNA'et er i I

det væsentlige som beskrevet af D. Frelfelder, Biochem. Biophys. Res. Commun. I

18: 141-144 (1965); og D. Freifelder, Biochem. Biophys. Acta 108: 318-319 I

(1965). 2 liter Escherichia co//-kultur dyrket i LB-medium blev udsat for varmechok

i 30 minutter ved 42°C og derefter overført til 39°C i 3 timer. Cellerne blev høstet I

25 ved centrifugering og blev resuspenderet i buffer indeholdende 1-5 mM MgCI2 og få I

dråber chloroform til at lysere cellerne. Lysatet blev påført toppen af en CsCI- I

tringradient og centrifugeret i 2 timer ved en hastighed pi 25.000 omdr./min i en I

SW25-rotor. Et opaliserende bånd, som dannedes på toppen af det CsCI-lag med I

højst densitet, blev isoleret og centrifugeret med natriumperchlorat til opnåelse af I

30 rent fag λ deo-DNA. I

DK 175537 B1 37

Konstruktion af pJBF-5401 - en vektor indeholdende deo-promotorerne PI og P2

Deo PI og P2 operator/promotorregionerne befinder sig på et 980 bp Avall-5 fragment, Valentin-Hansen et al., the EMBO Journal 1: 317 (1982). Dette fragment blev isoleret og klonet som følger (se også fig. 1): deo DNA blev skåret med Avail, og de 5’ udragende ender blev udfyldt ved Klenow-DNA-polymerase. BamHl-linkere blev bundet til blandingen af Avail-fragmenter, og blandingen af Avall-fragmenter med BamHI-linkere blev ligeret med T4-ligase til BamHI-skåret 10 pBR322.

Escherichia coli Sip540 (deleteret for deo-operonet) blev transformeret med den ligerede plasmidblanding og podet på LB-agar indeholdende ampicillin. De kloner, der bar et BamHI-insert indeholdende deo P1-P2, blev identificeret ved hybri- ^ 15 disering til et 32P-mærket syntetisk DNA-fragment svarende til nucleotider 138-167 af deo-promotoren.

Nucleotidsekvensen af det syntetiske fragment var: 20 5'-TTGCCCCAGGTAGACCGGCATCGATGTGAC-3'

En klon ud af adskillige, der hybridiserede til primeren, blev udvalgt og anvendt til yderligere analyser. Plasmid DNA isoleret fra denne klon blev skåret med BamHI og 25 analyseret elektroforetisk på agarosegeler. Fragmenter på 900 bp og 1300 bp samt et fragment svarende til vektoren blev observeret på gelerne. Disse fragmenter blev udsat for Southern-hybridiseringsanalyser med den mærkede probe. Det viste sig, at deo Pl-P2-promotorerne befandt sig i 900 bp-fragmentet. For yderligere at bekræfte tilstedeværelsen af deo P1-P2 blev 900 bp fragmentet skåret med Bglll, 30 BSSHII, EcoRI og Hpall. Størrelserne af de fragmenter, der blev genereret af disse enzymer ved skæring af det 900 bp store fragment, var i god overensstemmelse med det forudsete restriktionsmønster af deo Pl-P2-sekvensen. Det 900 bp store BamHI-fragment blev igen klonet i pBR322 som vist i fig. 1, og det nye plasmid, der blev opnået, som indeholder deo Pl-P2-promotorerne, blev betegnet pJBF-35 5401 (ATCC deponeringsnr. 67359).

38 I

DK 175537 B1 I

Konstruktion af pMF-5416 - en vektor indeholdende deo P1-P2 I

Vektoren pJBF-5401 indeholder ikke et hensigtsmæssigt restriktionssted mellem I

5 ribosombindingsstedets Shine-Dalgarno-sekvens og det første ATG-translations- I

startkodon. For at anvende deo Pl-P2-promo-torerne i en ekspressionsvektor var I

det derfor nødvendigt at konstruere et restriktionssted og samtidig at opretholde I

den samme afstand mellem ribosombindingsstedet og den første ATG. Dette blev ' I

opnået ved at konstruere et Ndel-restriktionssted omfattende sekvensen CATATG, I

10 som er spaltet CA/TATG. Det gen, der skal klones, skal have et Ndel-sted ved I

genets 5’-ende til indsætning i plasmidets Ndel-sted; Ndel-stedets ATG er I

startkodonen. H

Det nye Ndel-sted i deo Pl-P2-vektoren blev konstrueret ved stedspecifik muta- I

15 genese, Y. Morinaga et al., Biotechnology 2: 636-639 (1984) under anvendelse af H

BTG syntetisk DNA-fragment nr. 2015 som beskrevet i Fig. 2. De fire mulige plas- I

mider resulterende fra denne fremgangsmåde er vist i fig. 2. I

Bakterier indeholdende plasmid A elimineres, fordi de er ampicillinfølsomme. H

20 Bakterier indeholdende plasmid B elimineres, fordi de ikke vil hybridisere til det H

nick-translaterede radiomærkede BssHII-SalHI-fragment. Bakterier indeholdende I

plasmider C og D differentieres ved hybridisering til syntetisk DNA-fragment nr. H

2015 under stadig strengere betingelser og efterfølgende ved tilstedeværelsen af I

det nye Ndel-stedet introduceret pi de syntetiske DNA-fragmenter. Plasmid D, I

25 betegnet pMF5416, indeholder de deo Pl-P2-promotorer, der er proximale til det H

nye Ndel-restriktionssted. Sekvensanalyser (ifølge dideoxymetoden ifølge Sanger) H

af 450 bp af deo Pl-P2-promotorsekvensen afslørede imidlertid, at en 48 bp lang I

sekvens, der udstrækker sig fra bp 702-749 af deo Pl-P2-promotoren, ikke er til I

stede. Denne sekvens, som normalt er til stede i deo P2-promotorregionen, og som I

30 er essentiel for transkription, blev åbenbart deleteret under den steddirigerede H

mutagenese.

39 DK 175537 B1 i

Konstruktion af pMF-5531 - et plasmid, der producerer lave niveauer af en hSOD-analog

Den human kobber/zinksuperoxiddismutase (hSOD) kodende sekvens blev 5 derefter introduceret i vektoren indeholdende deo Pl-P2-promotor< og deletionen i P2 blev efterfølgende repareret.

Plasmidet pSODal3 (vist i fig. 21 og konstrueret som i beskrivelsen af figurerne) indeholder det gen, der koder for hSOD nedenstrøms for et Nde-restriktionssted.

10 Det var således muligt at konstruere et nyt plasmid som vist i fig. 3, som indeholder hSOD-genet nedenstrøms for deo Pl-P2-promotoren (med den 48 bp store deletion). Dette nye plasmid er blevet betegnet pMF-5516.

For at opnå ekspression blev deletionen i deo P2-regionen nu repareret som vist i 15 fig. 4 og beskrevet i beskrivelsen af figurerne. Dette producerede et plasmid, der i 5'-3’-sekvens indeholder, den fuldstændige deo Pl-P2-promotorsekvens (herunder det autentiske ribosombindingssted), Ndel-restriktionsstedet og hSOD-genet.

Dette plasmid blev transformeret til Escherichia coli S<p744, en mutant, der 20 mangler cyt R- og deo R-repressorerne. K. Hammer-Jesperson og P. Nygaard,

Molec. Gen. Genet. 148: 49-55 (1976). Efter transformation blev ca. 120 kloner screenet for hSOD-analogekspression ved elektroforese på polyacrylamidgel-ekstrakter af kulturer dyrket på LB-medium. Adskillige kloner generede et meget svagt proteinbånd, som co-migrerede med autentisk oprenset hSOD. En klon blev 25 udvalgt, og plasmid DNA blev oprenset fra denne ved densitetsgradientscentrifugering. Plasmidet blev betegnet pMF-5531. Plasmidet pMF-5531 blev introduceret ved transformation til Escherichia coli 5φ540 og S<p732. Kulturer blev dyrket i LB-medium (eksempel 13a) indeholdende 0,2% glycerol natten over, og en cellemasse svarende til én OD66o-enhed blev behandlet (som beskrevet i eksempel 15) inden 30 påføring på SDS-geler. Disse geler antydede, at et lavt niveau af SOD-analoge svarende til 1,5% af total Escherichia cotf-proteiner blev produceret i Escherichia co//-vært S<p540. Lidt højere niveauer af hSOD blev produceret i S<p732. Den hSOD-analog, der blev produceret i Stp540, reagerede med 12SI-mærket antihuman superoxiddismutaseantistof. For at eliminere muligheden for at det lave ekspres-35 sionsniveau er associeret med en sekvensvariation, der er forskellig fra den

I DK 175537 B1 I

I I

I forventede, blev et Bglll-StuI-fragment, der omfatter forbindelsesstedet for I

I restriktion og ligering, sekventeret og fundet at være korrekt. Dette bekræfter, at I

I plasmidet pMF-5531 indeholder hele deo Pl-P2-promotorregionen. I

I 5 I et efterfølgende eksperiment blev den stedspecifikke mutagenese af plasmidet I

I pJBF5401, der er beskrevet ovenfor (og i fig. 2 og 3), gentaget til dannelse af I

I plasmidet pMF-5416-2 (se fig. 47). Dette plasmid viste sig at indeholde den

I fuldstændige deo Pl-P2-sekvens uden deletion. , I

I 10 Plasmidet pMF-5513-1 blev produceret fra dette plasmid, som vist i fig. 36. I

I Plasmidet pMF-S513-l indeholder den hSOD-analogkodende sekvens under kontrol I

I af deo Pl-P2-promotorsekvensen og, så vidt det kan konstateres, er dette plasmid I

I identisk med plasmidet pMF-5531 (fig. 4). I

I 15 Det protein, der produceres af disse plasmider og af plasmider, der er beskrevet i I

I følgende afsnit, er en analog af naturligt kobber/*zinksuperoxiddismutase. Denne I

I analog er ikke-acetyleret og ikke-glycosyleret. I

I Modificering af deo-ribosombindingsstedet til fremstilling af pMF-5519 - et I

I 20 plasmid med god produktion af en hSOD-analog I

I ' Plasmidet pMF-5531 udviser et lavt ekspressionsniveau af hSOD-genet. I

I Dette kunne være en funktion af afstanden mellem ribosombindingsstedet og I

I messengerens første ATG, idet variation i denne afstand vides at påvirke

I 25 translation. Afstanden i pMF-5531 mellem enden af ribosombindingsstedet og det I

I første AFG er 4 nucleotider. Denne afstand blev forlænget til 6 nudeotider ved at I

I skære pMF-5531 med Ndel, udfylde det med Τ,,-polymerase og religere, hvorved I

I der blev fremstillet et nyt plasmid med to ekstra basepar.

I 30 Dette plasmid blev anvendt til at transformere Escherichia coli Sq>744 (cyt R' deo R) I

I og adskillige kloner blev analyseret ved restriktionsendonudeaseskæring med Ndel I

I for at bekræfte elimineringen af Ndel-stedet ved den udfyldende polymerasereak- I

I tion. Kloner, der indeholdt plasmider, der manglede Ndel-stedet, blev dyrket, og I

I cellelysaterne blev analyseret på SDS-polyacrylamidgeler. Adskillige lysater afslø- I

I 35 rede et proteinbånd, der co-migrerede med et hSOD-markørprotein. Intensiteten af I

I I

41 DK 175537 B1 dette bind viste sig at være flere gange større end den, der blev fundet i pMF-5531. Det plasmid, som syntes at være det med den højeste ekspression, betegnet pMF-5519, blev oprenset og introduceret i forskellige Escherichia co//-værter for at bestemme den mest fordelagtige vært til ekspression. Disse Escherichia co//-værter 5 omfattede vildtype (ATCC deponeringsnr. 12435), S<p928 (Δ deo), S<p929 (Δ deo, cyt R ) og S<p744 (deo R", cyt R). Sidstnævnte vært muliggjorde det højeste ekspressionsniveau. I overensstemmelse hermed blev plasmidet pMF-5519 transformeret til Escherichia coli S<p540, og densitometrisk analyse af proteinprofiler afslørede, at den producerede mere end dobbelt så meget hSOD-analog som 10 plasmidet pMF-5531 i Scp540 (dvs. 3,5% af totalt protein). Plasmidet pMF-5519 blev også transformeret til S<p732 og gav højere niveauer af SOD-analoge end når det var i S<p540, nemlig 5,6% totalt protein.

(Genotypen af hver anvendt Escherichia coli-stamme og kildereferencen 15 er specificeret i tabeller I og IA i eksempel 3).

Resultaterne af disse eksperimenter viser, at ekspression var i området fra ca.

300-900 mg hSOD pr. 50 O.D.-enheder bakteriekultur. Denne evaluering blev foretaget på basis af co-elektroforese og farvning af en 1 pg ren SOD standard 20 sammen med bakterielle prøver efterfulgt af densitometerscanning (enzymniveauer produceret af hver stamme er anført i tabel I i eksempel 3). Den nye sekvens i regionen af det udfyldte Ndel-sted blev bekræftet ved sekvensanalyser.

Yderligere forlængelser af deo Pl-P2-ribosombindingsstedet 25

Eftersom forlængelse af ribosombindingsstedet med 2 basepar (i plasmidet pMF-5519) gav en bedre hSOD-analogproteinproducent, blev en yderligere serie af 4 forlængelser af deo Pl-P2-ribosombindingsstedet konstrueret i et forsøg på at øge produktionen yderligere. For at opnå dette mål blev 8 enkeltstrengede syntetiske 30 DNA-sekvenser synte-tiseret som beskrevet i beskrivelsen til fig. 6.

Komplementære strenge blev blandet til dannelse af en slutkoncentration på 100 pmol/ml og fik lov til at hæfte sig sam-men i 26 timer ved 7°C til dannelse af 4 syntetiske dobbeltstrengede DNA-linkere betegnet I, II, III og IV. Hver dobbeltstrenget DNA-linker blev ligeret som vist i fig. 6 til et 540 bp stort fragment 35 fra deo P1-P2 operator/promotorregionen. Dette fragment var blevet fremstillet

I DK 175537 B1 I

I 42 I

I ved at skære plasmidet pMF-5519 med Stul og BamHI, oprense det resulterende I

I 1000 bp store deo Pi-P2-fragment fra lavsmelte-agarose og inkubere det I

I oprensede fragment med Bglll og Hinfl til dannelse af et 540 bp stort Bglll-Hinfl- I

I fragment; dette 540 bp store fragment blev isoleret fra agarosegel. Det I

I 5 resulterende fragment blev ligeret til pMF-5531 som vist i fig. 6, hvorved afstanden I

I mellem deo Pl-P2-sekvensen og den første ATG blev forlænget. (Plasmidet pMF- I

I 5531 bærer den uændrede Pl-P2-ribosombindingsstedsekvens og er en I

I lavniveauproducent af hSOD-protein.) De plasmider, der blev produceret i hvert I

I tilfælde, blev anvendt til at transformere Sip732 (cyt R‘ deo R'). Kloner blev I

I 10 undersøgt for ekspression af hSOD ved at dyrke dem i LB-medium indeholdende I

I ampicillin efterfulgt af lysering og elektroforese på SDS-acrylamidgeler. Kloner, I

I som syntes at udtrykke hSOD på niveauer, der var mindst lige så høje som pMF- I

I 5531 i S<p732, blev udvalgt, plasmiderne blev oprenset, og det fragment, der I

I indeholdt ribosombindingsstedet, blev analyseret ved dideoxysekventering. På I

I 15 nuværende tidspunkt er sekvensen af plasmider indeholdende 2 af ribosom- I

I bindingsstedsforlængelserne blevet bekræftet. Disse svarer til linkere betegnet I og I

I IV, dvs. henholdsvis 7-8 bp forlængelse og 9-10 forlængelse, og plasmiderne er I

I blevet betegnet henholdsvis pMF-558-26 og pMF-5536. Det har vist sig, at de I

I udtrykker lave niveauer af hSOD-analogprotein svarende til de niveauer, der er

I 20 udtrykt af pMF-5531. I

I Konstruktion af pMF-5520 - en højniveauekspressor af human I

I kobber/-zinksuperoxiddismutase (hSOD) gen I

I 25 Tidligere observationer i laboratoriet har antydet, at human kobber/-zink- I

I superoxiddismutase (hSOD) ekspression drevet af Pu-promotorsystemet kan I

I forbedres ved at erstatte ampicillinresistensgenet på plasmidet med tetracyclin- I

I resistensgenet. Denne fremgangsmåde blev anvendt til yderligere at forhøje I

I ekspressionen af hSOD drevet af deo-promotorerne. Ampicillinresistensgenet i j I

I 30 pMF-5519 blev erstattet med tetracyclinresistensgenet som vist i fig. 7. De frem- I

I stillede plasmider blev transformeret til S<p540 (deleteret for deo-operonet) og I

I podet på LB-agar indeholdende tetracyclin. SDS-gel elektroforeser af de tetra- I

I cyclin- og ampicillinresistente kloner viste forhøjede niveauer af SOD-ekspression I

I fra det tetracyclinresistente plasmid. Dette hidtil ukendte plasmid, der indeholder I

43 DK 175537 B1 tetracyclingenet og udtrykker en hSOD-analog under kontrol af deo-promotor-genet, blev betegnet pMF-5520.

Orienteringen af tetracydinresistensgenet blev bekræftet ved følgende fremgangs-5 måder. DNA fremstillet som beskrevet af H. C. Birnbaum og J. Doly, Nucl. Acid Res.

7: 1513 (1979) blev skåret med BamHI og udsat for elektroforese, hvilket viste 3 fragmenter på ca. samme størrelse, 1400-1500 bp. Dette bekræftede orienteringen af tetracydinresistensgenet med uret. (Hvis tetracydinresistensgenet var i en orientering mod uret, ville man forvente et mindre BamHI-fragment på ca. 700 bp; et 10 sådant fragment blev ikke produceret.) Plasmidet pMF-5520 blev oprenset og introduceret i forskellige Escherichia co//-værter for at bestemme den mest fordelagtige ekspressionsvært. hSOD-ekspressionsniveauerne af plasmidet pMF-5520 i et bredt udvalg af værter er beskrevet i eksempel 3.

15 Konstruktion af pMF-2005 - et h jkopiantalplasmid, der udtrykker hSOD-genet

For yderligere at forbedre ekspressionen af hSOD-gen under kontrol af deo P1-P2-operator/promotoren blev det besluttet at anvende et højkopiantalplasmid, ρΟΡΔ6 20 (ca. 7000 bp langt). Dette plasmid er en kopiantals mutant af pBGP120, som blev afledt af Col El, som beskrevet af D. H. Gelfand et al., PNAS 75: 5869-5873 (1978), Μ. H. Shepard et al., Cell 18: 267-275 (1979) og M. Muesing et al., Cell 24: 235-242 (1981). Dette mutante plasmid kan omfatte ca. 30% af total intracellu-lært DNA. ρΟΡΔδ blev først behandlet som vist i fig. 8 for at erstatte 25 ampicillin-resistensgenet med et tetracyclinresistensgen, og det nye tetracydinresistente højkopiantalplasmid blev betegnet pMF-2001. Deo P1-P2-operator/promotor-regionen og hSOD-genet blev indsat i dette plasmid som vist i Fig. 9. Det resul-terende plasmid (ca. 6400 bp langt) blev først introduceret til Sq>540 ved trans-formation og derefter podet på LB + Tet-agar. Kloner 30 indeholdende højkopiantals-mutanten og det indsatte fragment blev identificeret ved hybridisering til nick-translateret 32P-mærket BamHI-fragment isoleret fra pMF-5519. Et plasmid op-renset ved CsCI-densitetsgradientcentrifugering betegnet pMF-2005 blev introdu-ceret til et udvalg af Escherichia co//-værter såsom vildtype S<p732, Sq>540, S«p930, Sip928 (for genotype se ovenfor og også tabel I) og viste sig 35 at dirigere et meget højt ekspressionsniveau af hSOD-protein under kontrol af deo

DK 175537 B1 I

Pl-P2-operator/pro-motoren. Båndintensiteterne af det udtrykte hSOD-protein i I

disse værter ligner hinanden meget, hvilket antyder at repressorfunktion i værter, I

der bærer aktive deo R- og cyt R-repressorer, ikke længere er effektiv til at

begrænse ekspression; densitometrisk analyse viser at den fremstillede hSOD- I

5 analog udgør ca. 35% af totalt celleprotein. Plasmidet pMF-2005 i Escherichia coli I

S(p732 er blevet deponeret under ATCC deponeringsnr. 67362. I

Konstruktion af deo PI-P2-vektor med β-lactamase ribosombindingssted I

10 deo-ekspressionsvektoren pMF-5531 blev gjort tetracyclinresistent som vist i Fig. I

17 til dannelse af pMFS-5533A. (Som omtalt ovenfor forøger dette ekspressionen H

af hSOD, der er drevet af deo-promotorerne.) Det syntetiske β-lactamase ribosom- H

bindingssted fra ρ500βΜΑΧ-12 (deponeret i ATCC under deponeringsnr. 67177), I

blev indsat i pMFS-5533A som vist i fig. 18. (Produktionen af plasmidet I

15 ρ50ϋβΜΑΧ-12 er vist i fig. 13-16.) Det resulterende plasmid, betegnet pMFS-5538, I

indeholder i 5’-3' orden deo Pl-P2-operator/promotorregionen, det autentiske I

deo-RBS, det syntetiske β-lactamase ribosombindingssted og hSOD-genet. Pias- I

idet pMFS-5538 blev introduceret i Escherichia co//-værten 5φ732 og viste sig at I

være en moderat ekspressor af et hSOD-analogprotein (se tabel I i eksempel 3). I

EKSEMPEL 2 I

Optimale vækstbetingelser for ekspression af hSOD-analogprotein I

25 Ekspression af visse bakterielle genprodukter under deo P2-drevet transkription er H

meget lav i nærværelse af glucose. Dette er blevet vist både for de bakterielle

genprodukter af nudeotidkataboliserende enzymer fra deo-operonet (K. Hammer- I

Jesperson og A. Munch-Peterson, Mol. Gen. Genet. 137: 327-335 (1975)) og for I

genproduktet Escherichia co//-galactokinase (P. Valentin-Hansen et al., EMBO 1: H

30 317-322 (1982)).

Eksperimenter blev udført for at sammenligne virkningen af anvendelsen af H

succinat eller glycerol som carbonkilde til den deo Pl-P2-drevne fremstilling af H

human kobber/zinksuperoxiddismutaseanalogprotein. Forskellige stammer af H

35 Escherichia co//-værter (vildtype 5φ744, Sø930, 5φ928, 5φ540) blev anvendt (for I

45 DK 175537 B1

Escherichia coll·phenotyperne se tabel I i eksempel 3). Alle disse stammer blev også testet, når de indeholdt plasmider pMF-5519 og pMF-5520. Vildtypen Escherichia coli og Sip930 blev også testet, når de indeholdt plasmidet pMF-2005.

Samtlige testede Escherichia co//-stammer blev dyrket i LB-medium indeholdende 5 150 ppm Cu++, 10 ppm Zn++ og enten 0,2% succinat eller 0,3% glycerol som carbonkilde, (se eksempel 10 for anvendte standardteknikker).

Det viste sig, at når glycerol blev anvendt som carbonkilde, var mediets slut-pH

5,8-6,0; når succinat blev anvendt som carbonkilde var mediets slut-pH 8,8-9,0.

10 Ekspressionen af hSOD-analogprotein som målt ved gelelektroforese var meget højere, når glycerol blev anvendt; glycerol blev således anvendt som carbonkilde i efterfølgende eksperimenter.

1 ét eksempel voksede prototroph Escherichia coli-stamme S<j>732 bærende pasmi-15 et pMF 5520 godt i minimal medium indeholdende 75 ppm Cu++, 5 ppm Zn++ og 0,3% glycerol. Resultaterne er vist i tabel I i eksempel 3.

Det minimalemedium, der blev anvendt i samtlige eksperimenter, hvor det er an-ørt, er beskrevet nedenfor.

20 1 liter minimalmedium indeholder: K2HP04 - 8 g KH2P04 - 2 g i IMH4CI - 3g 25 Na-citrat 2 g

MgS04.7H20 - 400 mg Fe-citrat - 40 mg 1.0 ml sporstoffer 30 Sporstofopløsningen indeholder:

MnS04.2H20 - 1 g ZnS04.7H20 - 2,78 g CoCI2.6H20 - 2 g 35 Na2Mo04.2H20 - 2g

DK 175537 B1 I

CaCI2.2H20 - 3 g I

CuS0<j.5H20 - 1,85 g I

H3BO3 - 0,5 g I

Koncentreret HCI - 100 ml I

5 Deionoiseret vand - 900 ml I

Virkningen af beluftning på produktion af hSOD-analogprotein af forskellige I

stammer af Escherichia coli (S<p744, S<p928 og Sq>540) bærende ptasmidet pMF- I

5520 blev også undersøgt. Ekspressionen af hSOD-analogprotein som målt ved I

10 gelelektroforese er klart højere når der er lav beluftning. Disse laboratorieresultater I

blev opskaleret (i tilfældet med Escherichia coli S<p744 bærende pMF-5520) til I

2 liter gæringstanke (1 liter næringsvæske). Igen var hSOD-ekspressionen højere I

under lave beluftningsbetingelser, og disse blev anvendt i alt efterfølgende arbejde. I

15 Det konstitutive ekspressionssystems kinetik I

Idet ekspression, der er drevet af deo-promotorerne, er konstitutiv, når cellerne I

dyrkes på en ikke-glucose carbonkilde (som beskrevet ovenfor) var det af interesse I

at bestemme, om ekspressionsniveau er konstant ved et bestemt tidspunkt af I

20 kulturvækst. Til dette formål blev S<p732 indeholdende pMF-5520 podet i minimal- I

saltopløsning indeholdende glycerol til ODS60 0,05 og dyrket ved 37°C. I tidsinter- I

valler blev prøver på én ODeeo-ækvivalent fjernet og påført SDS-gelelektroforese. I

Intensiteten af SOD-proteinbånd steg, som kulturen nåede sen logaritmisk vækst- I

fase, og blev yderligere intens ved kulturens ældning (16-24 timers dyrkning). I

25 Densitometrisk analyse viser, at hSOD udgør 3-5% af totalt celleprotein ved I

logfase og akkumulerer gennem sen log og stationær fase op til 15% af totalt I

celleprotein. I

En bemærkelsesværdig egenskab ved den deo-promotordrevne ekspression I

30 er forholdet mellem hSOD-ekspression og kulturalder. Som beskrevet ovenfor er H

den relative intensitet af hSOD-proteinbåndet på SDS-polyacrylamidgeler rimeligt H

lav under logaritmisk vækstfase. En progressiv stigning i hSOD-ekspressionsniveau H

finder sted fra tidlig stationær fase til sen stationær fase, og denne ekspression H

topper ca. 16-24 timer efter podning af cellerne. Den observerede stigning i I

47 DK 175537 B1 ekspression i stationær fase kan tilskrives en stigning i plasmidkopiantal i cellen, eller stigning i transkription-translation af plasmidkodede gener som en konsekvens af reduceret transkription-translation fra hvilende cellers kromosomer. Afhængigheden af hSOD-ekspression på kulturalder var ikke observeret, når 5 værten indeholdt højkopiantalplasmidet pMF-2005; i dette tilfælde ligner hSOD-ekspressionsniveauerne i logfasevækst og i stationær fase hinanden. Dette er ikke overraskende i betragtning af, at én enkelt celle indeholder ca. 400 plasmider (Shepard et al., Cell 18: 267-275 (1979)).

10 De data, der er præsenteret her, viser klart, at det er muligt at opnå højniveau konstitutiv ekspression med deo-promotorerne. Den konstitutive ekspression med deo-promotor har adskillige fordele sammenlignet med et inducerbart ekspressionssystem. Den eliminerer behovet for ekstern påvirkning såsom temperaturskift eller medium-supplering og muliggør bedre oxygenoverførsel på grund af lavere 15 dyrkningstemperatur. Desuden fremmer systemet vækst og ekspression af klonede gener i kontinuer kultur. Andre værtsvektorsystemer, der udtrykker hSOD-analoge konstitutivt, er beskrevet i eksempel 14.

Idet det ikke ønskes at blive bundet til én teori, er det muligt, at det deo-konsti-20 tutive system til fremstilling af hSOD-analoge lykkes, fordi human superoxiddis-mutase er et opløseligt protein. Når uopløseligt protein, fx væksthormon, produceres under kontrol af deo Pl-P2-promotorer, foretrækkes det først at opnå den ønskede biomasse ved vækst på glucose og derefter at skifte over til en ikke-glucose carbonkilde til kemisk induktion (se eksempel 11 og 12).

25 EKSEMPEL 3

Enzymatisk aktivitet af det producerede hSOD-analogprotein 30 3 deo Pl-P2-vektorer, der udtrykker hSOD-analogprotein (pMF-5519, pMF-5520 og pMF-2005) blev introduceret i et udvalg af Escherichia co(i-værter, og den enzymatiske aktivitet af hSOD-analogen i rå celleekstrakter blev målt ved at følge inhi-beringen af ferricytochrom-C reduktion som beskrevet af McCord og Fridovich, J.

Biol. Chem. 244: 6049-6055 (1969).

35

I DK 175537 B1 I

I 48 I

I Resultaterne er vist i tabel 1. Disse eksperimenter antyder, at det tetracydinresi- I

I stente plasmid pMF-5520 producerer et noget højere niveau af hSOD-analogt en- I

I zym end det ampicillinresistente plasmid pMF-5519. Tabel I viser også klart, at det I

I højkopiantal deo Pl-P2-indeholdende plasmid pMF-2005 producerer ca. dobbelt så I

I S meget hSOD-analogt enzym som de andre deo Pl-P2-vektorer. I

I Som det også klart vises i tabel I, svarer plasmider, der producerer hSOD-analoge I

I under kontrol af en deo Pl-P2-promotor, til eller er bedre end pSODPiTll, et plas- I

I mid, der producerer hSOD under kontrol af en λ PL-promotor. Plasmidet I

I 10 pSODPiTll er deponeret hos "The American Type Culture Collection" (ATCC) i I

I Rockville, Maryland 20852, U.S.A. under ATCC deponeringsnr. 53468 ifølge I

I Buda pesttraktaten. Plasmidet har det restriktionskort, der er vist i fig. 13. I

49 DK 175537 B1

TABEL I

SOD-aktivitet i rå celleekstrakter

Gange stig- i Indeholdt X hSOD af to Gange stigning hSOD ning af

Stamme* plasmid talprotein i hSOD-protein S.A. hSOD S.A.

S.p540 pMF 5519 3,5 204 1,37 S<p540 pMF 5520 6,5 1,85 281 S(p930 pMF 5519 5,4 254 S<p930 pMF 5520 13,0 2,4 381 1,50 S<p732 pMF 5519 5,6 201 S(p732 pMF 5520 14,0 2,5 397 1,97 S<p732 pMF 5538 110

ATCC

12435 pMF 5519 6,2 140

ATCC

12435 pMF 5520 6,3 1,05 194 1,38

ATCC

12435 pMF 2005 35 5,6 700 5,00 S«p928 pMF 5520 263 S«p929 pMF 5520 282 S<p744 pMF 5520 397 A4255 pSOD^^i 113-188 * Bemærkning: For genotype og kilde af hver bakteriestamme, se tabel IA.

------ - i

DK 175537 B1 I

TABEL ΙΑ I

Bakteriestammer af Escherichia coli* H

* S#>540 - thi, leu, Adeoll, rspL (λ cl 857 Sam7 :: deo). I

JLJu

Scjp928 * thi, ton, upp, udp, lac, Adeoll.

S<p929 - thi, ton, upp, udp, lac, cyt R-15, Adeoll.

JLJL H

S<p930 - thi, ton, upp, udp, lac, Adeo, deo R-7, elm A.

*** S^732 - deo R-l, cyt R-4, str A. I

**** S^>744 - met, ile, cyt R, deo R. I

ATCC 12435 - vildtype. I

A A255 - biotin-afhængig vildtype. H

Escherichia coli-stamme S«>540 er beskevet af R. S. Buxton,

K. Hammer-Jesperson og T. D. Hansen, J. Bacteriol. 136: 668- H

681 (1978). I

** Escherichia coli-stammer S^928, S^929 og S<p930 er beskrevet I

af Valentin-Hansen et al., Molec. Gen. Genet. 159: 191-202 I

(1978). I

Escherichia coli-stamme S<p732 er beskrevet af K. Hammer-

Jesperson og A. Munch-Peterson, Molec. Gen. Genet. 137: 327- H

355 (1975); det er en prototropisk stamme. H

Escherichia coli-stamme S^7AA er beskrevet af K. Hammer-

Jesperson og P. Hygaard, Molec. Gen. Genet. 148:.49-55 H

(1976). I

^ Bemærk at anvendte F*-stammer er beskrevet i eksempel 21. I

51 DK 175537 B1 EKSEMPEL 4

Konstruktion af deo Pl-P2-vektor, der udtrykker MnSOD-GPX fusionsprotein 5

Plasmidet pE4GPX (se fig. 10) blev konstrueret som vist i fig. 39 og som beskrevet i US patentansøgning nr. 085,647. Plasmidet pE4GPX blev konstrueret fra plasmi-der pMSE4 (ATCC deponeringsnr. 53250), der indeholder den fuldstændige cDNA-sekvens, der koder for human MnSOD, og fra plasmidet pl8UL-l (ATCC depone-10 ringsnr. 67361), der indeholder den fuldstændig cDNA-sekvens, der koder for glutathionperoxidase (hGPX). Plasmid pE4GPX er et fusionsplasmid, der indeholder hele den kodende sekvens af hPGX ligeret til 3’-enden af det trunkerede hMnSOD-gen. Det udtrykker et fusionsprotein under kontrol af λ PL og cll-ribosombindings-stedet. Det producerede fusionsprotein er ca. 190 aminosyrer langt; N-terminal-15 sekvensen er de første 152 aminosyrer af hMnSOD. Den totale længde på ca. 190 aminosyrer viser muligvis, at translationstermineringen fandt sted inden for den kodende hGPX-sekvens.

Som vist i fig. 10, blev λ PL-promotor-operatoren fjernet fra plasmidet pE4GPX, og 20 det 1,3 kb store fragment fra pMF-5531 indeholdende deo Pl-P2-sekvensen blev indsat i stedet for. Dette hidtil ukendte plasmid, pDGE4-3 indeholder i 5'-3' orden deo P1-P2, cII-RBS og MnSOD-GPX-sekvenserne. Dette plasmid blev transformeret til Escherichia coii MC1061 (M. Casadaban og S. N. Cohen, J. Mol. Biol. 138: 179-207 (1988)), og de resulterende kloner blev analyseret for produktion af 25 MnSOD-GPX fusionsprotein. Cellerne blev dyrket i LB-medium -f ampicillin; LB-medium er beskrevet i eksempel 13. Celler der indeholdt plasmidet pDGE4-3 udtrykte store mængder af et hMnSOD-hGPX fusionsprotein, der co-migrerede med det fusionsprotein (ca. 190 aminosyrer langt), der blev produceret under kontrol af λ PL-promotoren og cII-RBS i plasmidet pE4GPX. Western blot-analyse under an-30 vendelse af anti-MnSOD-antistoffer viste at små mængder af et fusionsprotein i fuld størrelse blev produceret, hvilket antyder gennemlæsning af TGA-"stop"-kodonen inden for den kodende sekvens af hGPX.

I DK 175537 B1 I

I 52 I

I Således kan deo P1-P2 operator/promotorregionen sammen med cll-ribosom- I

I bindingsstedet dirigere syntesen af store mængder af et fusioneret MnSOD-GPX- I

I protein. I

I 5 Plasmidet pDGE4-3 blev også overført til Escherichia coli-stamme S<p732 (cyt R\ I

I deo R), og meget lignende ekspressionsniveauer blev opnået. I

I EKSEMPEL 5 I

I 10 Konstruktion af deo Pl-P2-vektor, der udtrykker humant væksthormon I

I (hGH)-protein I

I Plasmidet pTVR 568-4 blev konstrueret som vist i fig. 11 ved at fjerne hele den I

hMnSOD-kodende sekvens og en del af den hGPX-kodende sekvens fra plasmidet I

15 pDGE4-3 og erstatter disse med den sekvens, der koder for humant væksthormon I

I (hGH) fra plasmidet pTV 104(2) (ATCC deponeringsnr. 39384). Dette nye plasmid, I

pTVR 568-4, indeholder i 5'-3' orden deo P1-P2, cII-RBS og hele hGH-sekvensen. I

I Det blev transformeret til Escherichia coli MC1061, og kolonier, der udtrykker hGH- I

I analog, blev udvalgt ved at hybridisere polyklonale anti-hGH-antistoffer til kolonier, I

I 20 der var lyseret og immobiliseret på filtre. Efter vækst natten over i LB-nærings- I

væske indeholdende ampicillin (som beskrevet i eksempel 13) blev kulturen lyseret I

I og udsat for elektroforese pa SDS-polyacrylamidgeler. I

Det viste sig, at pTVR 568-4 dirigerer produktion af hGH på niveauer, der estime- I

I 25 res til at være 20-25% af det totale bakterielle protein. Direkte sammenligninger I

I pi polyacrylamidgeler af proteiner fra celler indeholdende denne konstruktion I

(pTVR 568-4) og fra celler indeholdende hGH under kontrol af λ PL-promotoren I

I (pTVR 104-2) antyder, at 50-100% mere hGH produceres af deo-promotoren I

I sammenlignet med λ-promotoren. I

53 DK 175537 B1 EKSEMPEL 6

Konstruktion af deo Pl-P2-vektor, der udtrykker bovint væksthormon (bGH)-analog 5

Plasmidet pMFS-5600 blev konstrueret som vist i fig. 12 ved at fjerne den MnSOD-kodende sekvens og en del af den hGPX-kodende sekvens fra deo P1-P2 ekspressionsvektoren pDGE4-3 og erstatter dem med den 750 bp store bGH-sekvens fra pSAL 440-11. Plasmidet pSAL 440-11 fremstilles som beskrevet i beskrivelsen til ίο fig. 12.

Det ligerede plasmid blev transformeret til Escherichia coli-stamme Sq>732 (cyt R' deo R ) (mht. detaljer for denne stamme se tabel I i eksempel 3). Kloner, der udtrykker met-asp-gln-bGH-analogen, blev udvalgt og dyrket i bufferede LB-15 medier indeholdende succinat som carbonkilde og ampicillin. Den klon, der var betegnet pMFS-5600, blev anvendt til isolering af plasmid og yderligere forsøg.

Plasmidet pMFS-5600 indeholder i 5’-3‘ orden deo P1-P2, det autentiske deo-RBS, cII-RBS, hele den bGH-kodende sekvens efterfulgt af en del af den hGPX-kodende 20 sekvens og den human kobber/zinksuperoxiddismutasekodende sekvens. Plasmid pMFS-5600 udtrykker bGH-protein på et højt niveau. GPX- og human kobber/zink-superoxiddismutasesekvenserne translateres ikke på grund af translationtermine-ringssignalet ved bGH-genets 3'-ende.

25 EKSEMPEL 7

Konstruktion af deo Pl-P2-vektorer, der udtrykker apoiipoprotein E (ApoE) fusionsprotein 1 35

Plasmidet pTVR 580-35 blev konstrueret som vist i fig. 19 ved at erstatte den hGH-kodende sekvens i plasmidet pTVR 568-4 med den hGH-ApoE fusionerede sekvens fra plasmidet pSAL 160-5; sekvensen omfatter de første 45 aminosyrer af hGH fusioneret til aminosyrer 12-299 af apoiipoprotein E3. Plasmidet pSAL-160-5 er vist i fig. 34 og er konstrueret som beskrevet i beskrivelsen til figurerne (fig. 22-25).

I DK 175537 B1 I

I I

I Det resulterende ligerede plasmid blev transformeret til Escherichia coli-stamme I

I A1645. Plasmidet pTVR 580-35 i Escherichia coli-stamme A1645 blev dyrket i LB- I

I styrket (LBF) medium. (1 liter LBF-medium indeholder 20 g trypton, 10 g gær- I

I ekstrakt, 5 g NaCI, 0,3 M MgSC>4 og 0,1 Μ K2HPO4). Kloner, der udtrykker et I

I 5 genprodukt af den forventede størrelse blev udvalgt, og klonen, der blev betegnet I

I pTVR 580-35, blev isoleret. I

I Plasmidet pTVR 580-35 indeholder i 5'-3‘ orden deo P1-P2, det autentiske deo- I

I RBS, cII-RBS og den hGH-ApoE fusionerede kodende sekvens. Den udtrykker I

I 10 fusioneret hGH-ApoE på høje niveauer. Plasmidet blev retransficeret til prototrof I

I stamme Escherichia coli MC1061, og den resulterende klon blev betegnet 580-35-

1. I

I EKSEMPEL 13 I

I 15 I

I Konstruktion af deo Pl-P2-vektorer, der udtrykker porcint væksthormon I

I (pGH) analogprotein I

I Følgende afsnit giver detaljer om konstruktionen af en serie deo Pl-P2-ekspres- I

I 20 sionsplasmider, der dirigerer produktionen af pGH-analogen. I

I (a) Plasmid pEFF-905 I

I Som vist i fig. 27 blev det fragment, der i 5'-3'-orden indeholder cll-risombindings^ I

I 25 stedet, pGH-sekvensen og TjT2-terminatorsekvensen, fjernet fra plasmidet pEFF- I

I 902 og sat ind i plasmidet pMF 5531, hvorfra hSOD-sekvensen delvist er blevet I

H

I fjernet. (Plasmidet pMF 5531 udtrykker hSOD-analogprotein under kontrol af deo j I

I Pl-P2-promotoren - se fig. 4). I

I 30 Det resulterende plasmid pEFF-905 blev transformeret til Escherichia coli Sq>732 I

I (beskrevet i tabel 1). Plasmid pEFF-905 udtrykker pGH-analogproteinet under I

I kontrol af deo PI-P2-promotoren og cll-ribosombindingsstedet. I

I Ekspressionen fra celler, der indeholder plasmidet pEFF-905, faldt imidlertid I

I 35 drastisk efter adskillige overførsler, hvilket antyder, at denne konstruktion er usta- I

55 DK 175537 B1 bil. Dyrkning af Escherichia coli Stp732-celler, der indeholder pEFF-905, i et rigt medium (LB + 0,3% glycerol + ampicillin) viser et progressivt fald i produktion af pGH-analoge efter kun 15 generationer. (1 liter LB-medium indeholder 10 g tryp-ton, 5 g gærekstrakt, 10 g NaCI og pH justeret til 7,5 med NaOH; som beskrevet af 5 T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sombrook, i Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Denne ustabilitet kan muligvis skyldes forkert adskillelse, forkert replikation eller andre årsager, der alle skyldes de meget høje ekspressionsniveauer.

10 (b) Plasmid pEFF-920 i) Konstruktion af plasmidet pEFF-920

For at øge plasmidstabilitet blev et 350 bp stort fragment indeholdende PAR 15 (partition) sekvensen fra plasmidet pSCIOl introduceret i pEFF-905, som vist i fig.

39. (PlasmidetpSCIOl er tilgængeligt hos ATCC under deponeringsnr. 37032, og det er blevet beskrevet af S. Cohen i J. Bact. 132: s. 734-737, 1977 og i J. Bact.

134:, s. 1141-1156, 1978). Det resulterende plasmid, betegnet pEFF-920, producerer pGH-analogproteinet under kontrol af deo Pl-P2-promotoren og cll-20 ribosombindingsstedet og omfatter yderligere PAR-sekvensen. Plasmidet pEFF-920 er deponeret i Escherichia coli-stamme S<p930 under deponeringsnr. ATCC 67706. 1 35 Vækst og ekspression af Escherichia coli S<p732, der bærer plasmidet pEFF-920 25

Plasmidet pEFF-920 blev introduceret i Escherichia coli Stp732 (beskrevet i tabel I) og dyrket i separate eksperimenter i rigt medium (LB + 0,3% glycerol + ampicillin) og i minimalmedium (MM + ampicillin + 0,2% glucose). Sammensætningen af LB-medium er som beskrevet i (a) ovenfor; sammensætningen af minimaimedium 30 (MM) er givet i eksempel 2. Plasmidstabilitet og ekspressionsniveauer blev fulgt. 1 rigt medium blev plasmiderne opretholdt stabilt i ca. 60 generationer, hvorefter der var et skarpt fald i ekspression; dette er en stor forbedring i forhold til ekspressionen af plasmidet pEFF-905, der viser et fald i ekspressionsniveauer efter kun 15 generationer (se (a) ovenfor).

I DK 175537 B1 I

I 56 I

I I minimalmedium (hvortil glucose er tilsat) blev plasmiderne opretholdt i mere end I

I 80 generationer, selv om de gav lave ekspressionsniveauer. Når glucose var op- I

I brugt, og glycerol blev tilsat som carbonkilde, akkumulerede pGH imidlertid i I

I cellerne og kunne observeres under mikroskop som store lysbrydende legemer. I

I 5 Disse observationer antyder, at PAR-sekvensen på plasmidet øger sandsynligheden I

I for korrekt replikation af hele plasmidet. Det lave niveau af deo Pl-P2-dreven I

I ekspression, der er beskrevet ovenfor, i nærværelse af glucose skyldes sandsynlig- I

I vis "glucoseeffekten", der er beskrevet ovenfor. Nar glucose er til stede, er

I ekspression af det genprodukt, der er drevet af deo P2-promotoren, meget lav; I

I 10 Idet deo PI-promotoren er svag fremstilles kun lidt genprodukt af deo P1-P2- I

I promotorerne i nærværelse af glucose. I nærværelse af glycerol som energikilde er I

I ekspression fra deo P2-promotoren imidlertid høj (eksempel 2). Nar glucose var I

I opbrugt, og glycerol var blevet tilsat som energikilde, blev deo Pl-P2-drevne I

I transkriptionsniveauer således forhøjet og store mængder pGH-analoge blev I

I 15 produceret. I

I (iii) Batchfermentering af E. coli-stamme Sq>732, der indeholder I

I plasmidet pEFF-920 I

I 20 Batchfermentering af stamme S<p732/pEFF-920 blev udført i 2-liters gæringstanke I

I ved 37°C i minimalmediumopløsning (se eksempel 2) og 1% glucose. Under disse I

I betingelser er fordoblingstiden 60 minutter. Når glucose var opbrugt, blev kulturen I

I dyrket med glycerol for at muliggøre at deo Pl-P2-dreven transkription af pGH- I

I analogen kunne finde sted (se (ii) ovenfor). Glycerolfermentering lodes fortsætte i I

I 25 4-8 timer. OD66o ved høsttid var fra 30-80 OD-enheder/ml afhængig af den mæng- I

I de glucose, der blev tilsat ved dyrkningens start. SDS-PAGE-elektroforese af prøver I

I fra høsttidspunktet antydede, at ekspressionen af pGH-analogen oversteg det ni- I

I veau, der blev observeret med andre λ PL-ekspressionssystemer (se tabel II i I

I eksempel 12), og at den totale mængde produceret pGH-analog var større end I

I 30 25% af totalt celleprotein. Se eksempel 16 hvad angår yderligere undersøgelser af I

I optimeringen af ekspression af pGH-analogprotein fra disse vektorer. I

EKSEMPEL 9 57 DK 175537 B1

Yderligere deo Pl-P2-plasmider, der udtrykker bovint væksthormon (bGH) analoge 5 Følgende afsnit giver detaljer om konstruktionen af plasmider, der udtrykker en pGH-analog under kontrol af deo PI-P2-promotorerne. Disse plasmider afviger fra dem, der er beskrevet i eksempel 6 (pMFS-5600) primært ved tilstedeværelsen af T|T2-transkriptionstermineringssekvenserne. Det var forventet, at dette ville øge 10 plasmidernes stabilitet; plasmidet pMFS-5600 så ud til at være ustabilt under almindelige vækstbetingelser.

(a) Konstruktion af plasmider, der udtrykker bGH-analoge 15 (i) Plasmid pMFS-5627

Det 1750 bp store fragment fra pFSAL-130-B27 {deponeringsnr. ATCC 67071), der indeholder bGH- og Tyiysekvenserne, blev fjernet og indsat i det deo P1-P2-indeholdende plasmidet pMF-558-26 (se fig. 6). Det resulterende plasmidet pMFS-20 5627, der er vist i fig. 29, blev transformeret til Escherichia coli Sq>732 (se tabel 1).

Plasmidet pMFS-5627 dirigerer ekspressionen af met-asp-gln-bGH-analogen under kontrol af deo Pl-P2-promotoren og deo-ribosombindingsstedet. Plasmidet pMFS-5627 er en lavniveauekspressor af bGH-analogen.

25 (ii) Plasmid pMFS-5603

Plasmid pMFS-5603 blev produceret fra plasmidet pMFS-5627 ved at erstatte deo-ribosombindingsstedet med cll-ribosombindingsstedet, som vist i fig. 30. Plasmidet pMFS-5603 blev overført til Escherichia coli S«p732 og gav et intermediært ekspres-30 sionsniveau af bGH-analog-proteinet.

(iir) Plasmid pMFS-5605

For at fremstille en bedre deo Pl-P2-ekspressor af bGH-analogen blev PAR-35 fragmentet fra plasmidet pEFF-920 ligeret til plasmidet pMFS-5603. Det resulte-

DK 175537 B1 I

58 I

rende plasmid pMFS-5605 (fig. 31) dirigerer uventet højniveauekspression af bGH- analogen (20-25% af det totale celleprotein) under kontrol af deo Pl-P2-promo-

toren og cll-ribosombindingsstedet. Plasmidet pMFS-5607 (fig. 35) blev I

konstrueret fra plasmidet pMFS-5605 ved at erstatte ampicillinresistensgenet med I

5 et gen for tetracyclinresistens. Plas-midet pMFS-5607 blev deponeret i Escherichia co//-stamme 5φ930{Γ) under depo-neringsnr. ATCC 67704. Læg mærke til at

Escherchia coli F‘-stammerne er beskre-vet i eksempel 15.

(b) Væksten af Escherichia coli S<p732, der indeholder plasmider, der I

10 udtrykker bGH-analoge I

Væksten af bGH-analoge udtrykkende plasmider pMFS-5627, pMFS-5603 og I

pMFS-5605 i Escherichia coii Sq>732 blev studeret på laboratorieskalaniveau.

Plasmiderne blev alle dyrket indledningsvis i LB-medium (eksempel 8b) + ampicillin I

15 + 0,2-0,3% glycerol. Efterfølgende blev de alle dyrket i minimalmedium (eksempel I

2) + 0,2% glucose; når glucosen var opbrugt blev 0,2-0,3% glycerol tilsat I

(eksempel 8b). I

EKSEMPEL 10 I

20 I

Standardteknikker anvendt ved eksemplerne I

Escherichia co//-transformation og isolation og oprensning af plasmid DNA blev I

udført ifølge Maniatis et al. i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring I

25 Harbor, 1982. DNA-fragmenter blev isoleret fra geler, der var fremstillet med lavt- I

smeltende agar (FMC) og oprenset med phenol. DNS-sekventering blev opnået I

ifølge dideoxymetoden af Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sti., USA, 74, s. 5463- I

5467, 1977. I 1 2 3 4 5 6

Protein blev bestemt ifølge fremgangsmåden af Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, s. I

2 265-275, 1954. SDS-polyacrylamidgeler til elektroforese blev fremstillet som be- 3

skrevet af Laemmli, U.K., Nature, 227, s. 680-685, 1970 og farvet med I

4

Coomassie-blue R. 15 μΙ af den totale celleekstrakt blev påført pr. hul medmindre I

5

andet er angivet. I

6 59 DK 175537 B1

Enzymaktivitet af superoxiddismutase blev målt i råekstrakter ifølge fremgangsmåden af McCord et al., J. Biol. Chem. 244, s. 6049-6055, 1969. Højt oprenset SOD, der tilvejebringer ca. 4000 enheder pr. mg protein, blev anvendt som standard.

5

Kolonihybridisering med syntetiske prober var i det væsentlige som beskrevet af Grunstein et al., Proc. Nat. Acad. Sti., USA, 72, s. 3961-3965, 1975. Hybridisering blev udført ved 8xSSC ved 42°C i 18 timer, og vaskene blev udført med 5xSSC/0,l% SDS ved samme temperatur. For at ændre stringens blev både SSC-10 koncentration og temperatur ændret efter behov. Nick-translation på oprensede DNS-fragmenter var som beskrevet i Maniatis et al. (supra). Hybridisering blev udført under anvendelse af 5xSSC ved 60°C i 18 timer og derefter vasket med lxSSC/0,1% SDS. Agfa røntgenstrålefilm blev som regel eksponeret til nitrocellulosefiltre i 4-6 timer inden fremkaldelse.

15

Restriktionsendonuclease, T4-ligase, T4-DNA-polymerase og Escherichia coii-DNA-polymerase (Klenow-fragment) blev skaffet fra New England Biolabs og anvendt som anbefalet af fabrikanterne. λ32Ρ-ΑΤΡ, a32P-deoxy-CTP og a320-deoxy-ATP blev leveret af Amersham.

20

Bakteriel vækst og ekstraktion

De Escherichia co//-stammer, der blev anvendt ved dette studium, er anført i tabel I. Hvor der ikke er angivet andet blev kulturerne dyrket i LB- eller minimalsaltop-25 løsninger (Vogel & Bonner, 1956) suppleret med ampicillin (100 pg/ml) eller tetra-cyclin (12,5 pg/ml) og med 0,2-0,3% glycerol som eneste carbonkilde.

Escherichia coli-ceIler indeholdende et plasmid, der udtrykker hSOD-analoge, blev dyrket i medium, hvortil Cu++ og Zn4+ rutinemæssigt blev tilsat (som regel ved 30 henholdsvis 75 og 10 pg/ml, medmindre andet er angivet). Tilsætningen af Cu er for at muliggøre produktion af enzymatisk aktive hSOD-analoge som beskrevet i US 4.742.004. Celler blev dyrket natten over ved 37åøåC, og en 1,0 OD66o-ækviva-lent blev høstet. Den bakterielle pellet blev resuspenderet i 100 μΙ 50 mM Tris-HCI pH 8 og lyseret i 3 x prøvebuffer indeholdende 30 volumenprocent glycerol, 9% 35 SDS, 2,1M mercaptoethanol, 187,5 mM Tris-HCI pH 6,8 og 0,5% bromphenolblåt

I DK 175537 B1 I

I 60 I

I og opvarmet i kogende vand i 5 minutter. Ekstrakter til SOD-enzymaktivitetsbe- I

I stemmelse blev fremstillet ved at ødelægge celler ved sonikering. I

I Oligonucleotidsyntese I

I 5 I

I Oligodeoxynucleotider blev fremstillet ved fastfasesyntese under anvendelse af I

I phosphoramiditkemi. Den anvendte syntesefremgangsmåde var i det væsentlige I

I den, der beskrevet af Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105: s. 661-663, 1983 og I

I Beaucage et al., Tetrahedron Letts 22: s. 1859-1862, 1981. I

I 10 I

I De syntetiske oligomerer blev oprenset ved gelelektroforese efterfulgt af Ci8- I

I kromatografi. En femtedel af hvert afbeskyttet lyofiliseret produkt blev opløst i 20 I

I ml gelbuffer indeholdende 80 volumenprocent formamid, påført til en 40 cm 20% I

I acrylamid/7M urinstofgel og udsat for elektroforese ved 300 v i 15 timer. Fuld- I

I 15 længdeprodukter blev lokaliseret ved at overføre gelen ved hjælp af plastfolier til I

I en fluorescerende TLC-plade med en 354 nm fluorescensindikator (Merck) og I

I analyseret ved at påvise UV-skygger. Udskårne gelfragmenter blev knust og I

I overført til siliconiserede rør indeholdende 3 ml 0,5M ammoniumacetat og I

opvarmet til 60°C i 60 minutter. DNA-opløsningen blev genvundet ved filtrering. I

I 20 Sep-Pak Ci8-patroner (Waters Associates) blev vædet med 10 ml 50 volumen- I

I procent acetonitril og skyllet med 10 ml destilleret vand inden applikation af I

I geleluaterne. Efter skylning med 5 ml destilleret vand blev oligonucleotiderne I

I genvundet fra søjler med tre separate applikationer af 1 ml 60% methanol og I

I derefter lyofiliseret. I

I 25 I

I EKSEMPEL 11 I

I Optimering af kemisk induktion af porcint væksthormon (pGH) og bovint I

I væksthormon (bGH) ekspression under kontrol af deo P1-P2 I

I 30 I

I I det følgende beskrives optimeringen af produktion af væksthormoner i I

Escherichia coli-ceUer indeholdende et plasmid, der udtrykker væksthormonet I

I under kontrol af deo Pl-P2-promotorerne. Formålet var at opnå den ønskede I

I biomasse af Escherichia coli-celierne ved indledende dyrkning på glucose, således I

I 35 af ekspression, der er kontrolleret af den stærke deo P2-promotor, er udsat for I

61 DK 175537 B1 katabolitrepression. Efterfølgende, efter at glucosen var opbrugt, blev en ikke-glucosecarbonkilde tilsat, hvilket muliggjorde kemisk induktion af deo P2-promo-toren og produktion af væksthormonet.

5 Den kemiske induktionsmetodik viste sig at give overensstemmende resultater med hensyn til væksthormonproduktion, og førte til beslutningen om at udvikle en lignende metodik til vækst og ekspression i fermenteringsbeholdere. Bemærk at konstitutiv produktion af de uopløselige væksthormoner gav dårlige resultater. Højniveaukonstitutiv ekspression af opløselige polypeptider såsom hSOD-analoge 10 kan imidlertid opnås (se eksempel 2).

Laboratorieskalaoptimering

Eksperimenter blev udført for at optimere ekspression af pGH-analogen og bGH-15 analogen under anvendelse af de plasmider, der indeholder deo P1-P2- promotorerne, der er beskrevet i eksemplerne ovenfor. Det plasmid, der blev anvendt til pGH-ekspression, var især plasmidet pEFF-920 (fig. 28 og eksempel 8b), der udtrykker met-asp-gln-pGH-analoge. De plasmider, der blev anvendt til bGH-ekspression, var plasmidet pMFS 5607 (fig. 37) og plasmidet pMFS 5605 20 {eksempel 19b og fig. 31), som er henholdsvis tetracyclinresistent og ampicil-linresistent, og som begge udtrykker met-asp-gln-bGH-analoge. Alle disse plasmider indeholder PAR-fragmentet. Ekspression blev sammenlignet i to forskellige værter, S<p732, som er cyt R- deo R' (ingen funktionel deo-repressor, men indeholder deo-enzymer) og S<p930, som er cyt R‘ og er deleteret for deo-enzymerne.

25 (se tabel la for en fuld beskrivelse af disse cellelinjer). Kulturer blev dyrket natten over i 50 ml minimalmedium (se nedenfor), hvortil glucose blev tilsat (slutkoncen-tration (0,2-0,4%). Efter glucose var blevet opbrugt, blev en carbonkilde såsom natriumlactat, fructose, succinat eller natriummaleat tilsat til en slutkoncentration på 0,2-0,4%, og kulturen blev dyrket i yderligere 3-4 timer ved 37°C. Prøver blev 30 fjernet ved 2-timers intervaller (1 OD66o ækvivalent) og påført til SDS-polyacryl-amidgeler. Resultaterne viser, at fructose og natriumlactat var de bedste af samtlige testede carbonkilder. Ekspressionen af pGH-analogen var konsekvent noget højere end bGH-analogens ekspression i den samme vært. Vært S<p930 viste sig at være bedre end vært S<p732, hvorfor samtlige eksperimenter i større skala, der 35 blev udført i 2-liters gæringstanke, var med vært Scp930.

DK 175537 B1 I

Optimering af deo-system i 2-liters gæringsbeholdere I

Mediets sammensætning I

Komponenter af dette medium er i g/liter, medmindre andet er angivet. Minimal- I

mediet beskrevet nedenfor svarer til det, der er beskrevet i eksempel 2. Bemærk

at medierne er modificerede eller ændrede efter de forskellige bakteriestammers I

krav. I

K2HP04 - 8 I

kh2po4 * 2 I

Na-citrat - 2 NH4C1 - 3 *Naracecat * 3 15 K2S04 * O.6

FeNH^-citrat - 0,02 I

CaCl2 - 0.04 I

Sporelementer - 3 ml/liter H

Sporelementstamoplesning I

MnS04*H20 - 1 g I

ZnS04·7H20 - 2,78 g I

25 CoCl2*6H20 - 2 g I

NaMo04-2H20 - 2 g I

CaCl2*2H20 - 3 g I

CuS04·5H20 - 1,85 g H3BO3 - 0,5 g

__ Koncentreret HC1 - 100 ml H

30

Deioniseret H20 - 900 ml H

* tilsat i visse forseg. H

63 DK 175537 B1

MgS04»7H20 tilsættes efter sterilisering til en slutkoncentration på 400 mg/liter.

Glucose tilsættes, når fermentoren podes, til en slutkoncentration på 10 g/liter (20 ml af 50% stamopløsning). Ampicillin tilsættes til en slutkoncentration på 100 Mg/ml.

5

Fremstilling af podekultur 200 ml minimalmedium indeholdende glucose (0,8 ml fra 50% stamopløsning), ampicillin og MgS04*7H20 podes med Escherichia coli S<p930/pMFS 5605 eller 10 S<p930/pMFS 5607 (bGH-analog) eller S<p930/pEFF 920 (pGH-analog) fra en friskdyrket LB-agarplade indeholdende glucose, som giver en OD66o på 0,05.

Kulturen dyrkes natten over ved 37°C ved 200-250 omdr./min. (New Brunswick-ryster) til opnåelse af en OD66o på 2-3.

15 Fermentor

Arbejdsvolumenet i den anvendte 2-liters fermentor var 1 liter, og temperaturen blev holdt ved 36-37°C. Fermentoren blev podet med 200 ml overnatskultur + 20 ml 50% glucose. Denne glucosekoncentration er tilstrækkelig til at opnå en OD66o 20 på 10-12. Alternativt kan det indledende opnås med 10 ml glucose og glucose-tilsætning samtidigt med pH-regulering. pH holdes på 7,2 fra start til slut og reguleres ved at tilsætte 10% NH4OH. Som regel blev et forudbestemt gluco-sevolumen på 20 eller 40 ml anvendt til at opnå henholdsvis 10 eller 20 OD-enheder. I løbet af vækstfasen med glucose skal opløst oxygen holdes på ikke 25 mindre end 20%, som er et ikke-begrænsende beluftningsniveau til biomasseproduktion. Antiskum tilsættes efter behov. En pludselig stigning i opløst oxygen (D.O.) til ca. 70% markerer det punkt, hvor glucosen er fuldt opbrugt. På dette stadium tilsættes 20 ml 50% fructose, og pumpen tilsluttes for at tillede 50% fructose fra et 100 ml reservoir. Efter flere minutter begynder det opløste oxygen 30 at falde og bliver holdt på mellem 5 og 15% og ikke højere; dette er et lavt beluftningsniveau til væksthormonanalogproduktion. Induktion med fructose udføres i 3-4 timer. Fructoseforbrug er vanskeligt at bestemme, idet der ikke Findes nogen hurtig fremgangsmåde til at bestemme dets koncentration. Det blev antaget, at hastigheden af fructoseforbrug lignede glucosens.

35

I DK 175537 B1 I

I 64 I

I Tabel II viser specifik produktivitet af væksthormon opnået ved fermentering af I

I værtsvektorsystemerne S<p930/pEFF 920, Sv930/pMFS 5605 og S(p930/pMFS 5607. I

I Systemet S<p930/pEFF 920 giver en specifik produktivitet på 0,1 for pGH, som er I

I ligeså god som den, der er opnået med λ PL-systemet. Den specifikke produktivitet I

I 5 af bGH fra ampicillin eller tetracydinresistente plasmider synes at være omtrent I

I den samme (plasmider pMFS 5605 og pMFS 5607). I

I Bemærk at specifik produktivitet defineres som g protein produceret pr. g I

I celletørvægt. I

I 10 I

I TABEL II I

I Værter og ekspressionsplasraider for pGH- og bGH-analoge

I Vært* Plasmid Antibio- Promotorer Rbs Klonet I

I ^ tikare- gen & I

I sistens relativ I

I ekspres- I

I sion***

I A4255 pRec-pig24 AMP λ PL dl pGH+ I

I 20 ATCC 12435 pEFF-902 AMP λ PL, deo PI ell pGH+++ I

I ATCC 12435 pEFF-9021 TET λ PL, deo PI ell pGH+++ I

I ATCC 12435 pEFF-9022 TET λ PL. deo PI ell pGH+++ I

I S<p732 pEFF-905 AMP deo P1-P2 deo.cll pGH++++ I

I S«p732 pEFF-920** AMP deo P1-P2 deo, cl I pGH+++-f I

I 25 S<p732 pMFS-5503 AMP deo P1-P2 deo, ell pGH+ I

I S<p732 pMFS-5605** AMP deo P1-P2 deo.cll pGH+++ I

I * £.coli-værten er beskrevet i tabel I. I

I ** PAR+. I

I 30 I

I *** Ekspressionsniveauer er udtrykt i et relativt område mellem I

I lavniveauekspressorer (+) og højniveauekspressorer (+-+H-+) . I

I Bemærk: Se også tabel III og IV i henholdsvis eksempel 18 og 19. I

I 35 I

65 DK 175537 B1 EKSEMPEL 12

Konstruktion af højkopiantalplasmid, der udtrykker bGH

5 Det blev besluttet, at konstruere et højkopiantal bGH-udtrykkende plasmid og at fermentere Escherichia coli, der indeholder dette plasmid, under anvendelse af de optimerede betingelser, der er beskrevet i eksempel 11.

Konstruktionen af det højkopiantaludtrykkende bGH er som vist i fig. 37. hSOD-10 genet i pMFS 2005 (fig. 9 og deponeringsnr. ATCC 67362) blev erstattet med bGH-genet stammende fra pMFS 5605 (fig. 31). Det resulterende plasmid, betegnet pMFS 2006, er tetracyclinresistent, og dette plasmid blev introduceret i Escherichia coli Sq>930.

15 Vækst og ekspression i fermentor

Denne kulturs fermenteringsbetingelser var i det væsentlige de samme, som er beskrevet i eksempel 16. Da celler indeholdende pMFS 2006 er tetracyclinresisten-te (og derfor vokser dårligt i minimalmedium), blev podekulturen suppleret med 1 20 ml LB-medium for at fremme en god vækst. OD660 af overnatskulturen var ca. 2-3. Fermentoren indeholdt 800 ml medium, og hele den 200 ml store podekultur (eller næsten det hele) blev sat til fermentoren for at opnå en OD660 pa 0,2-0,4. Mængden af tilsat glucose afhænger af det ønskede OD inden fructosetilsætning. For OD på 10-12 blev 10 g tilsat, hvorimod 30 g blev tilsat for OD på 30 (generelt var 25 forholdet 1 g glucose til 1 OD enhed).

En pludselig stigning i opløst oxygen (D.O.) markerede det punkt, hvor glucose var opbrugt. På dette trin blev 20 ml fructose tilsat, og pumpen blev tilsluttet til et 100 ml reservoir indeholdende 50% fructose. D.O. faldt efter få minutters fructosetil-30 sætning og nåede ca. 20-30%; på dette tidspunkt blev omrøringen reduceret for at opnå en D.O. på ikke mere end 15%. Denne kemiske induktion blev udført i 3 timer.

Tabel III viser den specifikke produktivitet af bGH, der blev opnået i forskellige 35 fermenteringer. Resultaterne viser, at tilsætning af acetat til mediet bidrager til en

I DK 175537 B1 I

I 66 I

I stigning i specifik produktivitet til ca. 0,2; den anvendte acetatkoncentration er I

I anført under sammensætning af mediet i eksempel 16. I

I TABEL III I

I 5 . I

I Specifik produktivitet af væksthormoner produceret af I

I vært/plasmidsysterner i forskellige fermenteringer H

I Stamme ODggQ ODggg D.W. S.P. Carbonkilde I

I 10 tQ te te tilsat efter

I glucose I

I Sv?732/pMF 5607 I

I tetr (bGH) 8,5 15,25 8,5 0,050 natriumlactat I

I 15 S^732/pMF 5607 I

I tetr (bGH) 10,2 20,00 6,5 0,080 I

I S<p930/pMF 5605 I

I Arapr (bGH) 12,2 45,00 14,1 0,124 fructose (43 g) I

I S<?930/pMF 5605 I

I 20 Ampr (bGH) 12,8 48,00 14,8 0,093 fructose (43 g) I

I Sp930/pMF 5607 11,9 40,75 15,1 0,140 fructose I

I S<p930/pEFF 920 I

I Ampr (pGH) 50,00 11,8 0,143 fructose fra start I

I til slut (75 g) I

I S<p930/pEFF 920 I

I 25 I Ampr (pGH) 8,0 50,00 15,9 0,127 fructose (30 g)

I S<p930/pEFF 920 I

I Ampr (pGH) 8,1 38,50 13,8 0,099 fructose (33 g) I

I S*930/pEFF 920 . I

I 30 I

I 35 I

67 DK 175537 B1

Ampr (pGH) 12,2 56,00 17,4 0,125 fructose (45 g) S<p930/pEFF 920 5 Ampr (pGH) 8,3 56,00 17,2 0,096 fructose (45 g) S*>930/pEFF 920 (pGH) 12,7 52,00 17,0 0,101 fructose (40 g) ATCC 12435/ pEFF 902 (pGH) 13,0 36,00 12,5 0,108 ^ (λ PL-systen>)

Forkortelser: tD - ODggø ved start med fructose eller natriumlactattil- førsel te - ODggø ved fermenteringens ophør D.W. te - Tørvægt i mg ved fermenteringens ophør S.P. - Specific produktivitet defineret som g protein pro duceret pr. g celletørvægt.

20 EKSEMPEL 13 25 Konstruktion af deo ekspressionsvektorer indeholdende translationsfremmer

Plasmidet pMF5531 (eksempel 1 og fig, 4), der bærer deo Pl-P2-promotoreme og det let modificerede deo-ribosombindingssted, dirigerer lavniveauekspression af 30 hSOD-analogprotein. Det var rapporteret af P.O. Olins og S.H. Rangwala ved 1987-mødet på "Molecular Genetics of Bacteria and Phages”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, at AT-rige sekvenser opstrøms for det ribosomale bindingssted kan fremme ekspressionen af prokaryote gener under visse forhold. Det blev besluttet, at undersøge om AT-rige sekvenser fremmede eukaryot genekspression 35 dirigeret af prokaryote promotorer såsom deo-promotoren.

I DK 175537 B1 I

I 68 I

I Til dette formål blev plasmidet pMF 5534 fremstillet ud fra pMF 5531 som vist i fig. I

I 32 og i beskrivelsen af figurerne. Dette plasmid indeholder i 5’-3’-sekvensen den

I fuldstændige deo-Pl-P2-promotorse-kvens, herunder en yderligere AT-rig sekvens, I

I 5 et Ndel-restriktionssted og hSOD-genet. Plasmidet pMF 5534 blev introduceret til

I Escherichia coli-stamme MC 1061 ved transformation. Adskillige individuelle kolo- I

I nier blev udvalgt og testet for ekspression ved vækst i LB-medium indeholdende I

I 0,3% glucose og 100 enheder/ml ampicillin, og pufret med M9 minimalsaltop- I

I løsning (LB medium er beskrevet i eksempel 13a; M9 minimalsaltopløsning er I

I 10 beskrevet af J.M. Miller i "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor I

I Laboratory, s. 431, 1972). Disse celler indeholdende pMF 5534 udtrykte over- I

I raskende hSOD i meget høje niveauer, hvorimod forældreplasmidet pMF 5531 er I

I en dårlig ekspressor af hSOD-analog. Bemærk at den eneste forskel mellem disse I

I to plasmider er, at pMF 5534 indeholder den AT-rige sekvens, og dette viser, at I

I 15 den AT-rige sekvens fremmer ekspression betydeligt. Plasmidet pMF 5534 er blevet I

I deponeret i Escherichia coli-stamme S<p930 (F) under deponeringsnr. ATCC 67703. I

I Yderligere detaljer af hSOD-analog-produktion under anvendelse af plasmidet pMF I

I 5534 er anført i eksempel 14; det blev overraskende fundet, at produktionsni- I

I veauer af hSOD-analog er 2-5 gange højere ved 30°C end ved 37°C. I

I 20 I

I For at teste om den forøgede ekspression er forbundet med høje niveauer af I

I mRNA-syntese eller forøget translation, blev mRNA isoleret fra i sen logfase I

I voksende celler fra forskellige værtsplasmidsystemer såsom ATCC 12435/pMF- I

I 5531, ATCC 12435/pMF 5534 og kontroller såsom ATCC 12435 og S<p930 (Δ deo, I

I 25 deo R). Det oprensede mRNA fra samtlige prøver blev først justeret til den samme I

I koncentration og derefter passeret gennem et dot-blot-apparat indeholdende et I

I nitrocellulosefilter. Nitrocellulosefiltret blev hybridiseret til syntetisk DNA-probe I

I #2913 (vist i beskrivelsen til fig. 4), der indeholder den 5’-ende utranslaterede I

I sekvens af den c/eo-P2-transkriberede messenger. De punkter, der blev observeret I

I 30 på røntgenfilm, blev passet til nitrocellulosefiltret, og nitrocellulosefiltersegmenter- I

I ne blev udskåret og talt i en scintillationstæller. De tællinger, der blev produceret I

I under anvendelse af Escherichia coli S(p930 mRNA, blev anvendt som nulkontrollen, I

I idet Sq>930 ikke indeholder nogen cfeo-sekvenser; de tællinger, der blev produceret I

I under anvendelse af deponeringsnr. ATCC 12435 mRNA, blev betragtet som den I

I 35 mængde c/eo-mRNA, der var til stede i værtsceller uden plasmid, og blev trukket I

69 DK 175537 B1 fra de tællinger, der blev opnået med mRNA opnået fra værter indeholdende pMF 5531 og pMF 5534. Sammenligningen af resultater fra værter indeholdende pMF 5531 og pMF 5534 viser, at mRNA-niveauer i værter indeholdende pMF 5534 er 1,5-2,5 gange højere end niveauer i pMF 5531. Den samme sammenligning fore-5 taget på basis af proteinbåndintensitet viser imidlertid en 15-20 ganges stigning i Stp930/pMF 5534-ekstrakten. Disse resultater antyder, at hSOD-ekspressions-forøgelse finder sted på translationsniveauet.

Deo Pl-dreven ekspression af hSOD

10

Som omtalt ovenfor, anses deo PI for at være en dårlig promotor. Desuden var det kendt, at deo PI er en dårlig promotor for hSOD-analogprotein, idet plasmidet pMF 5516 (fig. 3), der indeholder deo PI (men ikke deo P2 pi grund af deletion af 48 basepar), ikke udtrykker målbart hSOD-analogprotein. For at teste muligheden for 15 at den AT-rige sekvens kan fremme ekspression drevet af deo PI, blev deo P2-promotoren på plasmidet pMF 5534 fjernet. Dette blev opnået ved skæring af pMF 5534 med Avrll og Bglll, der fjerner ca. 500 bp mellem deo PI og deo-RBS. Efter en udfyldningsreaktion af de kohæsive ender med Klenow-enzym, blev det store fragment isoleret fra agarosegel, oprenset og ligeret med T4-ligase. Det nye plas-20 mid, betegnet pMF 5540 (fig. 44), blev introduceret ved transformation i forskellige værter og dyrket i LB-medium indeholdende ampicillin og 0,3% glucose. SDS-elektroforese viste et uventet tungt bånd, der co-migrerede med oprenset hSOD. Sammenligning af totalt celleproteinbåndintensiteter på SDS-geler af værter indeholdende pMF 5540 eller pMF 5534 viste overraskende, at pMF 5540 indeholdende 25 deo PI alene producerer ca. 50-75% af det hSOD, der blev observeret med pMF 5534.

Den konklusion, der blev opnået, var, at den ubetydelige hSOD-ekspression drevet af deo PI øges således af den AT-rige fremmersekvens, at celler, der bærer et 30 plasmid indeholdende en sådan konstruktion er fremragende udtrykkere af hSOD-analogprotein. Escherichia co//-værtsceIler indeholdende pMF 5540 er ikke udsat for katabolitrepression, fordi promotoren er deo PI. Sådanne celler kan derfor dyrkes til ekspression af hSOD-analog i nærværelse af glucose, og der er intet behov for at skifte til fructose, (se diskussion af katabolitrepression i eksempel 8).

35

I DK 175537 B1 I

I 70 I

I Den AT-rige region mangler iboende promotoraktivitet I

I For at sikre at det AT-rige fragment (fremmeren), der er til stede i plasmidet pMF I

I 5534, ikke har nogen iboende promotoraktivitet, blev plasmidet pMF 5534 spaltet I

I 5 for at eliminere hele deo Pl-P2-promotoren bortset fra den modificerede AT-rige I

I region og ribosombindingsstedet, som beskrevet i fig. 44. Det resulterende plas- I

I mid, pMF 5541, blev introduceret i Escherichia coii S<p930 og individuelle kloner I

I blev testet for hSOD-ekspression. SDS-gelelektroforese af kloner bærende plasmi- I

I der uden deo P1-P2 viste et meget svagt bånd, der co-migrerede med hSOD. Den- I

I 10 ne lavniveauekspression skyldes muligvis "gennemlæsnings"-aktivitet, der produ- I

I cerede ekstremt lidt mRNA, der kunne fremmes af den høje translationsaktivitet af I

I den AT-rige fremmersekvens. Eksperimentet antyder således, at den AT-rige regi- I

I on sandsynligvis mangler iboende promotoraktivitet. I

I 15 Fremmeraktivitet var også vist i værter indeholdende plasmidet pMF-945, som gav I

I høje pGH-analogniveauer (fig. 34). En lignende konstruktion (fig. 35) bærende I

I bGH-genet på plasmidet pMF 5608 gav lave bGH-analogniveauer. I

I EKSEMPEL 14 I

I 20 I

I Sekretion af human superoxiddismutase (hSOD) og bovint væksthormon I

I (bGH) til mediet i nærværelse af kobber- og zinkioner I

I Som vist i eksempel 1 og 2, kan højniveauproduktion af hSOD-analoge af I

I 25 Escherichia co//-værtsceller bærende plasmider, der indeholder hSOD-genet under I

I kontrol af deo Pl-P2-promotorerne, opnås. Det blev efterfølgende fundet, at så- I

I danne Escherichia coli-ceIler dyrket i fermentorer i minimalsaltmedium indeholden- I

I de en carbonkilde og Cu+2/Zn+2-ioner, overraskende frigør hSOD-analoge, fortrins- I

I vis til mediet. Dette blev observeret for kulturer dyrket i fermentorer i perioder I

I 30 længere end 16 timer. SDS-gelelektroforese af prøver af cellefrit medium viste I

I efter Coomassie-farvning et bånd, der co-migrerede med oprenset hSOD- I

I analogprotein. Intensiteten af dette bånd steg med tiden op til 48-60 timer fra I

I fermenteringens start. I

71 DK 175537 B1; i I ét eksperiment blev en kultur af Escherichia co/i S<p930 bærende plasmidet pMF 2005, en højkopiantal SOD-ekspressor (fig. 9) dyrket indledningsvis på glucose som carbonkilde og når glucosen var opbrugt ved ΟΟββο = 24, blev fructose tilsat. Dyrkningstingeiserne for hSOD-analogproduktion omfattede forhold med lav be-5 luftning (1 vvm) ved pH = 7,4 og ved 37°C.

Som beskrevet ovenfor blev et bånd, der co-migrerede med oprenset hSOD-ana-log, fundet på SDS-geler af cellefrit medium. For at vise at dette bånd faktisk er hSOD-analogen, blev der lavet et western-blot, og nitrocellulosefiltret blev udsat 10 for reaktion med radioaktivt mærket anti-hSOD-antistof. Det observerede bånd reagerede med antistoffet, hvilket bekræftede at proteinet er hSOD-analogen. For at teste om hSOD-analogen er enzymatisk aktiv blev hSOD-analyseret in vitro ifølge fremgangsmåden af McCord et al. (eksempel 10). Kvantificering af det proteinbind, der var set på SDS-gelen, og den enzymatiske aktivitet var nær over-15 ensstemmende. Ved ODeeo = 30 var hSOD-enzymaktiviteten i mediet 0,45 g/liter.

I kontroleksperimenter, hvor Cu2+/Zn+2 ikke blev tilsat, blev hSOD-analogprotein ikke frigjort til mediet. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 35

En mere drastisk observation blev gjort med Escherichia coli Sq>930 indeholdende 2 plasmidet pMF 5534 og dyrket ved 30°C i minimalmedium indeholdende glucose og 3

Cu+2/Zn+2-ioner. Dette værtsvektorsystem, der konstitutivt udtrykker hSOD-ana- 4 loge, kan gennemgående dyrkes på glucose; ekspression opnås tilsyneladende fra 5 deo PI plus fremmer og muligvis delvis fra deo P2 plus fremmer. hSOD akkumule- 6 rede i cellen i op til 24 timer fra fermenteringens start til opnåelse af ca. 3 g/liter 7 hSOD-analog ved OD66o = 25. På dette stadium begyndte hSOD at flyde ud i medi 8 et. Efter yderligere 12-15 timer, viste genelektroforese at hSOD-analogprotein var j 9 på en koncentration på ca. 1,1 g/liter i mediet, mens niveauet i cellen var ca.

10 2,0 g/liter. Kun lidt ikke-hSOD-protein blev fundet i mediet.

11

Bemærk at den temperatur, der blev anvendt til fermentering af den Escherichia coli, der indeholder plasmidet pMF 5534, var 30°C. Det blev overraskende fundet, at plasmider indeholdende fremmersekvensen gav 2-5 gange mere hSOD-analog, når de blev dyrket ved 30°C end ved 37°C.

I DK 175537 B1 I

I 72 I

I Det blev efterfølgende opdaget, at frigørelsen af protein til mediet i nærværelse af I

I Cu+2/Zn+2-ioner ikke synes at være begrænset til celler, der overproducerer hSOD. I

I Escherichia coli-værter indeholdende pMF 5608 (fig. 46), et plasmid bærende genet I

I for bovint væksthormon (bGH) under kontrol af deo-promotorer, der blev dyrket I

5 under de samme betingelser, som de ovenfor beskrevne (herunder tilsætning af I

I Cu+2/Zn+2), frigav et antal proteiner til mediet. Idet bovint væksthormon ophobes I

I hurtigt in vivo, var bGH-andelen i dette udskilte protein imidlertid lav. I kontrol- I

I eksperimenter, hvor Cu+2/Zn+2 ikke blev tilsat, blev meget lidt protein frigjort. I

I 10 Disse observationer viser, at udskillelse af protein til mediet afhænger af tilstede- I

I værelsen af Cu+2/Zn+2-ioner. Mekanismen af denne frigørelse er ikke klarlagt. Mens I

I det ikke ønskes at blive bundet til én bestemt teori, mener man at disse ioner I

I ændrer porerne i cellens membran, således at opløselige proteiner kan lække fra I

I cellen. Det er muligt, at kobberioner alene eller zinkioner alene eller andre diva- I

I 15 lente ioner kan frembringe den samme virkning. I

73 DK 175537 B1 EKSEMPEL 15

Escherichia coli F'-stammer anvendt som værter for plasmider 5 Følgende Escherichia cofi F-stammer blev konstrueret som beskrevet nedenfor og kan anvendes som værter for de plasmider, der er beskrevet andetsteds i nærværende beskrivelse: A4275, A5277, A4278, A4280, A4255 (F) og S<p930 (F). Stamme S<p930 (F) er blevet deponeret indeholdende plasmidet pMF 5534 under depo-10 neringsnr. ATCC 67703 og indeholdende plasmidet pMFS 5607 under depone-ringsnr. ATCC 67704.

(a) Fremstilling af stammer A4275, A5277, A4278 og A4280 15 De seks Escherichia coli F'-stammer, der er nævnt nedenfor, blev opnået fra

Escherichia coli Genetic Stock Center (C.G.S.C.), Dept, of Biology, Yale University, P.O.B. 6664, New Haven, Connecticut. Disse blev transformeret til at bære den kryptiske profag λ cl 857N+ δΒθπί-ΗΙδΗΙ og blev kureret for TnlO-transposonet. De blev undersøgt for tilstedeværelse af den temperatursensitive repressor (tab af 20 immunitet ved 42°C) og for tilstedeværelse af N+-genet (komplementering af en N-defekt fag).

q q S C Stamme- BTG-stamme- stamme nr. betegnelse produceret 25__________ 6300 F'MG 1655 > A 4275 4474 F*W 3110--> A 5277 5290 F‘W 2637 > A 4278 6315 F'MM 294 -—> endnu ikke tilgængelig 4452 F' 1000 > A 4280 4448 F" 1100 > endnu ikke tilgængelig 35

I DK 175537 B1 I

I 74 I

I Bemærk at CG.S.C-stamme nr. 4474, betegnet stamme (F') W3110, er blevet I

I deponeret med plasmidet pMFS 929 under deponeringsnr. ATCC 67705. I

I (b) Fremstilling af stamme A4255 (F ) og S<p930 (F) I

I 5 . I

I Escherichia coli-stamme A4255 og S<p930, der er beskrevet i nærværende beskri- I

I velse (tabel I), blev "kureret" til fremstilling af Escherichia coli-stammer henholds- I

I vis 4255 (F) og 5φ930 (F'). Den anvendte "kurerings"-metode er beskrevet af J.H. I

I Miller i "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, s. I

I 10 104-106 (1972). I

Claims (27)

1. Dobbeltstrenget DNA-plasmid, der ved introduktion i en egnet Escherichia coli-vaertscelle, gør værtscellen i stand til at udvirke ekspression af DNA, der koder for 5 et ønsket, naturligt forekommende eukaryotisk polypeptid eller en polypeptid-analog deraf med det naturligt forekommende polypeptids biologiske aktivitet og en aminosyresekvens, som i det væsentlige er den samme som og alligevel forskellig fra den, som det naturligt forekommende polypeptid har, og derved udvirke produktion af polypeptidet eller polypeptidanalogen, 10 kendetegnet ved, at det i 5'-3‘ orden omfatter følgende: a) DNA, som i 5’-3' orden omfatter tandempromotorerne deo PI og deo P2; 15 b) DNA, som omfatter et ribosombindingssted for at gøre mRNA, der transkriberes fra DNA, der koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen, i stand til at binde til ribosomer i værtscellen; c) en ATG startkodon; og 20 d) DNA, der koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen i fase med startkodonen; og som yderligere omfatter en DNA-sekvens, der omfatter et replikationsorigin fra 25 et bakterielt plasmid, der er i stand til autonom replikation i værtscellen, og en DNA-sekvens, som indeholder et gen, der er forbundet med et selekterbart eller identificerbart phenotypisk træk, som kommer til udtryk, nir plasmidet er til stede i værtscellen. ί

2. Plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Escherichia coli-væ rtscellen omfatter S<p732, S<p744, MC1061, S<p540, Sq>928, Stp929, S<p930 eller vildtype (ATCC deponeringsnr. 12435). I DK 175537 B1 I I 76 I

3. Plasmid ifølge krav 1, I I kendetegnet ved, at ribosombindingsstedet er det naturlige deo-ribosom- I I bindingssted afledt fra deo-operonet eller en mutant deraf, hvor deo-ribosom- I I bindingsstedet har en ændring af to baser i sekvensen nedstrøms fra Shine- I I 5 delgarno sekvensen, ved nukleotiderne -1 og -3 i forhold til nukleotidet A i I I startkodonet, I I eller I I er cll fra λ-bakteriofag med sekvensen: I I 10 I I TAAGGAAATACTTACAT I I ATTCCTTTATGAATGTA I I eller I I 15 er en cll-mutant fra λ-bakteriofag med sekvensen: I I TAAGGAAGTACTTACAT I I ATTCCTTCATGAATGTA I 20 I eller I I er det naturlige -lactamase ribosombindingssted afledt fra pBR322, I I 25 eller I I er et syntetisk nukleotid med sekvensen: I I Λ AATTCGAGCG CAAGGAAACAGGCTCA I I GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT I I 30 I I eller I DK 175537 B1 er et syntetisk nukleotid med sekvensen: AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG s

5 GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT eller er et syntetisk nukleotid med sekvensen: 10 GACAAGCCTAGGTTTGTTTAACTTTAAGGAGAAATCATA CTGTTCGGATCeAAACAAATTGAAATTCCTCTTTAGTAT.

4. Plasmid ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at replikationsoriginet stammer fra pBR322 eller ρΟΡίΔδ.

5. Plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det fænotypiske træk er medikamentresistens.

6. Plasmid ifølge krav 5, kendetegnet ved, at medikamentresistensen er resistens overfor amprcillin eller tetracydin.

7. Plasmid ifølge krav 1, 25 kendetegnet ved, at det naturligt forekommende polypeptid omfatter human kobber/zinksuperoxiddismutase, human mangansuperoxiddis-mutase, human glutathionperoxidase, humant væksthormon, bovint væksthormon, porcint væksthormon, humant apolipoprotein E eller et fibronektindomæne. 1 2 3 4 5 6

8. Plasmid ifølge krav 7, til fremstilling af en polypeptidanalog af human 2 kobber/zinksuperoxiddismutase, 3 kendetegnet ved, at det er betegnet pMF 5531 og har det restriktionskort, 4 der er vist i fig. 4; at det er betegnet pMF 5519 og har det restriktionskort, der er 5 vist i fig. 5; at det er betegnet pMF-558-26 og har det restriktionskort, der er vist i 6 fig. 6; at det er betegnet pMF-5520 og har det restriktionskort, der er vist i fig. 7; I DK 175537 B1 I I 78 I I at det er betegnet pMF-2005 og har det restriktionskort, der er vist i fig. 9, og er I I deponeret under ATCC deponeringsnr. 67362; at det er betegnet pMFS-5533A og I I har det restriktionskort, der er vist i fig. 17; eller at det er betegnet pMFS-5538 og I I har det restriktionskort, der er vist i fig. 18. I I 5 I

9. Plasmid ifølge krav 7, til fremstilling af en polypeptidanalog af humant I I væksthormon, I I kendetegnet ved, at det er betegnet pTVR56B4 og har det restriktionskort, I der er vist i fig 11. I I 10 I

10. Plasmid ifølge krav 7, til fremstilling af en polypeptidanalog af bovint I I væksthormon, I I kendetegnet ved, at det er betegnet pMFS-5600 og har det restriktionskort, I I der er vist i fig. 12, at det er betegnet pMFS-5627 og har det restriktionskort, der I I 15 er vist i fig. 29, at det er betegnet pMFS-5603 og har det restriktionskort, der er I I vist i fig. 30, at det er betegnet pMFS-5605 og har det restriktionskort, der er vist i I I fig. 31, eller at det er betegnet pMFS-2006 og har det restriktionskort, der er vist i I hg. 37. j I I 20 11. Plasmid ifølge krav 7, til fremstilling af en polypeptidanalog af porcint I I væksthormon, I I kendetegnet ved, at det er betegnet pEFF-905 og har det restriktionskort, I I der er vist i fig. 27, eller at det er betegnet pEFF-920 og har det restriktionskort, I der er vist i fig. 28. I I 25 I I 12. Værtsplasmidsystem til fremstilling af et naturligt forekommende eukaryotisk I I polypeptid eller en polypeptidanalog deraf, I I kendetegnet ved, at det omfatter et plasmid ifølge krav 1 i en egnet I I Escherichia coii-vært, fortrinsvis valgt blandt gruppen bestående af Sq>744, S<p732, I I 30 vildtype (ATCC deponerings-nr. 12435), Βφ540, S<p928, 5φ929, MC1061 og S<|>930. I I il I 13. Værtsplasmidsystem ifølge krav 12, I I kendetegnet ved, at Escherichia co//-værten er en Γ-stamme, fortrinsvis F- I I stammen betegnet F'MG1655 eller F'W3110 (ATCC deponeringsnr. 67705), F' I I 35 W2637, FMM294, F1000 eller F1100. I I I DK 175537 B1

14. Værtsplasmidsystem til fremstilling af en polypeptidanalog af human kobber/zinksuperoxiddismutase eller en polypeptidanalog af humant væksthormon, en polypeptidanalog af bovint væksthormon, en polypeptidanalog af af porcint 5 væksthormon, hvilket værtsplasmidsystem er kendetegnet ved, at det omfatter et plasmid ifølge krav 8 i en egnet Escherichia co//-vært.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et naturligt forekommende polypeptid eller 10 en polypeptidanalog deraf, kendetegnet ved, at et værtsplasmidsystem ifølge et hvilket som helst af kravene 9 til 11 dyrkes under betingelser, der muliggør produktion af polypeptidet eller analogen, og at det resulterende polypeptid eller den resulterende analog isoleres. 15

16. Fremgangsmåde til fremstilling af en polypeptidanalog af human kobber/zinksuperoxiddismutase, en polypeptidanalog af humant væksthormon, en polypeptidanalog af bovint væksthormon eller en polypeptidanalog af porcint væksthormon, 20 kendetegnet ved, at et værtsplasmidsystem ifølge krav 14 dyrkes under betingelser, der muliggør produktion af polypeptidanalogen, og at den resulterende analog isoleres.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 15, 25 kendetegnet ved, at betingelserne omfatter lav beluftning.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at betingelserne omfatter dyrkning på et medium indeholdende en ikke-glucose carbonkilde, fortrinsvis glycerol, fructose, succinat, 30 natriumlactat eller natriummalat. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, at betingelserne omfatter, at Escherichia coli~ce lierne indledningsvis dyrkes i glucose og at der tilsættes en ikke-glucose carbonkilde, I DK 175537 B1 I I 80 I I fortrinsvis glycerol, succinat, natriumlactat, fructose eller natriummalat, efter at I I glucosen er opbrugt. I

20. Fremgangsmåde ifølge krav 15, I 5 kendetegnet ved, at polypeptidet eller polypeptidanalogen udskilles til det I I medium, hvor værtsplasmidsystemet dyrkes, ved tilsætning af en divalent metalion I I til vækstmediet, fortrinsvis Cu+2, Zn+2, eller en blanding af de to ioner. I

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, I I 10 kendetegnet ved, at værtsplasmidsystemet dyrkes ved ca. 30°C I

22. Dobbeltstrenget DNA-ekspressionsplasmid, der ved introduktion i en egnet I I Escherichia co//-værtscelle, gør værtscellen i stand til at udvirke ekspression af I I DNA, der koder for et ønsket naturligt forekommende eukaryotisk polypeptid eller I 15 en polypeptidanalog deraf med det naturligt forekommende polypeptids biologiske I aktivitet og en aminosyresekvens, der i det væsentlige er den samme som, men I dog forskellig fra, det naturligt forekommende polypeptids aminosyre-sekvens, og I I derved udvirke produktion af polypeptidet eller polypeptidanalogen deraf, I I kendetegnet ved, at det i 5‘-3’ orden omfatter følgende: I I 20 I a) DNA, der i 5’-3’ orden omfatter tandempromotorerne deo PI og £}go P2; I b) en AT-rig sekvenstranslationsenhancer; I I 25 c) et Ndel restriktionsenzymsted; I I d) en ATG-startkodon; og e) DNA, der koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen i fase 30 med ATG-startkodonen; I I og som yderligere indeholder en DNA-sekvens, der omfatter et replikationsorigin I fra et bakterielt plasmid der er i stand til autonom replikation i værtscellen og en I DNA-sekvens, som indeholder et gen, der er forbundet med selekterbart eller DK 175537 B1 identificerbart phenotypidk træk, som kommer til udtryk, nar plasmidet er til stede i værtscellen.

23. Plasmid ifølge krav 22, 5 kendetegnet ved, at det naturligt forekommende polypeptid er human kobber/zink superoxid dismutase.

24. Plasmid ifølge krav 22, kendetegnet ved, at det naturligt forekommende polypeptid omfatter 10 human mangansuperoxiddismutase, human glutathionperoxidase, humant væksthormon, bovint væksthormon, porcint væksthormon, humant apolipoprotein E eller et fibronektindomæne.

25. Plasmid ifølge krav 23, 15 kendetegnet ved, at er benævnt pMF 5534 og er deponeret i Escherichia coli-stamme Sq>930 (F‘) under ATCC deponeringsnr. 67703.

26. Værtsplasmidsystem til fremstilling af en polypeptianalog til human kobber/zink superoxid dismutase, 20 kendetegnet ved, at det omfatter plasmidet ifølge krav 21 i en egent Escherichia coli-værtscelle.

27. Værtsplasmidsystemet ifølge krav 26, kendetegnet ved, at værten er valgt blandt gruppen bestående af 5φ744,

25 S<p732, og vildtype (ATCC deponerings Nr. 12435), 5φ540, S</>928, 5φ929, MC1061 og S<p930. 1 2 Værtsplasmidsystem ifølge krav 26, kendetegnet ved, at værten er en Γ-stamme. 30 2 Fremgangsmåde til fremstilling af en polypeptidanalog til kobber/zink superoxid dismutase, kendetegnet ved, værtsp/asmidet ifølge krav 26 dyrkes under egnede betingelser, der muliggør produktion af analogen, og at den resulterende analog 35 isoleres. DK 175537 B1 I

82 I

30. Fremgangsmåde ifølge krav 29, kendetegnet ved yderligere at omfatte at værtsplasmidet dyrkes ved ca. I 30°C. I