NO302185B1

NO302185B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et naturlig-forekommende polypeptid eller en polypeptidanalog derav

Info

Publication number: NO302185B1
Application number: NO883611A
Authority: NO
Inventors: Meir Fischer
Original assignee: Bio Technology General Corp
Priority date: 1987-08-14
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1998-02-02
Also published as: EP0303972A2; NO883611D0; AU2098288A; JPH01157391A; PT88271A; ES2112240T3; FI883749A0; DE3856101D1; KR890003953A; KR970000594B1; PT88271B; AU607249B2; DK175537B1; DK454988D0; DE3856101T2; IL87409A0; EP0303972B1; IL87409A; NZ225760A; FI104429B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et naturlig-forekommende polypeptid eller en polypeptidanalog derav.

Ekspresjonsvektorer, innbefattende ekspresjonsplasmider blir anvendt kommersielt for å produsere genprodukter mere effektivt enn tidligere tilgjengelige metoder såsom ekstraksjon fra naturlige kilder og organisk syntese. Escherichia coli blir ofte anvendt som vert hvori slike genprodukter kan bli produsert ved anvendelse av ekspresjonsplasmider. En omfattende diskusjon av ekspresjonsvektorer forekommer i P.H. Pouwels, B.E. Enger-Valk og W.J. Brammer, Cloning Vectors, Elsevier, publisert (1985).

Et antall kontrollmekanismer som regulerer genekspresjons-nivået i prokaryote vektorer er blitt beskrevet. Den regulatoriske prosessen kan virke på det transkripsjonene nivået eller translasjonene nivået. På det transkripsjonene nivået er kontroll av genekspresjon assosiert med inhibering eller stimulering av mRNA-syntese.

En måte å øke ekspresjonsnivået til et ønsket genprodukt er å anvende en vektor hvori genet som skal bli uttrykt er under kontroll av en sterk promoter, og denne fremgangsmåten blir hovedsakelig anvendt innenfor bioteknologiindustrien for å uttrykke genproduktene i høye nivåer.

Det transkripsjonene kontrollsystemet består av en DNA-sekvens som er inne i eller ved siden av, en promoter som har evnen til å binde et repressormolekyl. Når repressor-mole-kylet bindes til en spesifikk DNA-type, blir transkripsjon av DNA til mENA forhindret. For å initiere transkripsjon av DNA til mRNA må repressormolekylet bli fjernet eller dissosiert fra dets bindingsete, og dette blir tilveiebragt ved et spesifikk kjemisk eller fysisk stimulus. I mange tilfeller når det gjelder transkripsjonen kontroll er det nødvendig med en annen komponent for å drive transkripsjonen med høyest mulig kapasitet. Et eksempel på en slik komponent er cyklisk AMP-reseptorprotein (CRP) som er innbefattet i regulering av mange gener i katabolske veier.

Ekspresjonsplasmider inneholdende de regulerbare promoterene X Pl»treller lac, er blitt mye anvendt innenfor fagområdet. Andre promotere som er blitt anvendt innbefatter de regulerbare rec A og X Pjj-promoterene, de konstitutive amp og lpp-promoterene, og kunstige promotere som er blitt dannet ved fusjon av to forskjellige DNA-sekvenser eller ved kjemisk syntese av DNA-sekvenser.

Escherichia coli deo operon er blitt studert av Hammer-Jesperson og medarbeidere. [K. Hammer-Jesperson og A. Munch-Peterson, Molec. gen. Genet. 137: 327-335 (1975); R.S. Buxton, H. Albrechtsen og K. Hammer-Jesperson, J. Mol. Biol. 114: 287-300 (1977); R.S. Buxton, K. Hammer-Jesperson og T.D. Hansen, J. Bacteriol. 136: 668-681 (1978); P. Valentin-Hansen og K. Hammer-Jesperson, J. Mol. Biol. 133: 1-17 (1979); og P. Valentin-Hansen, H. Alba og D. Schumperli, The EMBO Journal 1: 317-322 (1982)].

Som vist i figur 20, består deo-operonet av fire nære beslektede gener som koder for enzymer som er innbefattet i nukleotid og deoksynukleotidkatabolismen, dvs. deoksyriboaldolase ( deo C), tymidin fosforylase ( deo A), fosfodeoksy-ribomutase ( deo B) og purin nukleotid fosforylase ( deo D). Transkripsjonen av alle fire nære beslektede deo genene er regulert ved to promoter/operator-regioner, deo Pl og deo P2 (eller Pl og P2). Når transkripsjonen av et gen er kontrollert av deo Pl og deo P2-promoterene som virker in tandem, blir betegnelsen deo Pl-P2-promoter eller deo promoter/operator-regionen anvendt.

Initiering av transkripsjon fra Pl blir negativt kontrollert av deo R repressoren og aktivert av induseren deoksyribose-5-fosfat. Initiering av transkripsjon fra P2 blir negativt kontrollert av cyt R repressoren, induseren er cytidln. Aktivering av P2 avhenger av det cykliske AMP/cyklism AMP-reseptor-proteinkomplekset, cAMP/CRP, selv om P2 også kan bli kontrollert av deo R repressoren. De to distale genene B og C i deo-oeronet er utsatt for enda en transkripsjonen kontroll: en indre promoter/operator region P3, regulert av ukjente kontrollproteiner og som blir indusert av inosin og guanosin. Sekvensen til deo P1-P2 promoter/operator-region er kjent, og hele deo P1-P2 promoter/operator-regionen er omtrent 760 bp lang, og de to promoterene er separert i en avstand på omtrent 600 bp. (P. Valentin-Hansen et al., The EMBO Journal 1: 317-322 (1982)).

Ekspresjon av et gen produkt under deo P2-drevet transkripsjon er veldig lav i nærvær av glukose og veldig høy i nærvær av andre energi-produserende kilder. Transkripsjon drevet av deo Pl er ikke utsatt for glukoseeffekten (katabolitt-repressjon), og deo Pl er også en mye svakere promoter enn deo P2. Man kan derfor manipulere ekspresjonen av et genprodukt som er drevet av deo Pl-promoteren både på ytre måter og ved valg av Escherichia coli-celler som ikke inneholder noen funksjonell deo R repressor.

Hele deo operonet er blitt klonet fra X bakteriofag som inneholder deo operonet og deo enzymene er blitt uttrykt i Escherichia coli vertsceller [M. Fischer og A. Short, Gene 17: 291-298 (1982)]. Det er blitt oppdaget at enzymaktivi-tetene til bakterier som inneholder det klonete deo-operonet ble amplifisert 500-50.000 ganger over nivået som ble funnet i villtype-cellene. Amplifikasjonsgraden avhenger av verts-genotypen. I vertsceller som inneholder både deo R og cyt R repressorene er amplifikasjonen av enzymet tymidin fosforylase omtrent 500 ganger; i vertsceller som ikke inneholder noen funksjonelle deo R og cyt R repressorer, er amplif ika-sj onen av tymidin fosforylase omtrent 50.000 ganger.

G. Dandanell og I.K. Hammer, The EMBO Journal 4: 3333-3338

(1985), beskriver transkripsjonen fusjon av deo Pl og deo P2 promoterfragmenter til Escherichia coli galaktokinasegenet. Dandanell et al. undersøkte ekspresjonen av galaktokinase, dvs. et prokaryot genprodukt, under kontroll av deo P2-promoterene integrert i det bakterielle kromosomet. Foreliggende oppfinnelse beskriver anvendelse av deo P1-P2 promoter på multikopi-plasmider for å drive ekspresjonen av eykaryote genprodukter.

Dandanell et al hevder at X Pl promoteren er 2-3 ganger så sterk som deo P2 promoteren (s. 3326, kolonne 2). I kontrast til dette, så nærmer eller overgår ekspresjonsnivåene som blir tilveiebragt ved anvendelse av spesifikke polypeptider og spesielt regulatoriske elementer ifølge oppfinnelsen i forhold til de som blir tilveiebragt ved anvendelse av en X Pl promoter.

Ved å foreslå at X Pl promoteren er 2 til 3 ganger sterkere enn deo P2 promoteren, som i igjen er sterkere enn deo Pl promoteren, fraviker Dandanell et al fra anvendelse av deo P1-P2 promoter som en sterk promoter. Som beskrevet ovenfor, har søkerene oppdaget at polypeptider blir produsert i uventede store mengder ved anvendelse av plasmidene ifølge oppfinnelsen som inneholder deo P1-P2 promoter sammen med de andre regulatoriske komponentene.

PCT internasjonale søknad nr. WO 84 01171, publisert mars 29. 1984, beskriver, men muliggjør ikke, anvendelse av en deo-promoter for å uttrykke veldig lave mengder av det kontrolle-rende proteinet til Escherichia coli-replikasjon, dvs. et ikke-eukaryot protein.

Plasmidene som uttrykker genproduktene under kontroll av X Pl promoteren, derimot uavhengig av X-genene i vertskromosomet, er av oss blitt betegnet som "uavhengig" plasmid ekspresjonsvektorer. M. Mieschendahl, T. Petri og Urs Hanggi, Biotechno logy 4: 802-808 (1986), for eksempel, beskriver et uavhengig plasmid hvori X cl repressorgenet blir kontrollert av tryptofanoperatoren/promoteren. Dette er derimot ikke et temperatur-kontrollert system.

M. Zabeau og K.K. Stanley, the EMBO Journal 1: 1217-1224

(1982) plasserte genet for en temperatur-følsom cl-repressor

i et plasmid med et lavt kopiantall som er kompatibel med pBR322-vektorer. Denne tilnærmingen krever derimot at to plasmider blir anvendt og at cl-plasmidet blir holdt i cellene ved seleksjon.

A.S. Waldman, E. Haeusslein og G. Milman, J. Biol. Chem. 258: 11571-11575 (1983) klonet genet og den autentiske promoteren for den temperaturfølsomme cl 857 repressoren rett inn i et plasmid. Det ble derimot ikke oppnådd en god ekspresjon av de klonede genene i slike konstruksjoner på grunn av amplifika-sjon av cl-genet og den medfølgende økningen i antallet cl-molekyler. I disse eksperimentene, utgjorde det klonete genproduktet bare omtrent 4$ av totalt, oppløselig, cellulært protein.

Et effektivt temperatur-følsomt, ekspresjonssystem hvor den varme-induserbare ekspresjonen av genene som er på ekspresjonsvektorene er uavhengig av ekspresjon av gener på vertskromosomet er ikke tidligere blitt beskrevet innenfor fagområdet. Effektiv, temperatur-følsom "uavhengig" plasmid ekspresjonsvektorer er dermed ikke blitt beskrevet.

Den svake deo Pl-promoteren blir tilveiebragt fra deo-operonet og satt inn i et X Pl ekspresjonsplasmid hvor den kontrollerer ekspresjonen av X cl 857 repressorgenet, og som dermed tillater termoinduserbar ekspresjon av genproduktene kontrollert av X PL-promoteren på det samme plasmidet. Dette ekspresjonsplasmidet er dermed uavhengig av X-genene på vertskromosomet og kan bli transformert inn i mange forskjellige verter. Det er dermed et "uavhengig" ekspresjons- inneholder et gen assosiert med en selekterbar eller identifiserbar fenotypisk markør som er manifestert når plasmidet er tilstede i vertscellen, og isolering av det resulterende polypeptidet eller analogen.

Egnede naturlig-forekommende polypeptider som blir produsert av plasmidene fremstilt heri innbefatter humant kobber/sink superoksyd-dismutase, humant mangan superoksyd-dismutase, humant glutation peroksydase, humant veksthormon, bovint veksthormon, grise veksthormon, humant apolipoprotein E eller forskjellige domener av fibronektin. Det er innlysende for fagmannen av plasmidene fremstilt heri kan inneholde DNA som koder for andre ønskede naturlig-forekommende polypeptider og polypeptidanaloger derav.

Dobbelt-trådet DNA kan bli anvendt for å produsere humant kobber/sink superoksyd dismutase, humant veksthormon, bovint veksthormon, grise-veksthormon eler apolipoprotein E. Det er innlysende for fagmannen at slike uavhengige plasmider kan inneholde DNA som koder for andre ønskede naturlig-forekommende polypeptider og polypeptidanaloger derav.

Beskrivelse av figurene

Eestriksj onskartene for hver av plasmidene som er vist i figurene 1-52 identifiserer ikke alle restriksjonssetene som er tilstede på hvert plasmid. I noen tilfeller er restriksjonssetene vist i en figur, men ikke i en annen. I alle tilfellene er derimot de restriksjonssetene som er nødvendige for at fagmannen kan utføre oppfinnelsen vist. De relative størrelsene til de forskjellige plasmidene er ikke vist i riktig skala og ingen konklusjoner kan bli trukket angående størrelsen av plasmidene fra figurene, deo-promoterene er blitt merket deo P1-P2, deo Pl eller deo P2.

Alle plasmidene som er blitt deponert i sammenheng med søknaden, med unntagelse av de som det er hevdet noe annet for, er blitt deponert til the American Type Culture Collec tion, (ATTC) i Rockville, Maryland 20852, U.S.A., i overensstemmelse med Budapest Treaty på International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure ("Budapest Treaty").

Fig. 1: Konstruksjon av pJBF- 5401 ( kloning av deo P1- P2)

X cl 857: DNA inneholdende hele deo-operonet (fremstilt som beskrevet i eksempel 1) ble spaltet med Avall og innfylt (Klenow-reaksjon). BamHI-linkere ble tilsatt og Avall-fragmentet med BamHI-linkere ble ligert med T^ligase til BamHI-spaltet pBR322 (ATCC Aksesjonsnr. 37017 - ikke-Budapest traktat-deponering). Det resulterende plasmid, pJBF-4501A, ble spaltet med BamHI, og fragmentet på 900 bp inneholdende deo P1-P2 promoterene ble ligert til pBR322 (også spaltet med BamHI). Det resulterende plasmidet, betegnet pJBF-5401, består av pBR322 DNA og deo P1-P2 promoter region DNA. Plasmid pJBF-5401 er blitt deponert i henhold til Budapest-traktaten til American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland under ATCC aksesjonsnr. 67359.

Fig. 2: Sete- rettet mutagenese av pJBF- 5401

Vektor pJBF-5401 inneholdende deo P1-P2 promoteren ble modifisert for å innføre et Ndel restriksjonssete mellom Shine-Dalgarno sekvensen til det ribosomale bindingssete (RBS) og første ATG til det kodende DNA. Dette ble oppnådd ved sete-rettet mutagenese, ved anvendelse av metoden til Y. Morinaga et al., Biotechnology 2: 636-639 (1984). pJBF-5401 ble spaltet med Pstl for å danne et linært DNA-fragment sammensmeltet med det store fragmentet som er produsert av BssHI/Sall spalting av pJBF-5401.

Et 20 bp syntetisk DNA-fragment som strekker seg over nukleotidene 750-770 av deo Pl-P2-promotersekvensen ble syntetisert kjemisk slik at et Ndel-sete blir dannet ved den riktige avstanden fra RBS; denne 20 bp sekvensen ble betegnet BTG-sekvens #2015. Den opprinnelige sekvensen og det nye konstruerte setet er vist nedenfor, hvor de understrekede basene viser de to nukleotidene som er substituerte.

Opprinnelig sekvens - GAGAATGAAATGACTGATCT -

BTG-sekvense #2015 - GAGAAT CATATGACTGATCT -

Ndel sete

Det syntetiske DNA-fragmentet var sammensmeltet til den enkelt-trådete regionen på foreldretråden, og den gjenværende åpningen ble fylt ved hjelp av T4DNA-polymerase for å tilveiebringe plasmid pMF-5416 (plasmid D), som inneholder deo P1-P2 (operator/promotorsekvens) og det nye Ndel restriksjonssetet; sekvensanalyse viste en 48 bp delesjon i deo P2 regionen (se eksempel 1).

Fig. 3: Konstruksjon av pMF- 5516

Plasmid pS0Dal3 (konstruert som vist i fig. 30.fra pS0Da2 (ATCC aksesjonsnr. 39786)) inneholder genet for humant kopper/sink superoksyddismutase (hSOD) som blir uttrykt under kontroll av X Pl promoteren og det ell ribosomale bindingssetet. Aatll-Ndel spalting pS0Dal3 tilveiebringer et stort fragment som inneholder SOD-genet, men ikke X Pl promoter og RBS. Aatll-Ndel spalting av pMF-5416 produserte et 900 bp dobbelttrådet segment inneholdende deo Pl-P2-promoteren (med 48 bp delesjonen i P2-regionen). Ligering av disse to fragmentene produserte et plasmid betegnet pMF-5516, som inneholder en modifisert deo Pl-P2-promoter (med 48 bp delesjonen) og hSOD-genet som går forut for Nde-restriksjonssetet.

Fig. 4: Konstruksjon av pMF- 5 531

pMF-5516 ble modifisert for å på ny sette inn det deleterte segmentet på 48 bp. For å oppnå denne enden, ble følgende seks enkelttrådete syntetiske DNA-sekvenser sammensmeltet for å tilveiebringe tre dobbelttrådete sekvenser som rekker fra bp 678 til bp 760 av P2-regionen, dvs. regionen som rekker fra Taql-setet til det nye konstruerte Ndel-setet. (Den

fullstendige sekvensen til deo Pl-P2-promoter/operator-regionen er gitt av P. Valentin-Hansen, H. Aiba og D. Schumperli, the EMBO Journal 1: 317-322 (1982)).

Trådnumrene 3107, 3604, 2913 og 1511 ble fosforylert med polynukleotidkinase og deretter ble hver tråd sammensmeltet til dets komplementære tråd dvs, tråd #2912 til #3107, #3604 til #2913 og #1511 til #2019. De tre dobbelt-trådete sekvensene ble festet ved ligering for å danne en 80 bp lang sekvens som inneholder de kohesive endene til Taql og Ndel.

Bglll-Ndel store fragmentet til pMF-5516 og Bglll-Taq fragmentet til pJBF-5401 ble isolert. Det 80 bp syntetiske fragmentet ble ligert til Bglll-Taq fragmentet fra pJBF-5401 som deretter ble ligert til Bglll-Ndel store fragmentet fra pMF-5516. Den resulterende ekspresjonsvektoren, pMF-5531, inneholder hele deo Pl-P2-systemet (innbefattende det autentiske RBS), Ndel restriksjonssetet og hSOD-genet. Den medfører ekspresjon i lavt nivå av et hSOD-analogt protein.

Fig. 5: Konstruksjon av pMF- 5519 - utvidelse av det ribosomale bindingssetet

Plasmid pMF-5531 ble behandlet med Ndel, fylt med T4DNA-polymerase og selv-ligert. Dette medfører økning av avstand mellom det ribosomale bindingssetet og første ATG med 2 basepar. Dette nye plasmidet, betegnet pMF-5519, inneholder i 5' til 3' retningen deo Pl-P2-promoteren, den utvidete RBS-ATG avstanden, og hSOD-genet. Den leder ekspresjon i høyt nivå av et hSOD-analogt protein.

Fig. 6: Flere utvidelser av deo P1- P2 ribosomale bindingssetet

Plasmid pMF-5519 ble spaltet med Stul og BamHI og et 100 bp fragment inneholdende deo Pl-P2-operatorpromoter-regionen ble isolert og inkubert med Bglll og Hinfl for å produsere et 540 bp Bglll-Hinfl fragment. Fire forskjellige syntetiske linkere ble preparert for festing til dette Bglll-Hinfl fragmentet for å produsere en serie på fire plasmider som er forskjellig fra hverandre i avstand mellom det ribosomale bindingssetet og første ATG.

For å oppnå denne enden, ble følgende åtte enkelttrådete syntetiske DNA-sekvenser syntetisert. Komplementære tråder ble sammensmeltet som produserte fire syntetiske dobbelt-trådete DNA-linkere betegnet I, II, III og IV.

De fire syntetiske linkerne, I, II, III og IV, har alle "klebrige ender" bestående av et Hinfl-sete og et Ndel-sete. Hver linker ble sammensmeltet separat til Bglll-Hinfl fragmentet fra pMF-5519 og deretter ligert, som dermed i hvert tilfelle produserte et nytt Bglll-Ndel fragment. Deretter ble hvert fragment separat sammensmeltet til det store Bglll-Ndel fragmentet fra pMF-5531 og ligert. De resulterende plasmidene inneholder et utvidet RBS. Inntil nå har bare 2 utav disse 4 konstruksjonene blitt sekvensert og sekvensen verifisert ved anvendelse av linkerne I og IV. De korresponderende plasmidene, betegnet pMF-558-26 (linker I) og pMF-5536 (linker IV) respektivt, er blitt transformert i Scp732 hvor de begge leder til ekspresjon i lavt nivå av et hSOD-analogt protein.

Fig. 7: Konstruksjon av pMF- 5520

pMF-5519 (som bærer ampicillin-resistens genet) ble spaltet med Aatll og Pstl og 3'-endene ble gjort butte ved spalting med T4DNA-polymerase. Denne spaltingen fjerner ampicillin-resistens-genet. Et 1450 bp fragment inneholdende tetracyklin resistens-genet fra pBR322 ble isolert ved spalting med EcoRI og Aval restriksjons-endonukleaser og 5'-endene ble fylt ved hjelp av T4DNA-polymerase for å danne butte ender. Fragmentet på 14 bp ble ligert til det rensede pMF-5519 fragmentet, som produserte et nytt tetracyklin-resistent plasmid betegnet pMF-5520 som inneholder, i 5' til 3' retningen, deo-promoteren og hSOD-genet. Dette plasmidet leder ekspresjon i høyt nivå av et hSOD analogt protein.

Fig. 8: Konstruksjon av pMF- 2001

Plasmid pOPlA6 er et høyt kopi-antall plasmid konstruert som beskrevet av D.H. Gelfand et al., PNAS 15: 5869-5873 (1978) og av M. Muesing et al., Cell 24: 235 (1981). Det ble spaltet med Clal og EcoRI, fylt med T4DNA-polymerase og det resulterende store fragmentet ble ligert til 1450 bp fragmentet (inneholdende tetracyklin-resistensgenet) fra pBR322 ved spalting med EcoRI og Aval og fylt-inn med T4DNA-polymerase. Dette erstatter ampicillin-resistens-genet til pOPlA6 effektivt med tetracyklin-resistensgenet. Det høyt kopi-antall tetracyklin-resistent-plasmidet som ble dannet ble betegnet pMF-2001.

Fig. 9: Konstruksjon av pMF- 2005

Plasmid 5519 ble spaltet med BamHI, fylt ved hjelp av T4DNA-polymerase og det resulterende lille fragmentet (inneholdende deo Pl-P2-operator/promoter-regionen og hSOD-genet) ble ligert til det store fragmentet tilveiebragt fra plasmid pMF-2001 etter Pstl-spalting og T4DNA-polymerase fjerning av 3'-endene. Dette overførte hele hSOD-genet under kontroll av deo Pl-P2-operator/promoter-regionen inn i høyt kopi-antall plasmidet. Det resulterende plasmidet, betegnet pMF-2005 er et høyt kopi-antall plasmid som leder et ekstremt høyt ekspresjonsnivå av et hSOD-protein analog under kontroll av deo Pl-P2-operator/promoter. Plasmid pMF-2005 er blitt deponert til ATCC i Rockville, Maryland 20852 U.S.A., under ATCC aksesjonsnr. 67362 i henhold til Budapest-traktaten.

Fig. 10: Konstruksjon av PDGE4- 3

Plasmid pE4GPX ble produsert fra plasmid pMSE4 (ATCC aksesjonsnr. 53250) som vist i fig. 28. Dette plasmidet uttrykker et MnSOD-GPX koblet protein under kontroll av X P^promoteren og ell ribosomale bindingssetet. Den ble spaltet med Nsil, og 3'-endene ble fjernet med T4DNA-polymerase, og deretter ble spaltet med Sspl for å fjerne X Pj^-promoteren. Det store fragmentet (4000 bp) ble isolert, og ligert til 1300 bp deo promoteren tilveiebragt fra pMF-5531 (fig. 4) ved Ndel-spalting, innfylling av Sspl spalting). Det nye plasmidet, betegnet pDGE4-3, inneholder i 5' til 3' retningen deo P1-P2-operator/promoter-sekvensen, omtrent 50 bp av cll-ribosomale bindingssetet, omtrent 450 bp av MnSOD-sekvensen og GPX-sekvensen.

pDGE4-3 leder syntesen av en stor mengde MnSOD-GPX koblet protein under kontroll av deo Pl-P2-promoter og ell RBS.

Fig. 11: Konstruks. ion av pTVR 568- 4

Plasmid pTV104(2) (ATCC aksesjonsnr. 39384) ble spaltet Ndel og Smal for å tilveiebringe det lille Ndel-Smal-fragmentet som inneholder hele hGH-sekvensen. Denne ble ligert til det store Ndel-PvuII-fragmentet tilveiebragt fra pDGE4-3. Det nye plasmidet, betegnet pTVR 568-4, inneholder i 5' til 3' retningen deo Pl-P2-promoteren, omtrent 50 bp av cll-ribosomale bindingssetet og den hGH-kodende sekvensen. pTVR 568-4 leder syntesen av store mengder av en hGH-analog under kontroll av deo Pl-P2-promoteren og ell RBS.

Fig. 12: Konstruksjon av pMFS- 5600 - et plasmid som produserer bGH under kontroll av deo P1- P2 operator/ promoterregionen

Plasmid pDGE4-3 (fig. 10) ble spaltet med Ndel og PvuII og det store Ndel-PvuII fragmentet ble isolert og ligert med T4ligase til en 750 bp bGH-sekvens tilveiebragt som følger. Plasmid pSAL 440-11 er identisk med plasmid pSAL 440-22 (fig. 24), dvs. et annet isolat fra den samme transformasjonen. bGH-sekvensen ble tilveiebragt fra pSAL 440-11 ved behandling med Hindlll, fylt i med det store Klenow DNA-polymerase-fragmentet etterfulgt av spalting med Ndel.

Det resulterende plasmidet betegnet pMFS-5600 inneholder i 5' til 3' retningen deo Pl-P2-promoteren, det autentiske deo RBS, omtrent 50 bp av clI RBS, bGH-genet, del av GPX-genet og Cu-Zn hSOD-genet. Plasmid pMFS-5600 leder syntesen av et bGH-analogt protein under kontroll av deo P1-P2 og det modifiserte ell RBS.

Fig. 13: Konstruksjon av paRB

Plasmid pSC-D^Tll (ATCC aksesjonsnr. 53468) leder ekspresjonen av en analog til humant Cu-Zn SOD. (Konstruksjonen av dette plasmidet ble beskrevet i ko-anviste U.S. patentnummer 4,742,004 og i Europa patent publikasjon nr. 173,280 som begge er referert til heri ved referanse). Det inneholder, i 5' til 3' retningen, X Pj^-promoteren, P-laktamase-promoteren, g-laktamase ribosomal bindingssetet og Cu-Zn hSOD-genet. Det store fragmentet produsert etter EcoRI og delvis BamHI spalting er deletert både for g<->laktamase promoter-ribosomale bindingssetet og SOD-genet. En syntetisk linker ble konstruert for å innføre nye restriksjonsseter, og ligert til fragmentet ovenfor. Dette produserer pARB, som inneholder X PL-promoteren rett oppstrøms for EcoRI, Smal, Xbal og Bglll-setene, i 5' til 3' retningen. Fig. 14: Konstruksjon av ppUN - en anvendbar ekspresjonsvektor Plasmid pSOD^Tll ble spaltet med Aval, Sspl og Stul og 1910 bp Aval-SspI-fragmentet ble isolert. Dette fragmentet ble ligert til det syntetiske SspI-EcoRI-fragmentet vist og til 1270 bp EcoRI-Aval-fragmentet fra pARB. Sekvensen til den syntetiske linkeren er forskjellig fra sekvensen til "naturlig" p-laktamase RBS ved tre nukleotidseter. De tre nukleotidene som er indikert i den syntetiske linkeren viser basepar-forandringene ved 3'-enden til p<->laktamase RBS ( CCA erstatter GAG). Dette eliminerer den første mulige ATG (C erstatter G) og de to andre basepar-forandringene danner et Ndel-sete (CA erstatter AG). Bortsett fra dette er syntetisk RBS identisk med p<->laktamase RBS. Denne konstruksjonen produserer det nye pUN-plasmidet som inneholder, i 5' til 3' retningen, X PL-promoteren, p<->laktamase-promoteren, syntetiske p-laktamase RBS med det unike Ndel-setet etterfulgt av Smal, Xbal og Bglll-setene.

Fig. 15: Konstruksjon av ppMA

Ndel-BamHI fragmentet fra pS0Dcxl3 (se fig. 3 - beskrivelse) som inneholder et hSOD cDNA ble satt inn i Ndel-Bglll store fragmentet til p<g>UN som vist. Plasmidet som ble produsert, betegnet p<g>MA, uttrykte hSOD-analogen i små mengder. Den eneste forskjellen i DNA-sekvensen mellom pSODe^Tll og det nye tilveiebragte plasmid pMA er i 3 basepar ved 3'-enden til det ribosomale bindingssetet (se beskrivelsene til figurene 14 og 16).

Fig. 16: Konstruksjon av pSODeMAX- 12

Plasmid pMA ble spaltet med Sspl og Ndel for å fjerne det syntetiske e-laktamase RBS, og det store Sspl-Ndel fragmentet ble ligert til den syntetiske linkeren vist, med dannelse av det nye pSODMAX-12. Den syntetiske linkeren består av p-laktamase RBS med en basepar-modifikasjon ved 3'-enden. Denne modifikasjonen danner et syntetisk (sli) p<->laktamase RBS med en baseforandring (A erstatter G) i forhold til autentisk3-laktamase RBS, som dermed eliminerer det første mulige ATG initieringskodonet. Basepar-forandringene kan bli oppsummert som følger:

Plasmid pSODMAX-12 er forskjellig fra plasmid pSODTll bare når det gjelder et basepar og leder ekspresjon av et SOD-analogt protein i høye nivåer. Plasmid pSODeMAX-12 er blitt deponert i Escherichia coli-stamm A4255 under ATCC aksesjonsnr. 67177.

Fig. 17: Konstruksjon av PMFS- 5533A

Plasmid pMF-5531 (vist i fig. 3) ble spaltet med Aatll og PstI og deretter behandlet med Klenow for å fjerne 3'-endene. Denne spaltingen fjerner ampicillin-resistens-genet. Det store fragmentet som ble produsert ble ligert til det lille pBR322-fragmentet, som inneholder tetracyklinresistens-genet, produsert ved spalting av pBR322 med EcoRI og Aval, og innfylling med Klenow-enzym.

Det resulterende plasmidet betegnet pMFS-5533A er identisk med pMF-5531 med unntagelse av ampicillin-resistens-genet er blitt erstattet med tetracyklin-resistens-genet; og det inneholder i 5' til 3' retningen deo Pl-P2-promoteren, Ndel-setet og hSOD-genet.

Fig. 18: Konstruksjon av pMFS- 5538

Plasmid pSODMAX-12 (tilveiebragt som vist i figurene 13-16) ble spaltet med Sali og Sspl og 2625 bp fragmentet inneholdende det syntetiske P-laktamase RBS og Cu-Zn SOD-genet ble tilveiebragt. Den ble ligert til et fragment inneholdende deo P1-P2, tilveiebragt ved restriksjon av pMFS-5533A med Ndel, etterfulgt av Klenow ifylling, og videre spalting med Sali.

Det resulterende plasmidet betegnet pMFS-5538 inneholder i 5' til 3' retningen deo Pl-P2-promoteren, det autentiske deo RBS, det syntetiske p<->laktamase ribosomale bindingssetet, og hSOD-genet. Den uttrykker et hSOD-analog protein i et moderat nivå.

Fig. 19: Konstruksjon av pTVR 580- 35

Plasmid pSAL-160-5 (konstruert som vist i figurene 31-34) uttrykker et koblet hGH apolipoprotein E protein hvor N-terminalen består av de første 45 aminosyrene til hGH koblet til ApoE3 hvor de første 11 aminosyrene er deletert. Det lille hGH-ApoE-fragmentet produsert ved spalting av dette plasmidet med PvuII og Smal ble ligert inn i det store fragmentet produsert ved PvulI-spalting av pTVR 568-4 (fig. 11). Dette erstatter effektivt hGH-sekvensen i pTVR 568-4 med den hGH-ApoE koblete sekvensen. Det resulterende plasmidet, betegnet pTVR 580-35 inneholder, i 5' til 3' retningen, deo Pl-P2-operator/promoter-regionen, ell ribosomale bindingssete og den hGH ApoE koblete sekvensen; den uttrykker store mengder av koblet hGH ApoE protein under kontroll av deo Pl-P2 og ell RBS.

Fig. 20: Skjematisk kart av deo operon

Denne figuren illustrerer et skjematisk kart av hele deo operon. De forskjellige deo-genene koder for følgende enzymer: deo C, deoksyriboaldolase; deo A, tymidinfosfory- lase; deo B, deoksyribomutase; og deo D, purinnukleotidfos-forylase. Tre operator/promoterregioner er blitt beskrevet: ved deo Pl, transkripsjonen er undertrykt av deo R repressoren og indusert av deoksyribose-5-P; ved deo P2, er transkripsjonen undertrykt av cyt R repressoren, indusert av cytidin eller adenosin og avhenger av cAMP og CRP; ved deo P3, er transkripsjonen kontrollert av ukjente proteinfaktorer og indusert av inosin og guanosin. cyt R og deo R genene er ikke bundet til deo operonet.

Fig. 21: Konstruksjon av pMFL 103

Plasmid pMFL-31 ble produsert ved innsetting av 5400 bp EcoRI-BamHI fragmentet til X DNA (inneholdende cl 857, Rex A, Rex B og N gen-sekvenser) inn i pBR322 spaltet med EcoRI og BamHI (se eksempel 8).

cl 857 Bglll-Clal-fragmentet ble fjernet fra pMFL-31 som vist og ligert til pRec 2/3 (ATCC aksesjonsnr. 39385) spaltet med Bglll og Clal, for å produsere det nye pMFL 103 plasmidet, hvor Rex A og Rex B genene er blitt eliminert.

Fig. 22: Konstruksjon av pMFL 110

cl 857 genet ble fjernet fra pMFL 103 ved Aatll-Bglll spalting. Denne ble satt inn i det store pMFL 31 fragmentet spaltet med de samme enzymene. Dermed ble et nytt plasmid, betegnet pMFL 110, produsert hvori omtrent 2500 bp av Rex A og Rex B genene er blitt eliminert fra pMFL 31 og som har et Aatll sete oppstrøms fra 5'-enden til cl 857 genet. Dette plasmidet, pMFL 110, inneholder cl 857-genet (Bglll-Aat fragmentet) oppstrøms for X Pl og N-genene (på et Bglll-BamHI-fragment). I dette plasmidet er X cl 857 genet under kontroll av den autentiske Prm-promoteren.

Fig. 23: Konstruksjon av PMF- 54DC

Plasmid pMFL 110 ble spaltet med Pstl og 3'-overhengende endene ble spaltet bort med Klenow-enzym. Dette ble etterfulgt av Clal-spalting. Pstl (Klenow)-ClaI-fragmentet inneholdende cl 857-genet, (1668 bp langt), ble spaltet med Hgi Åi som danner et 932 bp fragment som inneholder cl 857 genet som mangler 7 bp som koder for aminoterminus til proteinet fra startkodonet ATG. Dette fragmentet inneholder ikke Prm promoterregionen.

Et 28 bp syntetisk DNA-fragment ble syntetisert for å reparere 7 bp delesjonen og å danne Bglll, Seal og Ndel endonuklease gjenkjenningssetene oppstrøms for ATG-startkodonet til cl 857, og å danne et Hgi AI-sete rett etter ATG-startkodonet.

Shine-Dalgarno-sekvensen til X cll-genet ble satt inn mellom Bglll og Scal-setene, 11 bp oppstrøms fra det første ATG-kodonet til cl-proteinet. Syntetiske DNA-fragmenter på 28 basepar ble behandlet med polynukleotidkinase for å fosforyl-ere 5'-enden, deretter blandet med en 20 basepar komplementær tråd for å danne et dobbelttrådet DNA-fragment. Dette fragmentet ble også fosforylert ved 5'-enden for å lette ligeringen.

Dette fragmentet tilveiebragt ved spalting av pJBF 5401 (se fig. 1) med Bglll, PvuII og Aval inneholder deo Pl setet mellom BamHI-setet og Bglll-spaltingssetet ved 3'-enden av fragmentet. Dette fragmentet ble sammensmeltet til det syntetiske fragmentet og deretter til 932 bp Pstl (Klenow)-Hgi Ai fragmentet, og blandingen ble ligert med T4ligase. Det resulterende plasmidet, betegnet pMF-54DC, inneholder deo Pl operator/promoter, og cl 857 repressoren og den leder ekspresjonen av cl 857 repressorproteinet under kontroll av deo Pl-promoteren.

Fig. 24: Konstruksjon av PFSAL- B27

Plasmid pHG 44 (ATCC aksesjonsnr. 39806) er blitt beskrevet i inngitt U.S. patentsøknad serienr. 644,671 og EPO publikasjon nr. 173,280. Det er et plasmid avledet fra pBR322, inneholdende X PL-promoteren, ell ribosomale bindingssetet som kontrollerer bGH-genet, og T±T2transkripsjonsterminerings-sekvenser. CII ribosomale bindingssetet ble modifisert ved spalting med Nsil og fjerning av 3'-endene for å produsere plasmid pSAL 440-22. (dl* RBS indikerer modifikasjon av ell RBS, som nå uavhengig er N-proteinet). Plasmid pSAL 440-22 ble spaltet med Clal og 5'-endene ble fylt med Escherichia coli DNA polymerase (Klenow-fragment). Den lineære formen av DNA i full lengde som ble produsert ble ligert til fragmentet (1300-1350 bp langt), inneholdende deo Pl og cl 857, som var blitt isolert fra plasmid pMF-54DC etter delvis AccI, og BamHI spalting etterfulgt av Klenow ifylling.

Dette produserte plasmidene pFSAL-B27 og pFSAL-A5. Plasmid pFSAL-B27 inneholder i klokkeretningen deo Pl og X cl 857 repressoren, mens de i pFSAL-A5 har en orientering som er mot klokkeretningen. Påfølgende sekvensanalyse demonstrerte at deo Pl promoter-sekvensen som er tilstede i plasmid pFSAL-B27 er forkortet ved 5'-enden, mens hele deo Pl promotersekvensen er tilstede i pFSAL-A5. Den forkortede deo Pl promotersekvensen inneholder ikke lenger EcoRI restriksjonssetet. Begge plasmidene inneholder mot klokkeretningen X Plidet modifiserte ell ribosomale bindingssetet (dl*), bGH-genet og T^T2terminatorsekvensen. Disse plasmidene uttrykker et bGH-analogt protein bare når de blir varme-indusert (ved 42°) som demonstrerer at deo Pl operator/promoter-regionen leder uttrykkingen av et funksjonelt termolabilt cl 857 repressor protein (se eksempel 9). Plasmid pFSAL-B27 er blitt deponert til ATCC som pFSAL-130-B27 (ATCC aksesjonsnr. 67071). Et diagram av pFSAL-A5 er vist i figur 25.

Fig. 25: Konstruksjon av pSODeMAX- 12- cI

Plasmid pFSAL-A5 ble konstruert som beskrevet i teksten til fig. 24; den er lik plasmid pFSAL-B27 med unntagelse av at orienteringen av deo Pl og X cl 857 repressoren er mot klokkeretningen. I tillegg, inneholder plasmid pFSAL-A5 hele deo Pl promotersekvensen mens plasmid pFSAL-B27 inneholder den forkortede deo Pl promoter-sekvensen. Plasmid pFSAL-A5 ble spaltet med Sspl og XmnI og det lille fragmentet inneholdende deo Pl og X cl 857 ble ligert til det ifylte Aval-setet til plasmid pSODMAX-12 (se fig. 16).

Det resulterende plasmidet, betegnet pS0DeMAX-12-cI inneholder deo Pl som kontrollerer X cl 857 repressoren, og i en 5' til 3' retning, X Pl promoteren, p<->laktamase ribosomale bindingssetet og Cu-Zn SOD-genet. Dette plasmidet er uavhengig av X-genene på Escherichia coli-kromosomene og kan dermed bli transformert i mange forskjellige verter. Plasmid pSODpMAX-12-d uttrykker hSOD-analogen i omtrent halvparten av nivået til foreldreplasmid pS0D<g->MAX12.

Fig. 26: Konstruksjon av pTVR 700- 2

Det lille fragmentet inneholdende deo Pl og X cl 857 repressoren ble tilveiebragt fra plasmid pFSAL-A5 som beskrevet i fig. 25. Den ble ligert til det ifylte Clal-setet til plasmid pTVR 289-18 som uttrykker met-leu-leu-leu-met-ApoE (apolipoprotein E analog) under kontrollen av X ?l promoteren (se fig. 29).

Det resulterende plasmidet, pTVR 700-2, inneholder mot klokkeretningen X promoteren, p<->laktamase promoteren-ribosomale bindingssetet og sekvensen for ApoE analogen, og i klokkeretningen deo Pl operator/promoter og cl 857 repressor. Den uttrykker met-leu-leu-leu-met-ApoE bare når den er varme-indusert ved 42°C, som indikerer at deo Pl promoteren kontrollerer uttrykking av det funksjonelle termolabile cl 857 repressor-proteinet (se eksempel 11).

Merk: Plasmid pTVR 700-2 ble først ført inn i E. coli MC

1061 hvor den ble betegnet pTVR 596-1 og deretter transfektert inn i villtype Escherichia coli 12435 hvor den ble betegnet pTVR 700-2.

Fig. 27: Konstruksjon av pTVR 590- 4

Det lille fragmentet inneholdende deo Pl og X cl 857 repressoren ble tilveiebragt fra plasmid pFSAL-A5 som beskrevet i fig. 25. Den ble ligert til det ifylte Clal-setet til plasmid pTV 194-80 som uttrykker met-ApoE under kontroll av X Pl promoteren (plasmid pTV 194-80 ble konstruert som vist i figurene 31-33 og 35).

Det resulterende plasmidet, pTVR 590-4, inneholder mot klokkeretningen X Pl promoteren, p<->laktamase promoter-ribosomale bindingssetet og sekvensen for met-ApoE, og i klokkeretningen deo Pl promoteren og cl 857 repressoren. Den uttrykker metApoE bare når den blir varme-indusert ved 42°C, som indikerer at deo Pl promoteren kontrollerer uttrykking av den funksjonelle repressoren (se eksempel 11). Plasmid pTVR 590-4 er blitt deponert til American Type Culture Collection i Rockville, Maryland under ATCC aksesjonsnr. 67360.

Merk: Plasmid pTVR 590-4 ble først introdusert inn i Escherichia coli MC 1061 hvor den ble betegnet pTVT 583-17 og deretter transfektert inn i vill-type Escherichia coli 12435 hvor den ble betegnet pTVR 590-4 .

Fig. 28: Produksjon av pE4GPX

Plasmid pMSE4 (ATCC aksesjonsnr. 53250) inneholder cDNA som koder for hele den kodende sekvensen til MnSOD (human mangan superoksyd dismutase) under kontroll av X Pl promoteren og ell ribosomale bindingssetet. Den ble spaltet med Stul som fjernet et 67 bp fragment ved omtrent 450 bp fra 5'-enden til MnSOD-sekvensen. Fragmentet inneholdende GPX-sekvensen, tilveiebragt fra plasmid pl8UL-l (ATCC aksesjonsnr. 67361) ved Ndel-spalting, Klenow ifylling og Sspl-spalting, ble satt inn mellom de to Stul-setene innenfor MnSOD cDNA. Plasmid pl8UL-l er blitt deponert med ATTC i Rockville, Maryland under ATCC aksesjonsnr. 67361. Det resulterende plasmidet, pE4GPX, uttrykker et MnSOD-GPX koblet protein under kontroll av X Pl og det ell ribosomale bindingssetet.

Fig. 29: Produksjon av pTVR 289- 18

Konstruksjonen av plasmid pTVR 279-8 (ATCC aksesjonsnr. 53216) er i helhet beskrevet i ko-inngitte søknad US serienummer 896,750 og også beskrevet i EPO publikasjon nr. 173,280. Dette plasmidet uttrykker en met-leu-leu-leu-met apolipoprotein E3 analog under kontroll av X PL-promoteren og det ell ribosomale bindingssetet.

ell ribosomale bindingssetet ble fjernet fra pTVR 279-8 ved Ndel-spalting, Klenow ifylling og EcoRI-spalting, og det store fragmentet som ble produsert ble isolert. Dette fragmentet ble ligert til EcoRI-AluI 200 bp fragmentet fra pBLAll (ATCC aksesjonsnr. 39788) som inneholder promoteren og det ribosomale bindingssetet til g<->laktamase (betegnet pBLA). Det resulterende plasmidet inneholder i 5' til 3' retningen X Pl promoteren, p<->laktamase promoter-ribosomale bindingssetet og sekvensen for met-leu-leu-leu-met-ApoE, med delesjon av Ndel-setet ved 5'-enden til ApoE-sekvensen. Dette plasmidet, betegnet pTVR 289-18, uttrykker met-leu-leu-leu-met-ApoE.

(Konstruksjonen av plasmid pTVR 289-18 er også beskrevet i inngitte søknad US søknad serienummer 896,750, og er inkor-porert heri ved referanse for å klart illustrere hvordan plasmidet er konstruert).

Fig. 30: Konstruksjon av pS0Dal3 og pSODel

Plasmidet pS0Da2 (ATCC aksesjonsnr. 39786) ble delvis spaltet med EcoRI og den resulterende lineære formen av DNA ble isolert fra en agarosegel. Det rensede DNAet ble ifylt med DNA-polymerase I (Klenow) og religert. Den resulterende klonen pS0Dal3 inneholder et EcoRI-sete beliggende ved 5'- enden til det ribosomale bindingssetet. Et fragment inneholdende p<->laktamase promoteren og ribosomale bindingssetet ble isolert fra plasmid pBLAll (ATCC aksesjonsnr. 39788) som var blitt spaltet med EcoRI og Alul. 200 basepar-fragmentet ble ligert til det store fragmentet isolert fra pS0Dal3 som var blitt spaltet med Ndel, ifylt med DNA-polymerase I (Klenow) og deretter spaltet med EcoRI. Det resulterende plasmidet pSODcxl inneholder det ribosomale bindingssetet til g<->laktamase-genet og X PL-promoteren.

Fig. 31: Konstruksjon avPR0211 og pR012

Plasmid pJH200 (ATCC aksesjonsnr. 39783) ble delvis spaltet med Ndel, behandlet med DNA-polymerase I (Klenow) for å fylle inn endene og det resulterende DNAet ble religert for å danne ekspresjonsvektor pR0211. Ekspresjonsvektor pR0211 ble spaltet med Ndel og Hindlll, det store fragmentet ble isolert og ligert til et Ndel-Hindlll bGH-fragment isolert fra pAL500 (ATCC aksesjonsnr. 39782) for å produsere pR012. Ndel-EindIII-fragmentet ble produsert fra pAL500 ved å spalte med EcoRI og ved ligering til endene av det spaltede produktet syntetiske linkere med sekvensen:

TATGGATC

ACCTAGTTAA

Ligeringsblandingen ble spaltet med Ndel og Hindlll og det resulterende Ndel-Hindlll bGH-fragmentet ble isolert.

Fig. 32: Konstruksjon av p579

rRNA operon T^T2transkripsjonstermineringsfragmentet ble isolert fra plasmid pPSl (ATCC aksesjonsnr. 39807) som var blitt spaltet med Hindlll. T^Tg-fragmentet ble satt inn i det unike Hindlll-setet til pR0211 (fig. 31) som var blitt spaltet med Hindlll.

Den resulterende ekspresjonsvektoren, p579, inneholder X Pl~promoteren, Cjjribosomale bindingssetet, etterfulgt av T^Tg transkripsjonstermineringssignalene.

Fig. 33: Konstruksjon av pTV- 170

Ndel-Ndel ApoE fragmentet ble isolert fra plasmid pApoE-EX2 (ATCC aksesjonsnr. 39787) og satt inn i det unike Ndel-setet til ekspresjonsvektor p579 (fig. 32) som har blitt spaltet med Ndel. Det resulterende plasmidet pTV-170 uttrykker en analog til det naturlige humane ApoE proteinet med et metioninresidie satt til N-terminus.

Fig. 34: Konstruksjon av pSAL 160- 5

Et Aval-Aval fragment inneholdende ApoE DNA-sekvensen ble isolert fra pTV-170 (fig. 33) som var blitt spaltet med Aval. Fragmentet ble ifylt med DNA-polyemerase I (Klenow) og isolert på agarosegel. Det rensede ApoE-fragmentet ble satt inn i Pstl-setet til pTV 104(2) plasmid (ATCC aksesjonsnr. 39384) som var delvis spaltet med Pstl etterfulgt av spalting av 3'-endene med DNA-polymerase I (Klenow). Det resulterende plasmidet ble betegnet pSAL 160-5.

Fig. 35: Konstruksjon av pTV- 194

p-laktamase-promoteren og det ribosomale bindingssete-fragmentet ble isolert fra plasmid pBLAll (ATCC aksesjonsnr. 39788) etter spalting med EcoRI og Alul. Dette fragmentet ble ligert til det store fragmentet til pTV-170 (fig. 33) plasmid som delvis var blitt spaltet med Ndel, ifylt med DNA-polymerase I (Klenow) og deretter spaltet med EcoRI.

Fig. 36: Konstruksjon av pEFF- 902 - et " uavhengig" plasmid uttrykkende pGH- analog

Plasmid pRec-pig24 (ATCC aksesjonsnr. 53433) er blitt beskrevet i inngitt US patentsøknad serienr. 821,830. Den uttrykker en met-asp-gln-griseveksthormonanalog (pGH) under kontroll av X PL-repressoren og det ell ribosomale bindingssetet. Det 600 bp fragmentet som koder for pGH-analogen ble spaltet fra pRec-pig24 ved Ndel og PvuII spalting og satt inn i plasmid pFSAL-130-B27 (ATCC aksesjonsnr. 67071; fig. 24) hvorfra den bGH-kodende sekvensen var blitt fjernet ved delvis Ndel og fullstendig PvuII spalting. Det resulterende plasmid, betegnet pEFF-902, inneholder den forkortede deo Pl promoteren som kontrollerer X cl 857 repressoren og i tillegg i 5' til 3' rekkefølgen: X PL-promoteren, ell ribosomale bindingssetet, pgH-analog DNA-sekvens og T^T2transkripsjonstermineringskodende sekvensene. Dette plasmidet, som uttrykker det pGH-analoge proteinet i høyt nivå er uavhengig av X-genene på Escherichia coli-kromosomet og kan dermed bli transformert inn i mange forskjellige verter.

Fig. 37: Konstruksjon av pEFF- 9021 - en annen " uavhengig"

plasmid uttrykkende pGH- analog ( tetracyklin-resistent)

Et butt-endet fragment inneholdende tetracyklinresistensgenet fra plasmid pBR322 (ATCC aksesjonsnr. 370717), produsert ved spalting med EcoRI og Aval og ifylt med Klenow-enzym ble satt inn i det store fragmentet til plasmid pEFF-902 hvor ampicillin-genet var blitt fjernet ved Aatll og Pstl spalting etterfulgt av spalting av 3'-endene med Klenow. Dette produserer plasmid pEFF-9021 som ligner plasmid pEFF-902 med unntagelse av at ampicillinresistensgenet er blitt erstattet med tetracyklin-resistensgenet. Plasmid pEFF-9021 inneholder den forkortede deo Pl-promoteren som kontrollerer X cl 857 repressoren; og inneholder også i 5' til 3' retningen X Pl promoter, ell ribosomale bindingssetet og den pGH-analoge DNA-sekvensen og de T^Tg transkripsjonstermineringskodende sekvensene. Det er et uavhengig plasmid som uttrykker pGH-analogen i høyt nivå. Et annet isolat fra den samme ligeringen viste seg å være identisk med unntagelse av at tetracyklinresistensgenet er i den motsatte orienteringen; dette plasmidet, betegnet pEFF-9022, uttrykker også pGE-analogen i høyt nivå.

Fig. 38: Konstruksjon av pEFF- 905 - et deo PjP?Plasmid

uttrykkende pGH- analogen

Framgentet inneholder i 5' til 3'-retningen ell ribosomale bindingssetet, pGH-analoge DNA-sekvensen og de T-^Tg transkripsjonstermineringssekvensene ble tilveiebragt fra plasmid pEFF-9022 ved spalting med EcoRI, Dral og Pstl, etterfulgt av isolering av EcoRI-Dral-fragmentet og deretter fjerning av EcoRI 5'-endene med Mung bønne nuklease. Dette fragmentet ble ligert til det store fragmentet tilveiebragt fra plasmid pMF 5531 (fig. 4) hvor endel av hSOD-kodende sekvensen var blitt fjernet ved Ndel og Stul-spalting, etterfulgt av spalting med Mung-bønne av det store fragmentet produsert for å fjerne Ndel 5'-endene. Det resulterende plasmidet, betegnet pEFF-905, inneholder i 5' til 3'-retningen, deo P1-P2 promoter-sekvensen, ell ribosomale bindingssetet, pGH-analoge DNA-sekvensen og de T^Tg transkripsjonstermineringssekvensene. Dette plasmidet uttrykker det pGH-analoge godt, men konstruksjonen viste seg å være ustabil.

Fig. 39: Konstruksjon av pEFF- 920 - et deo P1- P2 plasmid

( PAR+) uttrykkende pGH- analog

Et fragment inneholdende PAR (del) sekvensen ble isolert fra plasmid pSClOl (ATCC aksesjonsnr. 37032) ved spalting av plasmidet med Sspl, PvuII og EcoRI, isolering av det produserte store fragmentet og spalting av dette med Hindi. Et 350 bp SspI-HincII fragment ble isolert og satt inn i EcoRV-setet i plasmid pEFF-905; det resulterende plasmidet ble betegnet pEFF-920. Dette plasmidet inneholder PAR-sekvensen og i 5' til 3'-rekkefølgen deo P1-P2 promoteren, ell ribosomale bindingssetet, den pGH-analoge DNA-sekvensen og T^T2transkripsjonstermineringssekvensene. Plasmid pEFF-920 uttrykker det pGH-analoge proteinet veldig godt og er blitt deponert i Escherichia coli-stamme Scp930 i ATCC under aksesjonsnr. 67706.

Fig. 40: Konstruksjon av pMFS- 5627 - et deo P1- P2 plasmid

uttrykkende bGH- analog

Fragmentet inneholdende i 5' til 3'-rekkefølgen den bovine veksthormon (bGH) analoge DNA-sekvensen og T-^Tg transkripsjonstermineringskodende sekvensene, ble isolert fra pFSAL-130-B27 (ATCC aksesjonsnr. 67071; se fig. 24) ved spalting med Ndel, Dral og Bglll. Dette fragmentet ble ligert til det store fragmentet tilveiebragt fra pMF 558-26 (fig. 6) etter Ndel og Stul-spalting. Det resulterende plasmidet, betegnet pMFS-5627 inneholder i 5' til 3'-retningen deo P1-P2 promoteren, deo ribosomale bindingssetet, bGH-analoge DNA-sekvensen og T^T£transkripsjonstermineringskodende sekvensene. Dette plasmidet uttrykker det bGH-analoge proteinet dårlig.

Fig. 41: Konstruksjon av pMFS- 5603 - et annet deo P1- P2

plasmid som uttrykker bGH- analogen

Det lille fragmentet inneholdende en del av deo P1-P2 promoterene og ell ribosomale bindingssetet, isolert fra plasmid pEFF-905 ved spalting med Bglll og Ndel, ble ligert til det store fragmentet tilveiebragt fra pMFS-5627 spaltet med Bglll og Ndel. Det resulterende plasmidet, betegnet pMFS-5603 inneholder i 5' til 3'-retningen deo Pl-P2-promoteren, ell ribosomale bindingssetet, bGH-analoge'DNA-sekvensen og ^1^2transkripsjonstermineringskodende sekvensene. Den uttrykker det bGH-analoge proteinet i middels høye nivåer.

Fig. 42: Konstruksjon av pMFS- 5605 - et deo P1- P2 plasmid

( PAR+) som uttrykker bGH- analog

Det lille fragmentet inneholdende PAR (del) sekvensen fra plasmid pEFF-920 (fig. 39) ble isolert fra plasmid pEFF-920 etter spalting med Aatll og Bglll. Dette fragmentet ble ligert til det store fragmentet til plasmid pMFS-5603 som var blitt spaltet med Aatll og Bglll. Det resulterende plasmidet, betegnet pMFS-5605, inneholder PAR-sekvensen og, i 5' til 3'-retningen deo Pl-P2-promoteren, ell ribosomale bindingssetet, bGH-analoge DNA-sekvensen og Ti To transkripsjonsterminerings kodende sekvensen. Den uttrykker det "bGH-analoge proteinet godt.

Plasmid pMFS-5607 (Tet<R>) ble konstruert fra plasmid pMFS-5605 (Amp^) ved anvendelse av metoden vist i fig. 7. Plasmid pMFS-5607 er blitt deponert i Escherichia coli-stammen S(p930 (F-) i ATCC under aksesjonsnr. 67704. (Escherichia coli- F-stammene er beskrevet ytterligere i eksempel 21).

Fig. 43: Konstruksjon av plasmid pMF- 5534 - et plasmid som inneholder en translasjonsenhancer og som uttrykker

hSOD- analogen

Plasmid pJBF5401 (fig. 1) ble spaltet med BamHI og det lille (900 bp) fragmentet ble isolert og renset fra lav smeltende agarose. BamHI-fragmentet ble deretter spaltet med restrik-sjonsenzymene Bglll og Taql og det dannete 440 bp fragmentet ble isolert og renset. Syntetiske linkere med numrene 2912, 3604, 3107, 2913 (beskrevet i detalj i beskrivelsen til fig. 4) som er identiske til en del av den publiserte deo nukleotidsekvensen som dekker deo P2-promoteroperatoren (Valentine-Hansen et al., EMBO 1: 317 (1982)) ble sammensmeltet, ligert til hverandre og deretter ligert til Bglll-Taql 440 bp fragmentet.

Korte oligonukleotidsekvenser på 34 og 39 baser i lengde ble kjemisk syntetisert. Disse sekvensene er som vist.

Etter sammensmelting av oligonukleotidene med numrene 3413 og 3913, ble dupleksen ligert til det utvidete Bglll-Taql fragmentet. Denne endelige ligeringen tilveiebragte et fragment, flankert av Bglll-Ndel restriksjonssetene, som innbefatter en AT-rik region (translasjons "enhancer" - se eksempel 18). Dette fragmentet ble ligert til det større fragmentet fra pMF-5531 som var blitt dannet ved spalting med Bglll-Ndel. Det resulterende plasmidet, betegnet pMF-5534, uttrykker det hSOD-analoge proteinet i høye nivåer. Den inneholder i 5' til 3'-retningen deo Pl-P2-promotere, modifiserte deo ribosomale bindingssetet med enhancer-sekvensen og den hSOD-analoge kodende sekvensen.

Plasmid pMF-5534 ble deponert i Escherichia coli-stamme Scp930(F~) i ATCC under aksesjonsnr. 67703.

Fig. 44: Konstruksjon av plasmid pMF- 5541

Plasmid pMF-5534 (fig. 43) ble spaltet med Bglll og Avrll. Det største fragmentet som ble observert på agarosegelen ble isolert og renset, og de kohesive endene ble ifylt med Klenow-enzym og ligert, som dermed på ny dannet Avrll-setet. Dette produserte plasmidet pMF-5540 som inneholder i 5' til 3'-retningen deo Pl-promoteren, modifisert deo ribosomale bindingssetet (RBS) med enhancersekvensen og den hSOD-analoge kodende sekvensen. Plasmid pMF-5540 produserer et høyt nivå hSOD analogt protein under kontroll av deo Pl-promoteren og den translasjonene enhanceren.

Plasmid pMF-5540 ble spaltet med EcoRI og Avrll; de kohesive endene ble deretter ifylt med Klenow-enzym og det største fragmentet ble isolert og ligert med T4ligase. Disse fremgangsmåtene fjernet deo Pl og P2 promotersekvensene med unntagelse av det deo ribosomale bindingssetet (RBS), og resulterte i dannelsen av pMF-5541 som inneholder i 5' til 3'-retningen det modifiserte deo RBS med enhancer-sekvensen og den hSOD-analoge kodende sekvensen. Dette plasmidet produserer et ekstremt lavt nivå av hSOD analogt protein.

Fig. 45: Konstruksjon av plasmid pMF- 945

Plasmid pEFF-920 (fig. 39 og ATCC aksesjonsnr. 67706) ble spaltet med Bglll og Ndel, og det største fragmentet ble isolert. Dette fragmentet ble ligert til det lille 540 bp fragmentet produsert ved spalting av plasmid pMF-5534 (fig. 43) med Bglll og Ndel. Dette produserer plasmid pMF-945 som inneholder PAR-sekvensen og 5' til 3'-retningen deo P1-P2-promotersekvensene, modifiserte deo RBS med enhancersekvensen, den pGH-analoge kodende sekvensen og T^T2transkripsjonstermineringssekvensene. Plasmid pMF-945 uttrykker det pGH-analoge proteinet i høyt nivå.

Fig. 46: Konstruksjon av plasmid pMF- 5608

Plasmid pMFS-5607 (ATCC aksesjonsnr. 67704) ligner plasmid pMFS-5605 (fig. 42) med unntagelse av at ampicillinresistensgenet er blitt erstattet med et gen for tetracyklinresistens ved anvendelse av samme metode som beskrevet i fig. 7. Plasmid pMFS-5607 ble spaltet med Ndel og Bglll og det resulterende store fragmentet ble ligert til det lille (540 bp) fragmentet produsert ved spalting av pMF-5534 (fig. 43) med Ndel og Bglll. Det resulterende plasmidet, betegnet pMF-5608 inneholder PAR-sekvensen og i 5' til 3'-retningen, deo Pl-P2-promotersekvensen, modifisert deo RBS med den AT-rike sekvensen (enhanceren), den bGH-analoge kodende sekvensen og T1T2transkripsjonstermineringssekvensen. Den uttrykker det bGH-analoge proteinet i lavt nivå.

Fig. 47: Konstruksjon av plasmid pMF- 5513- 1

Setespesifikk mutagenese av plasmid pJBR-5401 ble utført som beskrevet i fig. 2 og resulterte i produksjonen av plasmid pMF-5416-2 som inneholder hele sekvensen til deo P1-P2-promoterene. Dette plasmidet ble spaltet med Ndel og Aatll og det lille deo Pl-P2-fragmentet ble isolert og ligert til det store fragmentet tilveiebragt ved spalting av plasmid pSODal3 ved Ndel og Aatll (se fig. 3).

Det resulterende plasmidet, pMF-5513-1 inneholder i 5' til 3'-retningen hele deo Pl-P2-promotersekvensen og den hSOD-analoge kodende sekvensen. Dette plasmidet er på grunnlag av restriksjonsenzymanalyser antatt å være identisk med plasmid pMF-5531.

Fig. 48: Konstruksjon av plasmid pMFS- 2006

Det store fragmentet fra plasmid pMF-2005 (fig. 9) spaltet med Bglll og Styl ble ligert med T4 ligase til det lille fragmentet tilveiebragt fra plasmid pMFS-5605 (fig. 42) spaltet med Bglll og Styl. det resulterende plasmidet, betegnet pMFS-2006 inneholder tetracyklinresistensgenet og inneholder i 5' til 3'-retningen deo Pl-P2-promotersekvensen, ell ribosomale bindingssetet, bGH-analoge kodende sekvensen og T^T£transkripsjonstermineringskodende sekvenser. Dette plasmidet medfører uttrykking av bGH-analoge proteinet (met-asp-gln-bGH) i høyt nivå.

Flg. 49: Produksjon av fragmentene ved anvendelse av NIalII

for anvendelse til konstruksjon av pGH 30- 2

A. Et oligo dT-primet cDNA-bibliotek til gris hypofyse mRNA ble forsynt med C-hale og satt inn i plasmid pBR322 som var blitt spaltet med Pstl og forsynt med G-hale. Den ble transformert inn i Escherichia coli-stamme HB101 og selek-sjonen ble utført på Tet LB skåler. Hybridisering til en bGH-probe identifiserte plasmid pl07 (også kalt pPGH cDNA 107) som inneholder hele den kodende sekvensen til pGH analogen pluss ledersekvensen. Plasmid 107 ble spaltet med Pstl og det lille fragmentet som ble produsert inneholdende den kodende sekvensen til pGH-analogen (deletert med et glycyl-residie), ble spaltet med Smal og Nlalll. 325 bp fragmentet som ble produsert, inneholdende den midtre delen av pGH-sekvensen, ble isolert fra 2% bløte agarosegeler, og renset ved fenol.

B. Plasmid pFSAL-B27 (fig. 24 og ATCC aksesjonsnr. 67071) ble spaltet med EcoRI og Pstl. 340 bp-fragmentet ble isolert og spaltet med Nlalll og det resulterende 70 bp fragmentet, inneholdende det ell ribosomale bindingssetet og 5'-enden til den bGH-analoge sekvensen (identisk med 5'-enden til den pGH-analoge sekvensen), ble isolert fra 2% bløte agarosegeler og renset med fenol.

Fig. 50: Produksjon av plasmid pGH 30- 2

De to fragmentene produsert som beskrevet i fig. 49 ble ligert med T4 ligase og deretter ligert til det store fragmentet tilveiebragt ved spalting av plasmid pl07 med EcoRI og Smal. Dette produserte plasmid pGH 30-2 som inneholder det ell ribosomale bindingssetet og den pGH analoge kodende sekvensen i full lengde.

Fig. 51: Produksjon av plasmid pMFS- 928

Det store fragmentet fra plasmid pFSAL B27 (fig. 49) etter delvis EcoRI og PvuII spalting ble ligert til det lille fragmentet produsert fra plasmid pGH 30-2 spaltet med EcoRI og PvuII. Det resulterende plasmidet, betegnet pMFS-928 inneholder ampicillin-resistensgenet og i 5' til 3'-retningen X Pl»ell ribosomale bindingssetet, den pGH-analoge kodende sekvensen og T^T2transkripsjonsterminerende sekvensen. Den inneholder videre cl-repressorsekvensen under kontroll av den forkortede deo Pl-promoteren.

Plasmid pMFS-928 leder ekspresjon av met-asp-gln-pGH som mulig er deletert med et glycyl-residie. Preliminære sekvens-data indikerer at dette glycyl-residiet korresponderer til posisjon 39 til naturlig forekommende pGH; den N-terminale sekvensen met-asp-gln i tillegg i pGH-analogen korresponderer til posisjonene -3, -2 og -1. Det er på det nåværende tidspunkt ikke fastslått om et glycyl-residie er deletert i plasmid pMFS 928, forårsaket av problemer med kondensering av G-residiene i DNA-sekvensanalysen. Analyse av den komplementære tråden er underveis for å bestemme om den hele pGH-analoge sekvensen er tilstede eller ikke; hvis sekvensen er fullstendig, da er plasmidene pMFS 928 og pMFS 929 identiske.

Fig. 52: Produksjon av plasmid pMFS- 929

Det store fragmentet fra plasmid pMFS-928 etter PvuII og BssHII spalting ble ligert til det lille fragmentet produsert fra plamid pRec gris 24 (ATCC aksesjonsnr. 53433 og fig. 36) spaltet med PvuII og BssHII. Det resulterende plasmidet, betegnet pMFS-929, inneholder ampicillin-resistensgenet og i 5' til 3'-retningen X Pj^, ell ribosomale bindingssetet, den ikke-deleterte pGH-analoge kodende sekvensen i full lengde og T1T2transkripsjonstermineringskodende sekvensene; den inneholder videre cl-repressorsekvensen under kontroll av den forkortede deo Pl-promoteren. Den er blitt deponert i ATCC under aksesjonsnr. 67705.

Et dobbelt-trådet DNA-plasmid er blitt utviklet som ved innføring inn i en egnet bakteriell vertscelle, f.eks. Escherichia coli, gjør av vertscellen kan effektivt uttrykke et ønsket, naturlig-forekommende, eukaryot polypeptid eller en polypeptid-analog derav som har den biologiske aktiviteten til, og en aminosyresekvens som er vesentlig den samme som, men forskjellig fra, det naturlig-forekommende polypeptidet og som dermed tilveiebringer produksjon av polypeptidet eller polypeptidanalogen innbefattende i 5' til 3'-retningen følgende: a) DNA som innbefatter i 5' til 3'-retningen tandem-promoterene deo Pl og deo P2; b) DNA som innbefatter et ribosomalt bindingssete for at mRNA skal bli transkribert fra DNAet som koder for polypeptidet

eller polypeptidanalogen som har evnen til å bli bundet til ribosomer innenfor vertscellen;

c) et ATG-initieringskodon; og

d) DNAet som koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen

i fase med ATG-initieringskodonet;

og som i tillegg innbefatter en DNA-sekvens innbefattende et replikasjonsorigo fra det bakterielle plasmidet som har evnen til autonom replikasjon i vertscellen og en DNA-sekvens som inneholder et gen assosiert med en selekterbar eller identi-

fiserbar fenotypisk markør som blir manifestert når plasmidet er tilstede i vertscellen.

Egnede Escherichia coli vertceller hvorpå det dobbelt-trådete DNA kan bli ført inn i innbefatter Scp732, S<p744, MC1061, Scp540, Scp928, S(p929, Scp930 eller vill-type Escherichia coli (ATCC aksesjonsnr. 12435). Foretrukne Escherichia coli vertceller er celler som ikke inneholder noen funksjonell deo E og cyt E repressor såsom Escherichia coli-stammene Scp744 og Scp732.

Escherichia coli-celle Scp732, som inneholder plasmid pMF-2005, er blitt deponert til the American Type Culture Collection, Eockville, Maryland under ATCC aksesjonsnr. 67632. Escherichia coli vill-type stamme (ATCC aksesjonsnr. 12435) er fritt tilgjengelig fra den offentlige kolleksjonen til ATCC. Andre vertceller er kjent innenfor fagområdet. Se tabell I på side 84. Fenotypen til disse cellene er også beskrevet i tabell IA. Escherichia coli-stamme MC1061 er blitt beskrevet av M. Casadaban og S.N. Cohen, J. Mol. Biol. 138: 179-207 (1980).

En mengde F- Escherichia coli vertceller som kan bli anvendt som vertceller for plasmider er beskrevet. Mens spesifikke F~~ vertstammer som blir anvendt er beskrevet i mere detalj i eksempel 21, er det innlysende for fagmannen at hvilke som helst egnede F~~ Escherichia coli vertstammer kan bli anvendt. Spesifikke eksempler på Escherichia coli-stammer som kan bli anvendt innbefatter F~MG1655, F~W3110, F~W2637, F~~MM294, F-1000 og F-1100. Disse stammene er nøye diskutert i eksempel 21.

Egnede naturlig-forekommende polypeptider som kan bli produsert av plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter humant kobber/sink superoksyd dismutase, humant mangan superoksyd dismutase, humant glutation peroksydase, humant veksthormon, bovint veksthormon, griseveksthormon, humant apolipprotein E eller forskjellige domener av fibronektinmolekyler. Det er innlysende for fagmannen at plasmidene også kan inneholde DNA som koder for andre ønskede, naturlig-forekommende polypeptider.

Dobbelt-trådet DNA-plasmid ifølge oppfinnelsen innbefatter også tandem-promoterene deo Pl og deo P2. Som beskrevet detaljrikt i eksempel 1, var det for å klone deo P1-P2 operator/promoter-regionen først nødvendig å isolere og rense deo-operonet. deo-operonet ble isolert fra Escherichia coli Scpl084 som er beskrevet i Buxton et al., J. Bacteriol. 136: 668-681 (1978). Metoden for rensing av deo-operonet og for konstruering av et plasmid inneholdende tandempromoterene deo Pl og deo P2 er beskrevet i mere detalj i eksempel 1.

Forskjellige ribosomale bindingsseter for at mRNA skal bli transkribert fra DNA som koder for et ønsket polypeptid eller polypeptid-analog som har evnen til å binde ribosomer innenfor vertcellen er også innbefattet i oppfinnelsen. Et ribosomalt bindingssete som kan bli anvendt er det naturlig deo-ribosomale bindingssetet avledet fra deo-operonet. Et foretrukket ribosomalt bindingssete som er blitt anvendt er avledet fra deo-operonet og har en to-base endring i sekvensen nedstrøms for Shine-Dalgarno-sekvensen ved nukleotidene —1 og —3 i henhold til A'en til ini tieringskodonet. Dette ribosomale bindingssetet er beskrevet i mere detalj i beskrivelsen til figur 2.

Et annet foretrukket ribosomalt bindingssete som er blitt anvendt er det ell ribosomale bindingssetet fra X bakteriofag med følgende sekvens:

Et annet egnet ribosomalt bindingssete som kan bli anvendt innbefatter et mutant ell ribosomalt bindingssete fra X bakteriofag med sekvensen:

det naturlige p-laktamase ribosomale bindingssetet avledet fra pBR322;

et syntetisk oligonukleotid med sekvensen:

Et annet ribosomalt bindingssete som er blitt anvendt i foreliggende oppfinnelse er et syntetisk nukleotid med sekvensen:

Plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholder også et ATG-initieringskodon. DNAet som koder for det ønskede natur1ig-forekommende eukaryote polypeptidet eller polypeptid-analogen er i fase med ATG-initieringskodonet.

Plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter også en DNA-sekvens som innbefatter et replikasjonsorigo fra et bakterielt plasmid som har evnen for autonom replikasjon i vertcellen. Egnede replikasjonsorigoer kan bli tilveiebragt fra mange kilder. En slik kilde, plasmid pBR322, er fritt tilgjengelig fra den offentlige kolleksjonen til American Type Culture Collection som ATCC aksesjonsnr. 37017. Replikasjonsorigo kan også bli avledet fra p0PlA6. Dette plasmidet er velkjent innenfor fagområdet og er beskrevet av D.H. Gelfand et al., PNAS 15: 5869-5873 (1978) og av M. Muessing et al., Cell 24: 235 (1981).

En DNA-sekvens som inneholder et gen assosiert med en selekterbar eller identifiserbar fenotypisk markør som er manifestert når plasmidet er tilstede i vertcellen er også en komponent av plasmidet. Egnede gener innbefatter de som er assosiert med temperatur-følsomhet eller medikament resistens, f.eks. resistens mot ampicillin, kloramfenikol eller tetracyklin.

Plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis et sirkulært, lukket plasmid.

Som beskrevet ovenfor, kan plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen bli anvendt for å produsere mange, naturlig-forekommende polypeptider eller polypeptidanaloger derav. Blant plasmidene betraktet i oppfinnelsen er plasmider som produserer humant kobber/sink superoksyd-dismutase, humant mangan superoksyd-dismutase, humant glutation peroksydase, humant veksthormon, bovint veksthormon, grise veksthormon, humant apolipoprotein E eller fibronektin-domener.

Plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også bli anvendt for å produsere eukaryote polypeptidanaloger som har den biologiske aktiviteten til og en aminosyresekvens som er vesentlig den samme som, men forskjellig fra, den til det naturlig-forekommende polypeptidet eller analoger som har en aminosyresekvens som er identisk med den til det naturlig-forekommende polypeptidet, men er forskjellig ved at polypeptidet er acetylert eller ikke-glykosylert, for eksempel.

Plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen er blitt anvendt for å produsere en analog til naturlig-forekommende humant kobber/sink superoksyd-dismutase innbefattende en dimer av to polypeptid-subenheter hvor hver har en aminosyresekvens som er identisk med den til naturlig-forekommende humant kobber/sink-superoksyd dismutase, men som ikke er acetylert ved dets aminoterminus. Plasmid pMF 5531, som har restriksjonskartet vist i figur 4, produserer en slik analog til humant kobber/sink superoksyd dismutase. Andre plasmider som produserer analoger av humant kobber/sink superoksyd dismutase som definert ovenfor innbefatter plasmid pMF 5519, med restriksjonskartet vist i fig. 5; plasmid pMF 558-26 med restriksjonskartet vist i fig. 6; plasmid pMF 5534, med restriksjonskartet vist i fig. 43; plasmid pMF-5520, med restriksjonskartet vist i fig. 7; plasmid pMF 2005 , med restriksjonskartet vist i fig. 9; plasmid pMFS 5533A, med restriksjonskartet vist i fig. 17; og plasmid pMFS-5538, med restriksjonskartet vist i fig. 18.

Plasmidene fremstilt i oppfinnelsen er også blitt anvendt for å produsere en polypeptidanalog av humant veksthormon, med aminosyre-metionin festet til N-terminus til det naturlig-forekommende humane vekst-hormon-polypeptidsekvensen. Et eksempel på et slikt plasmid er plasmid pTVR 568-4, med restriksjonskartet vist i fig. 11.

Plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også bli anvendt for å produsere en analog til bovint veksthormon med aminosyrene metionin, asparaginsyre og glutamin festet til N-terminus av den naturlig-forekommende bovine veksthormonpolypeptidsekvensen. Eksempler på plasmider for produsering av analoger til bovint veksthormon som definert ovenfor, innbefatter plasmid pMFS-5600, med restriksjonskartet vist i fig. 12; plasmid pMFS 5627, med restriksjonskartet vist i fig. 40; plasmid pMFS-5603, med restriksjonskartet vist i fig. 41; plasmid pMFS-5605, med restriksjonskartet vist i fig. 42; og plasmid pMFS-2006, med restriksjonskartet vist i fig. 48.

Plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også bli anvendt for å produsere en analog til griseveksthormonet med aminosyrene metionin, asparaginsyre og glutamin festet til N-terminus til den naturlig-forekommende grise veksthormonpolypeptidsekvensen. Eksempler på plasmider for produsering av analoger til griseveksthormon som definert ovenfor innbefatter plasmid pEFF-905, med restriksjonskartet vist i fig. 38; og plasmid pEFF-920, med restriksjonskartet vist i fig. 39.

Plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen er også blitt anvendt for å produsere mange koblete polypeptider. Eksempler på koblete polypeptider som er blitt produsert ved plasmidene ifølge oppfinnelsen innbefatter plasmid pDGE4-3, med restriksjonskartet vist i fig. 10 og anvendt for å produsere et mangan superoksyd dismutase-glutation peroksydasekoblet polypeptid; og plasmid pTVR 580-35, med restriksjonskartet vist i fig. 19, og anvendt for å produsere et humant veksthormon-apolipoprotein E koblet polypeptid.

Vert plasmidsystem kan produsere av et naturlig-forekommende eukaryot polypeptid eller en polypeptidanalog derav innbefattende de forskjellige plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen i en egnet Escherichia coli vert. Escherichia coli-vert inneholdende plasmidet blir valgt fra gruppen av Escherichia coli-verter bestående av Scp744, Scp732, vill-type (ATCC aksesjonsnr. 12435 ), S(p540, S<p928, Scp929, MC1061, og Scp930.

Verten til vert plasmidsystemet kan også innbefatte en F~~ stamme. Verten kan være en hvilken som helst F- stamme som er kjent for fagmannen, mens spesifikke F— stammer som kan bli anvendt i vert plasmidsystemet innbefatter følgende F- stammer: F~MG1655; F~w3110; F-W2637; F~MM294; F~1000; og F_1100.

Ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er en analog til naturlig-forekommende humant kobber/sink superoksyd dismutase innbefattende en dimer av to polypeptidsubenheter hvor hver har en aminosyresekvens som er identisk med den til det naturlig-forekommende polypeptidet, men som ikke er acetylert ved N-terminus, et mangan superoksyd dismutase-glutationperoksydase-koblet polypeptid, et metionpolypeptid-analog av humant veksthormon, et met-asp-gln polypeptidanalog til bovint veksthormon, et met-asp-gln polypeptidanalog til griseveksthormon og et humant veksthormon-apolipprotein E kondensert polypeptid blitt produsert ved dyrking av vert plasmidsystemene innbefattende plasmider som inneholder DNAet som koder for hver av disse polypeptidene, analoger eller koblete polypeptidene og en egnet Escherichia coli-vert, under egnede betingelser som tillater produksjon av polypeptidene, analogene eller koblete polypeptidene og utvinning av det resulterende polypeptidet, analoge eller koblete polypeptidet.

Fremgangsmåten for produsering av et natur1ig-forekommende polypeptid eller en polypeptidanalog innbefatter betingelser med liten utlufting som er beskrevet mere detaljert i eksmplene 2, 16 og 17. Eksempel 2 beskriver optimale vekstbetingelser for produksjon av en analog til humant kobber/- sink superoksyd dismutase såsom analogen definert ovenfor. Eksemplene 16 og 17 beskriver optimale betingelser for produksjon av analoger til grise og bovine veksthormoner.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for produsering av et ønsket naturlig-forekommende polypeptid eller polypeptidanalog konstitutivt hvori en karbonkilde som er forskjellig fra glukose blir anvendt i vekstmediumet. Uten å være bundet til noen teori, er det antatt at DNA blir transkribert i lavere nivåer når DNAet som blir uttrykt er under kontroll av en deo P2 promoter/operator-region og glukose er tilstede i mediet. Glukose ser ut til å være med på å forårsake reduserende transkripsjonsnivåer. Egnede ikke-glukose karbonkilder som kan "bli anvendt i vekstmediumet innbefatter glycerol, fruktose, succinat, natriumlaktat og natriummalat selv om det er innlysende for fagmannen at andre kilder også kan bli anvendt.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å produsere ønskede polypeptider eller analoger som innbefatter dyrking av Escherichia coli-celler i glukose, som dermed reduserer transkripsjonsnivået av DNAet som koder for det ønskede polypeptidet mens Escherichia coli-celler vokser, og deretter tilsette en ikke-glukose karbonkilde etter fjerning av glukosen.

Ikke-glukose karbonkilder som kan bli anvendt i dette aspektet av oppfinnelsen innbefatter glycerol, succinat, natriumlaktat, fruktose og natriummalat. Andre ikke-glukose karbonkilder som kan bli anvendt kan lett bestemmes av f agmannen.

Egnede vekstmedia som kan bli anvendt innbefatter LB eller minimal saltmedia. Type medium som blir anvendt og elementer innbefattet i oppløsningen er beskrevet i detalj i eksempel 2. Andre elementer som kan bli anvendt i oppløsningen kan lett bestemmes av fagmannen.

En annen faktor som er blitt vist som øker produksjonen av ønskede polypeptider er svak lufting av vekstmediumet.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en metode hvori polypeptidet eller polypeptidanalogen som blir produsert i vert plasmidsystemet blir skilt ut mediumet hvori vert plasmidsystemet blir dyrket ved tilsetting av et divalent metallion til vekstmediumet.

Mens foretrukne divalente metallioner innbefatter Cu<+2>og Zn"1"2, så er det innlysende for fagmannen at et hvilket som helst egnet divalent metallion kan bli anvendt. Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte hvori det divalente ionet er en blanding av Cu<+2>og Zn<+2>metallioner. Det er innlysende for fagmannen at en blanding av egnede divalente metallioner kan bli anvendt. En bør også merke seg at polypeptidet blir skilt ut i mediet, ikke i periplasmaområdet.

En bør videre merke seg at når plasmidet som uttrykker det ønskede polypeptidet inneholder en translasjonsenhancer, såsom beskrevet nedenfor, er utbyttet av polypeptid vist seg å være overraskende høyere når veksten av Escherichia coli-cellene utføres ved omtrent 30°C.

Egnede Escherichia coli-vertceller hvori plasmidet beskrevet ovenfor kan bli ført inn i er de samme som de som er beskrevet ovenfor, innbefattende F~~ vertstammer beskrevet ovenfor. Foretrukne Escherichia coli-stammer innbefatter vill-type (ATCC aksesjonsnr. 12435) og Escherichia coli-stamme MC1061.

Et aspekt av oppfinnelsen er tilstedeværelsen av DNA som koder for et X cl 857 termolabilt repressorprotein i plasmidet. Siden produksjonen av X repressorproteinet ikke avhenger av tilstedeværelsen av X-genene i vertkromosomet, er plasmidet betegnet et "uavhengig" plasmid.

Egnede naturlig-forekommende polypeptider som kan bli produsert av plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter humant veksthormon, bovint veksthormon, grise-veksthormon, humant kobber/sink superoksyd dismutase, apolipoprotein E eller fibronektin-domener. Det er innlysende for fagmannen at plasmidet også kan inneholde DNA som koder for andre ønskede naturlig-forekommende polypeptider.

En viktig komponent av det uavhengige plasmidet er det ribosomale bindingssetet og egnede bindingsseter innbefatter et hvilket som helst av de som er diskutert tidligere i søknaden.

Plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholder også et ATG-initieringskodon. DNAet som koder for det ønskede naturlig-forekommende eukaryote polypeptidet eller analogen er i fase med ATG-kodonet.

Dette uavhengige plasmidet innbefatter et replikasjonsorigo fra et bakterielt plasmid som har evnen til autonom replikasjon i verten. Egnede replikasjonsorigo kan bli tilveiebragt fra et antall kilder, for eksempel, fra plasmid pBR322. Denne stammen er fritt tilgjengelig fra American Type Culture Collection som ATCC aksesjonsnr. 37017. Replikasjonsorigo kan også være avledet fra pOPlA6.

En DNA-sekvens som inneholder et gen assosiert med en selekterbar eller identifiserbar fenotypisk markør som er manifestert når det uavhengige plasmidet er tilstede i vertcellen er også en komponent av plasmidet. Egnede gener innbefatter de som er assosiert med temperaturfølsomhet eller medikamentresistens, dvs. resistens for ampicillin, kloramfenikol eller tetracyklin.

Som beskrevet ovenfor, kan plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen bli anvendt for å produsere mange, naturlig-forekommende polypeptider eller polypeptidanaloger derav. Blant de betraktede plasmidene er plasmider som produserer humant kobber/sink superoksyd dismutase, humant veksthormon, bovint veksthormon, grisevekthormon, apolipoprotein E og fibronektindomenene.

Plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også bli anvendt for å produsere eukaryote polypeptidanaloger som har den biologiske aktiviteten til og en aminosyresekvens som er vesentlig den samme som, men forskjellig fra, det til det naturlig-forekommende polypeptidet.

Plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen er blitt anvendt for å produsere en polypeptidanalog av bovint veksthormon med aminosyrene metionin, asparaginsyre og glutamin festet til N-terminus til det naturlig-forekommende bovine veksthormon-polyepeptidsekvens. Et eksempel på et slikt plasmid er plasmid pFSAL-130-B27, med restriksjonskartet vist i fig. 24 og deponert under ATCC aksesjonsnr. 67071 og plasmid pMF-B27 beskrevet i eksempel 23.

Plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen er også blitt anvendt for å produsere en polypeptidanalog til humant veksthormon med aminosyren metionin festet til N-terminus til den humane veksthormonpolypeptidsekvensen. Et eksempel på et slikt plasmid er plasmid pTVR 723-6 beskrevet i eksempel 22.

Plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen er også blitt anvendt for å produsere en polypeptidanalog til griseveksthormonet med aminosyrene metionin, asparaginsyre og glutamin festet til N-terminus til den naturlig-forekommende grisevekst-hormonpolypeptidsekvensen. Eksempler på plasmider for å produsere analoger av griseveksthormonet som definert ovenfor, innbefatter plasmid pEFF-902, med restriksjonskartet vist i fig. 36, plasmid pEFF-9021, med restriksjonskartet vist i fig. 37; og plasmid pMFS 929, med restriksjonskartet vist i fig. 52 og deponert under ATCC aksesjonsnr. 67705.

Plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen er også blitt anvendt for å produsere en analog til naturlig-forekommende humant kobber/sink superoksyd dismutase innbefattende en dimer av to polypeptidsubenheter som hver har aminosyresekvensen som er identisk til naturlig-forekommende humant kobber/sink superoksyd dismutase, men som ikke er acetylert ved dets aminoterminus. Et eksempel på et slik plasmid er plasmid pSODPMAX-12-cI, som har restriksjonskartet vist i fig. 25.

Plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også bli anvendt for å produsere en analog til apolipoprotein E. Et eksempel på et plasmid som produserer et met-leu-leu-leu-met apolipoprotein E analog er plasmid pTVR 700-2, med restriksjonskartet vist i fig. 26; og et eksempel på et plasmid som produserer en met-apolipoprotein analog er plasmid pTVR 590-4, med restriksjonskartet vist i fig. 27. Plasmid pTVR 714 (også pTVR 721-4) produserer også en analog til apolipoprotein E. Dette plasmidet er beskrevet i eksempel 12.

Escherichia coli-verten til vert plasmidsystemet kan også være en F- stamme. Verten kan være en hvilken som helst F~~ stamme som er kjent innenfor fagområdet, mens spesifikke F~~ stammer som kan bli anvendt innbefatter følgende F- stammer: F_MG1655; F-W3110; F~¥2637; FHYIM294; F~1000; og F-1100.

Ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan en met-asp-gln polypeptidanalog til bovint veksthormon, et met-asp-gln polypeptidanalog til griseveksthormon, et polypeptidanalog til humant kobber/sink superoksyd dismutase som definert ovenfor, og et polypeptidanalog til apolipoprotein E også som definert ovenfor, kan hver bli produsert ved dyrking av vert-plasmidsystemet innbefattende plasmider som inneholder DNA som koder for en analog til bovint veksthormon, en analog til griseveksthormon, en analog til humant kobber/sink superoksyd dismutase, og en analog til apolipoprotein E, respektivt, og en egnet Escherichia coli-vert, under egnede betingelser som tillater produksjon av analogene, respektivt, og utvinning av de resulterende analogene.

Translasjonsenhanceren i tillegg øker produksjonsnivået av polypeptidene som blir produsert av plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Det har vist at tilsetting av disse AT-rike regionene forsterker betraktelig ekspresjonen av DNA som koder for de ønskede polypeptidene (se eksempel 18 for nærmere detaljer). I en foretrukket fremstilling, har det vist seg at når Escherichia coli-celler og plasmider inneholdende AT-rike regioner blir dyrket i produksjonsmedia ved omtrent 30°C istedenfor 37°C, økes produksjonsnivået enda mer.

Det er innlysende for fagmannen at plasmidene kan produsere hvilke som helst ønskelige naturlig-forekommende polypeptider eller analoger derav, fortrinnsvis produserer plasmidet fremstilt ifølge oppfinnelsen humant kobber/sink superoksyd dismutase. I en foretrukket fremstilling, er plasmidet ifølge oppfinnelsen betegnet pMF 5534 og er blitt deponert i Escherichia coli-stamme Scp930 (F-) under ATCC aksesjonsnr. 67703.

Selv om vi har diskutert plasmidene og vert-plasmidene fremstilt ifølge oppfinnelsen når det gjelder tandem promotere deo Pl og deo P2, vil det være innlysende for fagmannen, i lys av det faktum at deo P2 er den sterkere promoteren, at oppfinnelsen videre tilveiebringer plasmider hvor deo P2 alene er promoteren.

Det vil i tillegg være innlysende for fagmannen at deo Pl promoteren også kan bli anvendt alene. Et eksempel på et slikt plasmid er plasmid pMF 5540. Plasmider som har en deo Pl promoter kan i tillegg innbefatte en AT-rik sekvens-translasjonsenhancer.

EKSEMPLER

Eksemplene som følger er beskrevet for å lette forståelsen av oppfinnelsen. Eksemplene innbefatter ikke detaljerte beskrivelser på konvensjonelle metoder som ble anvendt til konstruksjon av vektorene, innsetting av genene som koder for polypeptidene inn i slike vektorer for å danne plasmider eller innføring av de resulterende plasmidene inn i vertene. Eksemplene innbefatter heller ikke detaljerte beskrivelser for konvensjonelle metoder som ble anvendt for å analysere polypeptidene som blir produsert av slike vertplasmidsystemer. Slike metoder er velkjente for fagmannen og er beskrevet i mange publikasjoner innbefattende som eksempler følgende: T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sombrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York

(1982).

EKSEMPEL 1

Konstruksjon av deo P1- P2 vektor som uttrykker et hSOD analogprotein

For å klone deo P1-P2 operator/promoter-regionen, var det først nødvendig å isolere og rense deo-operonet.

X cl 857: DNA som koder for deo-operonet ble isolert fra Escherichia coli S<pl084 som inneholder en deo transduserende fag i en lysogen tilstand, Buxton et al., J. Bacteriol. 136: 668-681 (1978). Metoden for rensing av DNAet er hovedsakelig som beskrevet av D. Freifelder, Biochem. Biophys. Res. Commun. 18: 141-144 (1965; og D. Freifelder, Biochem. Biophys. Acta 108: 318-319 (1965). To liter Escherichia coli-kultur som ble dyrket i LB-medium ble varme-sjokkbehandlet i 30 min ved 42°C og deretter overført til 39°C i 3 t. Cellene ble høstet ved sentrifugering og suspendert i buffer inneholdende 1-5 mM MgCl2og noen få dråper kloroform ble tilsatt for å lysere cellene. Lysatet ble applisert på toppen av en CsCl trinn-gradient og sentrifugert i 2 t ved en hastighet på 25.000 RPM i en SW25 rotor. Et opaliserende bånd som ble dannet på toppen av den høyeste tetthetsputen av CsCl ble isolert og sentrifugert med natriumperklorat for å tilveiebringe rent fag X deo DNA.

Konstruksjon av pJBF- 5401 - En vektor som inneholder deo promoterene Pl og P2

Deo Pl og P2 operator/promoter-regionene er beliggende på et 980 bp AvaII-f ragment, Valentin-Hansen et al., the EMBO Journal 1: 317 (1982). Dette fragmentet ble isolert og klonet som følger (se også fig. 1): deo DNA ble spaltet med Avall og 5' overhengende endene ble ifylt ved Klenow-DNA polymerase. BamHI linkere ble satt til blandingen av AvalI-fragmentene, og blandingen av AvalI-fragmentene med BamHI-linkere ble ligert med T4ligase til BamHI - spaltet pBR322. Escherichia coli S(p540 (deletert for deo-operonet) ble transformert med den ligerte plasmidblandingen, og sådd ut på LB-skåler inneholdende ampicillin. Klonene som inneholdt et BamHI-innskudd inneholdende deo P1-P2 ble identifisert ved hybridisering til et<32>P-merket syntetisk DNA-fragment korresponderende til nukleotidene 138-167 av deo-promoteren.

Nukleotidsekvensen til det syntetiske fragmentet var:

5'-TTGC C C CAGGTAGAC C GGCATC GATGTGAC-3'

En klon ut i fra flere som hybridiserte til primeren ble plukket og anvendt for videre analyse.- Plasmid DNA isolert fra denne klonen ble spaltet med BamHI og analysert elektro-foretisk på agarosegeler. Fragmenter på 900 bp og 1300 bp, i tillegg til et fragment som korresponderer til vektoren, ble observert på gelene. Disse fragmentene ble utsatt for Southern hybridiseringsanalyser med den merkede proben. deo Pl-P2-promoterene viste seg å være beliggende i 900 bp fragmentet. For å videre verifisere tilstedeværelsen av deo P1-P2, ble 900 bp fragmentet spaltet med Bglll, BSSHII, EcoRI og Hpall. Størrelsene på fragmentene som ble dannet ved bruk av disse enzymene ved spalting av 900 bp fragmentet var i god overensstemmelse med det antatte restriksjonsmønsteret for deo Pl-P2-sekvensen. 900 bp BamHI-fragmentet ble på nytt klonet i pBR322 som vist i fig. 1 og det nye plasmidet som inneholder deo P1-P2 promoterene ble betegnet pJBF-5401 (ATCC aksesjonsnr. 67359).

Konstruksjon av pMF- 5416 - En vektor som inneholder deo P1- P2 Vektoren pJBF-5401 inneholder ikke et hensiktsmessig restriksjonssete mellom Shine-Dalgarno-sekvensen til det ribosomale bindingssetet og det første ATG translasjonsinitierings-kodonet. For å anvende deo P1-P2 promoterene i en ekspresjonsvektor, var det dermed nødvendig å konstruere et restriksjonssete og enda opprettholde den samme avstanden mellom det ribosomale bindingssetet og første ATG. Dette ble tilveiebragt ved konstruksjon av et Ndel restriksjonssete, bestående av sekvensen CATATG som er spaltet CA/TATG. Genet som skal bli klonet må et Ndel-sete ved 5'-enden av genet for innsetting inn i Ndel-setet til plasmidet; ATG til Ndel-setet er initieringskodonet.

Det Ndel-setet i deo P1-P2 vektoren ble konstruert ved setespesifikk mutagenese, Y. Morinaga et al., Biotechnology 2: 636-639 (1984) ved bruk av BTG syntetisk DNA-fragment nr. 2015, som beskrevet i fig. 2. De fire mulige plasmidene som fremkommer etter denne fremgangsmåten er vist i fig. 2.

Bakterier inneholdende plasmid A blir eliminerte på grunn av at de er ampicillin-følsomme. Bakterier inneholdende plasmid B blir eliminert fordi de ikke vil hybridisere til det nick-translaterte radioaktivt-merkede BssHII-SalHI-fragmentet. Bakterier inneholdende plasmidene C og D blir differensierte ved hybridisasjon til syntetisk DNA-fragment nr. 2015 under økende stringente betingelser og deretter ved nærvær av det nye Nde-setet ført inn på de syntetiske DNA-fragmentene. Plasmid D, betegnet pMF5416, inneholder deo Pl-P2-promoterene proksimalt til det nye Ndel-restriksjonssetet. Sekvensanalyse (ved dideoksymetoden til Sanger) av 450 bp av deo P1-P2-promotersekvensen viste at en 48 bp sekvens begynnende fra bp 702-749 av deo Pl-P2-promoteren ikke var tilstede. Denne sekvensen som vanligvis er tilstede i deo P2-promoterregionen og som er essensiell for transkripsjonen, var sannsynligvis blitt deletert i løpet av sete-rettet mutagenese.

Konstruksjon av pMF- 5531 - Et plasmid som produserer lave nivåer av en hSOD- analog

Den humane kobber/sink superoksyd-dismutase (hSOD) kodende sekvensen ble deretter ført inn i vektoren inneholdende deo P1-P2 promoteren og deretter ble delesjonen i P2 reparert.

Plasmid pS0Dc<13 (vist i fig. 30 og konstruert som beskrevet i beskrivelsen til figurene) inneholder genet som koder for hSOD nedstrøms for et Nde-restriksjonssete. Det var dermed mulig å konstruere et nytt plasmid som vist i fig. 3, som inneholder hSOD-genet nedstrøms fra deo P1-P2 promoteren (med 48 bp delesjonen). Dette nye plasmidet er blitt betegnet pMF-5516.

For å oppnå ekspresjon, ble delesjonen i deo P2-regionen nå reparert som vist i fig. 4 og beskrevet i beskrivelsen til figurene. Dette produserer et plasmid som inneholder, 5' til3'-sekvensen, fullstendig deo Pl-P2-promotersekvens (innbefattende det autentiske ribosomale bindingssetet), Ndel-restriksjonssetet og hSOD-genet.

Dette plasmidet ble transformert inn i Escherichia coli S<p744, en mutant som mangler cyt R og deo R repressorene. K. Hammer-Jesperson og P. Nygaard, Molec. Gen. Genet. 148: 49-55

(1976). Etter transformeringen, ble omtrent 120 kloner screenet for hSOD-analog ekspresjon ved å kjøre elektroforese på polyakrylamidgeler ekstrakter av kulturer dyrket i LB-medium. Flere kloner dannet et veldig svakt proteinbånd som vandret i sammen med autentisk renset hSOD. En klon ble plukket, og plasmid DNA ble renset fra denne ved tetthets-gradientsentrifugering. Plasmidet ble betegnet pMF-5531. Plasmid pMF-5531 ble ført inn ved transformering inn i Escherichia coli S<p540 og Scp732. Kulturer ble dyrket i LB-medium (eksempel 13a) inneholdende 0,2$ glycerol over natt, og en cellemasse ekvivalent til en OD^^q enhet "ble produsert (som beskrevet i eksempel 15) før applisering på SDS-geler. Disse gelene indikerte at et lavt nivå SOD-analog ekvivalent til 1,536 av totale Escherichia coli-proteiner ble produsert i Escherichia coli-vert Scp540. Noe høyere nivåer av hSOD ble produsert i Scp732. hSOD-analogen produsert i Scp540 reagerte med<125>l-merket anti-humant superoksyd dismutase antistoff. For å eliminere muligheten av at det lave ekspresjonsnivået er assosiert med en sekvensvariasjon som er forskjellig fra den som er ventet, ble et BglII-Stul-fragment som inneholder grensesetet for restriksjon og ligering sekvensert og funnet å være riktig. Dette bekrefter at plasmid pMF-5531 inneholder hele deo P1-P2 promoterregionen.

I et påfølgende eksperiment, ble den setespesifikke mutage-nesen av plasmid pJBF5401 beskrevet ovenfor (og i figurene 2°g 3) gjentatt og produserte plasmid pMF-5416-2 (se fig. 47). Dette plasmidet inneholdt hele deo Pl-P2-sekvensen uten delesjon. Plasmid pMF-5513-1 ble produsert fra dette plasmidet, som vist i fig. 47. Plasmid pMF-5513-1 inneholder hSOD-analoge kodende sekvensen under kontroll av deo P1-P2-promotersekvensen, og det ser ut som om dette plasmidet er identisk med plasmid pMF-5531 (fig. 4).

Proteinet produsert av disse plasmidene og av plasmider som er beskrevet i følgende seksjoner er en analog til naturlig humant kobber/sink superoksyddismutase. Denne analogen er ikke-acetylert og ikke-glykosylert.

Modifikasjon av det deo ribosomale bindingssetet for å produsere pMF- 5519 - Et plasmid med god produksjon av en hSOD- analog

Plasmid pMF-5531 utviser lavt ekspresjonsnivå av hSOD-genet. Dette kan være en funksjon av avstanden mellom det ribosomale bindingssetet og det første ATG til meddeleren (message) siden variasjon i denne avstanden er kjent for å påvirke translasjon. Avstanden i pMF-5531 mellom enden til det ribosomale bindingssetet og første ATG er på 4 nukleotider. Denne avstanden ble utvidet til 6 nukleotider ved spalting av pMF-5531 med Ndel, ifylling med T^polymerase og re-ligering, som dermed produserer et nytt plasmid med to ekstra basepar.

Dette plasmidet ble anvendt for å transformere Escherichia coli Scp744 (cyt R— deo R<->) og flere kloner ble analysert ved restriksjonsendonuklease-spalting med Ndel for å verifisere elimineringen av Ndel-setet ved polymerasereaksjonen som fyller inn. Kloner som inneholdt plasmider som mangler Ndel-setet ble dyrket, og cellelysatene ble analysert på SDS polyakrylamidgeler. Flere lysater viste et proteinbånd som vandret i sammen med et hSOD markørprotein. Intensiteten til det båndet fremkom flere ganger høyere enn det som ble funnet i pMF-5531. Plasmidet som så ut til å være den som hadde høyest ekspresjon, betegnet pMF-5519, ble renset og introdusert inn i en mengde Escherichia coli-verter, for å bestemme den mest ønskelige verten for ekspresjon. Disse Escherichia coli-vertene innbefatter vill-type (ATCC aksesjonsnr. 12435), Scp928 (A deo), Scp929 (a deo, cyt R-) og S(p744 ( deo R-, cyt R-). Den siste verten utviste det høyeste ekspresjonsnivået. Deretter ble plasmid pMF-5519 transformert inn i Escherichia coli Scp540, og densitometriske analyser av proteinprofilene viste at denne produserte mere enn to ganger så mye hSOD-analog som plasmid pMF-5531 i S<p540 (dvs. 3,5$ totalt protein). Plasmid pMF-5519 ble også transformert inn i S(p732 og ga høyere nivåer av SOD-analog enn når den var i Scp540, dvs. 5, b% totalt protein.

(Genotypen til hver Escherichia coli-stamme som ble anvendt og kildereferansen er ført opp i tabellene I og IA i eksempel 3).

Resultatene av disse eksperimentene viser at ekspresjonen varierte fra omtrent 300-900 mg hSOD pr. 50 O.D. enheter bakteriekultur. Denne beregningen ble utført på grunnlag av ko-elektroforese og farging av en standard 1 ug ren SOD sammen med bakterielle prøver etterfulgt av densitometer-scanning (enzym-nivåer som blir produsert av hver stamme er beskrevet i tabell I i eksempel 3). Den nye sekvensen i regionen av det ifylte Ndel-setet ble bekreftet ved sekvensanalyse.

Videre utvidelser av Deo P1- P2 ribosomale bindingssetet Siden utvidelse av det ribosomale bindingssetet med to basepar (i plasmid pMF-5519) produserte en bedre produsent av hSOD-analogt protein, ble en serie på fire utvidelser av det deo P1-P2 ribosomale bindingssetet konstruert i et forsøk på å øke produksjonen enda mere. For å oppnå denne enden, ble åtte enkelt-trådete syntetiske DNA-sekvenser syntetisert som beskrevet i beskrivelsen til fig. 6. Komplementære tråder ble blandet for å tilveiebringe en final konsentrasjon på 100 pmol/ml og sammensmeltet i 26 timer ved 7°C, som produserte 4 syntetiske dobbelt-trådete DNA-linkere betegnet I, II, III og IV. Hver dobbelt-trådete DNA-linker ble ligert som vist i fig. 6 til et 540 bp fragment fra deo P1-P2 operator/promoter-regionen. Dette fragmentet var blitt preparert ved spalting av plasmid pMF-5519 med Stul og Baml, rensing av det resulterende 1000 bp deo P1-P2 fragmentet fra lavt smeltende agarose, og inkubering av det rensede fragmentet med Bglll og Hinfl for å produsere et 540 bp Bglll-Hinfl fragment; dette 540 bp fragmentet ble isolert og renset fra agarosegelen. Det resulterende fragmentet ble ligert inn i pMF-5531 som vist i fig. 6, med forlenging av avstanden mellom deo Pl-P2-sekvensen og første ATG. (Plasmid pMF-5531 inneholder den uendrede P1-P2 ribosomale bindingssetesekvensen og produserer hSOD-protein i lavt nivå). Plasmidene produsert i hvert tilfelle ble anvendt til å transformere S<p732 (cyt R— deo R—). Kloner ble undersøkt for ekspresjon av hSOD ved dyrking i LB-medium inneholdende ampicillin etterfulgt av lysis og elektroforese på SDS akrylamidgeler. Kloner som uttrykte hSOD i nivåer som i det minste var så høye som pMF-5531 i scp732 ble plukket, plasmider ble renset og fragmentet inneholdende det ribosomale bindingssetet ble analysert ved dideoksysekvensering. Til nå er sekvensen til plasmider inneholdende to av de ribosomale bindingssete-forlengelsene blitt verifisert. Disse korresponderer til linkere betegnet I og IV, dvs. 7-8 bp forlenging og 9-10 bp forlenging, respektivt, og plasmidene er blitt betegnet pMF-558-26 og pMF-5536, respektivt. Det viste seg at disse uttrykker hSOD-analogt protein i lavt nivå og som ligner nivåene uttrykt av pMF-5531.

Konstruksjon av pMF- 5520 - som uttryker det humane kobber/- sink superoksyd dismutase ( hSOD) genet i høvt nivå

Tidligere observasjoner i vårt laboratorium har indikert at humant kobber/sink superoksyd dismutase (hSOD) ekspresjon drevet av pl promotersystemet kan bli forbedret ved erstatting av ampicillin-resistensgenet på plasmidet med tetracyklin-resistensgenet. Denne tilnærmingen ble anvendt for å forhøye ekspresjon av hSOD drevet av deo-promotere enda videre. Ampicillin-resistens-genet i pMF-5519 ble erstattet med tetracyklin-resistensgenet som vist i fig. 7. De produserte plasmidene ble transformert inn i scp540 (deletert for deo-operonet) og sådd ut på LB agar inneholdende tetracyklin. SDS-gelelektroforese av de tetracyklin- og ampicillin-resistente genene utviste økede nivåer av SOD-ekspresjon fra tetracyklin-resistentplasmid. Dette nye plasmidet, som inneholder tetracyklingenet og som uttrykker en hSOD-analog under kontroll av deo-promotergenet, ble betegnet pMF-5520.

Orienteringen av tetracyklin-resistensgenet ble bekreftet ved følgende metode. DNA fremstilt som beskrevet av H.C. Birnbaum og J. Doly, Nucl. Acid Res. 7: 1513 (1979 ) ble spaltet med BamHI og elektroforese ble kjørt for å tilveiebringe tre fragmenter på omtrent lik størrelse 1400-1500 bp. Dette bekreftet orienteringen av tetracyklin-resistensgenet i klokkeretning. (Hvis tetracyklin-resistensgenet var i en orientering mot klokkeretningen, ville man vente et mindre BamHI fragment på omtrent 700 bp; og et slik fragment ble ikke produsert). Plasmid pMF-5520 ble renset og innført inn i forskjellige Escherichia coli-verter for å bestemme den mest fordelaktige verten for ekspresjon. hSOD-ekspresjonsnivåene til plasmid pMF-5520 i forskjellige verter er "beskrevet i eksempel 3.

Konstruksjon av pMF- 2005 - Et høyt kopiantall plasmid som uttrykker hSOD- genet

For å forbedre ekspresjon av hSOD-genet under kontroll av deo P1-P2 operator/promoter enda mere, ble det bestemt å anvende et høykopiantall plasmid, pOPlA6, (omtrent 7000 bp i lengde). Dette plasmidet er en kopiantallmutant av pBGP120 som var avledet fra Col. El, som beskrevet av D.H. Gelfand et al., PNAS 75: 5869-5873 (1978), M.E. Shepard et al., Cell 18: 267-275 (1979 ) og M. Muesing et al., Cell 24: 235-242 (1981 ). Dette mutante plasmidet kan innbefatte omtrent 30$ av totalt intracellulært DNA. pOPlA6 ble først behandlet som vist i fig. 8 for å erstatte ampicillinresitens-genet med et tetracyklin-resistensgen, og det nye tetracyklin-resistens høykopiantall plasmidet ble betegnet pMF-2001. Deo P1-P2 operator/promoter-regionen og hSOD-genet ble satt inn i dette plasmidet som vist i fig. 9. Det resulterende plasmidet (omtrent 6400 bp i lengde) ble først introdusert til scp540 ved transformasjon og deretter sådd ut på LB + Tet agar. Kloner inneholdende høykopiantall-mutanten og det innsatte fragmentet ble identifisert ved hybridisasjon til nick-translatert ^ 2^~ mer^ e^ BamHI-fragment isolert fra pMF-5519. Et plasmid renset ved CsCl tetthetsgradient-sentrifugering betegnet pMF-2005 ble ført inn i en mengde Escherichia coli-verter, så som vill-type, scp732, s<p540, scp930, s(p928 (for genotype se ovenfor og også tabell I) og medførte et veldig høyt ekspresjonsnivå av hSOD-protein under kontroll av deo P1-P2 operator/promoter. Båndintensitetene til det uttrykte hSOD-protein i disse vertene ligner veldig på hverandre, som indikerer at repressorfunksjonen i verter som inneholder aktive deo R og cyt R repressorer ikke lenger er effektive når det gjelder begrensing av ekspresjon; densitometriske analyser viser at hSOD-analogen som blir produsert representerer omtrent 45$ av totalt celleprotein. Plasmid pMF-2005 i Escherichia coli s<p732 er blitt deponert under ATCC aksesjonsnr. 67362.

Konstruksjon av deo P1- P2 vektor med p- laktamase ribosomalt bindingssete

Deo-ekspres.jonsvektor pMF-5531 ble gjort tetracyklinresistent som vist i fig. 17, og dette tilveiebragte pMFS-5533A. (Som diskutert ovenfor, øker dette uttrykking av hSOD drevet av deo-promoterene). Det syntetiske p<->laktamase ribosomale bindingssetet fra pSODMAX-12 (deponert til ATCC under aksesjonsnr. 67177) ble satt inn i pMFS-5533A som vist i fig. 18. (Produksjon av plasmid pSODMAX-12 er vist i figurene 13-16). Det resulterende plasmidet, betegnet pMFS-5538, inneholder i 5' til 3'-retningen deo P1-P2 operator/promoterregionen, autentisk deo RBS, syntetisk p<->laktamase ribosomalt bindingssete og hSOD-genet. Plasmid pMFS-5538 ble ført inn i Escherichia coli-vert s<p732 og viste seg å være en moderat ekspressor av hSOD-analogt protein (se tabell I i eksempel 3).

EKSEMPEL 2

Optimale vekstbetingelser for ekspresjon av hSOD- analogt protein

Ekspresjon av visse bakterielle genprodukter under deo P2-drevet transkripsjon er veldig lav i nærvær av glukose. Dette er blitt demonstrert både for de bakterielle genproduktene til nukleotid kataboliserende enzymer til deo-operonet (K. Hammer-Jesperson og A. Munch-Peterson, Mol. Gen. Genet. 137: 327-335 (1975)) og for genproduktet Escherichia coli galaktokinase (P. Valentin-Hansen et al., EMBO 1: 317-322 (1982)).

Eksperimenter ble utført for å sammenligne effekten av å anvende succinat eller glycerol som karbonkilde for deo P1-P2 drevet produksjon av humane kobber/sink superoksyd-dismutase analogt protein. Forskjellige stammer av Escherichia coli-verter (vill-type, scp744, scp930, scp928, scp540 ) ble anvendt

(for Escherichia coli fenotyper se tabell I i eksempel 3). Alle disse stammene ble også testet når de inneholdt plasmidene pMF-5519 og pMF-5520. Vill-type Escherichia coli og scp930 ble også testet når disse inneholdt plasmid pMF-2005. Alle Escherichia coli-stammene som ble testet ble dyrket i LB-medium inneholdende 150 ppm Cu<++>, 10 ppm Zn<++>og enten 0,2$ succinat eller 0,3$ glycerol som karbonkilde (for anvendte standardteknikker, se eksempel 15).

Det viste seg at når man anvendte glycerol som en karbonkilde var den endelige pHen på mediumet 5,8 - 6,0; når succinat ble anvendt som en karbonkilde var den finale pHen på mediumet 8,8 - 9,0. Ekspresjon av hSOD-analogt protein målt ved gelelektroforese var mye høyere når glycerol ble anvendt; dermed ble glycerol anvendt som karbonkilde i påfølgende eksperimenter.

I et eksempel, vokste prototrof Escherichia coli-stamme scp732 inneholdende plasmid pMF 5520 godt i minimalmedium inneholdende 75 ppm Cu<++>, 5 ppm Zn<++>og 0,3$ glycerol. Resultatene er vist i tabell I i eksempel 3.

Minimalmediumet som blir anvendt i alle eksperimentene når dette blir hevdet er beskrevet nedenfor.

1 liter minimalmedium inneholder:

K2EP04- 8 g

KH2P04- 2 g

NH4C1 - 3 g

Na citrat - 2 g

MgS04.7H20 - 400 mg

Fe citrat - 40 mg

1,0 ml sporelementer

Sporelementoppløsningen inneholder:

MnS04.H20 -lg

ZnS04.7H20 - 2,78 g

CoCl2.6H20 - 2 g

Na2Mo04.2H20 - 2 g

CaCl2-2H20 - 3 g

CuS04.5H20 - 1,85 g

H3BO3- 0,5 g

Konsentrert HC1 - 100 mL

Deionisert vann - 900 mL

Effekten som utluftning har på produksjon av hSOD-analogt protein i forskjellige Escherichia coli-stammer (scp744, scp928 og scp540) som inneholder plasmid pMF-5520 ble også undersøkt. Ekspresjon av hSOD-analogt protein, slik det blir målt ved gelelektroforese, er klart høyere når det påføres svak utlufting. Disse laboratorieresultatene ble oppskalert (når det gjelder Escherichia coli scp744 inneholdende pMF-5520 ) til 2 liter fermentorer, (1 liter broth). Igjen var hSOD-ekspresjonen høyere ved lav utluftningsbetingelser og disse ble anvendt i det påfølgende arbeidet.

Kinetikk til det konstitutive ekspresjonssystemet

Siden ekspresjon drevet av deo promoterene er konstitutivt når cellen blir dyrket på en ikke-glykose karbonkilde (som beskrevet ovenfor), var det av interesse å undersøke om ekspresjonsnivået er konstant ved et gitt tidspunkt av kulturveksten. Dermed ble scp732 inneholdende pMF-5520 sådd ut i minimal saltoppløsning inneholdende glyserol til OD^^q på 0,05 og dyrket ved 37°C. Ved bestemte tidsintervaller, ble prøver av en OD^ø-ekvivalent fjernet og benyttet til SDS gelelektroforese. SOD-proteinbåndintensiteten økte når kulturen oppnådde senlogaritmisk vekstfase og ble enda mere intenst ved aldring av kulturen (16-24 t dyrking). Densitometriske analyser viser at hSOD representerer 3-5$ av totalt celleprotein ved log-fase og akkumulerer i gjennom senlogg og stasjonær fase opp til 1556 av totalt celleprotein.

Et fortreffelig trekk til deo-promoter-drevet ekspresjon er forholdet mellom hSOD-ekspresjon og alderen på kulturen. Som beskrevet ovenfor, er den relative intensiteten til hSOD-proteinbåndet på SDS polyakrylamidgeler i løpet av den logaritmiske vekstfasen relativ lav. En progressiv økning i hSOD-ekspresjonsnivået oppstår fra tidlig stasjonær fase til sen stasjonær fase og denne ekspresjonen når toppen omtrent 16-24 t etter utsåing av cellene. Den observerte økningen i ekspresjonen i stasjonær fase kan være forårsaket av økningen av plasmidkopiantallet i cellen, eller økningen av transkripsjon-translasjon av plasmid-kodete gener som en konsekvens av redusert transkripsjon-translasjon fra kromosomer til hvilende celler. Avhengigheten mellom hSOD-ekspresjon på kulturalderen ble ikke observert når verten inneholdt høyt kopiantall-plasmid pMF-2005; i dette tilfellet er hSOD-ekspresjonsnivåene lik hverandre i log-faseveksten og stasjonærfasen. Dette er ikke overraskende, da en enkelt celle omtrent inneholder 400 plasmider (Shepard et al., Cell 18: 267-275 (1979)).

Disse dataene som er representert viser klart at det er mulig å oppnå et høyt nivå av konstitutiv ekspresjon med deo-promoteren. Den konstitutive ekspresjonen med deo-promoter har flere fordeler i forhold til et induserbart ekspresjonssystem. Det gjør at nødvendigheten av ytre manipulasjon såsom temperatur-skift eller media-supplementering ikke er så nødvendig og tillater bedre oksygenoverføring på grunn av lavere dyrkingstemperatur. Systemet letter veksten og ekspresjonen av klonede gener i kontinuerlig kultur. Andre vertsvektorsystemer som uttrykker hSOD-analogen konstitutivt er beskrevet i eksempel 19.

Uten å være bundet til noen teori, er det mulig at det deo konstitutive systemet for produsering av hSOD-analog er vellykket fordi humant superoksyd dismutase er et oppløselig protein. Når uoppløselig protein, f.eks. veksthormon, blir foretrukket å først oppnå den ønskde biomassen ved vekst på glukose og deretter bytte over til en ikke-glukose karbonkilde for kjemisk induksjon (se eksemplene 16 og 17).

EKSEMPEL 3

Enzymatisk aktivitet av det produserte hSOD- analoge proteinet Tre deo P1-P2 vektorer som uttrykker hSOD-analogt protein (pMF-5519, pMF-5520 og pMF-2005) ble ført inn i forskjellige Escherichia coli-verter og den enzymatiske aktiviteten til hSOD-analogen i rå celleekstrakter ble målt ved bestemming av inhibisjon av reduksjon av ferricytokrom-C som beskrevet av McCord og Fridovich, J. Biol. Chem. 244: 6049-6055 (1969).

Resultatene er vist i tabell I. Disse eksperimentene indikerer at det tetracyklin-resistente plasmid pMF-5520 produserer et noe høyere nivå av hSOD-analogt enzym enn ampicillin-resistent plasmid pMF-5519 gjør. Tabell I demonstrerer også klart at høyt kopiantall deo P1-P2 inneholdende plasmid pMF-2005 produserer omtrent to ganger så mye hSOD-analogt enzym i forhold til andre deo P1-P2 vektorer.

Som også tabell I klart demonstrerer, er plasmider som produserer hSOD-analoger under kontroll av deo P1-P2 promoter lik eller overlegen i forhold til pSC-De^Tll, som er et plasmid som produserer hSOD under kontroll av en X Pl promoter. Plasmid pSOD^Tll er blitt deponert til American Type Culture Collection i Rockville, Maryland 20852, U.S.A. under ATCC aksesjonsnr. 53465 i forhold til Budapest-traktaten. Plasmidet har restriksjonskartet vist i fig. 13.

EKSEMPEL 4

Konstruksjon av deo P1- P2 vektoren som uttrykker MnSOD- GPX koblet protein

Plasmid pE4GPX (se fig. 10) ble konstruert som vist i fig. 28 og som beskrevet i ko-inngitt søknad US serienummer 085,647. Plasmid pE4GPX ble konstruert fra plasmidene pMSE4 (ATCC aksesjonsnr. 53250), som inneholder hele cDNA-sekvensen som koder for humant MnSOD og fra plasmid pl8UL-l (ATCC aksesjonsnr. 67361) som inneholder hele cDNA-sekvensen som koder for glutation peroksydase (hGPX). Plasmid pE4GPX er et fusjonsplasmid som inneholder hele den kodende sekvensen til hGPX ligert til 3'-enden av det forkortede hMnSOD-genet. Det uttrykker et koblet protein under kontroll av X Pl og ell ribosomale bindingssetet. Det koblete proteient som ble produsert har en lengde på omtrent 190 aminosyrer; N-terminale sekvensen er de første 152 aminosyrene til hMnSOD. Den totale lengden på omtrent 190 aminosyrer indikerer muligens at translasjonsterminering oppsto innenfor den kodende sekvensen til hGPX.

Som vist i fig. 10, ble X PL-promoter-operatoren fjernet fra plasmid pE4GPX, og 1,3 kb fragmentet fra pMF-5531 inneholdende deo P1-P2 sekvensen ble satt inn istedenfor. Dette nye plasmidet, pDGE4-3 inneholder i 5' til 3'-retningen deo Pl-P2, ell RBS og MnSOD-GPX-sekvensene. Dette plasmidet ble transformert inn i Escherichia coli MC1061 (M. Casadaban og S.N. Cohen, J. Mol. Biol. 138: 179-207 (1988) og de resulterende klonene ble analysert for produksjon av MnSOD-GPX koblet protein. Cellene ble dyrket i LB-medium + ampicillin; LB-medium er beskrevet i eksempel 13.

Cellene som inneholdt plasmid pDGE4-3 uttrykte store mengder av et hMnSOD-hGPX koblet protein som ko-migrerte med det koblete proteinet (omtrent 190 aminosyrer lang) produsert under kontroll av X PL-promoteren og ell RBS i plasmid pE4GPX. Western-blot analyse ved anvendelse av anti MnSOD antistoffer demonstrerte at små mengder av et fusjonsprotein i full størrelse ble produsert, som impliserer gjennomlesning av TGÅ "stopp"-kodonet innenfor den kodende sekvensen til hGPX.

deo P1-P2 operator/promoter-regionen kan sammen med ell ribosomale bindingssetet lede syntesen av store mengder av et koblet MnSOD-GPX protein.

Plasmid pDGE4-'3 ble også overført til Escherichia coli-stamme S(p732 (cyt R—, deo R-) og veldig lignende ekspresjonsnivåer ble oppnådd.

EKSEMPEL 5

Konstruksjon av deo P1- P2 vektor som uttrykker humant veksthormon ( hGH) protein

Plasmid pTVR 568-4 hie konstruert som vist i fig. 11 ved fjerning av hele hMnSOD og del av de hGPX-kodende sekvensene fra plasmid pDGE4-3 og erstatting av disse med den humane veksthormon (hGH) kodende sekvensen fra plasmid pTV 104(2)

(ATCC aksesjonsnr. 39384). Dette nye plasmidet pTVR 568-4, inneholder i 5' til 3'-retningend deo P1-P2, ell RBS og hele hGH-sekvensen. Den ble transformert inn i Escherichia coli MC1061 og kolonier som uttrykker hGH-analoger ble selektert ved hybridisering av polyklonale anti-hGH antistoffer til kolonier som er lyserte og immobiliserte på filtrene. Etter dyrking over natt i LB-medium inneholdende ampicillin (som beskrevet i eksempel 13), ble kulturen lysert og elektroforese kjørt på SDS polyakrylamid-geler.

Det viste seg at pTVR 568-4 leder produksjonen av hGH i nivåer bestemt til å være 20- 25% av totalt bakterielt protein. Direkte sammenligninger på polyakrylamidgeler av proteiner fra cellene som inneholder denne konstruksjonen (pTVR 568-4) og fra celler inneholdende hGH under kontroll av X PL-promoteren (pTV 104-2) indikerer at 50-10056 mere hGH blir produsert av deo-promoteren sammenlignet med X-promoteren.

EKSEMPEL 6

Konstruksjon av deo P1- P2 vektoren som uttrykker bovint veksthormon ( bGH) analog

Plasmid pMFS-5600 ble konstruert som vist i fig. 12 ved fjerning av MnSOD og del av de hGPX-kodende sekvensene fra deo P1-P2 ekspresjonsvektoren pDGE4-3 og erstatting av disse med 750 bp BGH-sekvensen fra pSAL 440-11. Plasmid pSAL 440-11 blir produsert som beskrevet i beskrivelsen til fig. 12.

Det ligerte plasmidet ble transformert inn i Escherichia coli-stamme S(p732 (cyt R— deo R—) (for detaljer angående denne stammen se tabell I i eksempel 3). Kloner som uttrykker met-asp-gln-bGH-analogen ble plukket og dyrket i bufret LB-media Inneholdende succinat som karbonkilde og ampicillin. Klonen betegnet pMFS-5600 ble anvendt for isolasjon av plasmid og for videre eksperimentering.

Plasmid pMFS-5600 inneholder i 5' til 3'-retningen deo P1-P2, det autentiske deo RBS, cl I RBS, hele bGH-kodende sekvensen etterfulgt av del av den hGPX-kodende sekvensen og humant kobber/sink superoksyd dismutase kodende sekvensen. Plasmid pMFS-5600 uttrykker bGE-proteinet i høyt nivå. GPX og humane kobber/sink superoksyd dismutase-sekvenser blir ikke translatert på grunn av translasjonstermineringssignalene ved 3'-enden til bGH-genet.

EKSEMPEL 7

Konstruksjon av deo P1- P2 vektorene som uttrykker apolipoprotein E ( ApoE) koblet protein

Plasmid pTVR 580-35 ble konstruert som vist i fig. 19 ved erstatting av hGH-kodende sekvensen i plasmid pTVR 568-4 med den hGH-ApoE koblete sekvensen fra plasmid pSAL 160-5; sekvensen innbefatter de første 45 aminosyrene til hGH koblet til aminosyrene 12-299 til apolipoprotein E3. Plasmid pSAL-160-5 er vist i fig. 34 og konstruert som beskrevet i beskrivelsen til figurene (figurer 31-34).

Det resulterende ligerte plasmidet ble transformert i Escherichia coli-stamme A1645. Plasmid pTVR 580-35 i Escherichia coli-stamme A1645 ble dyrket i LB beriket (LBF) medium.

(1 liter LBF medium inneholder 20 g trypton, 10 g gjaerekstrakt, 5 g NaCL, 0,3 M MgS04og 0,1 M K2HP04). Kloner som uttrykker genprodukt med ventet størrelse ble plukket og klonen betegnet pTVR 580-35 ble isolert.

Plasmid pTVR 580-35 inneholder i 5' til 3'-retningen deo Pl-P2, autentisk deo RBS, ell RBS og hGH-ApoE-koblete kodende sekvens. Den uttrykker koblet hGH-ApoE i høye nivåer. Plasmidet ble re-transfektert til den prototrofe stammen Escherichia coli MC1061 og den resulterende klonen ble betegnet 580-35-1.

EKSEMPEL 8

Konstruksjon av deo Pl vektoren som uttrykker X cl 857 repressor- protein

X cl 857 genet ble klonet som følger: X DNA inneholdende temperaturfølsom cl 857 ble kjøpt fra New England Biolabs. DNAet ble spaltet med EcoRI og BamHI restriksjonsenzymer og blandet med pBR322 spaltet med de samme enzymene. Blandingen ble ligert og transformert inn i Scp540. Koloniene tilveiebragt på LB-agar inneholdende ampicillin ble isolert, latt vokse på LB-agar og analysert for immunitet til X C60 infeksjon. Kolonier som ved utsåing på agarskåler tilveiebragte lyserte områder forårsaket av X C60-infeksjon ble kastet, mens de som ikke viste lysis ble analysert videre. Kloner som gjentatte ganger viser immunitet overfor infeksjon med X C60 inneholdt et plasmid med et innskudd på 5400 bp som inneholdt cl 857, Rex A, Rex B og N-gensekvensene. Dette plasmidet ble betegnet pMF-31.

Forsøk på å produsere kloningsvektorer som inneholder både cl 857 repressorsekvensen kontrollert av dets autentiske X Prm promoter og også et eukaryot gen som blir uttrykt under X P^var ikke vellykket; cellene vokste dårlig og produserte veldig lave mengder av det ønskede eukaryote protein. Vi antar at i slike kloner blir cl 857 repressoren overprodusert og er skadelig for vigorøs cellevekst. For å tillate at et lavt nivå av cl 857 repressoren blir syntetisert kontinuerlig, ble det bestemt å anvende den svake deo P1-P2 promoteren .

Konstruksjon av plasmid pMF 54DC er vist i figurene 21-23 og forklart i detalj i beskrivelsen til disse figurene. Disse konstruksjonene viser erstattingen av den autentiske Prm-promoteren til X cl 857 i plasmid pMFL 31 med deo Pl-promoteren og en syntetisk linker inneholdende Shine-Dalgarno sekvensen til ell ribosomale bindingssetet proksimalt for første ATG til den kodende sekvensen til repressoren. (Også Rex A og Rex B-genene ble fjernet fra pMFL 31). Det endelige plasmidet betegnet pMF 54DC, (fig. 23) ble anvendt for å transformere Escherichia coli MC1061. (M. Casadaban og S. Cohen, J. MOI. Biol. 138: 179-207 (1980).

Tretti (30) transformanter av Escherichia coli MC1061 transformert med pMF 54DC ble tilfeldig plukket og utsatt for infeksjon med X C60. Kloner som viser immunitet mot infeksjon med X C60 ble ikke lysert. Immuniteten beviser tilstedeværelse av et funksjonelt cl repressor i cellen og tyder dermed på at deo Pl-promoteren er funksjonell. For å verifisere tilstedeværelse av deo Pl og cl repressoren, ble plasmider fra flere kloner isolert og analysert for nærvær av de antatte endonuklease-gjenkjenningssetene. Plasmidet inneholdende alle antatte restriksjonsseter ble betegnet pMF 54DC. Det leder ekspresjonen av X cl 857 repressorproteinet under kontroll av deo Pl operator/promoter, demonstrert ved resistens overfor infeksjon med C60; cl 857 proteinproduktet er derimot ikke detekterbart på polyakrylamidgeler farget med Coomassi blå.

EKSEMPEL 9

Konstruksjon av en uavhengig bGH ekspresjonsvektor inneholdende X cl 857 repressorgenet under kontroll av deo Pl Følgende nye konstruksjon innbefatter X cl 857 repressorgenet på det samme plasmidet som bGH-genet uttrykt under kontroll av X cl 857 regulert X Pj^-promoter. Dette tillater at plasmidet blir ført inn i prototrofe bakterier uten først å innføre X cl 857-genet i vertcellekromosomet. Fragmentet inneholdende X cl 857-repressoren under kontroll av deo Pl operator/promoter-regionen ble isolert fra pMF 54DC som beskrevet i fig. 24. Dette fragmentet (med lengde på omtrent 1300 bp lang) ble ligert til den lineære formen av pSAL 440-22 (tilveiebragt som beskrevet i fig. 24) som inneholder genet for bGH under kontroll av X PL-promoteren og et modifisert (N-protein uavhengig) ell ribosomalt bindingssete (se fig. 24).<L>igeringen ble utført som følger: pSAL 440-22 spaltet med Clal og ifylt ved anvendelse av Klenow-DNA polymerase og de isolerte 1300 bp fragmentene ble blandet i et 1:2 forhold respektivt og blandingen ble ligert med T4lgiase. Den ligerte blandingen ble anvendt for å transformere en prototrof Escherichia coli (ATCC aksesjonsnr. 12435). Flere transformanter ble plukket og testet for immunitet etter infeksjon med X C60 ved 30° C og 42° C. De klonene som var immune ved 30°C (ikke lysis) og følsomme ved 42°C (lysert) ble videre analysert for å bestemme orienteringen av det innførte fragmentet ved anvendelse av restriksjonsenzym-kartlegging.

For å verifisere den riktige funksjonen av alle elementene på det nylig konstruerte plasmidet, ATCC aksesjonsnr. 12435 ble transformerte kloner dyrket i væskemedium ved 30 °C i 6 timer i kulturer på 3 ml. Kulturene ble delt i 2; en ble varmebe-handlet ved 42°C i 2 timer og den andre ble inkubert i samme tidsperiode ved 30°C. Protein ble ekstrahert fra disse to kulturene og utsatt for SDS gelelektroforese. Etter farging og fjerning av ubundet farge fremkom det at kulturer behandlet ved 42° C produserte et protein som ved elektroforesen migrerte identisk med referanse bGH. Dette proteinbåndet reagerte med anti-bGH antistoff. Ikke noe slikt bånd ble observert i de ikke-induserte kontrollkulturekstraktene. Hele den nye plasmiden ble betegnet pFSAL-A5, eller pFSAL-B27 avhengig av orienteringen av den innførte cl repressoren (som beskrevet i legenden til fig. 24).

Påfølgende sekvensanalyse demonstrerte at en delvis deo Pl promotersekvens forkortet ved 5'-enden er tilstede i plasmid pFSAL-B27, mens hele deo Pl promotersekvensen er tilstede i pFSAL-A5. Den manglende sekvensen i forkortet deo Pl er antatt å bestå av regionen fra begynnelsen av deo Pl til Accl-setet i posisjon 147-152 (se fig. 2 i P. "Valentin-Hansen et al., The EMBO Journal 1: 317-322 (1982)). Forkortet ldeo Pl består dermed av omtrent bare 72 nukleotider, fra Accl-setet til slutten av Bglll-setet i posisjon 222, og inneholder ikke lenger EcoRI-restriksjonsetet i posisjon 104-109. Dandanell og Hammer i EMBO Journal 4: 3333-3338 (1985) beskriver at "ifylling av EcoRI-setet i deo Pl ... ødela operatoraktiviteten". Det var overraskende at forkortet deo Pl uten den kjente operator/promoter-regionen i EcoRI-setet kontroller produksjonen av cl 857-repressoren.

Fragmentet inneholdende deo Pl-promoteren (eller del av denne) og X cl 857 repressorsekvensen kan bli fjernet fra pFSAL-A5 ved spalting med Sspl og XmnI og fra pFSAL-B27 ved kun Sspl spalting (se figurene 24 og 25). Dette fragmentet kan deretter bli satt inn i en hvilken som ekspresjonsvektor, hvor genproduktet blir uttrykt under X-promoteren, for å gjøre den vektoren en uavhengig termolabil ekspressor av genproduktet. Plasmid pFSAL-B27 er blitt deponert som pFSAL-130-B27 i Escherichia coli 12435 med ATCC aksesjonsnr. 12435 som ATCC aksesjonsnr. 67071. Den produserer omtrent 0,1 g bGH-analog pr. gram tørrcellevekt etter 3-4 timers varme-induksjon.

Den forkortede deo Pl-sekvenseni pFSAL-B27 kan bli omdannet til hel lengdesekvens med følgende rute. Spalt-plasmid pMF 5534 (ATCC aksesjonsnr. 67703) med Bglll og Aatll (Aatll-setet er beliggende i ampicillin-resistensgenet), isolerer lille fragmentet og ligerer til det store fragmentet tilveiebragt ved spalting av pFSAL-B27 med Bglll og Aatll. Det resulterende plasmidet inneholder hel-lengde deo Pl-sekvensen, og kan bli kuttet med Sspl for å fjerne fragmentet som inneholder deo Pl-promoterenog X cl-repressorsekvensen som beskrevet i paragrafen ovenfor.

EKSEMPEL 10

Konstruksjon av en uavhengig human kobber/ sink superoksyd dismutase ( hSOD) eksresjonsvektor som inneholder X cl 857 repressorgenet under kontroll av deo Pl

Plasmid pFSAL-A5 ble spaltet for å fjerne det lille fragmentet som inneholder X cl 857 under kontroll av deo Pl-promoteren, og denne ble ligert til det ifylte Aval-setet til plasmid pSODpMAX-12 (som vist i fig. 25). Plasmid pSODpMAX-12 (ATCC aksesjonsnr. 67177) uttrykker hSOD i høyt nivå og inneholder i 5' til 3'-retningen X Pj^-promoter, p<->laktamase promoter, et syntetisk p<->laktamase ribosomalt bindingssete (slI) og den humane kobber/sink superoksyd dismutase-sekvensen. Ligering av deo Pl + cl 857 sekvensen inn i dette plasmidet gir det resulterende plasmidet med høy ekspresjon evnen til å transformert inn i mange forskjellige Escherichia coli-celler, innbefattende prototrofe celler, siden den er uavhengig av cl-repressoren produsert av vertkromosomet. De resulterende plasmidene fra denne ligeringen ble anvendt for å transformere Escherichia coli-stamme MC1061. Retransforma-sjon inn i den prototrofe Escherichia coli-stamme ATCC aksesjonsnr. 12435 ble utført og plasmider som inneholder deo Pl + cl i begge orienteringene blekarakterisert. Et isolat betegnet pS0DMAX-12-cI har et godt ekspresjonsnivå av hSOD. Transformerte bakterier vokste godt ved 42°C og uttrykte hSOD analogt protein i minst 6 timer.

EKSEMPEL 11

Konstruksjon av uavhengig ApoE analoge ekspresjonsvektorer inneholdende X cl 857 repressorgenet under kontroll av deo Pl- promoteren

(a) Uavhengig vektor som uttrykker Met ApoE ( pTVR- 590- 4)

Fragmentet som inneholder deo Pl som kontrollerer cl 857-repressorgenet fra plasmid pFSAL-Å5 som vist i fig. 27 inn i plasmid pTV 194-80, som uttrykker ApoE analogen met-ApoE.

(Konstruksjon av plasmid pTV 194-80 er beskrevet i eksempel 4 og fig. 22 i ko-inngitte patentsøknad nr. 644,671 til Oppenheim et al. og i EPO publikasjon 173,280, hvor den er betegnet pTV 194.) Plasmidet betegnet pTVR 583-17 ble produsert og ført inn i Escherichia coli MC1061, og deretter retransformert inn i Escherichia coli ATCC aksesjonsnr. 12435, som er en prototrof vill-type stamme. Kloner ble screenet for immunitet overfor infeksjon med X C60. Kloner som inneholdt funksjonell cl 857 repressor ble analysert ved restriksjonsendonuklease-kartlegging og en klon betegnet pTVR-590-4 ble anvendt i videre eksperimentering. Dette plasmidet viste seg å være en termolabil ekspressor av met-ApoE, som dermed demonstrerer produksjonen av funksjonell termolabil cl 857 repressor til plasmidet. Plasmid pTVR-590-4 er blitt deponert til American Type Culture Collection i Rockville, Maryland, U.S.A. under ATCC aksesjonsnr. 67360.

(b) Uavhengig vektor som uttrykker Met- Leu- Leu- Met- ApoE

( pTVR 700- 2)

Fragmentet inneholdende deo Pl som kontrollerer cl 857 repressorgenet fra plasmid pFSAL-A5 ble satt inn som vist i fig. 26 inn i plasmid pTVR 289-18, som uttrykker apolipoprotein E (ApoE) analog met-leu-leu-leu-met-ApoE, under kontroll av X PL-promoter og p<->laktamase ribosomale bindingssetet.

(Plasmid pTVR 289-18 er konstruert som vist i fig. 29 fra plasmid pTVR 279-8 som uttrykker met-leu-leu-leu-met-ApoE under kontroll av X PL-promoteren og ell ribosomale bindingssetet; produksjonen av plasmid pTVR 289-8 (ATCC aksesjonsnr. 53216) er beskrevet i EPO publikasjon nr. 173,280. Effekten av dette er å gjøre det resulterende plasmidet betegnet pTVR 700-2 uavhengig av ekspresjon av den termolabile repressoren på vertkromosomet. Dette plasmidet pTVR 700-2 kan bli transformert inn i en mengde celler. (Plasmid pTVR 700-2 ble først ført inn i Escherichia coli MC1061 hvor den ble

betegnet pTVR 596-1 og deretter transfektert inn i vill-type Escherichia coli 12435 hvor den ble betegnet pTVR 700-2). Ekspresjonen av ApoE analogen ved pTVR 700-2 er til og med høyere enn ekspresjon av ApoE-analogen ved pTVR 590-4 (beskrevet ovenfor).

(c) Videre konstruksjon av uavhengig ApoE analog ekspresjonsvektorer

Videre konstruksjoner av uavhengig ApoE analog ekspresjonsvektorer er blitt utført hvri ApoE analogen blir uttrykt under kontroll av ell RBS istedenfor p-laktamase RBS, for å unngå muligheten av "lekkende" ekspresjon av p<->laktamase-promoteren RBS og produksjon av ApoE før termisk induksjon. I en slik konstruksjon, var deo Pl-cl fragmentet produsert fra pFSAL-A5 ved Xmnl/Sspl spalting satt inn i plasmid pTVR 279-8 (se fig. 29). Plasmid pTVR 279-8 produserer met-leu-leu-leu-met-ApoE under kontroll av X P^og ell ribosomale bindingssetet (se fig. 29); den ble åpnet med Clal, ifylt med Klenow DNA-polymerase og deo Pl - cl 857 fragmentet ble satt inn. Dette produserer plasmid pTVR 714 som ble ført inn i Escherichia coli 1061; dette uavhengige plasmidet har den kodende sekvensen for met-leu-leu-leu-met-ApoE under kontroll av X P^og ell ribosomale bindingssetet, og inneholder også deo Pl som kontrollerer X cl 857 repressorproteinet. Plasmid pTVR 714 ble deretter overført til Escherichia coli 12435 og betegnet pTVR 721-4.

EKSEMPEL 12

Konstruksjon av uavhengig griseveksthormon ( pGH) ekspresjonsplasmider inneholdende X cl 857 repressorgenet under kontroll av deo Pl promoteren

(a) Plasmid pEFF- 902

(i ) Konstruksjon av plasmid pEFF- 902

Utgangspunktet for griseveksthormon (pGH) ekspresjonsplasmidet som er beskrevet i denne søknaden er plasmid pRec-pig24. Dette plasmidet, vist i fig. 36 og beskrevet i ko-anmeldt, ko-inngitt U.S. søknad serienummer 821,830, er blitt deponert til ATCC under aksesjonsnummer 53433. Plasmid pRec-pig24 uttrykker termoinduserbart en pGH analog kontroll av X promoteren Pl og den termolabile repressoren cl 857 (som er inne på kromosomet); pGH-analogen har met-asp-gln som N-terminal sekvens festet til fenylalanyl-residiet som er den første aminosyren til autentisk pGH. I ovenfor nevnte US søknad ble plasmid pRec-pig24 beskrevet å være en spesielt foretrukket ekspressor av pGH analogt protein.

For å konstruere et uavhengig pGH uttrykkende plasmid, ble DNA som koder for pGH analogen fjernet fra pRec-pig 24 og satt inn i uavhengig bGH ekspresjonsplasmid pFSAL-130-B27 hvorfra den bGH-analoge kodende sekvensen var blitt tatt ut (fig. 36). Dette produserer plasmid pEFF-902.

(i i) Benk- skalavekst og ekspresjon av E. coli- stamme ATCC

nr. 12435 inneholdende plasmid pEFF- 902

Plasmid pEFF-902 ble ført inn i Escherichia coli ATCC aksesjonsnr. 12435 (en prototrof vill-type stamme) og dyrket i minimalmedium (se eksempel 2) inneholdende 0, 2% glukose i et totalt volum på 25-30 ml ved 30°C. Når OD^q oppnådde 0,9 - 1,0, ble temperaturen hevet til 42°C og flasken ble ristet i 4-6 timer. Før temperaturskiftet ble metionin til en final konsentrasjon på 100 mg/liter tilsatt. Ved 1 time tidsintervaller ble 1,0 OD enhetsprøver fjernet og analysert ved SDS polyakrylamidgelelektroforese. Coomassie blå fargede geler viste at det pGH-analoge proteinet blir progressivt akkumu-lert opp til 4 timer etter begynnelsen på induksjonen, og blir opprettholdt ved dette nivået i minst 6 timer etter at induksjonen begynnes.

Puls-merket og puls-chase eksperimenter med<3>^S-metionin bekreftet at de novo syntese av det pGH-analoge proteinet forløper i 6 timer etter at induksjonen er begynt og at pGH-analogen som ble produsert er veldig stabil.

Western-blot av proteinproduktene fra pEFF-902 og pRec-pig24 kulturene som ble dyrket samtidig, som ble behandlet<125>j_ merket anti-pGH antistoff, viste at pGH-analogen produsert av de to plasmidene ko-migrerte. Basert på<125>j signal intensiteten konkluderte vi med at pEFF-902 produserte mye mere pGH-analog enn pRec-pig24.

(lii) Batch- fermentas. lon av E. coli- stamme ATCC aksesjonsnr. 12435 inneholdende plasmid pEFF- 902

Escherichia coli ATCC aksesjonsnr. 12435 inneholdende plasmid pEFF-902 ble dyrket i 1 liter minimalmedium (eksempel 2) i et kar på 2 liter ved 30°, under glukosetilføring og pH-kontroll ved 15% NH4OH. Prøver ble fjernet ved intervaller på 1 time i 5 timer og 1,0 OD^g enhetprøver ble kjørt på SDS-polyakrylamidgeler. Densitometriske analyser av Coomassie blå fargete bånd viste at 4 timer etter begynnelsen på induksjonen utgjør pGH-analogen omtrent 23-2556 av det totale proteinet. I tillegg ble totalt tørrcellevekst målt og også mengden av pGH-protein produsert ved den sammme fermentasjonen ble bestemt ved sammenligning med kjente mengder som ble kjørt parallelt på samme gel; dette gir den spesifikke produktiviteten (gram protein produkt per gram tørr cellevekt) som i tre forskjellige bestemmelser varierte mellom 0,12 og 0,15.

Tabell II viser en sammenligning av ekspresjonsnivåene til plasmidene pEFF-902 og pRec-pig24 basert på både bench-skala eksperimentene og batch-fermentasjonene.

(b) Plasmidene pEFF- 9021 og pEFF- 9022

Vi har nylig funnet ut at SOD-ekspres jon drevet av X PL-promotersystemet kan bli forbedret ved erstatting av ampicillinresistensgenet på plasmidet med tetracyklinresistensgenet. Denne fremgangsmåten ble anvendt som et forsøk å forhøye ekspresjonen av pGH-analogen uttrykt under kontroll av X Pj^- promoteren i det termoinduserbare uavhengige plasmid enda mere. Vi erstattet derfor ampicillinresistensgenet i plasmid pEFF-902 med et tetracyklingen fra plasmid pBR322, som vist i fig. 37. Produktene til denne ligeringen ble transformert inn i Escherichia coli-stamme ATCC aksesjonsnr. 12435; to konstruksjoner som utviser tetracyklinresistens ble produset, pEFF-9021 og pEFF-9022. De er begge uavhengige plasmider som uttrykker pGH-analogen under kontroll av X PL-promoteren, blir termoinduserbart kontrollert av cl 857 repressoren; og plasmidene er bare forskjellig når det gjelder orienteringen av tetracyklinresistensgenet (fig. 37).

Induksjonseksperimenter i minimalmedium (eksempel 2) viste at begge tetracyklinresistentplasmidene uttrykker pGH-analogen i høye nivåer. Sammenligning av ekspresjonsnivåene til forskjellig pGH-analogt-uttrykkende plasmider er vist i tabell

II.

Resultatene ovenfor viser at de uavhengige termoinduserbare plasmidene pEFF-902, pEFF-9021, pEFF-9022 uttrykker pGH-analogen i et mye høyere nivå enn plasmid pRec-pig24. Konstruksjon av et annet uavhengig plasmid som uttrykker pGH-analogen er beskrevet i eksempel 20.

MERK: Se også tabellene III og IV i eksemplene 18 og 19, respektivt.

EKSEMPEL 13

Konstruksjon av deo P1- P2 vektorer som uttrykker griseveksthormon ( pGH) analogt protein

Følgende paragrafer beskriver konstruksjonen av en serie deo P1-P2 ekspresjonsplasmider som leder produksjonen av pGH-analogen.

(a) Plasmid pEFF- 905

Som vist i fig. 38, fragmentet inneholdende i 5' til 3'-retningen det ell ribosomale bindingssetet, pGH-sekvensen og T^T2terminatorsekvensen ble fjernet fra plasmid pEFF-902 og satt inn i plasmid pMF 5531 hvor hSOD-sekvensen var delvis blitt fjernet. (Plasmid pMF 5531 uttrykker hSOD-analogt protein under kontroll av deo P1-P2 promoteren - se fig. 4).

Det resulterende plasmidet pEFF-905 ble transformert inn i Escherichia coli Sq>732 (beskrevet i tabell I). Plasmid pEFF-905 uttrykker det pGH-analoge proteinet under kontroll av deo Pl-P2-promoteren og ell ribosomale bindingssetet. Nivået av produsert pGH-analog er veldig høyt og overgår det nivået som blir produsert av X PL-ekspresjonsvektor, pRec-pig24, og det som blir produsert av X Pl uavhengige ekspresjonsvektorene pEFF-902, pEFF-9021 og pEFF-9022 (se eksempel 12). En sammenligning av ekspresjonsnivåene av pGH-analogt protein ledet av disse plasmidene er vist i tabell II (eksempel 12).

Ekspresjonen til cellene inneholdende plasmidene pEFF-905 ble dramatisk redusert etter flere overføringer og dette indikerer at denne konstruksjonen er ustabil. Vekst av Escherichia coli S<p732-celler inneholdende pEFF-905 i rikt medium (LB + 0, 3% glycerol + ampicillin) viser en progressiv reduksjon i produksjonen av pGH-analog etter bare 15 generasjoner. (1 liter LB-medium inneholder 10 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 10 g NaCl og pH justert til 7,5 med NaOH; som beskrevet av T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sombrook, i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)). Denne ustabiliteten kan muligens være forårsaket av uriktig deling, uriktig replikasjon eller andre grunner, alle forårsaket av veldig høye ekspresjonsnivåer.

(b ) Plasmid pEFF- 920

(i ) Konstruksjon av plasmid pEFF- 920

For å øke plasmidstabiliteten, ble et 350 bp fragment inneholdende PAR (delings) sekvensen fra plasmid pSClOl ført inn i pEFF-905, som vist i fig. 39. (Plasmid pSClOl er tilgjengelig fra ATCC under aksesjonsnr. 37032 og det er blitt beskrevet av S. Cohen i J. Bact. 132: 734-737 (1977) og i J. Bact. 134: 1141-1156 (1978)). Det resulterende plasmidet, betegnet PEFF-920, produserer det pGH-analoge proteinet under kontroll av deo Pl-P2-promoteren og ell ribosomale bindingssetet og innbefatter i tillegg PAR-sekvensen. Plasmid pEFF 920 er blitt deponert i Escherichia coli-stamme Scp930 til ATCC under aksesjonsnr. 67706.

(i i) Vekst og ekspresjon av Escherichia coli S( p732 som

inneholder plasmid pEFF- 920

Plasmid pEFF-920 ble ført inn i Escherichia coli Scp732 (beskrevet i tabell I) og dyrket i separate eksperimenter i rikt medium (LB + 0,356 glycerol + ampicillin) og i minimalmedium (MM + ampicillin + 0 ,256 glukose). Sammensetningen av LB-mediumer som beskrevet i (a) ovenfor; sammensetningen av mimimalmedium (MM) er gitt i eksempel 2. Plasmidstabiliteten og ekspresjonsnivåene ble bestemt. I rikt medium ble plasmidene stabilt opprettholdt i omtrent 60 generasjoner og etter dette oppsto en skarp senking i ekspresjon; dette er en stor forbedring av ekspresjonen til plasmid pEFF-905 som viser en reduksjon i ekspresjonsnivåene etter bare 15 generasjoner (se (a) ovenfor).

I minimalmedium (hvori glukose blir tilsatt) blir plasmidene opprettholdt i mere enn 80 generasjoner selv om de tilveiebragte lave ekspresjonsnivåer. Når glukose ikke blir tilsatt og glycerol blir tilsatt som karbonkilde akkumulerte pGH i cellene og kunne bli observert under mikroskopet som store refraktive former. Disse observasjonene foreslår at PAR-sekvensen i plasmidet øker sannsynligheten for riktig replikasjon av hele plasmidet. Det lave nivået av deo P1-P2 drevet ekspresjon beskrevet ovenfor i nærvær av glukose er sannsynligvis forårsaket av "glukoseeffekten" beskrevet i "Bakgrunn for oppfinnelsen". Når glukose er tilstede, er ekspresjonen av genproduktet drevet av deo P2-promoteren veldig lav; siden deo Pl-promoteren er svak, blir det produsert lite genprodukt av deo Pl-P2-promoterene i nærvær av glukose. I nærvær av glycerol som en energikilde er ekspresjonen fra deo P2-promoteren høy (se eksempel 2). Når glukose ble fjernet og vi tilsatte glycerol som energikilde, ble deo P1-P2 drevne transkripsjonsnivåer forhøyet og store mengder pGH-analog ble produsert.

(iii) Batch- fermentas. ion av E. coli- stamme Scp732 inneholdende plasmid pEFF- 920

Batch-fermentasjon av stamme Scp732/pEFF-920 ble utført i 2 liter fermentorer ved 37° C i minimalmedium-oppløsning (se eksempel 2) og 1% glukose. Under disse betingelsene er doblingstiden på 60 minutter. Når glukose var oppbrukt, ble kulturen dyrket med glycerol for å tillate at deo P1-P2 drevet transkripsjon av pGH-analogen skal foregå (se (ii) ovenfor). Glycerol-fermentasjon ble fortsatt i 4-8 timer. OD660ved høstingen varierte fra 30-80 OD enheter/ml avhengig av mengden av glukose tilsatt ved begynnelsen på veksten. SDS-PAGE elektroforese av prøvene ved høstingspunktet indikerte at ekspresjonen av pGH-analogen overgikk nivået observert med andre X Pl ekspresjonssystemer (se tabell II i eksempel 12) og at mengden pGH-analog som ble produsert var høyere enn 25% av totalt celleprotein. For videre studier på optimalisering av ekspresjonen av pGH-analogt protein fra disse vektorene, se eksempel 16.

EKSEMPEL 14

Flere deo P1- P2 plasmider som uttrykker bovine veksthormon ( bGH) analoger

Følgende paragrafer beskriver konstruksjonen av plasmider som uttrykker en bGH-analog under kontroll av deo Pl-P2-promoterene. Disse plasmidene er forskjellige fra de som er beskrevet i eksempel 6 (pMFS-5600) hovedsakelig ved tilstedeværelse av de T^Tg transkripsjonstermineringssekvensene. Vi antok at dette økte stabiliteten til plasmidene; plasmid pMFS-5600 så ut til å være ustabil under vanlige vekstbetingelser.

(a) Konstruksjon av plasmider som uttrykker bGH- analog (i ) Plasmid pMFS- 5627

1750 bp fragmentet fra pFSAL-130-B27 (ATCC aksesjonsnr. 67071) inneholdende bGH og T^Tg-sekvensene ble fjernet og satt inn i deo P1-P2 inneholdende plasmid pMF-558-26 (se fig. 6). Det resulterende plasmidet pMFS-5627, vist i fig. 40 ble transformert inn i Escherichia coli Scp732 (se tabell I). Plasmid pMFS-5627 leder ekspresjonen av met-asp-gln-bGH analogen under kontroll av deo Pl-P2-promoteren og deo ribosomale bindingssetet. Plasmid pMFS-5627 uttrykker bGH-analogen i lavt nivå.

(ii ) Plasmid pMFS- 5603

Plasmid pMFS-5603 ble produsert fra plasmid pMFS-5627 ved erstatting av deo ribosomale bindingssetet med ell ribosomale bindingssetet som vist i fig. 41. Plasmid pMFS-5603 ble overført til Escherichia coli S(p732 og tilveiebragte et middels ekspresjonsnivå av bGH-analogt protein (se tabell

II).

(lii) Plasmid pMFS- 5605

For å produsere en bedre deo P1-P2 ekspressor av bGH-analogen, ble PAR-fragmentet fra plasmid pEFF-920 ligert inn i plasmid pMFS-5603. Det resulterende plasmidet pMFS-5605 (fig.

42) leder overraskende ekspresjon i høyt nivå av bGH-analogen (20-25$ av totalt celleprotein under kontroll av deo P1-P2-promoteren og ell ribosomale bindingssetet. Resultatene av bGH-analog ekspresjon er vist i tabell II. Plasmid pMFS-5607 (fig. 46) ble konstruert fra plasmid pMFS-5605 ved erstatting av ampicillinresistensgenet med et for tetracyklinresistens. Plasmid pMFS-5607 ble deponert i Escherichia coli-stamme Scp930(F~) til ATCC under aksesjonsnr. 67704. Merk at Escherichia coli F~ stammene er beskrevet i eksempel 21.

(b) Vekst av Escherichia coli S( p732 inneholdende plasmider som uttrykker bGH- analog

Vekst av bGH-analog-uttrykkende plasmidene pMFS-5627, pMFS-5603 og pMFS-5605 i Escherichia coli Scp732 ble studert på benkskala-nivå. Plasmidene ble alle opprinnelig dyrket i LB-medium (eksempel 13b) + ampicillin + 0, 2% - 0, 3% glycerol. Deretter ble de alle dyrket i minimalmedium (eksempel 2) + 0, 2% glukose; og når glukose var oppbrukt ble 0, 2% - 0, 3% glycerol tilsatt (se eksempel 13b).

EKSEMPEL 15

Standardteknikker anvendt i eksemplene

Escherichia coli transformasjon og isolasjon og rensing av plasmid DNA ble utført i henhold til Maniatis et al. i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor

(1982). DNA-fragmenter ble isolert fra gelene laget av lavtsmeltende agar (FMC) og renset med fenol. DNA-sekvensering ble oppnådd i henhold til dideoksy-metoden til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74: 5463-5467 (1977).

Protein ble bestemt ved metoden til Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1954). SDS-polyakrylamidgeler for elektroforese ble preparert som beskrevet av Laemmli, U.K., Nature 227: 680-685 (1970) og farget med Coomassie blå R. 15 pl totalt celleekstrakt ble applisert per hull hvis ikke noe annet er spesifisert.

Enzymaktiviteten til superoksyddismutase ble målt i råeks-traktene i henhold til fremgangsmåten til McCord et al., J. Biol. Chem. 244: 6049-6055 (1969). Høyt renset SOD som innbefatter omtrent 4000 enheter/mg protein ble anvendt som standard.

Kolonihybridisering med syntetiske prober ble essensielt utført som beskrevet av Grunstein et al., Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 72: 3961-3965 (1975). Hybridisasjon ble utført i 8xSSC ved 42°C i 18 t og vaskingene ble utført med 5xSSC/0,l% SDS ved samme temperatur. For å forandre stringensen, ble både SSC-konsentrasjonen og temperaturen forandret i henhold til det som var nødvendig. Nick-translasjon på rensede DNA-fragmentet ble utført som beskrevet i Maniatis et al.

(ovenfor). Hybridisasjon ble utført ved anvendelse av 5xSSC ved 60° C i 18 t og deretter vasket med lxSSC/0,1% SDS. Agfa røntgen-flimer ble vanligvis utsatt for nitrocellulosefiltrene i 4-6 t før fremkalling.

Restriksjonsendonuklease, T4ligase, T4DNA polymerase og Escherichia coli DNA polymerase (Klenow fragment) ble tilveiebragt fra New England Biolabs og anvendt som foreslått fra forhandleren. -y32P-ATP, a32P deoksy-CTP og a<32>P deoksy-ATP ble kjøpt fra Amersham.

Bakteriell vekst og ekstraksjon

Escherichia coli-stammene som blir anvendt i denne studien er ført opp i tabell I. Hvis ikke noe annet er beskrevet, ble kulturene dyrket i LB eller minimalsaltoppløsning (Vogel & Bonner 1956) supplementert med ampicillin (100 ug/ml) eller tetracyklin (12,5 pg/ml), innbefattende 0,2-0,3% glycerol som eneste karbonkilde.

Escherichia coli-celler inneholdende et plasmid som uttrykker hSOD-analogen ble dyrket i medium hvor det rutinemessig ble tilsatt Cu<++>og Zn<++>(vanligvis 75 og 10 ug/ml respektivt, hvis ikke noe annet er anført). Tilsetting av Cu er for å tillate produksjon av enzymatisk aktivt hSOD-analog som beskrevet i U.S. patentnummer 4,742,004. Cellene ble dyrket over natt ved 37° C og en ekvivalent til 1,0 OD^q Dle høstet. Den bakterielle pelleten ble resuspendert i 100 ul 50 mM Tris-HCl pH 8 og lysert i 3X prøvebuffer inneholdende 30%

(v/v) glycerol, 9% SDS, 2,1 M merkaptoetanol, 187,5 mM Tris-Hcl pH 6,8 og 0,5% bromfenol blå og oppvarmet i kokende vann i 5 min. Ekstrakter for SOD-enzymaktivitetsbestemming ble fremstilt ved ødelegging av cellene ved sonikering.

Oligonukleotidsvntese

Oligodeoksynukleotider ble fremstilt ved fast fase syntese med anvendelse av fosforamidit-kjemi. Den syntetiske fremgangsmåten som ble anvendt var essensielt som beskrevet av Adams et al., J. Am.Chem. Soc. 105: 661-663 (1983) og Beaucage et al., Tetrahedron Letts 22: 1859-1862 (1981).

De syntetiske oligomerene ble renset ved gel elektroforese etterfulgt av C-Lg kromatograf i. En-femtedel av hvert deblok-kerte frysetørrede produkt ble løst opp i 20 ml gelbuffer inneholdende 80% (v/v) formamid, applisert på en 40 cm 20% akrylamid/7 M ureagel og kjørt på elektroforese ved 300 v i 15 t. Produkter i full lengde ble lokalisert ved å overføre gelen med saran-folie på en fluorescerende TLC-plate med en 254 nm fluorescerende indikator (Merck) og analysert ved detektering av UV-skygger. Utkuttede gelfragmenter ble knust og overført til silikoniserte rør inneholdende 3 ml 0,5 M ammoniumacetat og oppvarmet ved 60°C i 60 min. DNA-oppløs-ningen ble utvunnet ved filtrering. Sep-Pak C-^g innsatser (Waters Associates) ble fuktet med 10 ml 50% (v/v) acetoni-tril og skylt med 10 ml destillert vann før applisering av geleluatene. Etter skylling med 5 ml destillert vann ble oligonukleotidene utvunnet fra kolonnene med tre separate anvendelser av 1 ml 60% metanol og deretter frysetørret.

EKSEMPEL 16

Optimalisering av kjemisk induksjon av griseveksthormon ( pGH) og bovint veksthormon ( bGH) uttrvkking under kontroll av deo P1- P2

Vi beskriver nedenfor optimalisering av produksjonen av veksthormoner i Escherichia coli-celler inneholdende et plasmid som uttrykker veksthormonet under kontroll av deo Pl-P2-promoterene. Hensikten var å oppnå de ønskede biomassene til Escherichia coli-cellene ved begynnede vekst på glukose, slik at ekspresjonen kontrollert av den sterke deo P2-promoteren er utsatt for katabolit-undertrykking. Deretter, etter at glukose er oppbrukt, blir en ikke-glukose karbonkilde tilsatt som tillater kjemisk induksjon av deo P2-promoteren og produksjon av veksthormonet.

Kjemisk induksjonsmetoden viste seg å tilveiebringe overensstemmende resultater for veksthormonproduksjon og førte til avgjørelsen innbefattende utvikling av en lignende metode for vekst og uttrykking i fermentasjonskar. Merk at konstitutiv produksjon av uoppløselige veksthormoner tilveiebragte dårlige resultater. Derimot, kan høyt nivå av konstitutiv ekspresjon av oppløselige polypeptider såsom hSOD analog bli oppnådd (se eksempel 2).

Benk- skala optimalisering

Eksperimentene ble utført for å optimalisere ekspresjonen av pGH-analogen og bGH-analogen ved anvendelse av plasmidene inneholdende deo Pl-P2-promoterene beskrevet i eksemplene ovenfor. Plasmidet anvendt for pGH-ekspresjon var plasmid pEFF-920 (fig. 39 og eksempel 13b), som uttrykker met-asp-gln-pGH analogen. Plasmidene anvendt for bGH-ekspresjon var plasmid pMFS 5607 (fig. 46) og plasmid pMFS 5605 (eksempel 14b og fig. 42) som er tetracyklinresistent og ampicillinre-sistent respektivt, og som både uttrykker met-asp-gln-bGH analogen. Alle disse plasmidene inneholder PAE-fragmentet. Vi sammenlignet ekspresjonen i to forskjellige verter, Scp732 som er cyt R- deo R— (ingen funksjonell deo repressor, men inneholder deo-enzymene) og Scp930 som er cytR- og som er deletert for deo-enzymene. (Se tabell Ia for fullstendig beskrivelse av disse cellelinjene). Kulturene ble dyrket over natt i 50 ml minimalmedium (se nedenfor) som var tilsatt glukose (final konsentrasjon (0,2-0,4%). Når glukose var oppbrukt, ble en karbonkilde såsom natriumlaktat, fruktose, succinat, eller natriummalat tilsatt til en final konsentrasjon på 0,2-0,4%, og kulturen ble dyrket i 3-4 t ved 37°C. Prøver ble fjernet ved tidsintervaller på 2 t (1 O.D6^q ekvivalent) og applisert på SDS polyakrylamidgeler. Resultatene viser at fruktose og natriumlaktat var de beste av alle karbonkildene som ble testet. Ekspresjonen av pGH analogen var noe høyere enn ekspresjonen av bGH-analog i samme vert. Vert Scp930 ble funnet å være overlegen i forhold til vert S(p732, derfor var alle oppskaleringseksperimenter som ble utført i 2 liter fermentorer med verten Scp930.

Optimalisering av deo systemet i 2 liter fermentor- kar Sammensetning av medium

Komponentene av dette mediumet er i g/liter hvis ikke noe annet er spesifisert. Minimalmediet beskrevet nedenfor er lik det som er beskrevet i eksempel 2. Merk at mediene er modifiserte eller forandret i henhold til forskjellige bakterielle stammenes krav.

MgS04'7H20 blir tilsatt etter sterilisering til en final konsentrasjon på 400 mg/liter. Glukose blir tilsatt ved utsåingstidspunktet i fermentoren til en final konsentrasjon på 10 g/l (20 ml av 50% stokk). Ampicillin blir tilsatt til en final konsentrasjon på 100 jjg/ml.

Preparerin<g>av så- kultur

To hundre ml minimalmedium inneholdende glukose (0,8 ml fra 50% stokk), ampicillin og MgS04*7H20 blir tilsatt med Escherichia coli S<p930/pMFS 5605 eller S(p930/pMFS 5607 (bGH-analog) eller S<p930/pMFS 920 (pGH-analog) fra en fersk vekst LB agarskål inneholdende glukose, for å tilveiebringe en °^660På 0,05. Kulturen blir dyrket over natt ved 37°C ved 200-250 rpm (New Brunswick rister) for å oppnå en OD^q på 2-3.

Fermentor

Arbeidsvolumet til 2 liter fermentoren som ble anvendt var 1 liter og temperaturen ble opprettholdt ved 36-37°C. Fermentoren ble sådd med 200 ml over natt kultur pluss 20 ml 50% glukose. Denne konsentrasjonen av glukose er tilstrekkelig for å oppnå en OD^g på 10-12. Alternativt, kan primingen bli oppnådd med 10 ml glukose og glukosetilsetting samtidig med pH-kontroll. pHen blir opprettholdt ved 7,2 fra begynnelse til slutt og blir kontrollert ved tilsetting av 10% NH4OH. Vanligvis ble et forutbestemt volum av glukose på 20 eller 40 ml anvendt for å oppnå 10 eller 20 OD-enheter respektivt. I løpet av vekstfasen med glukose, bør oppløst oksygen bli opprettholdt på et ikke lavere nivå enn 20%, som er et ikke-begrensende nivå på utluftningen for biomasse-produksjon. Anti-skummiddel blir tilsatt etter behov. En brå heving av oppløst oksygen (D.O.) til omtrent 70% markerer punktet hvorpå glukose er fullstendig oppbrukt. Ved dette stadiet blir 20 ml 50% glukose tilsatt og pumpen blir koblet til for å tilføre 50% fruktose fra et 100 ml reservoar. Etter flere minutter begynner oppløst oksygen å synke og blir opprettholdt mellom 5-15%, og ikke høyere; dette er et lavt utluft-ningsnivå for veksthormonanalog produksjon. Induksjon med fruktose blir utført i 3-4 t. Fruktose-forbruket er vanskelig å bestemme siden det ikke er noen rask måte å bestemme dets konsentrasjon på. Vi antar at forbrukshastigheten av fruktose er lik den for glukose.

Tabell III viser spesifikk produktivitet av veksthormon tilveiebragt ved fermentasjon av vertsvektorsystemene Scp930/pEFF 920, Scp930/pMFS 5605 og S(p930/pMFS 5607. System Scp930/pEFF920 tilveiebringer en spesifikk produktivitet på 0,1 for pGH som er like god som den som ble tilveiebragt med X Pl system. Spesifikk produktivitet av bGH fra ampicillin eller tetracyklin-resistente plasmider ser ut til å være veldig lik (plasmider pMFS 5605 og pMFS 5607, respektivt).

Merk at spesifikk produktivitet er definert som gram protein produsert per gram tørr cellevekt.

EKSEMPEL 17

Konstruks:1 on av høvt kopiantall plasmid uttrykkende bGH

Det ble konstruert et høyt kopiantall bGH-uttrykkende plasmid og fermentert Escherichia coli inneholdende dette plasmidet ved anvendelse av de optimaliserte betingelsene beskrevet i eksempel 16.

Konstruksjon av høyt kopiantall uttrykkende bGH er som vist i fig. 48. hSOD-genet i pMFS 2005 (fig. 9 og ATCC aksesjonsnr. 67632) ble erstattet med genet til bGH med opprinnelse fra pMFS 5605 (fig. 42). Det resulterende plasmidet, betegnet pMFS 2006, er tetracyklinresistent, og dette plasmidet ble ført inn i Escherichia coli Scp930.

Vekst og ekspresjon i fermentor

Betingelsene for fermentasjon av denne kulturen var essensielt de samme som beskrevet i eksempel 16. Siden cellene inneholdende pMFS 2006 er tetracyklinresistente (og vokser dermed dårlig i minimalmedium) ble så-kulturen supplementert med 1 ml LB-medium for å muliggjøre en god vekst. OD^q til over natt kulturen var omtrent 2-3. Fermentoren inneholdt 800 ml medium og hele 200 ml av så-kul turen (eller nesten hele) ble tilsatt til fermentoren for å oppnå en OD^q på 0,2-0,4-Mengde tilsatt glukose avhenger av ønsket OD før fruktose-tilføring. For OD på 10-12, ble 10 g tilsatt, mens for OD på 30, ble 30 g tilsatt (generelt er forholdet 1 g glukose til 1 OD-enhet).

En brå økning i oppløst oksygen (D.O.) markerte punktet for hvor glukose var oppbrukt. Ved dette stadiet ble 20 ml fruktose tilsatt og pumpen ble koblet til 100 ml reservoar inneholdende 50% fruktose. D.O. ble redusert etter noen minutters fruktosetilsetting og oppnådde omtrent 20£-30%; ved dette punktet ble omrøringen redusert for å oppnå en D.O. som ikke var høyere enn 15%. Denne kjemiske induksjonen ble utført i 3 timer.

Tabell IV viser den spesifikke produktiviteten av bGH tilveiebragt i forskjellige fermentasjoner. Resultatene demonstrerer at tilsetting av acetat til mediet er medvirk-ende til en økning i spesifikk produktivitet til omtrent 0,2; og acetatkonsentrasjonen som blir anvendt er ført opp i sammensetningen av mediet i eksempel 16.

EKSEMPEL 18

Konstruksjon av deo ekspresjonsvektorer inneholdende translasjons- enhancer

Plasmid pMF 5531 (eksempel 1 og fig. 4) inneholdende deo Pl-P2-promoterene og det noe modifiserte deo ribosomale bindingssetet leder ekspresjon i lavt nivå av hSOD analogt protein. Det var rapportert av P.O. 01 ins og S.H. Rangwala ved 1987-møtet om "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, at AT-rike sekvenser oppstrøms for det ribosomale bindingssetet kan forsterke ekspresjon av prokaryote gener i visse tilfeller. Det ble bestemt å undersøke om AT-rike sekvenser forsterket eykaryot genekspresjon ledet av prokaryote promotere såsom deo-promoteren.

For å oppnå denne enden, ble plasmid pMF 5534 fremstilt av pMF 5531 som vist i fig. 43 og i beskrivelsen til figurene. Dette plasmidet inneholder i 5' til 3'-sekvensen hele deo Pl-P2-promotersekvensen innbefattende en AT-rik sekvens i tillegg, et Ndel-restriksjonssete og hSOD-genet. Plasmid pMF 5534 ble ført inn i Escherichia coli-stamme MC 1061 ved transformasjon. Flere individuelle kolonier ble plukket og undersøkt for ekspresjon av veksten i LB-medium inneholdende 0,3% glukose og 100 enheter/ml ampicillin, bufret med M9 minimalsaltoppløsning (LB medium er beskrevet i eksempel 12a; M9 minimalsaltoppløsning er beskrevet av J.M. Miller i "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, side 431). Disse cellene som inneholdt pMF 5534 uttrykte overraskende hSOD i veldig høye nivåer mens det parentale plasmidet pMF 5531 uttrykker hSOD-analogen dårlig. Merk at den eneste forskjellen mellom disse to plasmidene er at pMF 5534 inneholder den AT-rike sekvensen, og dette demonstrerer at den AT-rike sekvensen forsterker i stor grad ekspresjonen. Plasmid pMF 5534 er blitt deponert i Escherichia coli-stamme Scp930(F—) til ATCC under aksesjonsnr. 67703. Flere detaljer når det gjelder hSOD-analog produksjon ved anvendelse av plasmid pMF 5534 er gitt i eksempel 19; det var overraskende at vi oppdaget at produksjonsnivåene til hSOD-analogen er 2-5 ganger høyere ved 30"C enn ved 37°C.

For å undersøke om den forsterkede uttrykkingen er assosiert med høye nivåer av mRNA syntese eller forsterket translasjon, ble mRNA isolert fra voksende celler i sen log-fase fra en mengde vert/plasmidsystemer såsom ATCC 12435/pMF-5531, ATCC 12435/pMF 5534, og kontroller såsom ATCC 12435 og Scp930 (a deo, deo R-). Renset mRNA fra alle prøvene ble først bragt til den samme konsentrasjonen og deretter sendt gjennom et dot-Blot-apparat inneholdende et nitrocellulosefilter. Nitrocellulosefilteret ble hybridisert til den syntetiske DNA-proben #2913 (vist i beskrivelsen til fig. 4) som inneholder 5'-enden til den ikke-translaterte sekvensen til deo P2 transkribert message (beskjed). Flekkene observert på røntgenfilmen ble parret med nitrocellulosefiltrene, og nitrocellulosefiltersegmentene ble skåret ut og telt i en scintillasjonsteller. Tellingene som ble produsert ved anvendelse av Escherichia coli Scp930 mRNA ble anvendt som null kontroll siden Scp930 ikke inneholder noen deo-sekvenser; tellingene produsert av ATCC aksesjonsnr. 12435 mRNA ble bestemt som den mengden deo mRNA som er tilstede i vertceller som ikke inneholder noe plasmid og ble trukket fra tellingene tilveiebragt med mRNA tilveiebragt fra verter inneholdende pMF 5531 og pMF 5534. Sammenligning av resultater mellom verter inneholdende pMF 5531 og pMF 5534 viser at mRNA-nivåene i vertene inneholdende pMF 5534 er 1,5 til 2,5 ganger høyere enn det de er i pMF 5531. De samme sammenligningene som ble gjort på basis av proteinbåndintensitet viste derimot en 15-20 ganger økning i ekstraktet til S(p930/pMF 5534. Disse resultatene indikerer at forsterking av hSOD-ekspresjon oppstår på translasjonsnivået.

Deo Pl drevet ekspresjon av hSOD

Som diskutert i bakgrunnen for oppfinnelsen, er deo Pl ansett en dårlig promoter til hSOD-analogt protein siden plasmid pMF 5516 (fig. 3), inneholdende deo Pl (men ikke noe deo P2 forårsaket av en delesjon på 48 basepar) ikke uttrykker målbar hSOD-analogt protein. For å undersøke muligheten av at den AT-rike sekvensen kan forsterke ekspresjon drevet av deo Pl, ble deo P2 promoteren på plasmid pMF 5534 fjernet. Dette ble oppnådd ved spalting av pMF 5534 med Avrll og Bglll som fjerner omtrent 500 bp mellom deo Pl og deo RBS. Etter ifylling reaksjon av de kohesive endene med Klenowenzym, ble det store fragmentet isolert fra agarosegelen, renset og ligert med T4ligase. Det nye plasmidet betegnet pMF 5540 (fig. 44) ble innført ved transformasjon til forskjellige verter og dyrket i LB-medium inneholdende ampicillin og 0,3% glukose. SDS elektroforese viste et uventet sterkt bånd som ko-migrerte med renset hSOD. Sammenligning av totalt celle-proteinbånd-intensiteter på SDS-geler til verter inneholdende pMF 5540 eller pMF 5534 viste overraskende at pMF 5540 inneholdende bare deo Pl produserer omtrent 50%-70% av hSOD observert med pMF 5534.

Konklusjonen var at det neglisjerbare hSOD-ekspresjon drevet av deo Pl blir forøket av den AT-rike enhancersekvensen at celler som inneholder et plasmid inneholdende en slik konstruksjon uttrykker hSOD-analogt protein i høy grad.

Escherichia coli vertceller inneholdende pMF 5540 er ikke utsatt for katabolit-undertrykking (represjon), fordi promoteren er deo Pl. Slike celler kan derfor bli dyrket for ekspresjon av hSOD-analog i nærvær av glukose og det er ikke nødvendig å skifte til fruktose. (Se diskusjonen om katabo-1it-represjon i eksempel 13).

Den AT- rike regionen mangler iboende promoteraktivitet

For å forsikre at det AT-rike fragmentet (enhanceren) som var tilstede i plasmid pMF 5534 ikke har noen iboende promoteraktivitet, ble plasmid pMF 5534 spaltet for å eliminere hele deo Pl-P2-promoteren med unntagelse av den modifiserte AT- rike regionen og ribosomale bindingssetet, som beskrevet i fig. 44. Det resulterende plasmidet, pMF 5541, ble ført inn i Escherichia coli Scp930, og individuelle kloner ble undersøkt for ekspresjon av hSOD. SDS-gelelektroforese av kloner som inneholder plasmider uten deo P1-P2 tilveiebragte et veldig svakt bånd som ko-migrerte med hSOD. Denne lave ekspresjonen er mulig forårsaket av "gjennomlesning" aktivitet som produserer ekstremt lite mRNA som kunne ha blitt forsterket av den høye translasjonsaktiviteten til den AT-rike enhancer-sekvensen. Eksperimentet indikerer dermed at den AT-rike regionen sannsynligvis mangler iboende promoteraktivitet.

Enhancer-aktivitet ble også vist i verter inneholdende plasmid pMF-945 som tilveiebragte høye pGH-analognivåer (fig. 45). En lignende konstruksjon (fig. 46) inneholdende bGH-genet på plasmid pMF 5608 tilveiebragte lave bGH-analognivåer.

EKSEMPEL 19

Utskilling av humant superoksyd dismutase ( hSOD) og bovint veksthormon ( bGH) inn i mediet i nærvær av kobber og sinkioner.

Vi viste i eksemplene 1 og 2 at produksjon av hSOD-analog i høyt nivå ved Escherichia coli vertceller inneholdende plasmidene som inneholder hSOD-genet under kontroll av deo Pl-P2-promoterene kan bli oppnådd. Vi fant deretter ut at slike Escherichia coli-celler som ble dyrket i fermentorer i minimal saltmedium inneholdende en karbonkilde og Cu<+2>/Zn<+2>ioner overraskende frigjorde hSOD-analog fortrinnsvis inn i mediet. Dette ble observert for kulturer dyrket i fermentorer i perioder som varte lenger enn 16 timer. SDS gelelektroforese av prøvene fra cellefritt medium viste etter Coomasie-farging, et bånd som ko-migrerte med renset hSOD-analogt protein. Intensiteten til dette båndet økte med tiden opp til 48-60 t fra fermentasjonsbegynnelsen.

I et eksperiment ble en kultur av Escherichia coli Scp930 inneholdende plasmid pMF2005, en høyt kopiantall SOD-uttrykker (fig. 9) dyrket opprinnelig på glukose som karbonkilde og når glukose var oppbrukt ved OD^g = 24, ble fruktose tilsatt. Kulturbetingelsene for hSOD-analog produksjon innbefattet lav utluftningsbetingelser (lvvm) ved pH = 7,4 og ved 37°C.

Som beskrevet ovenfor, ble et bånd som ko-migrerer med renset hSOD-analog funnet på SDS-geler av celle-fritt medium. For å demonstrere at dette båndet virkelig er hSOD-analogen, ble et Western-blot utført og nitrocellulosefiltere ble reagert med radioaktivt merket anti-hSOD antistoff. Det observerte båndet reagerte med antistoffet som bekrefter at proteinet er hSOD-analogen. For å undersøke om hSOD-analogen er enzymatisk aktiv, ble hSOD analysert in vitro i henhold til metoden til McCord et al. (Eksempel 15). Kvantitering av proteinbåndet observert på SDS-gelen og den enzymatiske aktiviteten var overensstemmende. Ved OD^g = 30, var hSOD-enzymaktiviteten i mediet 0,45 g/liter.

I kontrolleksperimenter hvor ikke noe Cu<+2>/Zn<+2>ble tilsatt ble ikke noe hSOD-analogt protein frigjort til mediet.

En mere dramatisk observasjon ble gjort med Escherichia coli S(p930 inneholdende plasmid pMF 5534 dyrket ved 30° C i minimalmedium inneholdende glukose og Cu<+2>/Zn<+2>ioner. Dette vert-vektorsystemet som konstitutivt uttrykker hSOD-analogen kan gjennomgående bli dyrket på glukose; og ekspresjonen blir sannsynligvis oppnådd fra deo Pl pluss enhancer og muligens delvis fra deo P2 pluss enhancer. hSOD akkumulerte i cellene opp til 24 t fra fermentasjonsbegynnelsen og tilveiebragte omtrent 3 g/l hSOD-analog ved OD^g = 25. Ved dette stadiet, begynte hSOD å bli skylt ut i mediet. Etter i tillegg 12-15 t viste gelelektroforesen at hSOD-analogt protein var i en konsentrasjon på omtrent 1,1 g/l i mediet, mens nivået i cellen var omtrent 2,0 g/l. Lite ikke-hSOD-protein ble funnet i mediet.

Merk at temperaturen som ble anvendt for fermentasjonen av Escherichia coli inneholdende plasmid pMF 5534 var 30°C. Vi fant overraskende ut at plasmider inneholdende enhancer-sekvensen tilveiebragte 2-5 ganger mere hSOD-analog når den ble dyrket ved 30°C enn ved 37"C.

Vi oppdaget deretter at frigjøring av protein i mediet i nærvær av Cu<+2>/Zn<+2>ioner ser ikke ut til å være unikt for celler som overproduserer hSOD. Escherichia coli-verter inneholdende pMF 5608 (fig. 46), et plasmid inneholdende et bovint veksthormon (bGH-gen) under kontroll av deo-promotere, dyrket under identiske betingelser med de som var beskrevet ovenfor (innbefattende tilsetting av Cu<+2>/Zn<+2>) frigjorde flere proteiner inn i mediet. Siden bovint veksthormon derimot aggregerer lett in vivo, var proporsjonen av bGH i dette utskilte proteinet lavt. I kontrolleksperimenter hvor ikke noe Cu<+2>/Zn<+2>ble tilsatt blé veldig lite protein frigjort.

Disse observasjonene viser at utskilling av protein inn i mediet avhenger av tilstedeværelse av Cu<+2>/Zn<+2>ioner. Mekanismen til denne frigjøringen er ikke klarlagt. Uten å være bundet av noen teori, antar vi at disse ionene forandrer porene i cellemembranen slik at oppløselige proteiner kan lekke fra cellen. Det er mulig at enten bare kobberioner eller bare sinkioner eller andre divalente ioner kan tilveiebringe den samme effekten.

EKSEMPEL 20

Konstruksjon av pGH " uavhengig" ekspresjonsplasmider uten anvendelse av syntetiske linkere

Konstruksjonen av uavhengige pGH-ekspresjonsplasmider er blitt beskrevet i eksempel 12. Det ble bestemt at man skulle konstruere et lignende plasmid uten anvendelse av syntetiske 1inkere.

En skjematisk oversikt for konstruksjon av et slikt plasmid er vist i figurene 49-51. Poenget ved kloningen var anvend-elsen av restriksjonsenzymet Nlalll og det faktum at de N-terminale og C-terminale delene av pGH er identiske med de til bGH. Fragmenter ble preparert som vist i fig. 49, og det ligerte plasmidet inneholdende fragmentene (fig. 50) ble transformert inn i Escherichia coli MC 1061 og sådd ut på LB + tet agarskåler. For å identifisere kolonier inneholdende Smal-Nlalll fragmentet, ble Pstl-Pstl-fragmentet til plasmid pl07 (fig. 49A) isolert og spaltet med Xmal, som spalter ved Smal-setet (se fig. 49). Det resulterende 340 bp fragmentet ble renset fra gelen, nick-translatert og merket med 32^ dCPT; og det ble deretter anvendt for hybridisering for å identifisere kloner. Hybridiseringen var i 5 SSC ved 55°C og vaskingen foregikk med 0,1 SDS/l SSC. Flere positive kloner ble plukket og plasmid DNA ble preparert ved metoden til Birnboim et al., J. Nucl. Acid Res. 7: 1513 (1979). Disse miniprepene ble deretter spaltet med forskjellig restrik-sj onsendonukleaser såsom EcoRI, Seal, Pstl for å verifisere at 70 bp sekvensen inneholdende EcoRI og Seal restriksjonssetene er tilstede. To kloner ble plukket, og deres plasmider ble renset ved CsCl-tetthetssentrifugering og betegnet pGH 30-2 og pGH 30-19 (fig. 50). For å danne den endelige konstruksjonen, ble plasmidene pFSAL b27 og pGH 30-2 spaltet, fragmenter ble renset og deretter ligert som vist i fig. 51.

Den ligerte blandingen ble anvendt for å transformere Escherichia coli MC 1061. Flere kloner fra denne transformasjonen ble plukket og testet for ekspresjon. Ekspresjonen ble bestemt ved dyrking av cellene ved 30° C i 1 ml LB-medium etterfulgt av "varme-sjokk" ved 42°C i 2 t og deretter analyse på SDS-geler. To kloner ble plukket for videre analyser, plasmid DNA ble preparert ved CsCl-gradientsentri-fugering og et plasmid ble anvendt for transformasjon av Escherichia coli-stamme ATCC 12435. Flere kloner ble screenet for ekspresjon, og en, betegnet pMFS 928, ble plukket som en representant for de nye uavhengige pGH-ekspresjonsvektorene. Sekvensering av EcoRI-Hindlll-fragmentet (inneholdende ell RBS og den pGH-analoge sekvensen) bekreftet den publiserte sekvensen.

Ekspresjon av pGH-analogen fra dette plasmidet er høy og den spesifikke produktiviteten er omtrent 0,12.

Det ble deretter oppdaget at met-asp-gln-pGH-analogen uttrykt av dette plasmidet muligens har en indre delesjon på 1 glycyl-residie (se beskrivelsen til figur 51). Derfor ble plasmid pMFS 929 konstruert som vist i fig. 52 for å danne et plasmid som ligner pMFS 928, men som inneholder hele pGH-analoge sekvensen. Plasmid pMFS 929, et uavhengig plasmid som uttrykker met-asp-gln-pGH analogt protein i høyt nivå, er blitt deponert i Escherichia coli-stamme (F-) W3110 til ATCC aksesjonsnr. 67705.

(Se eksempel 21 for en beskrivelse av Escherichia coli F~~ stammer).

EKSEMPEL 21

Escherichia coli F~ stammer anvendt som verter for plasmidene Følgende Escherichia coli F- stammer ble konstruert som beskrevet nedenfor og kan bli anvendt som verter for plasmidene som er beskrevet andre steder i spesifikasjonen: A4275, A5277, A4278, A4280, A4255 (F-) og Scp930 (F"). Stamme Scp930 (F~) inneholdende plasmid pMF 5534 er blitt deponert til ATCC under aksesjonsnr. 67703 og stammen Scp930 (F-inneholdende plasmid pMFS 5607 til ATCC aksesjonsnr. 67704.

(a) Preparering av Å4275. A5277. A4278 og A4280 stammene De seks Escherichia coli F~~ stammene som er ført opp nedenfor ble tilveiebragt fra Escherichia coli genetisk stock-center

(C.G.S.C.), Dept. of Biology, Yale University, P.O.B. 6664, New Haven, Connecticut. Disse ble transformert til å bære det kryptiske profage X cl 857N+ aBAMHIaHI og TnlO transposonet ble fjernet. De ble undersøkt for nærvær av den temperatur-følsomme repressoren (tap av immunitet ved 42°C) og for nærvær av N<+>genet (komplementasjon av en N defekt fag).

C.G.S.C Stamme

stamme nr. betegnelse BTG stamme produsert 6300 F-MG 1655 > A 4275

4474 F~W3110 > A 5277

5290 F~W 2637 > A 4278

6315 F-MM 294 > Ikke enda tilgjengelig 4452 F- 1000 > A 4280

4448 F~~ 1100 > Ikke enda tilgjengelig

Merk at C.G.S.C. stamme nr. 4474 betegnet stamme (F-) W3110 er blitt deponert inneholdende plasmid pMFS 929 til ATCC under aksesjonsnr. 67705.

(b ) Preparering av stammene A4255 ( F~) og Sq) 930 ( F~) Escherichia coli-stammene A4255 og S(p930, beskrevet i spesifikasjonen (tabell I) ble "fjernet" ("cured") for å produsere Escherichia coli stammene 4255 (F-) og Scp930 (F-), respektivt. "Fjernings"-metoden som ble anvendt er beskrevet av J.H. Miller i "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, s. 104-106 (1972).

EKSEMPEL 22

Konstruksjon av et uavhengig humant veksthormon ( hGH) ekspres. ionsplasmid inneholdende X cl 857 repressorgenet under kontroll av deo Pl

Plasmid pTV 104(2), med ATCC aksesjonsnr. 39384, er vist i fig. 34. Den inneholder hele sekvensen til humant veksthormon og uttrykker hGH-analogt protein i høyt nivå under kontroll av X PL-promoteren. Plasmid pTV 104(2) ble spaltet ved Smal- setet rett nedstrøms fra 3'-enden til hGH-sekvensen og oppstrøms for Ndel-setet; den resulterende full-lengde lineære formen av plasmidet ble ligert til det lille fragmentet inneholdende den forkortede deo Pl og cl 857 repressorsekvensen, tilveiebragt ved spalting av pFSAL-B27 (ATCC aksesjonsnr. 67071 og fig. 24) med Sspl.

Det resulterende plasmidet, betegnet pTVR 723-6, er uavhengig av X-genene på vertkromosomet. Den inneholder i 5' til 3'-retningen og i klokkeretningen X Pl, hGH-kodende sekvensen, forkortet deo Pl og cl 857 repressorsekvenser. Plasmid pTVR 723-6 ble transformert inn i Escherichia colivert ATCC aksesjonsnr. 12435 og viste et høyt ekspresjonsnivå av hGH-analogt protein, når den ble termoinduserbart indusert ved 42°C

EKSEMPEL 23

Sammenligning av ekspresjonen av bovint veksthormon ( bGH) fra uavhengige plasmider inneholdende full- lengde eller forkortet deo Pl.

Plasmid pFSAL-B27 (fig. 24 og ATCC aksesjonsnr. 67071) er et "uavhengig" plasmid (uavhengig av X-gener i vertkromosomet). Den uttrykker bGH under kontroll av X promoteren, og blir termoinduserbart kontrollert av cl 857 repressoren under kontroll av den forkortede deo Pl promoter-sekvensen (som beskrevet i eksempel 9).

Vi konstruerte et nytt plasmid identisk med pFSAL-B27 med unntagelse av at den inneholder full-lengde deo Pl-sekvensen.

(a) Konstruksjon av plasmid PMF- B27

Plasmid pMF 54DC (fig. 24) inneholdende full-lengde deo Pl-sekvensen og plasmid pFSAL-B27 ble begge spaltet med restrik-sjonsenzymene Aatll og Nsil. Det unike Aatll setet til hvert plasmid er beliggende i den ampicillin-resistenssekvensen og det unike Nsil-setet er i cl 857-sekvensen, dvs. nedstrøms for deo Pl-sekvensen. Det store fragmentet tilveiebragt fra pFSAL-B27 ble ligert med T4 ligase til det lille Aatll-Nsil-fragmentet inneholdende deo Pl-sekvensen tilveiebragt fra pMF 54DC. Etter transformasjon av det resulterende plasmidet inn i Escherichia coli F"~ stamme W2637 (eksempel 21), ble en klon renset og tilstedeværelse av hel-lengde deo Pl-promoteren i plasmidet, betegnet pMF-B27, ble verifisert.

(b) Sammenligning av bGH- ekspres. 1on fra plasmidene pMF-B27 og PFSAL- B27

Ved W2637-kulturer inneholdende enten plasmid pFSAL-B27 eller det nye plasmidet pMF-B27 ble sammenlignet. De ble dyrket ved 30°C til ODfcfcø på 0,8 og deretter ble temperaturen hevet til 42°C for å indusere bGE-syntese. Ved intervaller på 1 t ble en OD-ekvivalent celler fjernet fra hver kultur, pelletert, prosessert og analysert ved SDS polyakrylamidgelelektroforese. Resultatet viser at kulturer som inneholder det nye plasmidet pMF-B27 uttrykker bGH ved et nivå som er 5-8 ganger lavere enn kulturer som inneholder pFSAL-B27.

For å verifisere disse funnene, ble disse to kulturene dyrket i 2 liter fermentorer i minimalmedium. Igjen, var ekspresjonsnivåene, bestemt ved densitometrisk scanning av SDS-polyakrylamidgelene farget med Coomassie blue og sammenlignet med 1 ug standard bGH-protein som viste at bGH-nivåene produsert av pMF-B27 var 5-7 ganger lavere enn de som ble tilveiebragt med pFSAL-B27.

Det faktum at deo Pl-konstruksjonen er forkortet medfører en overraskende fordel, når det gjelder nivået av veksthormon som blir uttrykt, for plasmidet som inneholder denne.

På lignende måte, er en hvilken som helst forkortet deo Pl som innbefatter del av deo Pl-sekvensen, men som ekskluderer den kjente operator/promoter-regionen i EcoRI-setet (se eksempel 9), ventet å kontrollere produksjonen av X cl 857 repressoren.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et naturlig-forekommende polypeptid eller en polypeptidanalog derav,karakterisert vedå dyrke et vertsplasmidsystem under betingelser som muliggjør produksjon av polypeptidet eller analogen, i det verten er en egnet Escherichia coli vertscelle; og hvori plasmidet er et dobbelt-trådet DNA ekspresjonsplasmid som ved introduksjon inn i en egnet Escherichia coli vertscelle gjør at vertscelle'n har evnen til å tilveiebringe ekspresjon av DNA som koder for et ønsket, naturlig-forekommende, eukaryot polypeptid eller en polypeptidanalog derav med biologisk aktivitet til, og en aminosyresekvens som er vesentlig den samme som, men forskjellig fra, sekvensen til det naturlig-forekommende polypeptidet, og dermed tilveiebringer produksjon av polypeptidet eller polypeptidanalogen omfattende i 5' til 3' retningen følgende: a) DNA som inneholder i 5' til 3' retningen tandempromoterene deo Pl og deo P2; b) DNA som inneholder et ribosomalt bindingssete som gjør at mRNA transkribert fra DNA som koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen kan bli bundet til ribosomer innenfor vertscellen; c) et ATG initieringskodon; og d) DNA som koder for polypeptidet eller polypeptidanalogen i fase med ATG-initieringskodonet; og som i tillegg innbefatter en DNA-sekvens bestående av et replikasjonsorigo fra et bakterielt plasmid som har evnen til autonom replikasjon i vertscellen og en DNA-sekvens som inneholder et gen assosiert med en selekterbar eller identi fiserbar fenotypisk markør som er manifestert når plasmidet er tilstede i vertscellen, og isolering av det resulterende polypeptidet eller analogen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at Escherichia coli vertscellen er S<p732, Scp744, MC1061, Sq>540 , Scp928, Sep929, Scp930, eller vill-type (ATCC aksesjonsnr. 12435).

3.t Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det ribosomale bindingssetet ifølge b) er det naturlige deo ribosomale bindingssetet avledet fra deo operonet eller en mutant derav med en base med en 2-base alternering i sekvensen nedstrøms fra Shine-Dalgarno sekvensen ved nukleotidene -1 og -3 i relasjon til A i initieringskodonet; ell fra X bakteriofag med følgende sekvens:

en mutant ell fra X bakteriofag med følgende sekvens:

det naturlige P-laktamase ribosomale bindingssetet avledet fra pBR322; et syntetisk nukleotid med følgende sekvens:

et syntetisk nukleotid med følgende sekvens:

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det naturlig-forekommende polypeptidet innbefatter humant kobber/sink superoksyd dismutase, humant mangan superoksyd dismutase, humant glutation peroksydase, humant veksthormon, bovint veksthormon, grise-veksthormon, humant apolipoprotein E eller en fibronektin-domene.

Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fremstilling av en polypeptidanalog av humant kobber/sink superoksyd,karakterisert vedat de er betegnet pMF 5531 med restriksjonskartet vist i figur 4; pMF 5519 med restriksjonskartet vist i figur 5; pMF-558-26 med restriksjonskartet vist i figur 6; pMF-5536; pMF-5520 med restriksjonskartet vist i figur 7; pMF-2005 med restriksjonskartet vist i figur 9 og deponert under ATCC aksesjonsnr. 67362; pMFS-5533A med restriksjonskartet vist i figur 17; pMFS-5538 med restriksjonskartet vist i figur 18; eller pMF 5534 deponert under ATCC aksesjonsnr. 67703.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fremstilling av en polypeptidanalog av humant veksthormon,karakterisert vedat plasmidet er betegnet pTVR568-4 med restriksjonskartet vist i figur 11.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fremstilling av en polypeptidanalog av bovint veksthormon,karakterisert vedat plasmidet er betegnet pMFS-5600 med restriksjonskartet vist i figur 12; pMFS5627 med restriksjonskartet vist i figur 40; pMFS-5603 med restriksjonskartet vist i figur 41; pMFS-5605 med restriksjonskartet vist i figur 42; eller pMFS 2006 med restriksjonskartet vist i figur 48.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fremstilling av en polypeptidanalog av grise-veksthormon,karakterisert vedat plasmidet er betegnet pEFF-905 med restriksjonskartet vist i figur 38; eller pEFF-920 med restriksjonskartet vist i figur 39.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at betingelsene innbefatter lav lufting og vekst i et medium som inneholder en ikke-glukose karbonkilde.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at polypeptidet eller polypeptidanalogen utskilles inn i det mediet som vertplasmidsystemet dyrkes i ved tilsetting av et divalent metallion til vekstmediumet.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at betingelsene innbefatter at man først dyrker Escherichia coli-celler i glukose og tilsetter en ikke-glukose karbonkilde etter at glukose er brukt opp.