HU213418B - Process for producing polypeptides using bacterial host cells containing expression plasmids with deo promoter - Google Patents

Process for producing polypeptides using bacterial host cells containing expression plasmids with deo promoter Download PDF

Info

Publication number
HU213418B
HU213418B HU884331A HU433188A HU213418B HU 213418 B HU213418 B HU 213418B HU 884331 A HU884331 A HU 884331A HU 433188 A HU433188 A HU 433188A HU 213418 B HU213418 B HU 213418B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
fragment
host cells
plasmid
isolation
deo
Prior art date
Application number
HU884331A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT48681A (en
Inventor
Meir Fischer
Original Assignee
Bio Technology General Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Technology General Corp filed Critical Bio Technology General Corp
Publication of HUT48681A publication Critical patent/HUT48681A/hu
Publication of HU213418B publication Critical patent/HU213418B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)

Description

Budapest (54) Eljárás polipeptidek előállítására deo-promotert tartalmazó expressziós plazmidokat hordozó bakteriális gazdasejtek alkalmazásával (57) KIVONAT
A találmány tárgya eljárás polipeptidek előállítására deopromotert tartalmazó expressziós plazmidokat hordozó bakteriális gazdasejtek alkalmazásával. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható gazdasejtek olyan plazmidokkal vannak transzformálva, melyek megfelelő Escherichia coli gazdasejtekbe juttatva a gazdasejteket képessé teszik a deoPl-P2-promoterek szabályozása alatt álló, kívánt eukarióta eredetű polipeptideket vagy azok polipeptid-analógjait vagy fúziós polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák expresszálására. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható gazdasejtek tartalmazhatnak olyan plazmidokat is, melyek hőindukálható módon szabályozzák eukarióta gének expresszióját a XPL-promoter és az azonos plazmidban kódolt, deoPl-promoter szabályozása alatt álló hőérzékeny represszorfehérje vezérlésével. Az ilyen plazmidokkal transzformált gazdasejtek - amelyek közül némelyek tartalmazzák a represszorfehérjét kódoló DNS-t is - szintén alkalmasak az említett DNS-szekvenciák expresszálására.
A találmány szerinti eljárás alkalmas különböző eukarióta eredetű polipeptidek előállítására.
A leírás terjedelme: 95 oldal (ezen belül 52 lap ábra)
HU 213 418 B
HU 213 418 Β
A találmány tárgya eljárás polipeptidek előállítására deo-promotert tartalmazó expressziós plazmidokat hordozó bakteriális gazdasejtek alkalmazásával. A találmány szerinti élj árásban alkalmazható gazdasej tek olyan plazmidokkal vannak transzformálva, melyek megfelelő Escherichia coli gazdasejtekbe juttatva a gazdasejteket képessé teszik a deoPl-P2-promoterek szabályozása alatt álló, kívánt eukarióta eredetű polipeptideket vagy azok polipeptid-analógjait kódoló DNS-szekvenciák expresszálására. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható gazdasejtek tartalmazhatnak olyan plazmidokat is, melyek hőindukálható módon szabályozzák eukarióta gének expresszióját a XPL-promoter és az azonos plazmidban kódolt, deoPl-promoter szabályozása alatt álló hőérzékeny represszorfehéqe vezérlésével. Az ilyen plazmidokkal transzformált gazdasejtek - amelyek közül némelyek tartalmazzák a represszorfehéqét kódoló DNS-t is - szintén alkalmasak az említett DNS-szekvenciák expresszálására.
A találmány szerinti eljárás alkalmas különböző eukarióta eredetű polipeptidek előállítására, így például humán réz/cink szuperoxid diszmutáz hMnSOD-hGPX fúziós polipeptidek, humán mangán szuperoxid diszmutáz, humán növekedési hormon, szarvarmarha növekedési hormon, humán növekedési hormon - apolipoprotein-E fúziós polipeptidek, apolipoprotein-E és különböző fibronektin-domének előállítására.
Aktaszámunk: 64364-8484/PÁ
A kifejező vektorokat, beleértve a kifejező (expressziós) plazmidokat ipari mértékben alkalmazzák, hogy hatékonyabban állítsanak elő géntermékeket, mint a korábban rendelkezésre álló eljárásokkal, pl. természetes forrásokból való extrahálással és szerves szintézissel. Az Escherichia coli-t széles körben alkalmazzák gazdaszervezetként, amelyben az ilyen géntermékek előállíthatok kifejező plazmidokat alkalmazva. A kifejező vektorok átfogó tárgyalása található az alábbi kiadványban: Pouwels B.E., Enger-Valk, és Brammer W. J.: Cloning Vectors, Elsevier kiadó (1985).
Számos szabályozó mechanizmust írtak le, amelyek szabályozzák a génkifej eződés szintj ét prokarióta vektorokban. A szabályozási folyamat működhet átírási vagy transzlációs szinten. A génkifejeződés az átírási szintnél az mRNS szintézis gátlásával vagy stimulálásával társul.
Egy kívánt géntermék kifejeződése szintjének növelésére az egyik eljárás olyan vektor alkalmazása, amelyben a kifejezendő gén egy erős promoter szabályozása alatt van, és ez a leggyakoribb megközelítés, amelyet a biotechnológiai ipar alkalmaz a géntermékek kifejezésére magas szinten.
Az átírási szabályozó rendszer valamely DNS szekvenciából áll, amely egy olyan promotort tartalmaz vagy olyan promotorral szomszédos, amely képes valamely represszor molekula kötésére. Amikor a represszor molekula a DNS valamely speciális fajtájához kötődik, a DNS átírása mRNS-sé akadályoztatva lesz. Abból a célból, hogy a DNS átírása mRNS-sé meginduljon, a represszor molekulát el kell távolítani vagy disszociálni kell kötőhelyéről; ezt speciális kémiai vagy fizikai ráhatással lehet elérni. Az átírás szabályozásánál sok esetben egy további alkotórész is szükséges, hogy az átírást legnagyobb kapacitására serkentse. Ilyen alkotórészre példa lehet a ciklusos AMP-receptor fehérje (CRP), amely sok gén szabályozásában érdekelt a katabolikus útban.
A szakterületen kitérj edten alkalmazzák azokat a kifejező plazmidokat, amelyek a XPL, trp vagy lac szabályozható promotorokat tartalmazzák. A további promotorok között, amelyeket alkalmaznak, találjuk a szabályozható rec A és XPr promotorokat, a konstitutív amp és lpp promotorokat, és olyan mesterséges promotorokat, amelyeket két különböző DNS szekvencia fúziójával vagy DNS szekvenciák kémiai szintézisével alkottak meg.
Az Escherichia coli deo operont Hammer-Jesperson és munkatársai tanulmányozták [Hammer-Jesperson K. és Munch-Peterson A.; Molec. gén. Génét. 137, 327-335 (1975); Buxton R.S., Albrechtsen H. és Hammer-Jesperson K.; J. Mól. Bioi. 114, 287-300 (1977); Buxton R.S., Hammer-Jesperson K. és Hansen T.D.: J. Bacteriol. 136, 668-681 (1978); ValentinHansen P. és Hammer-Jesperson K.. J. Mól. Bioi. 133, 1-17 (1979); és Valentin-Hansen P., Aiba H. és Schumperli D.; The EMBO Journal 7,317-322 (1982)].
Amint a 20. ábrában bemutatjuk, a deo operon négy közeli rokon génből áll, amelyek a nukleotid és dezoxinukleotid katabolizmusban érdekeltek, ezek nevezetesen a dezoxiriboaldoláz (deo C), timidin foszforiláz (deo A), foszfodezoxiribomutáz (deo B) és purin nukleotid foszforiláz (deo D). Mind a négy közeli rokon deo gén átírása két promotor/regulátor területnél szabályozódik, a deo Pl-nél és deo P2-nél (másképpen Pl-nél vagy P2-nél). Amikor a gén átírása az egymás után (tandem) működő deo Pl és deo P2 promotorok szabályozása alatt történik, a deo P1-P2 promotor vagy deo promotor/operátor terület kifejezést alkalmazzuk.
A Pl-bői való átírás beindítását a deo R represszor negatívan szabályozza, és a dezoxiribóz-5-foszfát induktor aktiválja. A P2-ből való átírás beindítását a cyt R represszor negatívan szabályozza, az induktor itt a citidin. A P2 aktiválása a ciklikus AMP/ciklikus AMP receptor fehérje komplextől (cAMP/CRP) függ, bár a P2-t lehet szabályozni a deo R represszorral is. A deo operonban levő két központtól távol eső (disztális) gén, a B éc C gének, további átírás-szabályozásnak vannak alávetve: egy P3 belső promotor/operátor területnek, amelyet egy ismeretlen szabályozó fehérje szabályoz, és amelyet az inozin és guanozin indukál. A deo P1-P2 promotor/operátor terület szekvenciája ismert és a teljes deo P1-P2 promotor/operátor terület mintegy 760 bp hosszú, ahol a két promotor mintegy 600 bp távolsággal van egymástól elválasztva [Valentin-Hansen P. és munkatársai: The EMBO Journal 1, 317-322 (1982)].
A géntermék kifejeződése deo P2 által vezérelt átírás alatt nagyon kicsiny glükóz koncentráció jelenlétében és nagyon nagy mennyiségű, más energiatermelő források jelenlétében megy végbe. A deo Pl által vezérelt átírás nincs alávetve a glükóz-hatásnak (katabolit represszió), és a deo P1 sokkal gyengébb is promotorként, mint a deo P2. Ennek megfelelően egy génterméknek a deo Pl promotor által vezérelt kifejezését lehet manipulálni mind külső eszközökkel, mind olyan Escherichia coli sejtek kiválasztásával, amelyeknek nincs funkcionális deo R represszora.
A teljes deo operont a deo operont magában foglaló λ bakteriofágból klónozták és a deo enzimeket Escherichia coli gazdasejtekben fejezték ki [Fischer M. és Short A. Gene, 77, 291-298 (1982)]. Úgy találták, hogy a klónozott deo operont tartalmazó baktériumok enzimaktivitásai 500-50000-szer fölötte vannak a vad típusú sejtekben talált szinteknek. A sokszorozás mértéke függ a gazdasejt genotípusától. Azokban a gazdasejtekben, amelyek rendelkeznek mind a deo R, mind a cyt R represszorokkal, a timidin foszforiláz enzim sokszorozódása mintegy 500-szoros; azokban a gazdasejtekben, amelyek nem tartalmaznak funkcionális deo R és cyt R represszorokat, a timidin foszforiláz sokszorozása mintegy 50 000-szeres.
Dandanell G. és Hammer I.K. [The ENIBO Journal 4, 3333-3338 (1985)] ismertetik a deo Pl és deo P2 promotor fragmentumok transzkripciós fúzióját Escherichia coli galaktokináz génhez. Dandanell és munkatársai a galaktokináz, vagyis egy prokarióta géntermék kifejeződését vizsgálták meg a bakteriális kromoszómába integrált deo P1-P2 promotorok szabályozása alatt. Ezzel ellentétben a jelen találmány a deo P1-P2 promotor sok-kópiás plazmidokban való alkalmazásáról ad kitanítást, ahol a cél eukarióta géntermékek kifejezésének elősegítése.
Dandanell és munkatársai megállapítják, hogy a >.PL promotor 2-3-szór erősebb, mint a deo P2 promotor (3326. oldal, 2. oszlop). Ezzel ellentétben a jelen találmány speciális polipeptidjei és bizonyos szabályozó elemei hasznosításával kapott kifejeződés szintje megközelíti vagy meghaladja azokat a szinteket amelyeket XPL promotor alkalmazásával kapunk.
Azt sugallva, hogy a /.Pl promotor 2-3-szor erősebb, mint a deo P2 promotor, amely viszont erősebb, mint a deo Pl promotor, Dandanell és munkatársai távolról sem adnak olyan ki tanítást a deo P1-P2 promotor alkalmazásával kapcsolatban, hogy az erős promotor lenne. Amint fentebb megjegyeztük, a jelen találmány bejelentői úgy találták, hogy amikor a jelen találmány szerinti plazmidokat alkalmazzák, amelyek más szabályozó alkotórészekkel együtt a deo P1-P2 promotort tartalmazzák, váratlanul nagy mennyiségben termelődnek polipeptidek.
A WO 84/01171 számú PCT közzétételi irat, amelyet 1984. március 29-én tettek közzé, leírja, de nem támasztja alá, a deo promotor alkalmazását az Escherichia coli replikációszabályozó fehéijéjének, vagyis egy nemeukarióta fehéijének nagyon kis mennyiségben való kifejezésére.
Azokat a plazmidokat, amelyek géntermékeket fejeznek ki PL promotor szabályozása alatt, és amelyek még függetlenek a gazdaszervezet kromoszómájában levő λ génektől, mi „független” plazmid kifejező vektoroknak nevezzük. így pl. Mieschendahl M., Petri T· és Hanggi Urs [Biotechnology, 4, 802-808 (1986)] olyan független plazmidot ismertetnek, amelyben a λ cl represszor gént a triptofán operátor/promotor szabályozza. Ez azonban nem hőmérséklettel szabályozott rendszer.
Zabeau M. és Stanley Κ. K. [The EMBO Journal 7, 1217-1224 (1982)] egy hőmérséklet-érzékeny cl represszorhoz helyezte a gént egy olyan kis kópiaszámú plazmidban, amely összeférhető a pBR322 vektorokkal. Ez a megközelítés azonban két plazmid alkalmazását teszi szükségessé, valamint azt, hogy a cl plazmid szelektálással a sejtekben legyen tartva.
Waldman A. S., Haeussliein E. és Milman G. [J. Bioi. Chem. 258, 11571-11575 (1983)] a gént és a hőmérséklet-érzékeny cl 857 represszorhoz tartozó autentikus promotort közvetlenül egy plazmidba klónozzák. Nem érik el azonban a klónozott gének jó kifejeződését egy ilyen konstrukcióban a cl gén sokszorozódása és a cl molekulák számának ezzel együtt járó növekedése miatt. Ezekben a kísérletekben a klónozott géntermék csak mintegy 4%-a a teljes oldható sejtfehérjének.
A szakterületen még sehol sem írtak le hatékony, hőmérsékletérzéken kifejező rendszert, ahol a kifejező vektorokban hordozott gének hővel indukálható kifejezése független lenne a gazda kromoszómában levő gének kifejeződésétől. így nincsenek ismertetve sehol hatékony, hőmérséklet-érzékeny „független” plazmid kifejező vektorok.
A jelen találmány egyik kiviteli módjában a deo operonból kapott gyenge deo Pl promotort beiktatjuk egy XPl kifejező plazmidba, ahol ez szabályozza a λ cl 857 represszor gén kifejeződését, így lehetővé teszi a XPL promotor által szabályozott géntermékek hőindukálható kifejeződését ugyanabban a plazmidban. Ez a kifejező plazmid így független a gazdaszervezet kromoszómájában levő, λ génektől és gazdaszervezetek széles választékába transzformálható. Ez így tehát „független” kifejező plazmid. Váratlan módon a kívánt géntermék kifejeződése ezt a plazmidot alkalmazva elérheti a teljes sejtfehérje akár 25%-át is.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmányt. A jelen találmány olyan kettős szálú DNS plazmidot szolgáltat, amely megfelelő Escherichia coli gazdasejtbe bevezetve a gazdasejtet képessé teszi egy kívánt, természetben előforduló eukarióta polipeptidet vagy ezek valamely analógját kódoló DNS kifejezésének véghezvitelére, ahol a nevezett polipeptid a természetben előforduló polipeptid biológiai aktivitásával bír és olyan aminosavszekvenciával bír, amely lényegében a természetben előforduló polipeptid aminosavszerkvenciájával azonos vagy valamelyest különbözik attól, és ezáltal képessé teszi a polipeptid vagy polipeptid analóg előállításának végrehajtására; a nevezett DNS plazmid az 5’—>3 sorrendben az alábbiakat tartalmazza:
a) DNS-t, amely 5’—>3' irányban, tandem elrendezésben magában foglalja a deo Pl és deo P2 promo torokat;
b) DNS-t, amely magában foglal egy riboszomális kötőhelyet, a polipeptidet vagy polipeptid analógot kódoló DNS-ből átírt mRNS-t így képessé téve riboszómákhoz kötődni a gazdasejten belül;
c) egy ATG beindító kodont; és
d) DNS-t, amely a polipeptidet vagy polipeptid analógot kódolja a beindító kodonnal fázisban;
és amely magában foglal továbbá egy DNS szekvenciát, amely bakteriális plazmidból származó, a gazdasejtben autonóm replikációra képes origót tartalmaz, valamint magában foglal egy DNS szekvenciát, amely olyan szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely megmutatkozik, amikor a vektor jelen van a gazdasejtben.
A jelen találmány plazmidjai által termelt, alkalmas, természetben előforduló polipeptidek között találjuk a humán réz/cink szuperoxid diszmutázt, a humán mangán szuperoxid diszmutázt, a humán glutation peroxidázt, a humán növekedési hormont, a szarvasmarha növekedési hormont, a sertés növekedési hormont, a humán apolipoprotein E-t vagy a fibronektin különböző tartományait. Azok, akik a szakterületen jártasak, természetesen tudják, hogy a jelen találmány szerinti plazmidok tartalmazhatnak más kívánt, természetben előforduló polipeptideket és ezek polipeptid analógjait kódoló DNS-t is.
A találmány továbbá gazdaszervezet-rendszereket biztosít természetben előforduló eukarióta polipeptidek vagy ezek polipeptid analógjai előállításához, amely gazdaszervezet-rendszerek különböző, jelen találmány szerinti plazmidokat tartalmazzák megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A találmány eljárást is nyújt természetben előforduló polipeptidek vagy ezek polipeptid-analógjai előállítására, amely eljárás a jelen találmány szerinti gazdaszervezet-plazmid rendszer növesztéséből áll olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a szóban forgó polipeptid vagy analóg előállítását, valamint az így létrejött polipeptid vagy analóg kinyeréséből áll. A kívánt, természetben előforduló polipeptidek és a jelen találmány szerinti polipeptidek előállításához szükséges előnyös körülményeket is megadja a jelen találmány.
A jelen találmány olyan kettős szálú DNS-t, egy úgynevezett „független” plazmidot is szolgáltat, amely 5'—>3' irányban tartalmaz egy DNS-t, amely magában foglalja a, λ bakteriofágból származó PlOl promotort és operátort, valamint egy olyan DNS-t, amely a kívánt polipeptidet kódolja, és amely tartalmaz továbbá 5'—>3' irányban egy DNS szekvenciát, amely a deo Pl promotort tartalmazza és egy DNS-t, amely a λΡ] promotor cl hő-labilis represszorát kódolja; a represszor kifejeződése a deo Pl promotor szabályozása alatt van. Mivel a λ represszor fehérje termelése nem függ a gazdaszervezet kromoszómájában levő λ gén jelenlététől, a plazmidot „független” plazmidnak nevezzük.
Az ilyen független plazmidokat alkalmazhatjuk humán réz/cink szuperoxid diszmutáz, humán növekedési hormon, szarvasmarha növekedési hormon, vagy apolipoprotein E előállítására. Azok, akik a szakterületen jártasak, természetesen tudják, hogy az ilyen független plazmidok tartalmazhatnak más, természetben előforduló polipeptideket vagy ezek polipeptid analógjait kódoló DNS-t is.
A jelen találmány szolgáltat egy gazdaszervezetplazmid rendszert is és eljárásokat nyújt kívánt polipeptidek vagy analógjai előállítására; az eljárás a gazdaszervezet-plazmid rendszer növesztéséből áll olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a szóban forgó polipeptid vagy polipeptid-analóg termelését, valamint az így termelt polipeptid vagy analóg kinyeréséből áll.
Végül a jelen találmány kettős szálú DNS plazmidokat szolgáltat, amelyek tandem elrendezésben tartalmazzák a deo Pl és deo P2 promotorokat, valamint egy AT-ben gazdag szekvenciájú transzláció-fokozót. A transzláció-fokozó szekvencia növeli a jelen találmány szerinti plazmidok által termelt polipeptidek termelési szintjét.
Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat.
Az egyes, 1-52. ábrákban bemutatott plazmidokhoz tartozó restrikciós térképeknek nem mindegyike azonosítja az összes restrikciós helyet, amelyek az egyes plazmidokban megtalálhatók. Bizonyos esetekben egyes restrikciós helyeket az egyik ábrában bemutatjuk, a másikban nem. Azokat a restrikciós helyeket azonban, amelyek szükségesek ahhoz, hogy a területen járatos szakember gyakorlatban megvalósíthassa a találmányt, minden esetben bemutatjuk. A különböző plazmidok relatív méreteit nem mérethelyesen rajzoltuk és így nem lehet következtetéseket levonni abból, hogy az ábrákban a plazmidok milyen méretűek. A deo promotorokat deo Pl-P2-vel, deo Pl-gyel vagy deo P2-vei jelöljük.
Az összes plazmidot, amelyet ezzel a bejelentéssel kapcsolatban deponáltunk, az American Type Culture Collection-nál (ATCC,Rockville, Maryland 20852, Amerikai Egyesült Államok) deponáltuk, hacsak másképpen nem jelezzük; ezt a deponálást a Mikroorganizmusok Szabadalmi Eljárás Céljait szolgáló Deponálásának Nemzetközi Elismeréséről szóló Budapesti Szerződés (röviden „Budapesti Szerződés”) szerint végeztük.
1. ábra pJBF-5401 megalkotása (deo P1-P2 klónozása)
A teljes deo operont tartalmazó λ cl 857 : DNS-t (amelyet az 1. példában leírtak szerint állítunk elő) hasítjuk Avall-gyel és betöltjük (Klenow-reakció). BamHl kapcsolókat adunk hozzá, és a BamHl kapcsolókkal ellátott Avall fragmentumokat T4 ligáz segítségével BamHI-vel hasított pBR322-höz (ATCC 37017 - nem Budapesti Szerződés szerinti deponálás) Egáljuk. Az így létrejött pJBF-5401 A plazmidot BamHI-gyel emésztjük, és a deo P1-P2 promotorokat tartalmazó 900 bp-s fragmentumot újra Egáljuk pBR322-be (amelyet szintén BamHI-gyel hasítottunk). Az így létrejött plazmid, amelyet pJBF-5401-nek nevezünk, tartalmazza a pBR322 DNS-t és a deo P1-P2 promotor terület DNS-t. A pJBF-5401 plazmid a Budapesti szerződés szerint van deponálva az American Type Culture Collection-nál (ATCC; Rockville, Maryland) ATCC 67359 letéti számon.
2. ábra pJBF-5401 helyre irányuló mutagenezise
A deo P1-P2 promotort tartalmazó pJBF-5401 vektort módosítjuk, hogy Ndel restrikciós helyet vezessünk be a riboszomális kötőhely (RBS) Shine-Dalgamo szekvenciája és a kódoló DNS első ATG-je közé. Ezt helyre irányuló mutagenezissel hajtjuk végre Morigana Y. és munkatársai eljárását alkalmazva [Biotechnology, 2, 636-639 (1984)]. A pJBF-5401-et Pstl-gyel emésztjük, hogy lineáris DNS fragmentum keletkezzék, és ezt hagyjuk összeforradni a pJBF-5401 BssI/Sall emésztésével termelt nagy fragmentummal. Egy 20 bp-s szintetikus DNS fragmentumot, amely a deo P1-P2 750.-770. nukleotidjai között terül el, szintetizálunk kémiai úton úgy, hogy egy Ndel hely keletkezzék megfelelő távolságban az RBS-től; ezt a 20 bp-s szekvenciát # 2015 BTG szekvenciának nevezzük. Az eredeti szekvenciát és az új ónnak megalkotott helyet az alábbiakban mutatjuk be, ahol az aláhúzott bázisok mutatják azt a két nukleotidot, amelyet helyettesítettünk.
Eredeti szekvencia GAGAATűAAATGACTGATCT2015 BTG szekvencia GAGAATCATATGACTGATCTNdel hely
A szintetikus DNS fragmentumot hozzáforrasztjuk a szülő szálon levő egyszálú területhez, és a megmaradó térközt betöltjük T4 DNS polimerázzal, hogy a pMF5416 plazmidot (D plazmid) megkapjuk, amely tartalmazza a deo Pl-P2-t (operátor/promotor szekvencia) és az új Ndel restrikciós helyet; a szekvenciaelemzés azonban feltár egy 48 bp-s kiiktatást a deo P2 területben (lásd az 1. példát).
ábra A pMF-5516 megalkotása
A pSODa 13 plazmid [amelyet úgy alkotunk meg a pSODa2-ből (ATCC 39786), amint ezt a 30. ábrán bemutatjuk] tartalmazza a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz (hSOD) génjét, amely a XPL promotor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt fejeződik ki. A pSODa 13 emésztése AatlI-vel és Ndel-gyel egy olyan nagy fragmentumot termel, amely tartalmazza az SÓD gént, de nem tartalmazza a λΡ[ promotort és az RSB-t. A pMF-5416 AatlI-Ndel emésztése egy 900 bp-s kettős szálú szegmenst alakít ki, amely tartalmazza a deo P1-P2 promotort (a 48 bp-s kiiktatással a P2 területben). Ennek a két fragmentumnak a ligálása egy pMF-5516 nevű plazmidot alakít ki, amely egy módosított deo P1-P2 promotort (a 48 bp-s kiiktatással) tartalmaz, és tartalmazza a 4500 gént, amelyet az Ndel restrikciós hely előz meg.
4. ábra A pMF-5531 megalkotása
A pMF-5516-ot módosítjuk azért, hogy visszaiktassuk a kiiktatott 48 bp-s fragmentumot. Hogy ezt a célt elérjük, az alábbi hat egyszálú szintetikus DNS szekvenciát forrasztjuk össze, hogy három, a P2 terület 678.-760. bp területére kiterjedő kettős szálú szekvenciát kapjunk; ez a terület a Taql hely és az újonnan megalkotott Ndel hely közti szakaszt fogja át [a deo P1-P2 promotor/operátor terület teljes szekvenciáját ValentinHansen P., Aiba H. és Schumperli D. adják meg az EMBO Journal l, 317-322 (1982) irodalmi helyen],
Taq # 2912 szekvencia - S'-CÜAAGTGTGTTGCGGAGTAGATGTTAGAA # 3107 szekvencia - TTCACACAACGCCTCATCTACAATCTTATGA-5' # 3604 szekvencia -5'-TACTAACAAACTCGCAAGGTGAATTTTATTGGCGAC # 2913 szekvencia - TTGTTTGAGCGTTCCACTTAAAATAACCG # 1511 szekvencia -5 '-AAGCCAGGAGAATCA #2019 szekvencia - CTGTTCGGTCCTCTTACTAT-5'
Ndel
A 3107., 3604., 2913. és 1511. számú szálakat polinukleotid kináz segítségével foszforilezzük, majd az egyes szálakat összeforrasztjuk komplementer szálaikkal, vagyis a # 2912. szálat a # 3107. szállal, a # 3604. szálat a # 2913. szállal és a # 1511. szálat a # 2019. szállal. A három kettős szálú szekvenciát ligálással egyesítjük, hogy egy 80 bp hosszúságú szekvenciát alakítsunk ki, amely tartalmazza a Taql és Ndel kohezív végeket.
A pMF-5516 BglII-Ndel nagy fragmentumát és a pJBF-5401 BglII-Taq fragmentumát izoláljuk. A 80 bps szintetikus fragmentumot a pJBF-5401-bői származó BglII-Taq fragmentumhoz ligáljuk, amelyet azután a pMF-5516-b61 származó BglII-Ndel nagy fragmentumhoz ligálunk. Az így létrejövő kifejező vektor, a pMF-5531, tartalmazza a telje- deo P1-P2 rendszert (beleértve az autentikus RBS-t), az Ndel restrikciós helyet és a hSOD gént. Ez irányítja egy hSOD analóg fehérje alacsony szintű kifejeződését.
5. ábra pMF-5519 megalkotása - a riboszóma kötőhely kiterjesztése
A pMF-5531 plazmidot Ndel-gyel kezeljük, T4 DNS polimerázzal betöltjük és ön-ligáljuk. Ez a távolság növelésével jár 2 bázispárral a riboszomális kötőhely és az első ATG kodon között. Ez az új plazmid, amelyet pMF-5519-nek nevezünk, tartalmazza 5-3' irányban a deo P1-P2 promotort, a kiteijesztett RBS-ATG távolságot, és a hSOD gént. Ez irányítja egy hSOD analóg fehérje magas szintű kifejeződését.
6. ábra A deo P1—P2 riboszomális kötőhely további kiterjesztései
A pMF-5519 plazmidot Stul-gyel és BamHI-gyel hasítjuk és egy 1000 bp-s fragmentumot, amely a deo P1-P2 operátor-promotor területet tartalmazza, izoláljuk és inkubáljuk BglII-vel és Hinfl-gyel, hogy egy 540 bp-s BglII-Hinfl fragmentumot kapjunk. Négy különböző szintetikus kapcsolót állítunk elő abból a célból, hogy ehhez a BglII-Hinfl fragmentumhoz rögzítsük, így négy plazmidból álló sorozatot állítunk elő, amelyek egymástól a riboszomális kötőhely és az első ATG kodon közti távolságban különböznek.
Hogy ezt a célt elérjük, az alábbi nyolc egyszálú szintetikus DNS szekvenciát szintetizáljuk. A komplementer szálakat összeforrasztjuk, négy szintetikus kettős szálú DNS kapcsolót állítva elő, amelyeket I., II., III. és
IV. kapcsolónak nevezünk.
HinfI
AATATACAI szintetikus kapcsoló
TATGTAT (7-8 bp kiterjesztés)
Ndel
HinfI
AATATATCAII. szintetikus kapcsoló
TATAGTAT (8-9 bp kiterjesztés)
Ndel
HinfI
AATATCA III. szintetikus kapcsoló
TAGT'AT (6-7 bp kiterjesztés)
Ndel
Hinfl
AATCTAGACA IV. szintetikus kapcsoló
GATCTGTAT (9-10 bp kiterjesztés)
Ndel
A négy szintetikus kapcsoló, vagyis az I., II., III. és IV. szintetikus kapcsolók mindegyikének „tapadós” végei vannak, amelyek egy Hinfl helyből és egy Ndel helyből állnak.
Mindegyik kapcsolót egyenként hagyjuk hozzátapadni a pMF-5519-ből származó BglII-HinfI fragmentumhoz, majd ligálunk, így minden esetben egy új BglIINdel fragmentumot állítunk elő. Ezután minden egyes fragmentumot külön-külön hozzáforrasztunk a PMF-5531-ből származó nagy BglII-Ndel fragmentumhoz, majd ligálunk. Az így létrejövő plazmidok kiterjesztett RBS-sel bírnak. Jelenleg ebből a 4 konstrukcióból csak kettőt vetettünk alá szekvenciaelemzésnek, az I. és IV. kapcsolókat alkalmazva, és a szekvenciát igazoltuk. A megfelelő plazmidokat, amelyeket pMF-558-26-nak (I. kapcsoló) illetve pMF-5536-nak (IV. kapcsoló) nevezünk, S0372-be transzformáljuk, amelyben mindkettő egy hSOD analóg fehérje kifejeződését irányítja alacsony szinten.
7. ábra pMF-5520 megalkotása
A pMF-5519-et (amely hordozza az ampicillin rezisztencia gént) hasítjuk AatlI-vel és Pstl-gyel, és a 3' végeket egy síkban levő végekké alakítjuk T4 DNS polimerázzal végzett emésztéssel. Ez a hasítás eltávolítja az ampicillin rezisztencia gént. Egy 1450 bp-s fragmentumot, amely a pBR322-ből származó tetraciklin rezisztencia gént tartalmazza, izolálunk EcoRI és Aval restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással és az 5' végek T4 DNS polimerázzal végzett betöltésével, hogy egy síkban levő végeket kapjunk. Az 1450 bp-s fragmentumot a tisztított pMF-5519 fragmentumhoz ligáljuk, egy új, tetraciklin-rezisztens plazmidot alkotva meg, amelyet pMF-5520-nak nevezünk; ez tartalmazza 5’—>3' irányban a deo promotort és a hSOD gént. Ez a plazmid egy hSOD analóg fehérje magas szintű kifejezését irányítja.
8. ábra pMF-2001 megalkotása
A pOPlAó egy nagy kópiaszámú plazmid, amelyet úgy alkottak meg, amint ezt Gelfand D. H. és munkatársai [PNAS 75, 5869-5873 (1978)], valamint Muesing M. és munkatársai [Cell, 24, 235 (1981)] leírták. Ezt Clal-gyel és EcoRI-gyel hasítjuk, T4 DNS polimerázzal betöltjük és az így létrejött nagy fragmentumot az 1450 bp-s fragmentumhoz ligáljuk (amely a tetraciklin rezisztencia gént tartalmazza); ez utóbbi fragmentumot pBR322-ből kapjuk EcoRI-gyel és Aval-gyel végzett hasítással és T4 polimerázzal végzett betöltéssel.
Ezzel ténylegesen helyettesítjük a ρΟΡ1Δ6 ampicillin rezisztencia génjét a tetraciklin rezisztencia génnel. Az így előállított, új, nagy kópiaszámú, tetraciklin-rezisztens plazmidot pMF-2001-nek nevezzük.
9. ábra pMF-2005 megalkotása
Az 5519 plazmidot BamHI-gyel emésztjük, T4 DNS polimerázzal betöltjük és az így létrejött kis fragmentumot (amely tartalmazza a deo P1-P2 operátor/promotor területet és a hSOD gént) ligáljuk a pMF-2001 plazmidból PstI emésztéssel és a 3’ végek T4 DNS polimerázzal végzett eltávolításával kapott nagy fragmentumhoz. Ez átviszi a teljes hSOD gént a deo P1-P2 operátor/promotor szabályozása alá a nagy kópiaszámú plazmidba. Az így létrejövő plazmid, amelyet pMF2005-nek nevezünk, nagy kópiaszámú plazmid, amely egy hSOD fehérje analóg kifejeződését irányítja a deo P1-P2 operátor/ promotor szabályozású alatt, rendkívül magas szinten. A pMF-2005 plazmidot az ATCC-nél deponáltuk (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) ATCC 67362 letéti számon a Budapesti Szerződés előírásainak megfelelően.
10. ábra pDGE4-3 megalkotása
A pE4GPX plazmidot a pMSE4 plazmidból (ATCC 53250) állítjuk elő, amint ezt a 28. ábrában bemutatjuk. Ez a plazmid egy MnSOD-GPX fúziós fehérjét fejez ki a λΡ[ promotor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt. Ezt Nsil-gyel emésztjük, a 3' végeket T4 DNS polimerázzal eltávolítjuk, majd Sspl-gyel emésztjük, hogy a XPl promotort eltávolítsuk. A nagy fragmentumot (4000 bp) izoláljuk, majd az 1300 bp-s deo promotorhoz ligáljuk; ez utóbbit úgy kapjuk meg, hogy pMF-5531-et (4. ábra) Ndel-gyel emésztjük, Klenowval betöltjük és Sspl-gyel emésztjük. Az új plazmid, amelyet pDGE4—3-nak nevezünk, 5' >-3' irányban tartalmazza a deo P1-P2 operátor/promotor szekvenciát, mintegy 50 bp-t a cll riboszomális kötőhelyből, mintegy 450 bp-t az MnSOD szekvenciából, és a GPX szekvenciát.
A pDGE4-3 nagy mennyiségű MnSOD-GPX fúziós fehérje szintézisét irányítja a deo P1-P2 promotor és a cll RBS szabályozása alatt.
77. ábrapTVR 568-4 megalkotása
A pTV 104(2) plazmidot (ATCC 39384) emésztjük Ndel-gyel és Smal-gyel, hogy megkapjuk a kis NdelSmal fragmentumot, amely tartalmazza a teljes hGH szekvenciát. Ezt a pDGE4—3-ból kapott nagy NdelPvuII fragmentumhoz ligáljuk. Az új plazmid, amelyet pTVR 568-4-nek nevezünk, tartalmazza 5’—>3’ irányban a deo P1-P2 promotort, mintegy 50 bp-t a cll riboszóma kötőhelyből, és a hGH kódoló szekvenciát. A pTVR 568-4 egy hGH analóg nagy mennyiségű szintézisét irányítja a deo P1-P2 promotor és a cll RBS szabályozása alatt.
72. ábra pMFS-5600 megalkotása, vagyis olyan plazmid megalkotása, amely bGH-t állít elő a deo P1-P2 operátor/promotor terület szabályozása alatt
A pOGE4-3 plazmidot (10. ábra) Ndel-gyel és PvuII-vel hasítjuk és a nagy Ndel-PvuII fragmentumot izoláljuk, majd T4 ligáz segítségével egy 750 bp-s, az alábbiak szerint kapott bGH szekvenciához ligáljuk. A
HU 213 418 Β pSAL 440-11 plazmid azonos a pSAL 440-22 plazmiddal (24. ábra), nevezetesen egy különböző izolátum azonos transzformációból. A bGH szekvenciát a pSAL 440-11-ből kapjuk HindlII-mal végzett kezeléssel, Klenow DNS polimeráz nagy fragmentummal végzett betöltéssel, majd az ezt követő Ndel emésztéssel.
Az így létrejött plazmid, amelyet pMFS-5600-nak nevezünk, 5'—>3’ sorrendben tartalmazza a deo P1-P2 promotort, az autentikus deo RBS-t, mintegy 50 bp-t a cll RBS-ből, a bGH gént, a GPX gén egy részét, és a Cu-Zn hSOD gént. A pMFS-5600 plazmid irányítja egy bGH analóg fehérje szintézisét a deo P1-P2 és a módosított cll RBS szabályozása alatt.
3.ábra pARB megalkotása
A pSODPiTll plazmid (ATCC 53468; letétbe helyezve: 1986. Március 3-án) a humán Cu-Zn SÓD egy analógjának kifejeződését irányítja. (Ennek a plazmidnak a megalkotását a 4,742,004 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a 173,280 (1992. augusztus 12.) számú európai szabadalmi közzétételi irat írja le; ezek mindegyikét referenciaként építjük be a jelen bejelentésbe). Ez a plazmid 5’—>3' irányban tartalmazza a kPL promotort, a βlaktamáz promotort, a b-laktamáz riboszomális kötőhelyet és a Cu-Zn hSOD gént. Az EcoRI és részleges BamHI emésztés után kialakult nagy fragmentumból kiiktatódik mind a β-laktamáz promotor-riboszomális kötőhely, mind az SÓD gén. Egy szintetikus kapcsolót alkotunk meg, hogy új restrikciós helyeket vezessünk be, és a fenti fragmentumhoz ligáljuk. Ezzel jön létre a pARB, amely tartalmazza a XPL promotort közvetlenül fölfelé az EcoRI, Smal, Xbal és BglII helyektől, 5’—>3' irányban.
14. ábra p$UN megalkotása - ez a vektor általános célú kifejező vektor
A ρ8Οϋβ]Τ11 plazmidot Aval-gyel, Sspl-gyel és Stul-gyel emésztjük és az 1910 bp-s Aval-Sspl fragmentumot izoláljuk. Ezt a fragmentumot a bemutatott szintetikus SspI-EcoRI fragmentumhoz és a pARB-ből származó 1270 bp-s EcoRI-Aval fragmentumhoz ligáljuk. A szintetikus kapcsoló szekvenciája három nukleotid helynél tér el a „természetes” β-laktamáz RBS szekvenciájától. A szintetikus kapcsolóban jelzett három nukleotid a bázispár-változást a β-laktamáz RBS 3' végénél mutatja (CCA helyettesíti a GAG-t). Ez eltünteti az első lehetséges ATG-t (C helyettesíti a G-t), és a két másik bázispárváltozás egy Ndel helyet képez (CA helyettesíti az AG-t). Egyébként a szintetikus RBS azonos a β-laktamáz RBS-sel. Ez a konstrukció az új ρβίΓΝ plazmidot hozza létre, amely 5*—>3’ irányban tartalmazza a /.Pl promotort, a β-laktamáz promotort, a szintetikus β-laktamáz RBS-t az egyedi Ndel hellyel, ezt követik az Smal, Xbal és BglII helyek.
15. ábra ρβΜΑ megalkotása
A pSODa 13-ból (lásd a 3. ábra leírását)- amely egy hSOD cDNS-t tartalmaz - származó Ndel-BamHI fragmentumot beiktatjuk a ρβυΝ nagy Ndel-BglII nagy fragmentumába a bemutatottak szerint. A kialakult plazmid, amelyet ρβΜΑ-nak nevezünk, a hSOD analógot fejezi ki alacsony szinten. A DNS szekvenciában az egyetlen különbség a ρΞΟϋβιΤΙ1 és az újonnan kapott ρβΜΑ plazmid között 3 bázispárban van a riboszomális kötőhely 3' végénél (lásd a 14. és 16. ábrákhoz tartozó leírásokat).
16. ábra pSODfiMAX-12 megalkotása
A ρβΜΑ plazmidot Sspl-gyel és Ndel-gyel hasítjuk, hogy eltávolítsuk a szintetikus β-laktamáz RB5-t, és a nagy Sspl-Ndel fragmentumot a bemutatott szintetikus kapcsolóhoz ligáljuk, így alakítva ki az új ρβΟϋβΜΑΧ12 plazmidot. A szintetikus kapcsoló a β-laktamáz RBSből áll egy bázispár-módosítással a 3' végnél. Ez a módosítás egy szintetikus (síi) β-laktamáz RBS-t alakít ki egy bázisváltozással (A helyettesíti a G-t) az autentikus β-laktamáz RBS-hez viszonyítva, így tüntetve el az első lehetséges ATG iniciációs kodont. A bázispárváltozásokat az alábbiakban foglalhatjuk össze.
Autentikus szekvencia a pSODpiTl ]-ben: AAGGAAGAGTATGAGTATG Szintetikus szekvencia a ρβΜΑ-ban; AAGGAAGAGT AT CC AT ATG
Ndel hely
Szintetikus (síi) szekvencia a pSODpMAX-12-ben: AAGG AAGAGTATAAGT ATG
Αρ800βΜΑΧ-12ρ1ηζπύ03ρ800βΤ11 plazmidtól így csak egy bázispárban különbözik és magas szinten irányítja egy SÓD analóg fehérje kifejeződését. A ρ80ϋβΜΑΧ-12 plazmidot Escherichia coli A4255 törzsben deponáltuk ATCC 67177 számon.
17. ábra pMFS-5533A megalkotása
A pMF-5531 plazmidot (amelyet a 4. ábránál mutattunk be) hasítjuk AatlI-vel és Pstl-gyel, majd Klenowval kezeljük, hogy eltávolítsuk a 3' végeket. Ez a hasítás eltávolítja az ampicillin rezisztencia gént. Az így kialakult nagy fragmentumot a kis pBR322 fragmentumhoz ligáljuk, amely a tetraciklin rezisztencia gént hordozza; ezt a fragmentumot a pBR322 EcoRI-gyel és Aval-gyel végzett hasításával és Klenow enzimmel végzett betöltésével alakítjuk ki.
Az így létrejött plazmid, amelyetpMFS = 5533A-nak nevezünk azonos a pMF-5531-gyei, azzal a kivétellel, hogy az ampicillin rezisztencia gén a tetraciklin rezisztencia génnel van helyettesítve; ez 5'—>3' irányban tartalmazza a deo P1-P2 promotort, az Ndel helyet és a hSOD gént.
18. ábra A pMFS-5538 megalkotása
A ρ8ΟΟβΜΑΧ-12 plazmidot (amelyet a 13.-16. ábrákban bemutatott módon kaptunk meg) Sall-gyel és Sspl-gyel hasítjuk és így kapjuk meg a szintetikus βlaktamáz RBS-t és a Cu-Zn SÓD gént tartalmazó 262 bp-s fragmentumot. Ezt egy, a deo Pl-P2-t tartalmazó fragmentumhoz ligáljuk; ez utóbbi fragmentumot úgy kapjuk meg, hogy a pMFS-5533A-t Ndel-gyel hasítjuk, majd ezt Klenow-val betöltjük, és tovább emésztjük Sall-gyel.
HU 213 418 Β
Az így létrejött plazmid, amelyet pMFS-5538-nak nevezünk, 5'—>3' sorrendben tartalmazza a deo P1-P2 promotort, az autentikus deo RB5-t, a szintetikus βlaktamáz riboszomális kötőhelyet és a hSOD gént. Ez egy hSOD analóg fehérjét fejez ki mérsékelt szinten.
19. ábra pTVR 580—35 megalkotása
A pSAL-160-5 plazmid (amelyet a 31 -34. ábrákban bemutatottak szerint alkotunk meg) egy fúziós hGHapolipoprotein E fehérjét fejez ki, ahol az N-terminális a hGH első 45 aminosavát tartalmazza az ApoE3-hoz fuzionálva, amelyből az első 11 aminosav ki van iktatva. A kis hGH-ApoE fragmentumot, amely ennek a plazmidnak PvuII-vel és Smal-gyel végzett hasításával alakul ki, ligáljuk abba a nagy fragmentumba, amelyet a pTVR 568-4 PvuII emésztésével alakítottunk ki (11. ábra). Ez ténylegesen helyettesíti a hGH szekvenciát a pTVR 568-4-ben a hGH-ApoE fúziós szekvenciával. Az így létrejöttplazmid, amelyet pTVR 5 80-35-nek nevezünk, 5'—>3' sorrendben tartalmazza a deo P1-P2 operátor/promotor területet, a cll riboszomális kötőhelyet és a hGH ApoE fúziós szekvenciát; ez nagy mennyiségben fejez ki egy fúziós hGH ApoE fehérjét a deo P1-P2 és cll RBS szabályozása alatt.
20. ábra A deo operon vázlatos térképe
Az ábra a teljes deo operon vázlatos térképét ábrázolja. A különböző deo gének az alábbi enzimeket kódolják: deo C; dezoxiriboaldoláz; deo A; timidin foszforiláz; deo B, dezoxiribomutáz; és deo D, purin nukleotid foszforiláz. Három operátor/promotor területet írtak le: a deo Pl-nél az átírást a deo R szorítja vissza (represzálja)és a dezoxiribóz 5-P indukálja; a deo P2nél az átírást a cyt R represszor szorítja vissza és citidin vagy adenozin indukálja és CAMP-től és CRP-től függ; a deo P3-nál az átírást ismeretlen fehéije-faktorok szabályozzák és inozin vagy guanozin indukálja. A cyt R és deo R gének nem kötődnek a deo operonhoz.
21. ábra A pMFL 103 megalkotása
A pMFL-31 plazmidot a /.DNS 5400 bp-s fragmentumának (amely tartalmazza a cl 857, Rex A, Rex B és N gén szekvenciákat) beiktatásával állítjuk elő EcoRIgyel és BamHI-gyel hasított pBR322-be (lásd a 8. példát).
A cl 857 BglII-Clal fragmentumot a bemutatottak szerint eltávolítjuk a pMFL-31 -bői és ligáljuk BglII-vel és Clal-gyel hasított pRec 2/3-ba (ATCC 39385 letétbe helyezve: 1983. június. 29-én), így alakítva ki az új pMFL 103 plazmidot, amelyből a Rex A és Rex B gének el vannak távolítva.
22. ábra A pMFL 110 megalkotása
A pMFL 103-ból a cl 857 gént AatlI-BglII emésztéssel eltávolítjuk. Ezt az azonos enzimekkel hasított nagy pMFL 31 fragmentumba iktatjuk be. így egy új plazmidot hozunk létre, amelyet pMFL 110-nek nevezünk, és amelyben a pMFL 31-ből származó Rex A és Rex B gének mintegy 2500 bp-je el van távolítva, és amelynek egy AatlI helye van a cl 857 gén 5' végétől fölfelé. Ez a plazmid, a pMFL 110, tartalmazza a cl 857 gént (BglII-Aat fragmentum) a PL-től fölfelé; és tartalmaz N géneket (egy BglII-BamHI fragmentumban). Ebben a plazmidban a λ cl 857 gén az autentikus Prm promotor szabályozása alatt van.
23. ábra A pMF-54DC megalkotása
A pMFL 110 plazmidot Pstl-gyel hasítjuk és a 3' túlnyúló végeket leemésztjük Klenow-enzimmel. Ezt Clal-gyel végzett emésztés követi. A cl 857 gént tartalmazó PstI(Klenow)-ClaI fragmentumot (1668 bp hoszszúságú) HgiAI-gyel emésztjük, amely egy 932 bp-s fragmentumot alakít ki; ez tartalmazza a cl 857 gént úgy, hogy a fehérje aminoterminálisát kódoló területből hiányzik 7 bp az ATG start-kodontól számítva. Ez a fragmentum nem tartalmazza a Prm promotor területet.
Egy 28 bp-s szintetikus DNS fragmentumot szintetizálunk, hogy helyreállítsuk a 7 bp-s kiiktatást és BglII, Seal és Ndel endonukleáz felismerő helyeket alakítsunk ki a cl 857 ATG start-kodonjától fölfelé, és egy Hgi Al helyet alakítsunk ki közvetlenül az ATG start-kodont követően.
Belli Seal HeiAI bp-s kapcsoló 5-GATCTAAGGAGTACTTACATATGAGCA-3'
S.D. Nde
A cll gén 5hine-Dalgamo szekvenciája (S.D.) a BglII és Seal helyek közé van beiktatva, 11 bp-vel a cl fehéije első ATG kodonjától fölfelé. A 28 bázispáros szintetikus DNS fragmentumokat polinukleotid kinázzal kezeljük, hogy foszforilezzük az 5' végeket, majd összekeverjük egy 20 bázispáros komplementer szállal, hogy kialakítsunk egy kettős szálú DNS fragmentumot. Ezt a fragmentumot szintén foszforilezzük az 5' végnél, hogy megkönnyítsük a ligálást.
bp-s komplementer szintetikus DNS fragmentum
3-ATTCCTTCATGAATGTATAC-5'
Az a fragmentum, amelyet pJBF 5401 (lásd az 1, ábrát) BglII-vel, PvuII-vel és Aval-gyel végzett emésztésével kaptunk, a deo P1 helyet a BamHI hely és a BglII hasítási hely között tartalmazza a fragmentum 3' végénél. Ezt a fragmentumot a szintetikus fragmentumhoz forrasztjuk, majd a 932 bp-s PstI(Klenow)-HgiAI fragmentumhoz forrasztjuk, és a keveréket T4 ligázzal ligáljuk. Az így létrejött plazmid, amelyet pMF-54DCnek nevezünk, tartalmazza a deo P1 operátor/promotort, és a cl 857 represszort, és a cl 857 represszor fehéije kifejeződését irányítja a deo Pl promotor szabályozása alatt.
24. ábra A pFSAL-B27 megalkotása
A pHG44 plazmidot (ATCC 39806; letétbe helyezve: 1984. augusztus. 20-án) az ezzel együtt bejelentett, ezzel összefüggő 644,671 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a 173,280 számú európai szabadalmi közzétételi irat ismerteti. Ez egy pBR322-ből származó plazmid, amely magában foglalja a λΡρ promotort, a bGH gént szabályozó cll riboszomális kötőhelyet és a T)T2 átírás-terminációs szekvenciákat. A cll riboszomális kötőhelyet módosít8 juk úgy, hogy N sil-gy el hasítjuk és a 3' végeket eltávolítjuk; így kapjukmeg apSAL 440-22 plazmidot (A cll RBSacIIRBSmódosításátjelzi,amelyígymostfüggetlen az N fehérjétől). A pSAL 440-22 plazmidot Clalgye 1 hasítj uk és az 5' végeket betöltjük Escherichia coli DN S polimerázzal (Klenow fragmentum). A DNS-nek ígyelőállítottteljeshosszúságúlineárisformájátligáljuk ahhoz a fragmentumhoz (1300-1350 bp hosszúságú), amely tartalmazza a deo Pl-et és a cl 857-et; ezt a fragmentumotapMF-54DCplazmidbólizoláltukrészleges Acél és teljes BamHI emésztés, majd ezt követő Klenow-betöltésután.
Ez a munkamenet alakítja ki a pFSAL-B27, és pFSAL-A5 plazmidokat. A pFSAL-B27 plazmid óramutatójárása szerinti irányban tartalmazza a deo Pl-et és a λεί 857 represszort, míg ugyanezek óramutató járásával ellenkező irányban helyezkednek el a pFSAL-A5ben. A szekvenciaelemzés ezután azt mutatja meg, hogy a pFSAL-B27 plazmidban jelen levő deo Pl promotor szekvencia meg van csonkítva az 5' végén, míg a pFSAL-A5-ben a teljes deo Pl promotor szekvencia jelen van. A megcsonkított deo Pl promotor szekvencia már nem tartalmazza az EcoRI restrikciós helyet. Mindkét plazmid az óramutató járásával ellentétes irányban tartalmazza a XPL-t, a módosított cll riboszomális kötőhelyet (cll), a bGH gént és a T|T? terminátor szekvenciákat. Ezek a plazmidok csak akkor fejeznek ki egy bGH analóg fehérjét, amikor hővel indukáljuk (42 °C hőmérsékleten); ez azt mutatja be, hogy a deo Pl operátor/promotor terület irányítja egy funkcionálisan hőlabilis cl 857 represszor fehérje kifejezését (lásd a 9. példát). A pFSAL-B27 plazmidot az ATCC-nél deponáltuk pFSAL-130-B27 néven (ATCC 67071). A pFSAL-A5 egyik diagramját a 25. ábrában mutatjuk be.
25. ábra A pSOD$MAX-l 2-cl megalkotása
A pFSAL-A5 plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt a 24. ábra magyarázatában leírtuk; ez hasonló a pFSALB27 plazmidhoz azzal a kivétellel, hogy a deo Pl és a λ cl 857 represszor orientációja óramutatóval ellenkező irányú. Ezen kívül a pFSAL-A5 a teljes deo Pl promotort tartalmazza, míg a pFSAL-B27 a csonkított deo Pl promotor szekvenciát tartalmazza. A pFSAL-A5 plazmidot Sspl-gy el és XmnI-gyel hasítj uk és a deo P1 -et és 1 cl 857-et tartalmazó kis fragmentumot ligáljuk a pSODpMAX-l 2 plazmid betöltött Aval helyébe (lásd a 16. ábrát).
Az így létrejövő plazmid, amelyet ρ8ΟϋβΜΑΧ-12cl-nek nevezünk, tartalmazza a λεί 857 represszort szabályozó deo Pl-et, a ZPL promotort, a β-laktamáz riboszomális kötőhelyet és a CuZn SÓD gént. Ez a plazmid független az Escherichia coli kromoszómában levő λ génektől és ezáltal sokféle gazdaszervezetbe transzformálható. A ρΞΟϋβΜΑΧ-Π-οΙ plazmid egy hSOD analógot fejez ki mintegy fele olyan szinten, mint 3ρ80ϋβΜΑΧ12 szülö-plazmid.
26. ábra A pTVR 700-2 megalkotása
A deo Pl-et és a λ cl 857 represszort tartalmazó kis fragmentumot a pFSAL-A5 plazmidból kapjuk, amint ezt a 25. ábrában leírtuk. Ezt a pTVR 289-18 plazmid betöltött Clal helyére ligáljuk, amely leu-leu-leu-met-ApoE-t (apolipoprotein E analóg) fejez ki a XPl promotor szabályozása alatt (lásd a 29. ábrát)
Az így létrejött plazmid, a pTVR 700-2, óramutató járásával ellenkező irányban tartalmazza a λ promotort, a β-laktamáz promotor-riboszomális kötőhelyet és az ApoE analóghoz szolgáló szekvenciát, és óramutató járásának megfelelő irányban a deo Pl operátor/promotort és a cl 857 represszort. Ez met-leu-leu-leu-met-ApoE-t csak akkor fejez ki, amikor 42 °C hőmérsékleten hővel indukáljuk; ez azt jelzi, hogy a deo Pl promotor szabályozza a funkcionális hőlabilis cl 857 represszor fehérje kifejezését (lásd all. példát).
Megjegyzés: A pTVR 700-2 plazmidot először E. coli MC 106-be vezettük be, ahol ezt pTVR 596-1-nek neveztük el, majd ezt követően vad típusú E. coli 12435-be fertőztük át, ahol ezt pTVR 700-2-nek neveztük el.
27. ábra A pTVR 590—4 megalkotása
A deo Pl-et és λ cl 857 represszort tartalmazó kis fragmentumot a pFSAL-A5 plazmidból kapjuk meg, amint ezt a 25. ábrában leírjuk. Ezt a pTV 194-80 plazmid, amely met-ApoE-t fejez ki a λ Pl promotor szabályozása alatt, betöltött Clal helyébe ligáljuk (a pTV 194-80 plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt a 31 -33. és 35. ábrákban bemutatjuk).
Az így létrejövő plazmid, a pTVR 59—4, tartalmazza az óramutató járásával ellenkező irányban a XPl promotort, a β-laktamáz promotor-riboszomális kötőhelyet és a met-ApoE-hez tartozó szekvenciát, és az óramutató járásával megegyező irányban a deo Pl promotort és a cl 857 represszort. Ez a met-ApoE-t csak akkor fejezi ki, amikor 42 °C hőmérsékleten hővel indukáljuk; ez azt jelzi, hogy a deo Pl promotor szabályozza a funkcionális represszor kifejeződését (lásd all. példát). A pTVR 590-4 plazmidot az American Type Culture Collection-nál deponáltuk (Rockville, Maryland) ATCC 67360 számon.
Megjegyzés: A pTVR 590-^4 plazmidot először Escherichia coli MC 1061-be vezettük be, ahol ezt pTVR 583-17-nek neveztük el, majd vad típusú Escherichia coli 12435-be fertőztük át, ahol ezt pTVR 590—4-nek neveztük.
28. ábra A pE4GPX megalkotása
A pMSE4 plazmid (ATCC 53250) olyan cDNS-t tartalmaz, amely az MnSOD (humán mangán szuperoxid diszmutáz) teljes kódoló szekvenciáját kódolja a Z,Pl promotor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt. Ezt Stul-gyel hasítjuk, ezzel eltávolítunk egy 67 bp-s fragmentumot mintegy 450 bp-re a MnSOD szekvencia 5' végétől. Azt a fragmentumot, amely a GPX szekvenciát tartalmazza, és amelyet a pl8UL—1 plazmidból (ATCC 67361) kapunk meg Ndel emésztéssel, Klenow betöltéssel és Sspl emésztéssel, beiktatjuk az MnSOD cDNS-en belül levő két Stul hely közé. A pl8UC-l plazmidot az ATCC-nél (Rockville, Mary9 land) ATCC 67361 számon helyeztük el. Az így létrejött plazmid, a pE4GPX, egy MnSOD-GPX fúziós fehérjét fejez ki a λ PL és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt.
29. ábra A pTVR-289-18 megalkotása
A pTVR 279-8 plazmid megalkotását (ATCC 53216; letétbe helyezve: 1985. augusztus 2-án) teljességgel leírja az ezzel együtt bejelentett, ezzel összefüggő 896,750 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, de leírja a 173,280 számú európai szabadalmi közzétételi irat is.
Ez a plazmid egy met-leu-leu-leu-met apolipoprotein E3 analógot fej ez ki a λ PL promotor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt.
A cll riboszomális kötőhelyet a pTVR 279-8-ból Ndel emésztéssel, Klenow-betöltéssel, majd EcoRI emésztéssel eltávolítjuk, majd a kialakult nagy fragmentumot izoláljuk. Ezt a fragmentumot ligáljuk a pBLAl 1böl (ATCC 39788; letétbe helyezve: 1984. augusztus 2-án) származó 200 bp-s EcoRI-AluI fragmentumhoz, amely tartalmazza a β-laktamáz riboszomális kötőhelyet (amelyet pBLA-nak nevezünk). Az így létrejövő plazmid 5' -» 3' irányban tartalmazza a XPL promotort, a β-laktamáz promotor-riboszomális kötőhelyet és a met-leu-leu-leu-met-ApoE-hez tartozó szekvenciát, az ApoE szekvencia 5' végénél az Ndel hely kiiktatásával. Ez a plazmid, amelyet pTVR 289-18-nak nevezünk, met-leu-leu-leu-met-ApoE-t fejez ki. (A pTVR 289-18 plazmid megalkotását leírja az ezzel együtt benyújtott, ezzel összefüggő, 896,750 számon bejelentett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amelyet referenciaként építünk be ide, hogy világosabban bemutathassuk, hogyan alkotjuk meg ezt a plazmidot).
30. ábra A pSODa.13 és SOD$1 megalkotása
A pSODa2 plazmidot (ATCC 39786; letétbe helyezve: 1984. augusztus 2-án) részlegesen emésztjük EcoRIgyel és az így létrejövő lineáris formájú DNS-t agaróz gélről izoláljuk. A tisztított DNS-t DNS polimeráz I-gyel (Klenow) betöltjük és újra ligáljuk. Az így létrejövő pSODa 13 klón egy EcoRI helyet tartalmaz a riboszomális kötőhely 5' végénél elhelyezve. Egy olyan fragmentumot izolálunk az előzőleg EcoRI-gyel és Alul-gyel emésztett pBLAll plazmidból (ATCC 39788; letétbe helyezve: 1984. augusztus 2-án), amely tartalmazza a β-laktamáz promotort és a riboszomális kötőhelyet. A 200 bázispáros fragmentumot az előzőleg Ndel-gyel emésztett, DNS polimeráz I-gyel (Klenow) betöltött, majd EcoRI-gyel emésztett pSODa 13-ból izolált nagy fragmentumhoz ligáljuk. Az így létrejövő ρΞΟϋβΙ plazmid tartalmazza a β-laktamáz gén riboszomális kötőhelyét és a λ PL promotort.
31. ábra A pRO211 és pRO12 megalkotása
A pJH200 plazmidot (ATCC 39783; letétbe helyezve: 1984. augusztus 2-án) részlegesen emésztjük Ndelgyel, DNS polimeráz I-gyel (Klenow) kezeljük, hogy a végeket betöltsük és az így létrejövő DNS-t újra ligáljuk, hogy kialakítsuk a pRO211 kifejező vektort. A pRO211 kifejező vektort Ndel-gyel és HindlII-mal emésztjük, a nagy fragmentumot izoláljuk és egy, a pAL500-ból (ATCC 39782; letétbe helyezve 1984. augusztus 2-án) izolált Ndel-HindlII bGH fragmentumhoz ligáljuk, hogy a pRO12-t állítsuk elő (Az Ndel-HindlII fragmentumot a pAL500-ból úgy állítjuk elő, hogy EcoRI-vel emésztjük és az emésztési tennék végeihez az alábbi szekvenciájú szintetikus kapcsolókat kapcsoljuk:
TATGGATC
ACCTAGTTAA
A ligálási keveréket Ndel-gyel és HindlII-mal emésztjük és az így létrejövő Ndel-HindlII bGH fragmentumot izoláljuk.
32. ábra A p579 megalkotása
Az előzőleg HindlII-mal emésztett pPSA plazmidból (ATCC 39807; letétbe helyezve: 1984. augusztus 2-án) az rRNS operon T1T2 átírás terminációs fragmentumot izoláljuk. A T,T2 fragmentumot beiktatjuk az előzőleg HindlII-mal emésztett pRO211 (31. ábra) egyedi HindlII helyébe. Az így létrejövő p579 kifejező vektor tartalmazza a λΡ| promotort és a cll riboszomális kötőhelyet, amelyet a T]T2 átírás terminációs jelek követnek.
33. ábra A pTV-170 megalkotása
Az Ndel-Ndel ApoE fragmentumot a pApoE-EX2 plazmidból (ATCC 39787; letétbe helyezve: 1984. augusztus 2-án) izoláljuk és beiktatjuk az előzőleg Ndelgyel emésztett p579 kifejező vektor (32, ábra) egyedi Ndel helyébe. Az így létrejövő pTV-170 plazmid a természetes humán ApoE fehérje egy analógját fejezi ki, amely analógban egy metionin-gyök van hozzátéve az N-terminálishoz.
34. ábra A pSAL 160-5 megalkotása
Egy, az ApoE DNS szekvenciát tartalmazó Aval-Aval fragmentumot izolálunk az előzőleg Avalgyel emésztett pTV-170-ből (33. ábra). A fragmentumot DNS polimeráz I-gyel (Klenow) betöltjük és agaróz gélen izoláljuk. A tisztított ApoE fragmentumot beiktatjuk a pTV 104(2) plazmid (ATCC 39384; letétbe helyezve: 1983. június 29-én) PstI helyébe, amely plazmidot részlegesen emésztettünk Pstl-gyel, máj d a 3' végeket emésztettük DNS polimeráz I-gyel (Klenow). Az így létrejött plazmidot pSAL 160-5-nek nevezzük.
35. ábra A pTV-194 megalkotása
A β-laktamáz promotor- és riboszomális kötőhely fragmentumát izoláljuk a pBLAll plazmidból (ATCC 39788; letétbe helyezve: 1984. augusztus 2-án) EcoRIgyel és Alul-gyel végzett emésztés után. Ezt a fragmentumot az előzetesen Ndel-gyel részlegesen emésztett, DNS polimeráz I-gyel (Klenow) betöltött, majd EcoRIgyel emésztett pTV-170 plazmid (33. ábra) nagy fragmentumába ligáljuk.
36. ábra A pEFF-902 megalkotása - ez a plazmid pGH analógot kifeiező „független plazmid”
A pRec-pig24 plazmidot (ATCC 53433; letétbe he10
HU 213 418 Β lyezve: 1986. január 20-án) az ezzel együtt bejelentett ezzel összefüggő 821,830 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés írja le. Ez egy met-asp-glu sertés növekedési hormon (pGH) analógot fejez ki a XPL represszor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A pGH analógot kódoló 600 bp-s fragmentumot a pRec-pig24-ből hasítjuk ki Ndel-gyel és PvuII-vel végzett emésztéssel, és beiktatjuk a pFSAL-130-B27 plazmidba (ATCC 67071,24. ábra), amelyből a bGH kódoló szekvenciát részleges Ndel és teljes PvuII emésztéssel előzőleg eltávolítottuk. Az így létrejött plazmid, amelyet pEFF-902-nek nevezünk, tartalmazza a Xcl 857 represszort szabályozó megcsonkított deo P1 promotort, továbbá 5'<-3' irányban az alábbiakat: a λ Pl promotort, a cll riboszomális kötőhelyet, a pGH analóg DNS szekvenciát és a T]T2 átírás terminációs kódoló szekvenciákat. Ez a plazmid, amely magas szintű kifejezője a pGH analóg fehéijének, független az Escherichia coli kromoszóma λ génjeitől és ezáltal gazdaszervezetek széles választékába transzformálható.
7. ábra A pEFF—9021 megalkotása - ez egy további „független ”, pGH analógot kifejező (tetraciklin-rezisztens) plazmid
Egy tompa végű, a pBR322 plazmidből (ATCC 37017) származó tetraciklin rezisztencia gént tartalmazó fragmentumot, amelyet a pBR322 EcoRI-gyel és Avalgyel végzett hasításával és Klenowval végzett betöltésével állítunk elő, beiktatunk a pEFF-902 plazmid nagy fragmentumába, amelyből az ampicillin gént korábban már eltávolítottuk olyan módon, hogy AatlI-vel és Pstlgyel emésztettük, majd a 3' végeket Klenow-val emésztettük. Ezzel hozzuk létre a pEFF-9021 plazmidot, amely a pEFF-902 plazmidhoz hasonló azzal a különbséggel, hogy az ampicillin rezisztencia gén a tetraciklin rezisztencia génnel van helyettesítve. A pEFF-9021 plazmid tartalmazza a /„cl 857 represszort szabályozó deo Pl promotort; ez tartalmazza továbbá 5'—+'3’ irányban az alábbiakat: a /„Pl promotort, a cll riboszomális kötőhelyet, a pGH analóg DNS szekvenciát, és a T)T2 átírás terminációs kódoló szekvenciákat. Ez független plazmid, amely a pGH analóg magas szintű kifejezője. Ugyanabból a ligálásból egy másik izolátumot is azonosnak találunk azzal a kivétellel, hogy a tetraciklin rezisztencia gén az ellenkező orientációban van; ez a plazmid, amelyet pEFF-9022-nek nevezünk, szintén magas szintű kifejezője a pGH analógnak.
38. ábra A pEFF—905 megalkotása — ez pGH analógot kifejező deo P1P2 plazmid
Azt a fragmentumot, amely 5'->3' irányban tartalmazza a cll riboszomális kötőhelyet, a pGH analóg DNS szekvenciát és a T]T2 átírás terminációs szekvenciákat, a pEFF-902 plazmidből EcoRI-gyel, Dral-gyel és Pstlgyel végzett emésztéssel, amelyet az EcoRI-Dral fragmentum izolálása, majd az Ecoftl 5' végek Mung bab nukleázzal végzett eltávolítása követ, kapjuk meg. Ezt a fragmentumot a pMF 5531 plazmidből (4. ábra) kapott nagy fragmentumhoz ligáljuk (ezt a nagy fragmentumot úgy állítjuk elő, hogy a hSOD kódoló szekvencia egy részét Ndel-gyel és Stul-gyel végzett emésztéssel és a kialakult nagy fragmentumon az Ndel 5' végek eltávolítására végzett Mung bab emésztéssel eltávolítjuk). Az így létrejött plazmid, amelyet pEFF-905-nek nevezünk, 5'->-3' irányban tartalmazza a deo P1-P2 promotor szekvenciát, a cll riboszomális kötőhelyet, a pGH analóg DNS szekvenciát és a T]T2 átírás terminációs szekvenciákat. Ez a plazmid nagyon jó kifejezője a pGH analóg fehérjének, de a konstrukció nem bizonyul stabilnak.
39. ábra A pEFF-920 - ez pGH analógot kifejező deo P1-P2plazmid (PÁR')
Egy, a PÁR (elválasztó) szekvenciát tartalmazó fragmentumot izolálunk a pSCIOl plazmidből (ATCC 37032), a plazmid hasításával Sspl-gyel, PvuII-vel és EcoRI-gyel, az így keletkezett nagy fragmentum izolálásával, és ennek HincII-vel végzett hasításával. Egy 350 bp-s SspI-HincII fragmentumot izolálunk és beiktatjuk a pEFF-905 plazmidban levő EcoRV helybe, az így létrejött plazmidot pEFF-920-nak nevezzük. Ez a plazmid magában foglalja a PÁR szekvenciát és 5^31 irányban a deo P1-P2 promotort, a cll riboszomális kötőhelyet, a pGH analóg DNS szekvenciát és a T[T2 átírás terminációs szekvenciákat. A pEFF-920 plazmid nagyon jó kifejezője a pGH analóg fehérjének, és ez Escherichia coli S093O törzsben deponálva van az ATCC-nél ATCC 67706 deponálási számon.
40. ábra A pMFS-5627 megalkotása - ez bGH analógot kifeiező deo P1-P2 plazmid
Azt a fragmentumot, amely 5’—>3’ irányban tartalmazza a szarvasmarha növekedési hormon (bGH) analóg DNS szekvenciát és a T]T2 átírás terminációs kódoló szekvenciákat, a pFSAL-130-B27-böl (ATCC 67071; lásd 24. ábra) izoláljuk Ndel-gyel, Dral-gyel és BglIIvel végzett emésztéssel. Ezt a fragmentumot ahhoz a nagy fragmentumhoz ligáljuk, amelyet Ndel és Stul emésztés után pMF 558-26-ból (6. ábra) kapunk. Az így létrejövő plazmid, amelyet pMFS-5627-nek nevezünk, 5’—>3* sorrendben tartalmazza a deo P1-P2 promotort, a deo riboszomális kötőhelyet, a bGH analóg DNS szekvenciát és a T[T2 átírás terminációs kódoló szekvenciákat. Ez a plazmid gyenge kifejezője a bGH analóg fehérjének.
41. ábra A pMFS-5603 megalkotása - ez egy másik, bGH analógot kifeiező deo P1-P2 plazmid
Azt a kis fragmentumot, amely a deo P1-P2 promotorok egy részét és a cll riboszomális kötőhelyet tartalmazza, és amelyet pEFF-905 plazmidből BglIIvel és Ndel-gyel végzett emésztéssel izolálunk, ligáljuk ahhoz a nagy fragmentumhoz, amelyet a pMFS-5627-ból kapunk BglII-vel és Ndel-gyel végzett hasítással. Az így létrejövő plazmid, amelyet pMFS-5603-nak nevezünk, 5'—+3’ irányban tartalmazza a deo P1-P2 promotort, a cll riboszomális kötőhelyet, a bGH analóg DNS szekvenciát és a T]T2 átírás terminációs kódoló szekvenciákat. Ez a bGH analóg fehérje közepes szintű kifejezője.
42. ábra A pMFS-5605 megalkotása - ez bGH analógot kifejező deo PJ-P2 plazmid (PAR+)
A pEFF-920 plazmidból származó PÁR (megosztási) szekvenciát tartalmazó kis fragmentumot izoláljuk a pEFF-920 plazmidból (39. ábra) AatlI-vel és BglII-vel végzett emésztés után. Ezt a fragmentumot az előzőleg AatlI-vel és BglII-vel hasított pMFS-5603 plazmid nagy fragmentumához ligáljuk. Az így létrejövő plazmid, amelyet pMFS-5605-nek nevezünk, tartalmazza a PÁR szekvenciát, és 5'-+3' irányban a deo P1-P2 promotort, a cll riboszomális kötőhelyet, a bGH analóg DNS szekvenciát és a TjT2 átírás terminációs kódoló szekvenciákat. Ez a bGH analóg fehéije nagyon jó kifejezője.
A pMFS-5607 (TetR) plazmidot a pMFS-5605 (AmpR) plazmidból alkotjuk meg, azt az eljárást alkalmazva, amelyet a 7. ábrában mutattunk be. A pMFS5607 plazmidot Escherichia coli 50930 (F_) törzsben az ATCC-nél deponáltuk ATCC-67704 deponálási számon. (Az Escherichia coli F törzseket leírja a 21. példa is).
43. ábra A pMF-5534 plazmid megalkotása - ez olyan plazmid amely egy transzlációs fokozót tartalmaz és hSOD analógot fejez ki
A pJBF 5401 plazmidot (1. ábra) BamHI-gyel hasítjuk és a kis (900 bp) fragmentumot izoláljuk és tisztítjuk alacsony olvadáspontú agarózon. A BamHI fragmentumot azután BglII és Taql restrikciós enzimekkel hasítjuk, és a kialakított 440 bp-s fragmentumot izoláljuk és tisztítjuk. A2912., 3604., 3107., 2913. számú szintetikus kapcsolókat (amelyeket a 4. ábra leírásánál részleteztünk), amelyek azonosak a közölt deo nukleotid szekvencia egy részével, lefedve a deo P2 promotor-operátort [Valentine-Hansen és munkatársai: EMBO 7, 317 (1982)], összeforrasztjuk, egymáshoz ligáljuk, majd a 440 bp-s BglII-Taql fragmentumhoz ligáljuk.
és 39 bázis hosszúságú rövid oligonukleotidokat szintetizálunk kémiai úton. Ezeket a szekvenciákat az alábbiakban mutatjuk be.
AT-ben gazdag terület
AAGCCTAGGTTTGTTTAACTTTAAGGAGAAATCA #3413 3-CTGTTCGGATCCAAACAAATTGAAATTCCTCTTTAGTAT # 3913
A 3413. és 3913. számú oligonukleotidok összeforrasztása után a duplexet a kiterjesztett BglII-Taql fragmentumhoz ligáljuk. Ez a végső ligálás olyan fragmentumot alakít ki, amelyet Bglll-Ndel restrikciós helyek szegélyeznek, és amely egy AT-ben gazdag területet foglal magában (ez a „transzlatális fokozó” lásd a
18. példát). Ezt a fragmentumot az előzőleg BglII-vel és Ndel-gyel hasított pMF-5531 nagy fragmentumához ligáljuk. Az így létrejövő plazmid, amelyet pMF-5534nek nevezünk, hSOD analóg fehéije magas szintű kifejezője. Ez 5^31 irányban tartalmazza a deo P1-P2 promotorokat, a módosított deo riboszomális kötőhelyet a fokozó szekvenciával, és a hSOD analóg kódoló szekvenciát.
A pMF-5534 plazmidot Escherichia coli 50930 törzsben az ATCC-nél deponáltuk ATCC 67703 letéti számon.
44. ábra A pMF-5541 plazmid megalkotása
A pMF-5534 plazmidot (43. ábra) BglII-vel és Avrllvel hasítjuk. Az agaróz gélen megfigyelt legnagyobb fragmentumot izoláljuk és tisztítjuk, és a kohezív végeket betöltjük Klenow-enzimmel és ligáljuk, így alkotva újra az Avall helyet. Ez a művelet a pMF-5540 plazmidot hozza létre, amely Ó'-G' irányban tartalmazza a deo Pl promotort, a módosított deo riboszomális kötőhelyet (RBS) a fokozó szekvenciával, és a hSOD analóg kódoló szekvenciát. A pMF-5540 plazmid magas szinten termel hSOD analóg fehérjét a deo Pl promotor és a transzlációs fokozó szabályozása alatt.
A pMF-5540 plazmidot EcoRI-gyel és AvrII-vel hasítjuk; a kohezív végeket ezután Klenow enzimmel betöltjük és a nagy fragmentumot izoláljuk és T4 ligázzal ligáljuk. Ezek a műveletek eltávolítják a deo Pl és P2 promotor szekvenciákat a deo riboszomális kötőhely (RBS) kivételével; így jön létre a pMF-5541 plazmid, amely 5'—>3' sorrendben tartalmazza a módosított deo RBS-t a fokozó szekvenciával és a hSOD analóg kódoló szekvenciát. Ez a plazmid rendkívül alacsony szinten termel hSOD analóg fehérjét.
45. ábra pMF—945 plazmid megalkotása
A pEFF-920 plazmidot (39. ábra; ATCC 67706) hasítjuk BglIIvel és Ndel-gyel, és a nagy fragmentumot izoláljuk. Ezt a fragmentumot a pMF-5534 (43. ábra) BglII-vel és Ndel-gyel végzett hasításával előállított kis, 540 bp-s fragmentumhoz ligáljuk. Ez az eljárás a pMF945 plazmidot hozza létre, amely magában foglalja a PÁR szekvenciát és 5'->3' irányban a deo P1-P2 promotor szekvenciákat, a módosított deo RBS-t a fokozó szekvenciával, a pGH analóg kódoló szekvenciát és a T)T2 átírás terminációs szekvenciákat. A pMF-945 plazmid a pGH analóg fehéije magas szintű kifejezője.
46. ábra A pMF-5608 plazmid megalkotása
A pMFS-5607 plazmid (ATCC 67704) hasonló a pMFS-5605 plazmidhoz (42. ábra), azzal a kivétellel, hogy az ampicillin rezisztencia gén a tetraciklin rezisztencia génnel van helyettesítve, ugyanazt az eljárást alkalmazva, mint amelyet a 7. ábrában leírtunk. A pMFS5607 plazmidot Ndel-gyel és BglII-vel hasítjuk és az így létrejövő nagy fragmentumot a pMF-5534 (43. ábra) Ndel-gyel és BglII-vel végzett hasításával kialakított kis (540 bp) fragmentumhoz ligáljuk. Az így létrejött plazmid, amelyet pMF-5608-nak nevezünk, tartalmazza a PÁR szekvenciát és 5'—*3' irányban a deo P1-P2 promotor szekvenciát, a módosított deo RBS-t az ATben gazdag szekvenciával (ez a fokozó), a bGH analóg kódoló szekvenciát, és a T]-T2 átírás terminációs szekvenciákat. Ez a bGH analóg fehéije alacsony szintű kifejezője.
47. ábra A pMF-5513-1 plazmid megalkotása
A pJBR-5401 plazmid hely specifikus mutagenezisét úgy hajtjuk végre, amint ezt a 2. ábránál leírtuk, és ez a pMF-5416-2 plazmid kialakítását eredményezi, amely tartalmazza a deo P1-P2 peomotorok teljes szekvenciáját. Ezt a plazmidot Ndel-gyel és AatlI-vel hasítjuk és a kis deo P1-P2 fragmentumot izoláljuk és a pSODal3 plazmid Ndel-gyel és AatlI-vel végzett emésztésével kapott nagy fragmentumhoz ligáljuk (lásd a 3. ábrát). Az így létrejött plazmid, a pMF-5513-1 tartalmazza 5’—>3' irányban a teljes deo P1-P2 promotor szekvenciát és a hSOD analóg kódoló szekvenciát. Erről a plazmidról úgy véljük, hogy azonos a pMF-5531 plazmiddal a restrikciós enzimes elemzés alapján.
48. ábra A pMFS-2006plazmid megalkotása
A pMF-2005-ből (9. ábra) BglII-vel és Styl-gyel való hasítással előállított nagy fragmentumot ligáljuk T4 ligáz segítségével a pMFS-5605 plazmidból (42. ábra) BglII-vel és Styl-gyel végzett hasítással kapott kis fragmentumhoz. Az így létrejövő plazmid, amelyet pMFS2006-nak nevezünk, magában foglalja a tetraciklin rezisztencia gént és 5^31 sorrendben tartalmazza a deo P1-P2 promotor szekvenciát, a cll riboszomális kötőhelyet, a bGH analóg kódoló szekvenciát és a T]T2 átírás terminációs kódoló szekvenciákat. Ez a plazmid egy bGH analóg fehérje (met-asp-gln-bGH) magas szintű kifejeződését irányítja.
49. ábra Fragmentumok előállításapGH 30-2 megalkotásában való felhasználásra, NlaIII-at alkalmazva
A. ) Sertés hipofízis mRNS oligo-dT-vel beindított cDNS könyvtárát C-farokkal látjuk el és beiktatjuk olyan pBR322 plazmidba, amelyet előzőleg Pstl-gyel hasítottunk és G-farokkal láttunk el. Ezt Escherichia coli HB101 törzsbe transzformáljuk és szelektálást végzünk Tét LB lemezeken. A hibridizálás egy bGH vizsgáló mintához a pl07 plazmidot azonosítja (amelyet nevezünk pGH cDNS 107-nek is), amely tartalmazza a pGH analóg teljes hosszúságú szekvenciáját és a vezető szekvenciát. A 107 plazmidot Pstl-gyel hasítjuk és az így képződött kis fragmentumot, amely tartalmazza a pGH analóg kódoló szekvenciát (egy glicin gyök kiiktatásával), Smal-gyel és NlalII-mal hasítjuk. Az így keletkezett 325 bp-s fragmentumot, amely tartalmazza a pGH szekvencia központi részét, 2%-os lágy agaróz gélről izoláljuk és fenollal tisztítjuk,
B. ) A pFSAL-B27 plazmidot (24. ábra; ATCC 67071) EcoRI-gyel és Pstl-gyel hasítjuk. A 340 bp-s fragmentumot izoláljuk és NlalII-mal hasítjuk, és az így létrejövő 70 bp-s fragmentumot, amely tartalmazza a cll riboszomális kötőhelyet és a bGH analóg 5’ végét (amely azonos a pGH analóg szekvencia 5’ végével) izoláljuk 2%-os lágy agaróz gélről és fenollal tisztítjuk.
50. ábra pGH 30-2 plazmid előállítása
A 49. ábránál leírt módon előállított két fragmentumot T4 ligázzal ligáljuk, majd a pl07 plazmid EcoRI-gyel és Smal-gyel végzett hasításával kapott nagy fragmentumhoz ligáljuk. Ez a műveletsor a pGH 30-2 plazmidot alakítja ki, amely tartalmazza a cll riboszomális kötőhelyet és a teljes hosszúságú pGH analóg kódoló szekvenciát.
51. ábrapMFS-928 plazmid előállítása
A pFSAL B27 plazmidból (49. ábra) részleges EcoRI és PvuII hasítás után kapott nagy fragmentumot a pGH 30-2 plazmid EcoRI-gyel és PvuII-vel végzett hasításával kapott kis fragmentumhoz ligáljuk. Az így létrejövő plazmid, amelyet p MFS-928-nak nevezünk, tartalmazza az ampicillin rezisztencia gént és 5’—*-3’ irányban a λ Pfet, a cll riboszomális kötőhelyet, a pGH analóg kódoló szekvenciát és a T)T2 átírás terminációs szekvenciát; tartalmazza továbbá a cl represszor szekvenciát a megcsonkított deo Pl promotor szabályozása alatt.
A pMFS-928 plazmid met-asp-gln-pGH kifejeződését irányítja, amelyből valószínűleg hiányzik egy glicingyök. Az előzetes szekvencia adatok azt jelzik, hogy ez a glicin gyök a természetben előforduló pGH 39. helyzetének felel meg; a pGH analógban levő met-asp-gln N-terminális többlet-szekvencia a -3, -2 és -1 helyeknek felel meg. Jelenleg nem világos, vajon hiányzik- egy glicin gyök a pMFS 928 plazmidban, mivel a G gyök kondenzációja gondot okoz a DNS szekvenciaelemzésben. A komplementer szál elemzése folyamatban van, hogy meghatározzuk, vajon jelen vane a teljes pGH analóg szekvencia vagy sem; ha a szekvencia teljes, akkor a pMFS 928 és pMFS 929 azonos.
52. ábra A pMFS-929 plazmid előállítása
A pMFS-928 plazmidból PvuII-vel és BssHII-vel végzett hasítás után kapott nagy fragmentumot a PvuIIvel és BssHII-vel hasított pRec pig 24 plazmidból (ATCC 53433; 36. ábra) előállított kis fragmentumhoz ligáljuk. Az így létrejövő plazmid, amelyet pMFS-929nek nevezünk, tartalmazza az ampicillin rezisztencia gént és 5’—>3’ irányban a, XPL-t, a cll riboszomális kötőhelyet, a teljes hosszúságú, kiiktatást nem tartalmazó pGH analóg kódoló szekvenciát és a T|T2 átírás terminációs kódoló szekvenciákat; tartalmazza továbbá a cl represszor szekvenciát a megcsonkított deo Pl promotor szabályozása alatt. Ezt a plazmidot ATCC 67705 számon deponáltuk.
Az alábbiakban a találmány részletes leírását adjuk meg.
Kettős szálú DNS plazmidot fejlesztettünk ki, amely megfelelő bakteriális gazdasejtbe, pl. Escherichia coliba bevezetve a gazdasejtet képessé teszi egy kívánt, természetben előforduló eukarióta polipeptid vagy ennek polipeptid analógja kifejezésének kivitelezésére, ahol a nevezett analóg azonos biológiai aktivitással bír, mint a természetben előforduló polipeptid, és aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetben előforduló polipeptidével, de mégis különbözik attól, és ezáltal képessé teszi a polipeptid vagy polipeptid analóg előállításának kivitelezésére; a nevezett kettős szálú DNS 5'-*3' irányban az alábbiakat foglalja magában:
a. ) DNS-t, amely 5’—>-3’ irányban magában foglalja a deo Pl és deo P2 egymást követő (tandem) promotorokat;
b. ) DNS-t, amely magában foglal egy riboszomális kötőhelyet abból a célból, hogy a polipeptidet vagy polipeptid analógot kódoló DNS-ből átírt mRNS-t képessé tegye riboszómákhoz kötődni a gazdasejten belül;
c) egy ATG iniciációs kodont;
d) a polipeptidet vagy polipeptid analógot kódoló DNS-t az ATG iniciációs kodonnal fázisban;
magában foglal továbbá egy DNS szekvenciát, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból eredő replikációs origót tartalmaz, és egy DNS szekvenciát, amely egy olyan szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely megmutatkozik, amikor a plazmid a gazdasejtben jelen van.
A megfelelő Escherichia coli gazdasejtek, amelyekbe a kettős szálú DNS-t be lehet vezetni, között találjuk az 50732, 50744, MC1061, 50540, 50928, 50929, 50930, vagy vad típusú (ATCC 12435) Escherichia coli törzseket. Az előnyös Escherichia coli gazdasejtek azok a sejtek, amelyek nem tartalmaznak funkcionális deo R és cyt R represszorokat; ilyenek pl. az Escherichia coli 50744 és 50732 törzsek.
Az Escherichia coli 50732 sejt, amely tartalmazza a pMF-2005 plazmidot, az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland 20852, Amerikai Egyesült Államok) van deponálva ATCC 67362 deponálási számon. A vad típusú Escherichia coli törzs (ATCC 12435) szabadon rendelkezésre áll az ATCC közönség számára nyitott gyűjteményében. Más gazdasejtek is ismertek a szakterületen, lásd a későbbi I. Táblázatot. Ezeknek a sejteknek a fenotípusát is leírjuk az IA. táblázatban. Az Escherichia coli MCI061 törzset Casadaban M. és Cohen S.N. írták le az alábbi irodalmi helyen: J. Mól. Bioi. 138, 179-207 (1980).
A jelen találmány Escherichia coli F“ gazdasejtek széles választékát nyújtja, amelyeket gazdasejtekként lehet alkalmazni a plazmidokhoz. Miközben az alkalmazott speciális F“ gazdatörzseket leírjuk részletesebben a 21. példában, azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy bármely megfelelő Escherichia coli F“ gazdatörzs alkalmazható. Speciális példái az Escherichia coli gazdasejteknek, amelyeket alkalmazhatunk, az F MG 1655, F~ W3110, F- W2637, F“ MM294, F~ 1000 és F~ 1100 törzsek. Ezeket a törzseket részletesebben a 21. példában ismertetjük.
A megfelelő természetben előforduló polipeptidek között, amelyeket a jelen találmány szerinti plazmiddal elő lehet állítani, találjuk a humán réz/cink szuperoxid diszmutázt, a humán mangán szuperoxid diszmutázt, a humán glutation peroxidázt, a humán növekedési hormont, a szarvasmarha növekedési hormont, a sertés növekedési hormont, a humán apolipoprotein E-t, vagy a fibronektin molekula különböző tartományait. Azok, akik a szakterületen jártasak, természetesen tudják, hogy a plazmidok tartalmazhatnak más kívánt, természetben előforduló polipeptideket kódoló DNS-t is.
A jelen találmány kettős szálú plazmid DNS-e magában foglalja a deo Pl és deo P2 egymás utáni (tandem) promotorokat is. Amint ezt az 1. példában részletesebben leírjuk, abból a célból, hogy a deo P1-P2 operátor/promotor területet klónozzuk, először a deo operont kell izolálni és tisztítani. A deo operont Escherichia coli 501084-ből izoláljuk, amelyet Buxton és munkatársai írnak le [J. Bacteriol. 136, 668-681 (1978)]. A deo operon tisztításának és a deo Pl és deo P2 tandem promotorokat tartalmazó plazmid megalkotásának módszerét az 1. példában írjuk le részletesebben.
Különböző riboszomális kötőhelyeket is alakít ki a jelen találmány abból a célból, hogy egy kívánt polipeptidet vagy polipeptid analógot kódoló DNS-ből átírt mRNS-t képessé tegye a gazdasejten belüli riboszómákhoz kötődni. Az egyik ilyen riboszóma kötő hely, amelyet alkalmazhatunk, a deo operonból származó természetes deo riboszomális kötőhely. Egy előnyös riboszomális kötőhely, amelyet alkalmazunk, a deo operonból származik és két bázisos változása van a szekvenciában a Shine-Dalgamo szekvenciától lefelé a-1 és -3 nukleotidnál az iniciációs kodon A-jához viszonyítva. Ezt a riboszomális kötőhelyet részletesebben a 2. ábra magyarázatánál újuk le.
Egy másik előnyös riboszomális kötőhely, amelyet alkalmazunk, a cll riboszomális kötőhely a λ bakteriofágból, amely az alábbi szekvenciával bír:
TAAGGAAATACTTACAT
ATTCCTTTATGAATGTA
A további megfelelő riboszomális kötőhelyek között, amelyeket alkalmazhatunk, találunk egy mutáns cll riboszomális kötőhelyet a λ bakteriofágból, amely az alábbi szekvenciával bír:
TAAGGAAGTACTTACAT
ATTCCTTCATGAATGTA;
találjuk a természetes β-laktamáz riboszomális kötőhelyet, amely a pBR322-ből származik;
találunk egy szintetikus oligonükleotidot, amely az alábbi szekvenciával bír:
AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA
GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT; és találunk egy szintetikus oligonükleotidot, amely az alábbi szekvenciával bír:
AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG
GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT.
Egy további riboszomális kötőhely, amelyet a jelen találmányban alkalmazunk, egy olyan szintetikus nukleotid, amelynek a szekvenciája az alábbi:
GACAAGCCTAGGTTTGTTTAACTTTAAGGAGAAATCATA
CTGTTCGGATCCAAACAAATTGAAATTCCTCTTTAGTAT.
A jelen találmány plazmidjai tartalmaznak egy ATG iniciációs kodont is. A kívánt, természetben előforduló eukarióta polipeptidet vagy polipeptid analógot kódoló DNS fázisban van az ATG iniciációs kodonnal.
A jelen találmány szerinti plazmid magában foglal egy olyan DNS szekvenciát is, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból származó replikációs origót tartalmaz. A megfelelő replikációs origókat számos forrásból kaphatjuk meg. Az egyik
HU213 418B ilyen forrás, a pBR322 plazmid, szabadon rendelkezésre áll az American Type Culture Collection szabad gyűjteményében (Public Collection) ATCC 37017 számon. A replikációs origó származhat a pOPlA6-ból is. Ez a plazmid a szakterületen jól ismert; ezt Gelfand D.H. és munkatársai [PNAS 15, 5869-5873 (1978)], valamint Muessing és munkatársai [Cell, 24, 235 (1981)] írják le.
Egy olyan DNS szekvencia is alkotórésze a plazmidnak, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely megnyilvánul, ha a plazmid jelen van a gazdasejtben. Az ilyen megfelelő gének között találjuk azokat, amelyek hőmérséklet-érzékenységgel vagy gyógyszer-rezisztenciával társulnak, pl. ampicillinre, klóramfenikolra vagy tetraciklinre való rezisztenciára.
A jelen találmány szerinti plazmidok általában kör alakú, zárt plazmidok.
Amint fentebb leírtuk, a jelen találmány szerinti plazmidot alkalmazhatjuk számos természetben előforduló polipeptid vagy polipeptid-analóg alőállítására. A jelen találmányhoz alkalmazott plazmidok között vannak azok a plazmidok, amelyek humán réz/cink szuperoxid diszmutázt, humán mangán diszmutázt, humán glutation peroxidázt, humán növekedési hormont, szarvasmarha növekedési hormont, sertés növekedési hormont, humán apolipoprotein E-t vagy fibronektin tartományokat termelnek.
A jelen találmány szerinti plazmidokat alkalmazhatjuk eukarióta polipeptid analógok előállítására is, amelyek azonos biológiai aktivitással és lényegében azonos, de mégis eltérő aminosav-szekvenciával bírnak, mint a természetben előforduló polipeptid, vagy olyan analógok előállítására, amelyek aminosav-szekvenciája azonos a természetben előforduló polipeptid aminosavszekvenciájával, de különböznek pl. abban, hogy a polipeptid acetilezve van, vagy nincs glikozilezve.
A jelen találmány szerinti plazmidokat alkalmazhatjuk a természetben előforduló humán réz/cink szuperoxid diszmutáz olyan analógjának előállítására, amely két polipeptid alegység dimerjéből áll, amelyek mindegyikének aminosav-szekvenciája azonos a természetben előforduló humán réz/cink szuperoxid diszmutázéval, de amelyek nincsenek acetilezve amino-terminálisukon. A pMF 5531 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 4. ábrában mutatjuk be, a humán réz/cink szuperoxid diszmutáznak egy ilyen analógját termeli. A további plazmidok, amelyek a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz fentebbiek szerint meghatározott analógjait termelik, találjuk a pMF 5519 plazmidot, amelynek restrikciós térképét az 5. ábrában mutatjuk be; a pMF 558-26 plazmidot, amely a 6. ábrában bemutatott restrikciós térképpel bír; a pMF 5534 plazmidot, amely a 43. ábrában bemutatott restrikciós térképpel bír; a pMF-5520 plazmidot, amely a 7. ábrában bemutatott restrikciós térképpel bír; a pMF 2005 plazmidot, amely a 9. ábrában bemutatott restrikciós térképpel bír; a pMFS 5533A plazmidot, amely a 17. ábrában bemutatott restrikciós térképpel bír; és a pMFS 5538 plazmidot, amely a 18. ábrában bemutatott restrikciós térképpel bír.
A jelen találmány szerinti plazmidokat alkalmazzuk humán növekedési hormon olyan polipeptid analógjainak előállítására is, amelyek metionin aminosavval bírnak a természetben előforduló humán növekedési hormon polipeptid szekvencia N-terminálisához rögzítve. Az ilyen plazmidra példa a pTVR 568-4 plazmid, amelynek restrikciós térképét a
11. ábrában mutatjuk be.
A jelen találmány szerinti plazmidokat alkalmazzuk olyan szarvasmarha növekedési hormon analóg előállítására, amely metionin, aszparaginsav és glutamin aminosavakkal bír a természetben előforduló szarvasmarha növekedési hormon polipeptid szekvencia N-terminálisához rögzítve. A szarvasmarha növekedési hormon fentebb meghatározott analógjait termelő plazmidokra példák az alábbiak: a pMFS-5600 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 12. ábrában mutatjuk be; a pMFS 5627 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 40. ábrában mutatjuk be; a pMFS-5603 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 41. ábrában mutatjuk be; a pMFS-5605 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 42. ábrában mutatjuk be; és a pMFS 2006 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 48. ábrában mutatjuk be.
A jelen találmány szerinti plazmidokat alkalmazzuk olyan sertés növekedési hormon előállítására, amely metionin, aszparaginsav és glutamin aminosavakkal bír a természetben előforduló sertés növekedési hormon polipeptid szekvencia N-terminálisához rögzítve. A sertés növekedési hormon fentebb meghatározott analógjait termelő plazmidokra példa lehet a pEFF-905 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 38. ábrában mutatjuk be; és a pEFF-920 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 39. ábrában mutatjuk be.
A jelen találmány szerinti plazmidok alkalmazhatók számos fúziós polipeptid előállítására. Az olyan fúziós polipeptidek között, amelyeket a jelen találmány szerinti plazmidokkal állítunk elő, találjuk a pDGE4—3 plazmidot, amelynek restrikciós térképét a 10. ábrában mutatjuk be; ezt mangán szuperoxid diszmutáz-glutation peroxidáz fúziós polipeptid előállítására alkalmazzuk; és a pTVR 580-35 plazmidot, amelynek restrikciós térképét a 19. ábrában mutatjuk be, és amelyet humán növekedési hormon - apolopoprotein E fúziós polipeptid előállítására alkalmazunk.
A jelen találmány gazdaszervezet-rendszereket is nyújt valamely természetben előforduló eukarióta polipeptid vagy ennek polipeptid analógja előállítására; ezek a rendszerek a találmány szerinti különböző plazmidokat tartalmaznak megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben. A plazmidot tartalmazó Escherichia coli gazdaszervezet az Escherichia coli 50744, 50732, vad típusú törzs (ATCC 12435), 5 0540,50928,50929, MC1061, és 50930 törzsek valamelyike lehet.
A gazdaszervezet-plazmid rendszer Escherichia coli gazdaszervezete lehet F törzs is. Bár a gazdaszervezet lehet bármilyen F_ törzs, amely ismerős azok számára, akik a szakterületen járatosak, a speciális F' törzsek, amelyeket alkalmazhatunk a gazda-plazmid rendszerben, az alábbi F~ törzsekből kerülnek ki: F“MG1655; F“W3110; F-W2637; F“MM294; F1000; és F~1100.
A jelen találmány gazdaszervezet rendszereket is nyújt a természetben előforduló réz-cink szuperoxid diszmutáz valamely analógja előállítására, amely a polipeptid alegységek dimerjeiből áll, ahol az alegységek mindegyikének aminosav-szekvenciája azonos a természetben előforduló humán réz/cink szuperoxid diszmutáz aminosav-szekvenciájával, de amely nincs acetilezve aminoterminálisánál; egy ilyen gazdaszervezet-plazmid rendszer humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló DNS-t tartalmaz, mint pl. olyan plazmidot, amelyről fentebb tárgyaltunk, megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A jelen találmány továbbá gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt szuperoxid díszmutáz-glutation peroxidáz fúziós polipeptid előállítására, amely a fúziós polipeptidet kódoló DNS-t pl. pDGE4-3-at tartalmazza megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A jelen találmány továbbá gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt humán növekedési hormon polipeptid analógjának előállítására, amely metionin aminosavval bír a természetben előforduló humán növekedési hormon N-terminálisához rögzítve; ez a rendszer egy humán növekedési hormon analógot kódoló DNS-t, pl. pTVR 568-4-et tartalmaz megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A jelen találmány továbbá, gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt szarvasmarha növekedési hormon polipeptid analógjának előállítására, amely metionin, aszparaginsav és glutaminsav aminosavakkal bír a természetben előforduló szarvasmarha növekedési hormon polipeptid N-terminálisához rögzítve; ez a rendszer a szarvasmarha növekedési hormon egy analógját kódoló DNS-t tartalmazza, pl. a pMFS-560, pMFS-5627; pMFS-5603, pMFS-5606 vagy pMFS-2006 plazmidot, megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A jelen találmány továbbá gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt sertés növekedési hormon polipeptid analógjának előállítására, amely metionin, aszparaginsav és glutaminsav aminosavakkal bír a természetben előforduló sertés növekedési hormon polipeptid N-terminálisához rögzítve; ez a rendszer a sertés növekedési hormon egy analógját kódoló DNS-t, pl. a pEFF-505 vagy pEFF-920 plazmidot tartalmazza megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A jelen találmány továbbá gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt humán növekedési hormon-apolipoprotein fúziós polipeptid előállítására; ez a rendszer a fúziós polipeptidet kódoló DNS-t pl. a pTVR 580-35 plazmidot, tartalmazza megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A jelen találmány egy másik szempontja szerint a találmány eljárást nyújt természetben előforduló polipeptid vagy analógja előállítására, pl. a fentebb meghatározott analógok előállítására; ez az eljárás abból áll, hogy a jelen találmány szerinti gazdaszervezet-plazmid rendszert olyan körülmények között növesztjük, amely lehetővé teszi a polipeptid vagy analóg előállítását, és a létrejött polipeptidet vagy analógot kinyerjük.
Ezt az eljárást alkalmazva a természetben előforduló humán réz/cink szuperoxid diszmutáz egy analógját, amely két polipeptid-alegység dimerjét tartalmazza, ahol az alegységek mindegyikének a természetben előforduló polipeptid aminosav-szekvenciájával azonos aminosavszekvenciája van, de amely az N-terminálisán nincs acetilezve; egy mangán szuperoxid díszmutáz-glutation peroxidáz fúziós polipeptidet; a humán növekedési hormon egy metionin polipeptid analógját; a szarvasmarha növekedési hormon egy metasp-glu polipeptid analógját; a sertés növekedési hormon egy metasp-gln polipeptid analógját; és egy humán növekedési hormonapolipoprotein E fúziós polipeptidet állítunk elő az olyan gazdaszervezet-plazmid rendszerek növesztésével, amelyek az ezeket a polipeptideket, analógokat vagy fúziós polipeptideket kódoló DNS-t tartalmazó plazmidokból és megfelelő gazdasejtekből állnak, megfelelő körülmények között, amelyek lehetővé teszik a polipeptidek, analógok vagy fúziós polipeptidek előállítását, valamint az így létrejött polipeptid, analóg vagy fúziós polipeptid kinyerésével.
A természetben előforduló polipeptid vagy polipeptid-analóg előállítására szolgáló eljárás kis mértékű levegőztetést biztosító körülmények között megy végbe, amint ezt részletesebben leírjuk a 2., 16., és 17. példákban. A 2. példa bemutatja az optimális növesztési körülményeket a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz egy analógjának, pl. a fentebb ismertetett analógnak előállításához. A 16. és 17. példák a sertés- és szarvasmarha növekedési hormonok analógjainak előállításához adják meg az optimális körülményeket.
A jelen találmány továbbá eljárást nyújt egy kívánt, természetben előforduló polipeptid vagy polipeptid analóg előállítására konstitutív módon, ahol egy glükóztól eltérő szénforrást használunk a növesztő tápközegben. Bár nem kívánunk elméletekhez kötődni, úgy véljük, hogy a DNS alacsonyabb szinten íródik át amikor a kifejezendő DNS egy deo P2 promotor/operátor terület szabályozása alatt van és glükóz van jelen a tápközegben. A glükóz, úgy tűnik, belejátszik az átírás szintjének csökkenésébe. Alkalmas nem-glükóz szénforrások, amelyeket a növesztő tápközegben alkalmazhatunk, lehetnek pl. a glicerin, fruktóz, szukcinát, nátrium-laktát és nátrium-malát, bár azok, akik a szakterületen járatosak, tudják, hogy más források is alkalmazhatók.
A jelen találmány továbbá eljárást nyújt kívánt polipeptidek vagy analógok előállítására, amely eljárás abból áll, hogy kezdetben glükóz jelenlétében növesztjük az Escherichia coli sejteket, ezáltal csökkentve a kívánt polipeptidet kódoló DNS átírási szintjét, miközben az Escherichia coli sejtek növekednek, majd ezt követően nem-glükóz szénforrást adunk a glükóz kifogyása után.
A nem-glükóz szénforrások, amelyeket a jelen találmány e szerint a szempontja szerint alkalmazhatunk, lehetnek pl. a glicerin, szukcinát, nátrium-laktát, fruktóz és nátrium-malát. Más szénforrások, amelyeket alkalmazhatunk, is ismeretesek és elfogadottak azok számára, akik a szakterületen járatosak.
A megfelelő tápközegek között, amelyet alkalmazhatunk, találjuk az LB vagy minimál-só tápközeget. Az alkalmazott tápközeg típusát és az elemeket, amelyeket, amelyet az oldat tartalmaz, részletesebben is leírjuk a
HU 213 418 Β
2. példában. További elemek, amelyeket az oldatban alkalmazhatunk, könnyen alkalmazhatók és elfogadhatók azok számára, akik a szakterületen jártasak.
Egy másik tényező, amelyről bemutatjuk, hogy növeli a kívánt polipeptidek előállítását, a növesztő tápközeg alacsony levegőztetési szintje.
A találmány továbbá olyan eljárást nyújt, ahol a gazdaszervezet-plazmid rendszerben előállított polipeptid vagy polipeptidanalóg kiválasztódik a tápközegbe, amelyben a gazdaszervezet-plazmid rendszer növekszik, valamely kétértékű fémion hozzáadásával a növesztő tápközeghez.
Bár az előnyös kétértékű fémionok a Cu(2+> és Zn2+, azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy bármely alkalmas kétértékű iont használhatjuk. A találmány továbbá magában foglal egy eljárást, ahol a kétértékű ion Cu(2+> és Zn2+ fémionok keveréke. Itt is az a helyzet, hogy azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy bármiféle alkalmas kétértékű ion keverékét alkalmazhatjuk. Azt is meg kell jegyeznünk, hogy a polipeptid a tápközegbe választódik ki, nem a periplazmatikus térbe.
Azt is meg kell jegyeznünk továbbá, hogy amikor a kívánt polipeptidet kifejező plazmid transzlációs fokozót tartalmaz, amint ezt alább leírjuk, a polipeptid kitermelését meglepően magasabbnak találjuk akkor, amikor az Escherichia coli sejtek növesztését mintegy 30 °C hőmérsékleten hajtjuk végre.
A jelen találmány egy másik kiviteli módjában a találmány kettős szálú DNS plazmidot nyújt, amely megfelelő bakteriális gazdasejtbe, pl. Escherichia coliba bevezetve a gazdasejtet képessé teszi, a gazdasejt hőmérsékletének növelésével olyan hőmérsékletre, amelynél a cl hőlabilis represszor inaktiválódik egy kívánt, természetben előforduló eukarióta polipeptid vagy ennek polipeptid analógja kifejezésének kivitelezésére, ahol a nevezett analóg azonos biológiai aktivitással bír, mint a természetben előforduló polipeptid, és aminosavszekvenciája lényegében azonos a természetben előforduló polipeptidével, de mégis különbözik attól, és ezáltal képessé teszi a polipeptid, vagy polipeptid-analóg előállításának kivitelezésére; a nevezett kettős szálú DNS 5'->3' irányban az alábbiakat foglalja magában:
a) DNS-t, amely magában foglalja a λ bakteriofágból származó PlOl promotort és operátort;
b) DNS-t, amely magában foglal egy riboszomális kötőhelyet abból a célból, hogy a polipeptidet vagy polipeptid analógot kódoló DNS-ből átírt mRNS-t képessé tegye riboszómákhoz kötődni a gazdasejten belül;
c) egy ATG iniciációs kodont;
d) a polipeptidet, vagy polipeptid-analógot kódoló DNS-t az ATG iniciációs kodonnal fázisban;
magában foglal továbbá 5’—*3' irányban egy DNS szekvenciát amely tartalmazza a deo Pl promotort vagy egy részét; egy DNS-t, amely a, XPL promotor cl hőlabilis represszorát kódolja, ahol a represszor kifejeződése a deo Pl promotomak vagy egy részének szabályozása alatt van;
továbbá magában foglal egy DNS szekvenciát amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból eredő replikációs origót tartalmaz; és egy olyan szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént, amely megmutatkozik, amikor a plazmid a gazdasejtben jelen van.
A megfelelő Escherichia coli gazdasejtek, amelyekbe a fentebb leírt plazmidokat bevezethetjük, ugyanazok, amelyeket fentebb már leírtunk, beleértve a fentebb leírt F gazdatörzseket is. Az előnyös Escherichia coli gazdatörzsek közt találjuk a vad típusú törzset (ATCC 12435) és az Escherichia coli MCI061 törzset.
A jelen találmány egy másik szempontja a λ cl 857 hőlabilis represszor fehérjét kódoló DNS jelenléte a plazmidban. Mivel a represszor fehérje termelése nem függ a, λ gének jelenlététől gazdaszervezet kromoszómájában, a plazmidot nevezhetjük „független” plazmidnak.
A megfelelő természetben előforduló polipeptidek között, amelyeket a jelen találmány szerinti plazmidokkal elő lehet állítani, találjuk a humán réz/cink szuperoxid diszmutázt, a humán növekedési hormont, a szarvasmarha növekedési hormont, a sertés növekedési hormont, az apolipoprotein E-t, vagy a fibronektintartományokat. Azok, akik a szakterületen járatosak, tudják, hogy a plazmid tartalmazhat más kívánt, természetben előforduló polipeptideket kódoló DNS-t is.
A független plazmid fontos alkotórésze a riboszomális kötőhely és megfelelő kötőhelyek, beleértve mindazokat, amelyeket a bejelentés korábbi részében már ismertettünk.
A jelen találmány szerinti plazmid tartalmaz egy ATG iniciációs kodont is. A kívánt természetben előforduló eukarióta polipeptid vagy analóg fázisban van az ATG kodonnal.
Ez a független plazmid magában foglal egy, a gazdaszervezetben autonóm replikációra képes baktériumból származó replikációs origót. Megfelelő replikációs origókat kaphatunk sokféle, különböző forrásból, pl. a pBR322 plazmidból. Ez a törzs szabadon rendelkezésre áll az American Type Culture Collection-nál ATCC 37017 deponálási számon. A replikációs origó származhat a pOPlA6-ból is.
A plazmidnak egyik alkotórésze az a DNS szekvencia is, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely megnyilvánul, amikor a független plazmid jelen van a gazdasejtben. A megfelelő gének között találjuk azokat, amelyek hőmérséklet-érzékenységgel vagy gyógyszer-rezisztenciával, pl. ampicillinre, klóramfenikolra vagy tetraciklinre való rezisztenciával társulnak.
A jelen találmány szerinti plazmid előnyösen kör alakú, zárt plazmid.
Amint fentebb leírtuk, a jelen találmány szerinti plazmidot számos természetben előforduló polipeptid vagy polipeptid analóg előállítására alkalmazhatjuk. Azok között a plazmidok között, amelyek szóba jöhetnek, találjuk azokat a plazmidokat, amelyek pl. humán réz/cink szuperoxid diszmutázt, humán növekedési hormont, szarvasmarha növekedési hormont, sertés növekedési hormont, apolipoprotein E-t és fibronektin tartományokat állítanak elő.
A jelen találmány szerinti plazmidokat alkalmazhatjuk olyan eukarióta polipeptid analógok előállítására, amelyeknek biológiai aktivitása azonos a természetben előforduló polipeptid biológiai aktivitásával, és aminosav-szekvenciáj a lényegében azonos, mégis valamelyest különböző a természetben előforduló polipeptid aminosav-szekvenciájától.
Egy jelen találmány szerinti plazmídot alkalmazunk a szarvasmarha növekedési hormon olyan analógjának előállítására, amely metionin, aszparaginsav és glutamin aminosavakkal bír a természetben előforduló szarvasmarha növekedési hormon polipeptid szekvencia N-terminálisához rögzítve. Ilyen plazmidra példa a pFSAL-130-B27 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 24. ábrában mutatjuk be, és amelyet ATCC 67071 számon deponáltunk, valamint a pMF-B27 plazmid, amelyet a 23. példában írunk le.
Egy jelen találmány szerinti plazmídot alkalmazunk olyan humán növekedési hormon polipeptid analóg előállítására is, amely metionin aminosawal bír a humán növekedési hormon polipeptid szekvencia N-terminálisához rögzítve. Ilyen plazmidra példa a pTVR 723-6 plazmid, amelyet a 22. példában írunk le.
Egy jelen találmány szerinti plazmídot alkalmazunk olyan sertés növekedési hormon analóg előállítására is, amely metionin, aszparaginsav és glutamin aminosavakkal bír a természetben előforduló sertés növekedési hormon polipeptid szekvencia N-terminálisához rögzítve. A sertés növekedési hormonok fentebb meghatározott analógjait termelő plazmidokra példák lehetnek a pEFF-902 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 36. ábrán mutatjuk be; a pEFF-9021 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 37. ábrán mutatjuk be; és a pMFS 929 plazmid, amelynek restrikciós térképét az 52. ábrában mutatjuk be, és amelyet deponáltunk ATCC 67705 deponálási számon.
Egy jelen találmány szerinti plazmídot alkalmazunk olyan természetben előforduló humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analóg előállítására, amely két polipeptid alegység dimerje, amely alegységek mindegyikének azonos az aminosavszekvenciája, mint a természetben előforduló humán réz/cink szuperoxid diszmutázé, de nincsenek acetilezve amino-terminálisukon. Ilyen plazmidra példa a pSODpMAX-12-d plazmid, amelynek restrikciós térképét a 25. ábrában mutatjuk be.
Egy jelen találmány szerinti plazmídot alkalmazhatunk egy apolipoprotein E analóg előállítására is. Met-leu-leu-leu-met apolipoprotein E analógot előállító plazmidra példa a pTVR 700-2 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 26. ábrában mutatjuk be; és egy metapolipoprotein analógot előállító plazmidra példa a pTVR 590-4 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 27. ábrában mutatjuk be. A pTVR 714 (valamint a pTVR 721—4) szintén termelnek apolipoprotein E analógot. Ezt a plazmídot a 12. példában mutatjuk be.
A jelen találmány gazdaszervezet-plazmid rendszereket is nyújt természetben előforduló eukarióta polipeptidek vagy polipeptid analógjaik előállítására; ez a rendszer különböző, jelen találmány szerinti plazmidokból áll megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben. Az Escherichia coli gazdaszervezet a fentebb leírt gazdaszervezetek bármelyike lehet.
A gazdaszervezet-plazmid rendszer Escherichia coli gazdaszervezetek bármelyike lehet.
A gazdaszervezet-plazmid rendszer Escherichia coli gazdaszervezete lehet F“ törzs is. Bár a gazdaszervezet lehet bármely olyan gazdaszervezet, amely a szakterületen jártasak számára ismert, a speciális F“ törzsek között, amelyet alkalmazhatunk, az alábbi F~ törzseket találjuk; F-MG1655; FAV3110; F’W2637; F’MM 294; F'1000; és FI 100.
A jelen találmány továbbá gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt szarvasmarha növekedési hormon egyik fentebb meghatározott polipeptid analógjának előállítására, amely a met-asp-gln szarvasmarha növekedési hormon analógot kódoló DNS-t tartalmazó plazmidból, vagyis a pFSAL-130-27 plazmidból áll megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben. A jelen szempont szerint előnyös gazdaszervezet a vad típusú Escherichia coli (ATCC 12435).
A találmány továbbá gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt met-asp-gln sertés növekedési hormon polipeptid analóg előállítására, amely rendszer met-asp-gln sertés növekedési hormont kódoló DNS-t tartalmazó valamely plazmidból, pl. pEFF-902, pEFF-9021 vagy pMFS 929 plazmidból áll megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A jelen találmány továbbá gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt apolipoprotein E fentebb meghatározott különböző polipeptid analógjai előállítására, ahol a rendszer apolipoprotein E-t kódoló DNS-t tartalmazó valamely plazmidból, pl. pTVR 700-2, pTVR 590—4 vagy pTVR 714 (valamint pTVR 721-4) plazmidból áll megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben. A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában az apolipoprotein E analóg met-apolipoprotein E analóg és a gazdaszervezet vad típusú Escherichia coli (ATCC 12435), ahol ez a gazdaszervezet-plazmid rendszer az ATCC-nél deponálva van ATCC 67360 deponálási számon.
A jelen találmány egy másik szempontja szerint a találmány eljárást nyújt természetben előforduló polipeptidek vagy analógjaik előállítására, amely abból áll, hogy a jelen találmány szerinti gazdaszervezet-plazmid rendszert növesztjük (ahol a plazmid valamely független plazmid) olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a polipeptid vagy analóg előállítását, és a keletkező polipeptidet vagy analógot kinyerjük.
A jelen találmány szerinti eljárást alkalmazva előállíthatjuk a szarvasmarha növekedési hormon met-asp-gln analógját, a sertés növekedési hormon met-asp-gln polipeptid analógját, a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz valamely fentebb meghatározott analógját, és az apolipoprotein E valamely fentebb meghatározott analógját olyan gazdaszervezet plazmid rendszert növesztve, amely a szarvasmarha növekedési hormon analógját, a sertés növekedési hormon analógját, a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógját, illetve az apolipoprotein E analógját kódoló DNS-t tartalmazza, valamint egy megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetet, ahol a növesztést olyan megfelelő körülmények között végezzük, amely lehetővé teszi az analógok előállítását, majd a keletkezett analógokat kinyerjük.
HU 213 418 Β
A jelen találmány egy másik kiviteli módjában a találmány kettős szálú DNS plazmidot nyújt, amely megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetbe bevezetve a gazdasejtet képessé teszi egy kívánt polipeptidet vagy polipeptid analógját kódoló DNS kifejezésének kivitelezésére, ahol a nevezett analóg azonos biológiai aktivitással bír, mint a természetben előforduló polipeptid és aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetben előforduló polipeptidével, de mégis különbözik attól, és ezáltal képessé teszi a polipeptid vagy polipeptid analóg előállításának kivitelezésére; a nevezett kettős szálú DNS 5'-*-3' irányban az alábbiakat foglalja magában:
a) DNS-t, amely 5'->3’ irányban foglalja magában a deo Pl és deo P2 promotorokat;
b) egy AT-ben gazdag transzláció-fokozó szekvenciát;
c) egy Ndel restrikciós enzimhelyet;
d) egy ATG iniciációs kodont; és
e) DNS-t, amely a polipeptidet vagy polipeptid analógot kódolja az ATG iniciációs kodonnal fázisban;
és amely magában foglal továbbá egy olyan DNS szekvenciát, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból eredő replikációs origót tartalmaz, valamint egy olyan DNS szekvenciát, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely jellemző kinyilvánul, amikor a plazmid jelen van a gazdaszervezetben.
A transzlációs fokozó többlet növeli a találmány szerinti plazmidok által termelt polipeptidek előállítási szintjét. Úgy találjuk, hogy ennek az AT-ben gazdag területnek a hozzáadása nagy mértékben fokozza a kívánt polipeptideket kódoló DNS kifejeződését (további részletekkel kapcsolatban lásd a 18. példát). Az egyik előnyös kiviteli módban úgy találjuk, hogy amikor Escherichia coli sejteket és az AT-ben gazdag területet tartalmazó plazmidokat a termelő közegben 30 °C hőmérsékleten növesztjük 37 °C helyett, a termelési szint még tovább növekszik.
Bár azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a plazmidok termelhetnek bármilyen kívánt, természetben előforduló polipeptidet vagy analógot, a jelen találmány szerinti plazmidok előnyösen humán réz/cink szuperoxid diszmutázt termelnek. Az egyik előnyös kiviteli módban a jelen találmány szerinti plazmidot pMF 5534nek nevezzük, és ezt Escherichia coli S093O(F“) törzsben az ATCC-nél deponáltuk ATCC 67703 számon.
A jelen találmány továbbá gazdaszervezet-plazmid rendszert nyújt egy természetben előforduló humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analóg előállítására, amely analóg két polipeptid alegység dimerjéből áll, amely alegységek mindegyikének azonos aminosavszekvenciája van, mint a természetben előforduló réz/cink szuperoxid diszmutáznak, de amino-terminálisukon nincsenek acetilezve; a rendszer a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz egyik analógját kódoló DNS-t tartalmazó plazmidból áll, pl. pMF 5534 plazmidból megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben.
A gazdaszervezet-plazmid rendszerhez megfelelő gazdaszervezetek lehetnek az Escherichia coli S0744,
S0732, vad típusú (ATGC 12435), S0928, S0929, MCI061, és S093O törzsek. A gazdaszervezet lehet valamely F~ törzs is.
A jelen találmány továbbá eljárást nyújt réz/cink szuperoxid diszmutáz valamely fentebb meghatározott polipeptid analógjának előállítására, amely eljárás a gazdaszervezet-plazmid rendszer növesztéséből áll megfelelő körülmények között, amelyek lehetővé teszik az analóg előállítását, és az így létrejött réz/cink szuperoxid diszmutáz analóg kinyeréséből.
Az egyik előnyös kiviteli módban az ilyen előnyös körülmények közt találjuk a gazdaszervezet-plazmid rendszer növesztését mintegy 30 °C hőmérsékleten.
Bár a jelen találmány szerinti plazmidokat és gazdaszervezet-plazmid rendszereket a deo Pl és deo P2 tandem promotorok vonatkozásában tárgyaljuk, azok, akik a szakterületen jártasak, tudják azon tény miatt, hogy a deo P2 promotor erősebb promotor, mint a jelen találmány szerinti promotor, hogy a jelen találmány olyan promotorokat is nyújt, ahol a promotor a deo P2 egyedül.
Pontosabban a jelen találmány olyan kettős szálú DNS plazmidot nyújt, amely megfelelő Escherichia coli gazdasejtbe bevezetve a gazdasejtet képessé teszi egy kívánt, természetben előforduló eukarióta polipeptid vagy ennek polipeptid analógja kifejezésének kivitelezésére, ahol a nevezett analóg azonos biológiai aktivitással bír, mint a természetben előforduló polipeptid, és aminosav szekvenciája lényegében azonos a természetben előforduló polipeptidével, de mégis különbözik attól, és ezáltal képessé teszi a polipeptid vagy polipeptid analóg előállításának kivitelezésére; a nevezett kettős szálú DNS 5'->3' irányban az alábbiakat foglalja magában:
a) DNS-t, amely a deo P2 promotort foglalja magában;
b) DNS-t, amely magában foglal egy riboszomális kötőhelyet abból a célból, hogy a polipeptidet vagy polipeptid analógot kódoló DNS-ből átírt mRNS-t képessé tegye riboszómákhoz kötődni a gazdasejten belül;
c) egy ATG iniciációs kodont;
d) a polipeptidet vagy polipeptid analógot kódoló DNS-t az ATG iniciációs kodonnal fázisban;
magában foglal továbbá egy DNS szekvenciát amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból eredő replikációs origót tartalmazza, és egy DNS szekvenciát, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely megmutatkozik, amikor a plazmid a gazdasejtben jelen van.
A jelen találmány továbbá olyan plazmidokat nyújt, mint amelyeket fentebb leírtunk, de amelyek tartalmaznak még egy AT-ben dús transzláció-fokozó szekvenciát.
Ezen kívül azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a deo Pl promotort egyedül is alkalmazhatjuk. Az ilyen plazmidra példa a pMF 5540 plazmid. A deo Pl promotorral bíró plazmidok tartalmazhatnak továbbá egy AT-ben gazdag transzláció-fokozó szekvenciát is.
PÉLDÁK
Az alább következő példákat azért mutatjuk be, hogy segítsünk a találmány megértésében, de nem az a szán19 dékunk, és egyáltalán nem úgy állítottuk össze ezeket, hogy a találmány oltalmi körét korlátozzuk. A példák nem foglalják magukban a vektorok megalkotásában, a polipeptideket kódoló gének ilyen vektorokba való beiktatásában, hogy plazmidokat képezzünk, vagy az így létrejövő plazmidok gazdaszervezetbe való bevezetésében alkalmazott hagyományos módszereket. A példák nem foglalják magukban azoknak a hagyományos eljárásoknak a részletes leírását sem, amelyeket az ilyen gazdaszervezet-plazmid rendszerek által termelt polipeptidek vizsgálatára alkalmazunk. Az ilyen eljárások jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak, és számtalan közleményben le vannak írva, pl. az alábbiban: Maniatis T., Fritsch E.F. és Sambrook J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982).
7. PÉLDA hSOD analógfehérjét kifejező deo P1-P2 vektor megalkotása
Abból a célból, hogy a deo P1-P2 operátor/promotor területet klónozzuk, először a deo operont kell izolálni és tisztítani.
AÁcI 857 DNS-t, amely a deo operont kódolja, izoláljuk Escherichia coli S01084-ből, amely magában foglal egy deo transzdukáló fágot lizogén állapotban [Buxton és munkatársai: J. Bacteriol. 136, 668-681 (1978)]. A DNS tisztításának eljárása lényegében az, amelyet Freifelder D. leírt az alábbi két közleményben: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 18,141-144 (1965); Biochem. Biophys. Acta 108, 318-319 (1965). LB tápközegen nőtt Escherichia coli tenyészet 2 literét hősokknak vetjük alá, 42 °C hőmérsékleten 30 percen át, majd 3 órára átvisszük 39 °C hőmérsékletre. A sejteket centrifugálással kinyeqük és újra szuszpendáljuk olyan pufferban, amely 1-5 mól/1 MgCl2-t és néhány csepp kloroformot tartalmaz, hogy lizáljuk a sejteket. A lizátumot egy CsCl lépcsőzetes gradiens tetejére tápláljuk és 2 órán át centrifugáljuk 25 000 fordulat/perccel SW25 rotorban. Egy opaleszkáló csíkot, amely CsCl legnagyobb sűrűségű párnájának tetején képződik, izolálunk és centrifugálunk nátrium-perkloráttal, hogy tiszta λ fág deo DNS-t kapjunk.
pJBF-S401 megalkotása - ez olyan vektor, amely tartalmazza a Pl és P2 deo promotorokat
A deo Pl és P2 operátor/promotor területek egy 980 bp-s Avall fragmentumon helyezkednek el [Valentin-Hansen és munkatársai: The EMBO Journal 7, 317 (1982)]. Ezt a fragmentumot a következőképpen izoláljuk és klónozzuk (lásd még az 1. ábrát is): deo DNS-t hasítunk Avall-vel és az 5' túlnyúló végeket betöltjük Klenow DNS polimerázzal. BamHI kapcsolókkal bíró Avall fragmentumok keverékét T4 ligázzal ligáljuk a BamHI-gyel hasított pBR322-höz. Escherichia coli S054O-sejteket (amelyekből hiányzik a deo operon) transzformálunk a ligáit plazmid-keverékkel, és ampicillint tartalmazó, LB agarra szélesztjük. A deo Pl-P2-t tartalmazó BamHI beiktatást magában foglaló kiónokat azonosítjuk 32P-vel jelzett szintetikus DNS fragmentumhoz való hibridizálással, ahol ez a fragmentum a deo promotor 138-167 nukleotidjainak felel meg.
A szintetikus fragmentum nukleotid szekvenciája az alábbi:
5'-TTGCCCCAGGTAGACCGGCATCGATGTGAC-3'
A számos klón közül, amely hibridizál a printerhez, egyet felveszünk és ezt alkalmazzuk a további emésztéshez. Az ebből a klónból izolált plazmid DNS-t BamHIgyel emésztjük és elektroforézíssel elemezzük agaróz gélen. A vektornak megfelelő fragmentumon kívül 900 bp-s és 1300 bp-s fragmentumokat figyelünk meg a gélen. Ezeket a fragmentumokat Southern hibridizációs elemzésnek vetjük alá egy jelzett vizsgáló mintával. A deo P1-P2 promotorokról kimutatjuk, hogy a 900 bp-s fragmentumon belül vannak.
Abból a célból, hogy tovább igazoljuk a deo P1-P2 jelenlétét, a 900 bp-s fragmentumot BglII-vel, BssHIIvel, EcoRI-gyel és Hpall-vel hasítjuk. Az ezekkel az enzimekkel a 900 bp-s fragmentum hasításakor kialakult fragmentumok méretei jó egyezésben vannak a deo P1-P2 szekvencia előre jósolt restrikciós mintájával. A 900 bp-s BamHI fragmentumot újból klónozzuk pBR322-ben amint ezt az 1. ábrán bemutatjuk, és a kapott új plazmidot, amely tartalmazza a deo P1-P2 promotorokat, pJBF-5401-nek nevezzük (ATCC 67359).
A pMF-5416 megalkotása — ez olyan vektor, amely tartalmazza a deo P1-P2-Í
A pJBF-5401 vektor nem tartalmaz hagyományos restrikciós helyeket a riboszomális kötőhely ShineDalgamo szekvenciája és az első ATC transzlációs iniciációs kodon között. Abból a célból, hogy a deo P1-P2 promotorokat valamely kifejező vektorban alkalmazzuk, szükséges tehát egy restrikciós helyet kialakítani, és mégis fenntartani az azonos távolságot a riboszomális kötőhely és az első ATG kodon között. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy egy Ndel restrikciós helyet alakítunk ki, amely a CATATG szekvenciából áll, amely CA/TATG formában hasad. A klónozandó génnek rendelkeznie kell a gén 5' végénél egy Ndel hellyel, hogy beiktathassuk a plazmid Ndel helyébe; az Ndel hely ATG-je az iniciációs kodon.
Az új Ndel helyet a deo P1-P2 vektorokban hely-specifikus mutagenezissel alakítjuk ki [Morinaga Y. és munkatársai: Biotechnology, 2, 636-639 (1984)], BTG 2015 szintetikus DNS fragmentumot alkalmazva, amint ezt a 2. ábrában leírjuk. Az ebből a munkamenetből kapott négy lehetséges plazmidot a 2. ábrában mutatjuk be.
Az A plazmidot tartalmazó baktériumok eltűnnek, mivel ezek ampicillin-érzékenyek. A B plazmidot tartalmazó baktériumok eltűnnek, mivel ezek nem hibridizálnak a hézag (nick)- transzlatált, radioaktívan jelzett BssHII-SalHI fragmentumhoz. A C plazmidot és D plazmidot tartalmazó baktériumok a 2015. szintetikus DNS fragmentumhoz való hibridizálással differenciálódnak növekvő szigorúságú feltételek között, követ20 kezesképpen a szintetikus DNS fragmentumban bevezetett új Ndel hely jelenléte révén. A D plaz. mid, amelyet pMF 5416-nak nevezünk, tartalmazza a deo P1-P2 promotorokat az új Ndel restrikciós helyhez proximálisan. A deo P1-P2 promotor 450 bp-jének szekvenciaelemzése azonban (Sanger didezoxi-módszerével) feltárja, hogy egy 48 bp-s szekvencia, amely a 702-749 bp között terjedne ki, nincs jelen. Ez a szekvencia, amely normális körülmények között jelen van a deo P2 promotor területben és az átíráshoz fontos, nyilvánvalóan kiiktatódik a helyre irányuló mutagenezis során.
A pMF-5531 megalkotása —ez olyan plazmid, amely alacsony szinten termel egy hSOD analógot
A humán réz/cink szuperoxid diszmutáz (hSOD) kódoló szekvenciát ekkor olyan vektorba iktatjuk be, amely deo P1-P2 promotort tartalmaz, következésképpen a P2-ben való kiiktatódás helyreáll.
A pSODal3 plazmid (amelyet a 30. ábrában mutatunk be, és úgy alkotunk meg, amint ezt az ábrák magyarázatánál leírjuk) tartalmazza a hSOD-t kódoló gént egy Nde restrikciós helytől lefelé. így lehetséges egy új plazmidot megalkotni, amely tartalmazza a hSOD gént a deo P1-P2 promotortól lefelé (a 48 bp-s kiiktatással). Ezt az új plazmidot pMF-5516-nak nevezzük (lásd
3. ábra magyarázata).
Abból a célból, hogy kifejeződést équnk el, a deo P2-ben levő kiiktatást most helyreállítjuk, amint ezt a
4. ábrában bemutatjuk és az ábrák magyarázatánál leírjuk. Ez olyan plazmidot alakít ki, amely 5'—>3’ szekvencia irányban tartalmazza a teljes deo P1-P2 promotor szekvenciát (beleértve az autentikus riboszomális kötőhelyet), az Ndel restrikciós helyet, és a hSOD gént.
Ezt a plazmidot Escherichiacoli S0744-be transzformáljuk; ez olyan mutáns, amelyből hiányoznak a cyt R és deo R represszorok [Hammer-Jesperson K. és Nygaard P. Molec. Gén. Génét. 148, 49-55 (1976)]. A transzformációt követően mintegy 120 kiónt vizsgálunk át hSOD analóg kifejeződésére az LB tápközegen nőtt tenyészetek poliakrilamid gélen végzett elektroforézisével. Több klón alakít ki nagyon gyenge fehérje csíkot, amely együtt vándorol az autentikus tisztított hSOD-vel. Az egyik kiónt kiemeljük és plazmid DNS-t tisztítunk belőle sűrűség-gradiens centrifugálással. A plazmidot pMF-5531-nek nevezzük. A pMF-5531 plazmidot transzformálással bevezetjük Escherichia coli S054O-be és S0732-sejtekbe. Tenyészeteket növesztünk LB tápközegben (13a. példa), amely 0,2% glicerint tartalmaz, egy éjszakán át, és 1 OD660 egységgel egyenértékű sejttömeget feldolgozunk (amint a 15. példában leírjuk) az SDS gélre való felvitel előtt. Ezek a gélek azt jelzik, hogy egy alacsony szintű SÓD analóg, amely az összes Escherichia coli fehérje 1,5%-ával egyenértékű, termelődik az Escherichia coli S054O gazdaszervezetben. Valamivel magasabb szinten termelődik a hSOD az S0732-ben. Az S054O-ben termelthSOD analóg reagál a l25I-vel jelzett anti-humán szuperoxid diszmutáz antitesttel. Abból a célból, hogy eltüntessük annak lehetőségét, hogy az alacsony szintű kifejeződés a várttól eltérő szekvencia variációval társul, egy BglII-StuI fragmentumot, amely magában foglalja a restrikció és ligálás találkozási helyét, szekvenciaelemzésnek vetjük alá, és korrektnek találjuk. Ez azt igazolja, hogy a pMF-5531 plazmid tartalmazza a teljes deo P1-P2 promotor területet.
Egy ezt követő kísérletben a fentebb leírt (és a 2. és 3. ábrákban bemutatott) pJB5401 plazmid hely-specifikus mutagenezisét ismételjük meg, és így állítjuk elő a pMF 5416-2 plazmidot (lásd a 47. ábrát). Erről a plazmidról kimutatjuk, hogy tartalmazza a teljes deo P1-P2 szekvenciát kiiktatás nélkül.
Ebből a plazmidból készítjük el a pMF-5513-1 plazmidot, amint ezt a 47. ábrában bemutatjuk. A pMF5513-1 plazmid tartalmazza a hSOD analóg kódoló szekvenciát a deo P1-P2 promotor szekvencia szabályozása alatt, és amennyire megállapítható, ez a plazmid azonos a pMF-5531 plazmiddal (4. ábra).
Az ezekkel a plazmidokkal és azokkal a plazmidokkal, amelyeket a következő fejezetekben leírunk, termelt fehérje a természetes humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógja. Ez az analóg nincs acetilezve és nincs glikozilezve.
A deo riboszomális kötőhely módosítása a pMF-5519 előállítására - ez olyan plazmid, amely jól termel egy hSOD analógot
A pMF-5531 plazmid a hSOD gén alacsony szintű kifejeződését mutatja. Ez lehet a távolság függvénye a riboszomális kötőhely és az üzenet első ATG kodonja között, mivel a változásokról ebben a távolságban ismert, hogy hatással vannak a transzlációra. A távolság a pMF5531-ben a riboszomális kötőhely vége és az első ATG hely között 4 nukleotid. Ezt a távolságot 6 nukleotidra terjesztjük ki olyan módon, hogy a pMF-5531-et elhasítjuk Ndel-gyel, betöltjük T4 polimerázzal és újra Egáljuk, így alkotva új plazmidot két többlet-bázispárral.
Ezt a plazmidot alkalmazzuk Escherichia coli S0744-sejtek (cyt R- deo R-) transzformálására, és számos kiónt elemzünk Ndel-gyel végzett restrikciós endonukleázos hasítással, hogy igazoljuk az Ndel hely eltűnését a betöltő polimerázos reakcióval. Azokat a kiónokat, amelyek Ndel helyet nélkülöző plazmidokat tartalmaznak, növesztjük, és a sejt-lizátumokat SDS poliakrilamid gélen elemezzük. Számos lizátum mutat fel olyan fehérje csíkot, amely együtt vándorol egy hSOD marker fehérjével. Ennek a csíknak az intenzitása sokszorosan nagyobbnak tűnik, mint a pMF-5531-ben található csíké. Azt a plazmidot, amely a legerősebb kifejezőnek látszik, és amelyet pMF-5519-nek neveztünk el, tisztítjuk és bevezetjük különböző Escherichia coli gazdaszervezetekbe abból a célból, hogy a kifejeződéshez meghatározzuk a legkedvezőbb gazdaszervezetet. Ezek között az Escherichia coli gazdaszervezetek között találjuk a vad típusú törzset (ATCC 12435) és az S0928 (Δ deo), S(6929 (Adeo, cyt R ) és S0744 (deo R, cyt R-) törzseket. Ez utóbbi gazdaszervezet képes a legmagasabb szintű kifejeződésre. Ezt követően a pMF-5519 plazmidot Escherichia coli S054O-be transzformáljuk, és a fehérje profilok denzitometriás elemzése feltárja, hogy ez több, mint kétszer annyi hSOD analógot termel, mint a pMF 5531 az S054O-ben (azaz a teljes fehérje 3,5%-át). A pMF-5519-et azután S0732-be transzformáljuk és az SÓD analóg magasabb szintjét termeljük, mint az S054O-ben, nevezetesen a teljes fehérje 5,6%-át.
(Az egyes alkalmazott Escherichia coli törzsek genotípusát, és a forrásokra való utalásokat az I. és la. táblázatokban részletezzük a 3. példában).
Ezeknek a kísérleteknek az eredményei feltárják, hogy a kifejeződés a 300 és 900 mg hSOD/50 OD egység baktériumtenyészet tartományban mozog. Ezt az értékelést a baktérium mintáknak 1 pg tiszta standard SOD-vel való együttes elektroforézise és festése alapján végezzük, amelyet denzitométeres leolvasás követ. (Az egyes törzsek által termelt enzimszinteket a 3. példában levő
I. táblázatban részletezzük). Az új szekvenciát a betöltött Ndel hely területében szekvenciaelemzéssel igazoljuk.
A deo P1-P2 riboszomális kötőhely további kiterjesztései
Mivel a riboszomális kötőhely kiterjesztése két bázispárral (a pMF-5519 plazmidban) hSOD analóg fehéije jobb kifejezőjét alakítja ki, a deo P1-P2 riboszomális kötőhely négy kiterjesztésének további sorozatát alkotjuk meg abból a célból, hogy megkíséreljük tovább növelni a termelést. Hogy ezt a célt elérjük, nyolc egy szálú szintetikus DNS szekvenciát szintetizálunk, amint ezt a 6. ábra magyarázatánál leírjuk. A komplementer szálakat összekeverjük, hogy 100 pmól/ml végső koncentrációt érjünk el, és hagyjuk összeforradni 26 órán át 7 °C hőmérsékleten, hogy 4 szintetikus kettős szálú DNS kapcsolót alakítsunk ki, amelyet I„ IE, IH. és IV. kapcsolóknak nevezünk. Az egyes kettős szálú DNS kapcsolókat ligáljuk, amint ezt a 6. ábrában bemutatjuk, a deo P1-P2 operátor/promotor területből származó 540 bp-s fragmentumhoz. Ezt a fragmentumot előzőleg úgy állítjuk elő, hogy a pMF-5519 plazmidot Stul-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, az így létrejövő 1000 bp-s deo P1-P2 fragmentumot tisztítjuk alacsony olvadáspontú agarózról, és a tisztított fragmentumot BglII-vel és Hinfl-gyel inkubáljuk, hogy egy 540 bp-s BglII-HinfI fragmentumot alakítsunk ki; ezt az 540 bp-s fragmentumot agaróz gélről izoláljuk és tisztítjuk. Az így létrejövő fragmentumot pMF-553- be ligáljuk, amint ezt a 6. ábrában bemutatjuk, így növelve a távolságot a deo P1-P2 szekvencia és az első ATG kodon között. (A pMF-5531 plazmid hordozza a változatban Pl-P2 riboszomális kötőhely szekvenciát, és a hSOD fehérje alacsony szintű termelője). Az egyes esetekben kialakított plazmidokat S032 (cyt R deo R“) transzformálására használjuk. A kiónokat hSOD kifejezésére vizsgáljuk ampicillint is tartalmazó LB tápközegben növesztve, majd lizálva és SDS akrilamid gélen elektroforézisnek vetve alá. Azokat a kiónokat, amelyekről úgy tűnik, hogy a hSOD-t legalább olyan magas szinten fejezik ki S0732-ben, mint a pMF-5531, kiemeljük, a plazmidokat tisztítjuk, és a riboszomális kötőhelyeket tartalmazó fragmentumot elemezzük didezoxi-szekvenciaelemzéssel.
Jelenleg a riboszomális kötőhely kiterjesztései közül kettőt tartalmazó plazmidok szekvenciája van igazolva.
Ezek az I. és IV. kapcsolóknak, vagyis 7-8 bp kiterjesztésnek, illetve 9-10 bp kiterjesztésnek felelnek meg; ezeket a plazmidokat pMF 558-26-nak, illetve pMF-5536-nak nevezzük. Úgy találjuk, hogy ezek olyan alacsony szinten fejezik ki a hSOD analóg fehérjét, amely a pMF-5531 által kifejezett szintekhez hasonló.
A pMF-5520 megalkotása - ez a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz (hSOD) gén magas szintű kifejezője
A laboratóriumunkban végzett korábbi megfigyelések azt jelzik, hogy a PL promotor rendszer által elősegített humán réz/cink szuperoxid diszmutáz (hSOD) kifejezést javítani lehet azzal, hogy a plazmidban az ampicillin rezisztencia gént helyettesítjük a tetraciklin rezisztencia génnel. Ezt a megközelítést azért alkalmazzuk, hogy tovább növeljük a deo promotorok által elősegített hSOD kifejeződését. Az ampicillin rezisztencia gént a pMF-5519-ben úgy helyettesítjük a tetraciklin rezisztencia génnel, amint ezt a 7. ábrában bemutatjuk. Az így előállított plazmidot S0 540-be (amelyből hiányzik a deo operon) transzformáljuk és tetraciklint is tartalmazó LB agarra szélesztjük. A tetraciklin- és ampicillinrezisztens kiónok SDS gél elektroforézise az SÓD kifejeződés megnövekedett szintjét tálja fel a tetraciklin-rezisztens plazmidból. Ezt az új plazmidot, amely a tetraciklin gént tartalmazza és egy hSOD analógot fejez ki a deo promotor gén szabályozása alatt, pMF-5520nak nevezzük.
A tetraciklin-rezisztencia gén orientációját az alábbi eljárással igazoljuk. A DNS-t, amelyet a Bimbaum H.C. és Doly J. által leírt [Nucl. Acid Rés. 7, 1513 (1979)] módon készítünk el BamHI-gyel emésztjük és elektroforézisnek vetjük alá; így három fragmentumot tárunk fel mintegy azonos, 1400-1500 bp méretben. Ez a tetraciklin rezisztencia gén óramutató járásának megfelelő orientációját igazolja. (Ha a tetraciklin rezisztenia gén az óramutató járásával ellenkező irányban lenne, kisebb, mintegy 700 bp-s BamHI fragmentum lenne várható; ilyen fragmentum azonban nem termelődik). A pMF-5520 plazmidot tisztítjuk és különböző Escherichia coli gazdasejtekbe vezetjük be, hogy meghatározzuk a legkedvezőbb gazdaszervezetet a kifejeződéshez. A pMF-5520 plazmid hSOD kifejezési szintjeit sokféle gazdaszervezetben a 3. példában írjuk le.
A pMF-2005 megalkotása - ez hSOD gént kifejező nagy kópiaszámú plazmid
Abból a célból, hogy még tovább javítsuk a hSOD gén kifejeződését a deo P1-P2 operátor/promotor szabályozása alatt, elhatároztuk, hogy egy nagy kópiaszámú plazmidot, apOPlA6-ot (amely mintegy 700 bp hosszú) alkalmazunk. A plazmid a pBGP120 egyik kópiaszámmutánsa, ahol apBG120 a Col. El-ből származik, amint ezt Gelfand D.H. és munkatársai [PNAS 75, 5869-5873 (1978)] ShepardM.H. és munkatársai [Cell, 18,267-275 (1979)], valamint Muesing M. és munkatársai [Cell, 24, 235-242 (1981)] leírják. Ez a mutáns plazmid a teljes intracelluláris DNS-nek mintegy 30%-át alkothatja. A pOPlA6-ot először úgy kezeljük, ahogyan a 8. ábrában
HU 213 418 Β leírjuk, hogy az ampicillin rezisztencia gént tetraciklinrezisztencia génnel helyettesítsük, és az új tetraciklinrezisztens nagy kópiaszámú plazmidot pMF2001-nek nevezzük. A deo P1-P2 operátor/promotor területet és a hSOD gént ebbe a plazmidba iktatjuk, amint ezt a 9. ábrában bemutatjuk. Az így létrejövő plazmidot (amely mintegy 6400 bp hosszúságú) először transzformálással az S054O-be bevezetjük, majd LB + Tét agaron szélesztjük. A nagy kópiaszámú mutánst és a beiktatott fragmentumot hézag(nick)-transzlatált, 32P-vel jelzett pMF-5519-ből izolált BamHI fragmentumhoz való hibridizálással izoláljuk. Egy CsCl sűrűség-gradiens centrifugálással tisztított plazmidot, amelyet pMF 2005-nek nevezünk, egy sor különböző Escherichia coli sejtbe vezetjük be, pl. vad típusú törzsbe, S0732-be, S054Obe, S093O-ba, S0928-ba (a genotípusokkal kapcsolatban lásd az I. táblázatot), és kimutatjuk, hogy ezek nagyon magas szinten irányítják a hSOD fehérje kifejeződését a deo P1-P2 operátor/promotor szabályozása alatt. A kifejezett hSOD fehérje csíkok intenzitásai ezekben a gazdaszervezetekben egészen hasonlók, jelezve, hogy a represszor funkció a gazdaszervezetekben, amelyek aktív deo R és cyt R represszorokat foglalnak magukban, már nem hatékonyak a kifejeződés korlátozásában; a denzitometriás elemzés feltárja, hogy a termelt hSOD analóg a teljes sejtfehérje mintegy 35%-át képviseli. A pMF-2005 plazmidot Escherichia coli S0732ben deponáltuk ATCC 67362 számon.
A fi-laktamáz riboszomális kötőhellyel rendelkező deo P1-P2 vektor megalkotása
A pMF-5531 deo kifejező vektort tetraciklin-rezisztenssé tesszük, amint ezt a 17. ábrán bemutatjuk, így alakítva ki a pMFS-5533A-t. (Amint fentebb tárgyaltuk, ez növeli a hSOD-nak deo promotorok által elősegített kifejeződését). A pSODpMAX- 12-böl (amelyet ATCC 67177 számon deponáltunk) származó szintetikus β-laktamáz riboszomális kötőhelyet beiktatjuk a pMFS-5533A-ba, amint ezt a 18. ábrán bemutatjuk. (A ρ80ϋβΜΑΧ-12 plazmid előállítását a 13-16. ábrákban mutatjuk be). Az így létrejött plazmid, amelyet pMFS-5538-nak nevezünk, 5’—>3’ sorrendben tartalmazza a deo P1-P2 operátor/promotor területet, az autentikus deo RBS-t, a szintetikus β-laktamáz riboszomális kötőhelyet és a hSOD gént. A pMFS-5538 plazmidot az Escherichia coli S0732 gazdaszervezetbe vezetjük be, és ez a hSOD analóg fehérje mérsékelten jó kifejezőjének bizonyul (lásd a 3. példában az I. táblázatot).
2. PÉLDA
Optimális növekedési körülmények a hSOD analóg fehérje kifejeződéséhez
Bizonyos bakteriális géntermékek kifejeződése deo P2 által elősegített átírás esetén nagyon alacsony glükóz jelenlétében. Ezt bemutatták mind a deo operon nukleotid katabolizáló enzimjeinek bakteriális géntermékeinél [Hammer-Jesperson K. és Munch-Peterson A.: Mól. Gén. Génét. 137, 327-335 (1975)], mind az Escherichia coli galaktokináz gén-terméknél [ValentinHansen P. és munkatársai: EMBO 1,317-322 (1982)].
Kísérleteket végzünk, hogy összehasonlítsuk a szukcinát vagy glicerin, mint szénforrás alkalmazásának hatását a deo P1-P2 által elősegített humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analóg fehérje termelésére. Az Escherichia coli gazdaszervezetek különböző törzseit (vad típus, S0744, S093O, S0928, S054O) alkalmazzuk (az Escherichia coli fenotípusokkal kapcsolatban lásd a 3. példában az I. táblázatot). Ezeket a törzseket akkor is megvizsgáljuk mind, amikor a pMF-5519 és pMF-5520 plazmidokat foglalják magukban. A vad típusú Escherichia colit és az S093O-at akkor is megvizsgáljuk, amikor pMF-2005 plazmidot foglalnak magukban. Az összes megvizsgált Escherichia coli törzset olyan LB tápközegben növesztjük, amely 150 ppm Cu2+-t, 10 ppm Zn2+-t és szénforrásként vagy 0,3% glicerint, vagy 0,2% szukcinátot tartalmaz (az alkalmazott technikákkal kapcsolatban lásd a 15. példát).
Úgy találjuk, hogy amikor szénforrásként glicerint alkalmazunk, a tápközeg végső pH-ja 5,8-6,0; amikor szénforrásként szukcinátot alkalmazunk, a tápközeg végső pH-ja 8,8-9,0. A hSOD analóg kifejeződése, amint gélelektroforézissel mérjük, sokkal magasabb, amikor glicerint alkalmazunk; így tehát a következő kísérletekben szénforrásként glicerint alkalmazunk.
Az egyik példában a prototróf, pMF 5520 plazmidot magában foglaló Escherichia coli S0372 törzs jól nő 75 ppm Cu2+-t, 5 ppm Zn2+-t és 0,3% glicerint tartalmazó tápközegen. Az eredményeket a 3. példában levő I. táblázatban mutatjuk be.
Az összes olyan kísérletben, ahol minimál tápközeg alkalmazását jelezzük, az alábbi tápközeget állítjuk össze:
liter minimál tápközeg tartalmazza az alábbiakat: K2HPO4-8g KH2PO4-2g NH4C1 - 3 g Na-citrát - 2 g MgSO4.7H2O - 400 mg Fe-citrát - 40 mg 1,0 ml nyomelemoldat.
A nyomelemoldat az alábbiakat tartalmazza: MnSO4.H2O - 1 g ZnSO4.7H2O - 2,78 g CoCl2.6H2O - 2 g Na2MoO4.2H2O - 2 g CaCl2.2H2O - 3 g CuSO4.5H2O - 1,85 g H3BO3-0,5 g Koncentrált HC1 - 100 ml Ionmentesített víz - 900 ml.
A levegő hatását a hSOD analóg fehérje termelésére a pMF-5520 plazmidot magában foglaló különböző Escherichia coli törzsek (S0744, S0928 és S054O) révén szintén vizsgáljuk. A hSOD analóg fehérje kifejeződése, amint ezt gélelektroforézissel méljük, világosan nagyobb, amikor az alacsony fokú levegőztetést alkalmazzuk. Ezeket a laboratóriumi eredményeket felnagyítjuk (a pMF-5520-at magában foglaló Escherichia coli 50744 esetében) 2 literes fermentorra (1 liter folyékony tápközeg). A hSOD kifejeződés itt is nagyobb kis leve23 gőztetés feltételei között, így ezeket alkalmazzuk az összes ezutáni kísérletben.
A konstitutív kifejező rendszer kinetikája
Mivel a deo promotorok által elősegített kifejeződés 5 konstitutív, amikor a sejteket valamely nem-glükóz szénforráson növesztjük (amint fentebb leírtuk), érdekes meghatározni, vajon a kifejeződési szint állandó-e a tenyészet növekedésének minden adott időpontjában. Ebből a célból pMF-5520-at tartalmazó S0732-t glice- 10 rint tartalmazó minimál só közegbe oltjuk 0,05 OD660 értékig és 37 °C hőmérsékleten növesztjük. Időközönként egy OD660 ekvivalens mintáit kivesszük és SDS gélelektroforézisre terheljük. Az SÓD fehérje csík intenzitása növekszik, amikor a tenyészet eléri a késői loga- 15 ritmikus növekedési fázist és tovább erősödik a tenyészet korosodásával (16-24 óra tenyésztés). A denzitometriás elemzések feltárják, hogy a hSOD az összes sejtfehéqe mintegy 3-5%-át képviseli a lóg fázisban és a késői lóg és stacionárius fázis során a teljes 20 sejtfehéqe akár 15% -áig is összegyűlhet.
A deo promotor által elősegített kifejeződés jellemző vonása a kapcsolat a hSOD kifejeződés és a tenyészet kora között. Amint fentebb leírtuk, a logaritmikus növekedési fázis során a hSOD fehéije csíkok relatív inten- 25 zitása egészen alacsony. Határozott növekedés történik a hSOD kifejeződési szintben a korai stacionárius fázis és a késői stacionárius fázis közti tartományban, és ez a kifejeződés 16-24 órával a sejtek oltása után éri el a tetőfokát. A megfigyelt növekedést a stacionárius fázis- 30 bán a plazmid kópiaszáma növekedésének tulaj doníthatjuk a sejtben, vagy a géneket kódoló plazmid transzkripció-transzlációja növekedésének, amely a nyugvó sejtek kromoszómáiból való csökkentett transzkripció-transzláció következménye. A hSOD kifejeződés függőségét 35 a tenyészet korától nem figyeljük meg akkor, amikor a gazdaszervezet a nagy kópiaszámú pMF-2005 plazmidot tartalmazza; ebben az esetben a hSOD kifejezési szint hasonló a lóg fázisú növekedésben és a stacioriárius fázisban. Ez nem meglepő, ha meggondol- 40 juk, hogy egyetlen sejt mintegy 400 plazmidot tartalmaz [Shepard és munkatársai: Cell, 18,267-275 (1979)].
Az itt megadott adatok világosan megmutatják, hogy lehetséges magas szintű konstitutív kifejeződést elérni a deo promotorokkal. A konstitutív kifejeződésnek deo 45 promotorokkal számos előnye van összehasonlítva egy indukálható kifejező rendszenei szemben. Ez csökkenti az igényt a külső manipulációkra, pl. hőmérsékletelcsúsztatásra vagy tápközeg-kiegészítésre és jobb oxigénátvitelt tesz lehetővé az alacsonyabb tenyésztési hőmérséklet miatt. Ezenkívül a rendszer megkönnyíti a növesztést és a klónozott gének kifejezését folyamatos tenyészetben. További gazdaszervezet-vektor rendszereket írunk le a 19. példában, amelyek konstitutíven fejeznek ki hSOD analógot.
Bár nem kívánunk kötődni egyetlen elmélethez sem, lehetséges, hogy a hSOD analógot termelő deo konstitutív rendszer azért sikeres, mert a humán szuperoxid diszmutáz oldható fehérje. Amikor oldhatatlan fehérjét, pl. növekedési hormont állítunk elő deo P1-P2 promotorok szabályozása alatt, előnyösebb először a kívánt biomasszát glükózon való növekedéssel elérni, majd ez után átkapcsolni nem-glükóz szénforrásra a kémiai indukcióhoz (lásd a 16. és 17. példát).
3. PÉLDA
A termelt hSOD analóg fehérje enzimes aktivitása
Három, hSOD analóg fehérjét kifejező deo P1-P2 vektort (pMF-5519, pMF-5520 és pMF-2005) vezetünk be különböző Escherichia coli gazdaszervezetekbe, és mérjük a hSOD analóg enzimes aktivitását a ferricitokróm C redukciója gátlásának megfigyelésével, amint ezt McCord és Fridovich leírták [J. Bioi, Chem. 244, 6049-6055 ( 1969)].
Az eredményeket az I. táblázatban mutatjuk be. Ezek a kísérletek azt jelzik, hogy a pMF-5520 tetraciklin-rezisztens plazmid a hSOD analóg enzimet valamivel magasabb szinten termeli, mint az ampicillin-rezisztens pMF-5519 plazmid. Az I. táblázat azt is világosan demonstrálja, hogy a nagy kópiaszámú, deo Pl-P2-t tartalmazó pMF-2005 plazmid mintegy kétszer annyi hSOD analóg enzimet termel, mint a többi deo P1-P2 vektorok.
Amint az 1. táblázatból világosan megmutatkozik, a hSOD analógot deo P1-P2 promotor szabályozása alatt termelő plazmidok azonos mértékben vagy jobban termelnek, mint a pSODPjTl 1, vagyis egy olyan plazmid, amely a hSOD-t XPL promotor szabályozása alatt termeli. A pSODpiTll-et az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) deponáltuk ATCC 53468 számon a Budapesti Szerződés szabályai szerint. Ennek a plazmidnak a restrikciós térképét a 13. ábrában mutatjuk be.
I. TÁBLÁZAT
SÓD aktivitás a nyers sejtkivonatban
Törzs* A befogadott plazmid A hSOD%-a az összes fehérjében A hSOD-ban való növekedés szorzószáma hSOD fajlagos aktivitása A hSOD fajlagos aktivitásban való növekedés szorzószáma
S054O pMF5519 3,5 204
S054O pMF5520 6,5 1,85 281 1,37
S093O pMF5519 5,4 254
S093O pMF5520 13,0 2,4 381 1,50
Törzs* A befogadott plazmid A hSOD%-a az összes fehérjében A hSOD-ban való növekedés szorzószáma hSOD fajlagos aktivitása A hSOD fajlagos aktivitásban való növekedés szorzószáma
S0732 pMF5519 5,6 201
S0732 pMF5520 14,0 2,5 397 1,97
S0732 pMF5538 110
ATCC 12435 pMF5519 6,2 140
ATCC 12435 pMF5520 6,3 1,05 194 1,38
ATCC 12435 pMF2005 35 5,6 700 5,0
S0928 pMF5520 263
S0929 pMF5520 282
S0744 pMF5520 397
A 4255 ρδΟϋβ,Τ,, 113-188
* Megjegyzés: Az egyes baktériumtörzsek genotípusával és forrásával kapcsolatban lásd az 1 A. táblázatot.
IA. TABLAZAT Escherichia coli gazdatörzsek1 * S054O-thi, leu,Adeol 1, rspL, (cl 857 Sam7: :deo).
** S0928-thi, tón, upp, upd, lac, Adeol 1.
** S0929-thi, tón, upp, upd, lac, cyt R-15, Adeol 1.
** S093O-thi, tón, upp, upd, lac, Adeo R-7, clmA.
*** S0732-deo R-l, cyt R-4, strA.
**** S0744-met, ile, cyt R, deo R.
ATCC 12435 - vad típusú.
A 4255 - biotin-fuggő vad típusú.
* Az Escherichia coli S054O törzset Buxton R.S., Hammer-Jesperson K. és Hansen T.D. írják le [J. Bacteriol. 136, 668-681 (1978)].
** Az Escherichia coli S0928, S0929 és S093O törzseket Valentin-Hansen és munkatársai írják le [Molec. Gén. Génét. 159, 191-202 ( 1978)].
*** Az Escherichia coli S0732 törzset HammerJesperson K. és Munch-Peterson A. írják le [Molec. Gén. Génét. 137, 327-355 (1975)]; ez prototróf törzs.
**** Az Escherichia coli S0744 törzset Hammer-Jesperson K. és Hygaard P. íqák le [Molec. Gén., Génét. 148,49-55 (1976)].
Megjegyezzük, hogy az alkalmazott F~ törzseket a
21. példában írjuk le.
4. PÉLDA
MnSOD-GPXfúziós fehérjét kifejező deo P1-P2 vektor megalkotása
A pE4GPX plazmidot (lásd a 10. ábrát) úgy alkotjuk meg, amint ezt a 28. ábrában bemutatjuk és az ezzel a bejelentéssel együtt 085,647 sorozatszámon benyújtott és ezzel összefüggő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírjuk. A pE4GPX plazmidot a pMSE4 plazmidból (ATCC 53250; letétbe helyezve: 1985. szeptember 25-én) amely tartalmazza a humán MnSOD-t kódoló teljes cDNS szekvenciát, és a 35 pl8 UL-1 plazmidból (ATCC 67361; letétbe helyezve: 1987. március 20-án), amely tartalmazza a glutation peroxidázt (hGPX) kódoló teljes cDNS szekvenciát, alkotjuk meg. A pE4GPX fúziós plazmid, amely tartalmazza a hGPX teljes kódoló szekvenciáját a megcsonkí40 tott hMnSOD gén 3' végéhez ligáivá. Ez fúziós fehérjét fejez ki a XPl és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A termelt fúziós fehéije mintegy 190 aminosav hosszúságú; az N-terminális szekvencia a hMnSOD első 152 aminosava. A 190 aminosavas teljes hosszúság talán 45 azt jelzi, hogy a transzláció befejezése a hGPX kódoló szekvencián belül történik.
Amint a 10. ábrában bemutatjuk, kPL promotor-operátor el van távolítva a pE4GPX plazmidból, és a deo P1-P2 szekvenciát tartalmazó pMF-5531-ből származó 50 1,3 kb-s fragmentum van beiktatva ennek helyébe. Ez az új plazmid, a pDGE4-3 5'—>3' irányban tartalmazza a deo Pl-P2-t, a cll RBS-t és az MnSOD-GPX szekvenciákat. Ezt a plazmidot Escherichia coli MCI061-be [Casadaban M. és Cohen S.N.. J. Mól. Bioi. 138, 55 179-207 (1988)] transzformáljuk és az így létrejövő kiónokat megvizsgáljuk MnSOD-GPX fúziós fehéije termelésére. A sejteket LB tápközeg + ampicillinen növesztjük; az LB tápközeget a 13. példában írjuk le.
Azok a sejtek, amelyek tartalmazzák a pDGE4-3 60 plazmidot, nagy mennyiségben fejeznek ki egy hMnSOD-h GPX fúziós fehérjét, amely együtt vándorol azzal a (mintegy 190 aminosav hosszúságú) fúziós fehér] ével, amely a pE4GPX plazmidban termelődik a XPL promotor és a cll RBS szabályozása alatt. Az antiMnSOD-t alkalmazó Westem-folt elemzés azt mutatja, hogy egy teljes méretű fúziós fehérje kis mennyisége termelődik, sejtetve a TGA „stop” kodon átolvasását a hGPX kódoló szekvencián belül.
így a deo P1-P2 operátor/promotor terület a cll riboszomális kötőhellyel együtt irányíthatja egy fúziós MnSOD-GPX fehérje nagy mennyiségének a szintézisét.
A pDGE4—3 plazmidot szintén átvisszük Escherichia coli S0732 (cyt R“, deo R ) törzsbe, és a kifejeződés nagyon hasonló szintjeit kapjuk.
5. PÉLDA
Humán növekedési hormon (hGH) fehérjét kifejező deo P1—P2 vektor megalkotása
A pTVR 568-4 plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt a 11. ábrában bemutatjuk, eltávolítva a teljes hMnSOD kódoló szekvenciát és a hGPX kódoló szekvencia egy részét a pDGE4-3 plazmidból és ezeket a pTV 104(2) plazmidból (ATCC 39384; letétbe helyezve: 1983. június 29-én) származó, humán növekedési hormont (hGH) kódoló szekvenciával helyettesítjük. Ez az új plazmid, a pTVR 568—4,5'—>3' irányban tartalmazza a deo Pl-P2-t, a cll RBS-t és a teljes hGH szekvenciát. Ezt Escherichia coli MCI061-be transzformáljuk és a hGH analógot kifejező telepeket kiválasztjuk poliklonális anti-hGH antitestek hibridizálásával lizált és szűrőn immobilizált telepekhez. Egy éjszakán át ampicillint is tartalmazó LB tápközegen végzett növesztés után a tenyészeteket lizáljuk és elektroforézisnek vetjük alá SDS poliakrilamid gélen.
Úgy találjuk, hogy a pTVR 568-4 a hGH termelését olyan szinten irányítja, amely a teljes bakteriális fehérje 20-25%-ára becsülhető. Az ezt a konstrukciót (pTVR 568-4) tartalmazó sejtekből és a hGH-t a λΡι, promotor szabályozása alatt álló, hGH-t tartalmazó sejtekből (pTV 104—2) származó fehérjék közvetlen összehasonlítása poliakrilamid gélen azt jelzi, hogy a deo promotor által 50-100%-kal több hGH termelődik, mint a λ promotor által.
6. PÉLDA
Szarvasmarha növekedési hormon (bGH) analógot kifejező deo P1-P2 vektor megalkotása
A pMFS-5600 plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt a 12. ábrában bemutatjuk, hogy az MnSOD-t kódoló szekvenciákat és a hGPX kódoló szekvenciák egy részét eltávolítjuk a pDGE4-3 deo P1-P2 kifejező vektorból és a p SÁL 440-11 -bői származó 750 bp-s bGH szekvenciával helyettesítjük. A pSAL 440-11 plazmidot úgy állítjuk elő, amint ezt a 12. ábra magyarázatánál leírjuk.
A ligáit plazmidot Escherichia coli S0732 (cyt R deo R“) törzsbe transzformáljuk (ennek a törzsnek a részletesebb ismertetése a 3. példa I. táblázatában látható). A met-asp-gln-bGH analógot kifejező kiónokat kiemeljük és pufferolt LB tápközegben, amely szénforrásként szukcinátot tartalmaz, valamint ampicillint is tartalmaz, növesztjük. A pMFS-5600-nak nevezett kiónt alkalmazzuk plazmid izolálásához és további kísérletekhez.
A pMFS-5600 plazmid 5’—>3’ irányban tartalmazza a deo Pl-P2-t, az autentikus deo RBS-t, a cll RBS-t, a teljes bGH kódoló szekvenciát, amelyet a hGPX kódoló szekvencia egy része és a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz kódoló szekvencia követ. A pMFS-5600 plazmid bGH fehérjét fejez ki magas szinten. A GPX és humán réz/cink diszmutáz szekvenciák nem transzlatálódnak a bGH gén 3' végénél levő transzlációs terminációs szignál miatt.
7. PÉLDA
Apolipoprotein E (Apó E) fúziós fehérjét kifejező deo P1-P2 vektorok megalkotása
A pTVR 580-35 plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt a 19. ábrában bemutatjuk, a pTVR 568-4 plazmidban a hGH kódoló szekvenciát a pSAL 160-5 plazmidból származó hGH-Apo E fúziós szekvenciával helyettesítve; ez a szekvencia tartalmazza a hGH első 45 aminosavát az apolipoprotein E312.-299. aminosavaihoz fuzionálva. A pSAL-160-5 plazmidot a 34. ábrában mutatjuk be; ezt úgy alkotjuk meg, amint az ábrák magyarázatánál (31.-34. ábrák) leírjuk.
Az így létrejövő ligáit plazmidot Escherichia coli A 1645 törzsbe transzformáljuk. A pTVR 580-35 plazmidot Escherichia coli A 1645 törzsben megerősített LB tápközegben (LBF) növesztjük. (1 liter LBF tápközeg 20 g triptont, 10 g élesztőkivonatot, 5 g NaCl-t, 0,3 mól/1 MgSO4-et és 0,1 mól/1 K2HPO4-et tartalmaz). A várt méretű gén terméket kifejező ki ónokat kiemeljük, és a pTVR 580-35-nek nevezett kiónt izoláljuk.
A pTVR 580-35 plazmid 5'—>3' irányban tartalmazza a deo Pl-P2-t, az autentikus deo RBS-t, a cll RB5-t és a fuzionált hGH-Apo E kódoló szekvenciát. A plazmidot visszafertőzzük a prototróf Escherichia coli MCI061 törzsbe, és az így létrejövő kiónt 5 80-35-1 -nek nevezzük.
8. PÉLDA
A Lel 857 represszor fehérjét kifejező deo Pl vektor megalkotása
A λ cl 857 gént a következőképpen klónozzuk. A hőmérsékletérzékeny cl 857-et magában foglaló λ DNSt a New England Biolabs-tól szerezzük be. A DNS-t EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel hasítjuk és összekeverjük az azonos enzimekkel hasított pBR322vel. A keveréket Egáljuk és S054O-be transzformáljuk. Az ampicillint tartalmazó LB agaron kapott telepeket izoláljuk, LB agaron növesztjük és megvizsgáljuk λ C60 fertőzésre való immunitásra. Azokat a telepeket, amelyek agar lemezre való szélesztéskor lizált területeket alakítanak ki a λ C60 fertőzés miatt nem vesszük figyelembe, míg azokat, amelyek nem mutatnak lízist, tovább elemezzük. Azok a kiónok, amelyek ismételten mutatnak immunitást λ C60-nal való fertőzésre, egy 5400 bp-s beiktatással rendelkező plazmidot tartalmaznak, amely tartalmazza a cl 857-et, valamint a Rex A, Rex B és N génszekvenciákat. Ezt a plazmidot pMFL-31-nek nevezzük.
Azok a kísérletek, hogy mind az autentikus, λ Prm promotorja által szabályozott cl 857 represszor szekvenciát mind a Pl segítségével kifejezendő eukarióta gént magában foglaló klónozó vektorokat állítsunk elő, sikertelenek, a sejtek gyengén nőnek és a kívánt eukarióta fehérjét nagyon kis mennyiségben termelik. Úgy véljük, hogy az ilyen kiónokban a cl 857 represszor túltermelődik és ez káros az élénk sejtnövekedésre. Abból a célból, hogy a szintetizálandó cl 857 represszor alacsony szintjét lehetővé tegyük folyamatosan, elhatároztuk, hogy a gyenge deo Pl promotort hasznosítjuk.
A pMF 54DC plazmid megalkotását a 21-23. ábrákban mutatjuk be, és ezeknek az ábráknak a magyarázatánál részletezzük. Ezek a konstrukciók pMFL 31 plazmidban a λ cl 857 autentikus Prm promotorjának a helyettesítését mutatják a deo Pl promotorral és egy olyan szintetikus kapcsolóval, amely a represszor kódoló szekvenciájának első ATG kodonjához proximális cll riboszomális kötőhely Shine-Dalgamo szekvenciáját tartalmazza. (A Rex A és Rex B gének szintén eltűnnek a pMFL 31-ből). A pMF 54DC-nék nevezett (23. ábra) végső plazmidot alkalmazzuk Escherichia coli MCI061 transzformálására [Casadaban M. és Cohen S.. J. Mól. Bioi. 138, 179-207( 1980)].
Harminc (30), pMF 54DC-vel transzformált Escherichia coli MCI061 transzformánst emelünk ki véletlenszerűen és λ C60-nal végzett fertőzésnek tesszük ki. Azok a kiónok, amelyek immunitást mutatnak XC60nal végzett fertőzésre, nem lizálnak. Az immunitás a funkcionális cl represszor jelenlétét bizonyítja a sejtben és így bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a deo Pl promotor fünkcionális. Abból a célból, hogy a deo Pl és a cl represszor jelenlétét igazoljuk, számos klónból plazmidokat izolálunk és elemezzük a várt endonukleáz felismerő helyek jelenlétére. Az összes várt restrikciós helyet magában foglaló plazmidot pMF 54DC-nek nevezzük. Ez irányítja a λ cl 857 represszor fehérje kifejeződését a deo Pl operátor/promotor szabályozása alatt, amint ezt a C60-nal végzett fertőzésre való rezisztencia demonstrálja; a cl 857 fehérje azonban nem mutatható ki a Coomassie kékkel festett poliakrilamid gélen.
9. PÉLDA
A λ cl 857 represszor gént tartalmazó független, a bGH-t a deo Pl szabályozása alatt kifejező vektor megalkotása
Az alábbi új konstrukció magában foglalja a λ cl 857 represszor gént ugyanabban a plazmidban mint a bGH gén, amikor a cl 857 által irányított XPl promotor szabályozása alatt fejezzük ki. Ez lehetővé teszi, hogy a plazmidot prototróf baktériumokba vezessük be a nélkül, hogy előbb bevezessük a λ cl 857 gént a gazdasejt kromoszómájába. A λ cl 857 represszort a deo Pl operátor/promotor terület szabályozása alatt tartalmazó fragmentumot izoláljuk a pMF 54DC-ből, amint ezt a 24. ábránál leírjuk. Ezt a fragmentumot (amely mintegy 1300 bp hosszú) a pSAL 440-22 lineáris formájába ligáljuk (amelyet úgy kapunk meg, ahogyan ezt a 24. ábránál leírjuk), amely tartalmazza a bGH gént a /.Pl promotor és a módosított (N-fehérjétöl független) cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt (lásd a 24. ábrát). A ligálást az alábbiak szerint végezzük; a Clal-gyel hasított és Klenow DNS polimeráz alkalmazásával betöltött pSAL440-22-t és az izolált 1300 bp-s fragmentumokat 1 : 2 arányban összekeverjük és a keveréket T4 ligázzal ligáljuk. A ligáit keveréket alkalmazzuk egy prototróf Escherichia coli (ATCC 12435) transzformálására. Számos transzformánst emelünk ki és vizsgálunk meg immunitásra λ C60-nal 30 °C és 42 °C hőmérsékleteken végzett fertőzéssel. Azokat a kiónokat, amelyek immunisak 30 °C hőmérsékleten (nincs lízis), míg érzékenyek 42 °C hőmérsékleten (lizálnak), tovább vizsgáljuk, hogy meghatározzuk a beiktatott fragmentum orientációját restrikciós enzimes térképezés segítségével.
Abból a célból, hogy igazoljuk az összes elem megfelelő funkcióját az újonnan megalkotott plazmidban, ATCC 12435-be transzformált kiónokat növesztünk folyékony tápközegben 30 °C hőmérsékleten 6 órán át 3 ml-es tenyészetekben. A tenyészeteket kétfelé választjuk; az egyiket hővel kezeljük 42 °C hőmérsékleten 2 órán át, és a másikat ugyanennyi ideig 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ebből a két tenyészetből fehérjét extrahálunk és SDS gélelektroforézisnek vetjük alá. A festést és a nem kötött festék eltávolítását követően világossá válik, hogy a 42 °C hőmérsékleten kezelt tenyészet olyan fehéqéttermel, amely elektroforéziskor a bGH referenciával azonos módon vándorol. Ez a fehérje-csík reagál az anti-bGH antitesttel. Ilyen csík nem figyelhető meg a nem indukált, kontroll tenyészet kivonataiban. Az új összetett plazmidot pFSAL-A5-nek, vagy pFSAL-B27-nek nevezzük, a beiktatott cl represszor orientációjától függően (amint ezt a 24. ábra magyarázatánál leírjuk).
Ezt követően a szekvenciaelemzés azt mutatja be, hogy egy részleges, az 5' végnél megcsonkított deo Pl promotor szekvencia van jelen a pFSAL-B27 plazmidban, míg a teljes deo Pl promotor szekvencia van jelen a pFSAL-A5-ben. A megcsonkított deo Pl-ben hiányzó szekvenciáról úgy véljük, hogy a deo Pl rajtjától a 147152. helynél levő AccI helyig terjedő területet tartalmazza [lásd a 2. ábrát Valentin-Hansen és munkatársai közleményében: The EMBO Journal /, 317-322 (1982)]. így a megcsonkított deo Pl csak mintegy 72 nukleotidból áll, az AccI helytől a BglII hely 222. helynél levő végéig, és már nem tartalmazza az EcoRI restrikciós helyet a 104.-109. helynél. Dandanell és Hammer [The EMBO Journal 4, 3333-3338 (1985)] ismertetik, hogy „az EcoRI hely kitöltése a deo Pl-ben.... elroncsolja az operátor aktivitást. Meglepő módon a megcsonkított deo Pl az Eco Rí helyben levő ismert operátor-promotor terület nélkül szabályozza a cl 857 represszor termelését.
Megjegyezzük, hogy a deo Pl promotort (vagy egy részét) tartalmazó fragmentumot és a λ cl 857 represszor szekvenciát a pFSAL-A5-ből Sspl-gyel és XmnI-gyel végzett emésztéssel és apFSAL-B27-ből csak Sspl-gyel végzett emésztéssel távolíthatjuk el (lásd a 24. és 25. ábrákat). Ezt a fragmentumot azután bármilyen olyan kifejező vektorba beiktathatjuk, ahol a géntermék a λ promotor szabályozása alatt fejeződik ki, így alakítva ki, hogy a vektor a géntermék független hőlabilis kifejezője legyen. A pFSAL-B27 plazmidot pFSAL-130-B27-ként Escherichia coli 12435-ben deponáltuk ATCC 67071 deponálási számon. Ez mintegy 0,1 g bGH analógot termel 1 g száraz sejttömegre számítva 3-4 órás höindukció után.
A pFSAL-B27-ben levő megcsonkított deo Pl szekvenciát át lehet alakítani teljes hosszúságú szekvenciává az alábbi úton. A pMF 5534 plazmidot (ATCC 67703) BglII-vel és AatlI-vel emésztjük (az AatlI hely az ampicillin rezisztencia génen belül helyezkedik el), a kis fragmentumot izoláljuk és ezt a pFSAL-B27 BglII-vel és AatlI-vel végzett emésztéséből kapott nagy fragmentumhoz ligáljuk. Az így létrejövő plazmid tartalmazza a teljes hosszúságú deo Pl szekvenciát, és SspII-gyel el lehet hasítani, hogy eltávolítsuk a deo Pl promotort és a λ cl represszor szekvenciát tartalmazó fragmentumot, amint ezt a korábbi fejezetben leírtuk.
10. PÉLDA
Független humán réz/cink szuperoxid diszmutáz (hSOD) kifejező vektor megalkotása, amely tartalmazza a λ cl 857 represzszor gént a deo Pl szabályozása alatt
A pFSAL-A5 plazmidot elhasítjuk, hogy eltávolítsuk a λ cl 857-et a deo Pl promotor szabályozása alatt tartalmazó kis fragmentumot, és ezt a pSODpMAX-12 betöltött Aval helyébe ligáljuk (amint ezt a 25. ábrában bemutatjuk). A pSODbMAX-12 plazmid (ATCC 67177; letétbe helyezve: 1986. augusztus 6-án) magas szintű hSOD kifejező, amely 5'—>13' sorrendben tartalmazza a λΡι promotort, a β-laktamáz promotort, egy szintetikus β-laktamáz riboszomális kötőhelyet (síi) és a humán réz/cink szuperoxid diszmutáz szekvenciát. A deo Pl + cl 857 szekvenica ligálása ebbe a plazmidba megadja az így létrejövő, magas szinten kifejező plazmidnak azt a képességet, hogy Escherichia coli sejtek széles választékába transzformálódjék, beleértve a prototróf sejteket is, mivel ez független azoktól a cl represszoroktól, amelyeket a gazda kromoszóma termel. Az ebből a ligálásból kialakuló plazmidot alkalmazzuk Escherichia coli MCI061 törzs transzformálására. Ezt a prototróf Escherichia coli ATCC 12435 törzsbe transzformáljuk vissza és jellemezzük azokat a plazmidokat, amelyek a deo Pl + cl-t hordozzák mindkét orientációban. Az egyik izolátum, amelyet pSODβMAX-12-cI-nek nevezünk, a hSOD jó kifejeződési szintjét adja. A transzformáit baktériumok 42 °C hőmérsékleten jól nőnek és legalább 6 órán át fejeznek ki hSOD analóg fehérjét.
11. PÉLDA
Független ApoE analóg kifejező vektorok megalkotása, amelyek tartalmazzák a Lel 857 represszor gént a deo Pl promotor szabályozása alatt (a) Met ApoE-t kifejező független vektor (pTVR590-4)
A pFSAL-A5 plazmidból származó, a cl 857 represszor gént szabályozó deo Pl-et tartalmazó fragmentumot ligáljuk a 27. ábrában bemutatott módon a pTV 194-80 plazmidba, amely a met-ApoE ApoE-analógot fejezi ki. [A pTV 194-80 plazmid megalkotását az ezzel a bejelentéssel együtt benyújtott és ezzel összefüggő 644,671 (1984. augusztus 27.) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (Oppenheim és munkatársai) és a 173,280 (1992. augusztus 12.; bejelentés közzétéve : 1986. március 5-én) számú európai szabadalmi közzétételi irat 4. példájában és 22. ábrájában írják le, ahol ezt pTV 194-nek nevezik], A pTVR 583-17-nek nevezett plazmidot állítjuk így elő, és Escherichia coli MC1061 -be vezetjük be, majd ezt követően újra transzformáljuk Escherichia coli ATCC 12435be, vagyis egy prototróf, vad típusú törzsbe. A kiónokat átvizsgáljuk λ C60-nal fertőzésre való immunitásra. Azokat a kiónokat, amelyek funkcionális cl 857 represszorral rendelkeznek, restrikciós endonukleázos térképezéssel elemezzük, és az egyik kiónt, amelyet pTVR-590-4-nek nevezünk, alkalmazzuk a további kísérletekhez. Ez a plazmid a met ApoE hőlabilis kifejezőjének bizonyul, ezáltal mutatva be a fúnkcioná.lis hőlabilis cl 857 represzor termelését a plazmid révén. A pTVR 590-4 plazmidot az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) deponáltuk ATCC 67360 számon.
(b) Met-Leu-Leu-Met-Apo E-t kifejező független vektor (TVR-70O-2)
A cl 857 represszor gént szabályozó deo Pl-et tartalmazó, a pFSAL-A5 plazmidból származó fragmentumot a 26. ábrán látható módon beiktatjuk a pTVR 289-18 plazmidba, amely a met-leu-leu-leu-met-ApoE apolipoprotein E (ApoE) analógot fejezi ki a XPL promotor és a β-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt. (A pTVR 289-18 plazmidot úgy alkotjuk meg, amint a 29. ábrában bemutatjuk, a pTVR 279-8 plazmidból, amely met-leu-leu-leu-met ApoE-t fejez ki a XPL promotor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt; a PTVR 279-8 plazmid (ATCC 53216; letétbe helyezve: 1985. augusztus 2-án) megalkotását a 173,280 számú európai szabadalmi közzétételi irat írja le. Ennek az a hatása, hogy az így létrejövő, pTVR 700-2 plazmidot függetlenné teszi a gazdasejt kromoszómáján levő hőlabilis represszor kifejeződésétől. Ezt a pTVR 700-2 plazmidot sokféle sejtbe lehet transzformálni. (A pTVR 700-2 plazmidot először Escherichia coli MCI061-be vezettük be, ahol ezt pTVR 596-1-nek neveztük, majd ezt követően vad típusú Escherichia coli 12435-be fertőztük át, ahol ezt pTVR 700-2-nek neveztük). Az ApoE analóg kifejeződése pTVR 700-2 révén még magasabb, mint az ApoE analóg kifejeződése pTVR 590-4 révén (amelyet fentebb írtunk le).
(c) Független ApoE analóg kifejező vektorok további konstrukciói
Független ApoE analóg kifejező vektorok további konstrukcióit készítjük el, amelyekben az ApoE analóg a cll RBS szabályozása alatt fejeződik ki a β-laktamáz RBS5 szabályozása helyett abból a célból, hogy elkerüljük a „szivárgó” kifejeződés lehetőségét a β-laktamáz promotor RBS révén és az ApoE termelését a hőindukció előtt. Az egyik ilyen konstrukcióban a deo Pl-cl fragmentumot, amelyet pFSAL-A5-ből állítunk elő XmnI/SspI emésztéssel, beiktatjuk a pTVR 279-8 plazmidba (lásd a 29. ábrát). A pTVR 279-8 plazmid met-leu-leu-leu-met-ApoE-t termel a λ Pl és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt (lásd a
HU 213 418 Β
29. ábrát); ezt Clal-gyel nyitjuk, Klenow DNS polimerázzal betöltjük és a deo Pl-cl 857 fragmentumot beiktatjuk. így állítjuk elő a pTVR 714 plazmidot, amelyet Escherichia coli 1061-be vezetünk be; ez a független plazmid met-leu-leu-leu-met ApoE kódoló szekvenciával bír a XPl és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt, és tartalmazza a λ cl 857 represszor fehérjét szabályozó deo Pl-et is. A pTVR 714 plazmidot ezt követően átvisszük Escherichia coli 12435-be, és pTVR 721.4.nek nevezzük.
12. PÉLDA
Független sertés növekedési hormont (pGH) kifejező plazmidok megalkotása, amelyek a λ cl 857 represszort tartalmazzák a deo Pl promotor szabályozása alatt (a) pEFF-902 plazmid (i) A pEFF-902 plazmid megalkotása
A jelen bejelentésben leírt sertés növekedési hormon (pGH) kifejező plazmidokban a kiindulási pont a pRecpig24 plazmid. Ezt a plazmidot, amelyet a 36. ábrában mutatunk be, és amelyet az ezzel együtt bejelentett, ezzel összefüggő 821,830 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ír le, az ATCC-nél ATCC 534331 (letétbe helyezve : 1986. január 20-án) számon deponáltunk. A pRec-pig24 plazmid hőindukáltan fejez ki egy pGH analógot a XPL promotor és a hőlabilis cl 857 represszor (amely a kromoszómán belül van) szabályozása alatt; a pGH analógnak met-asp-glnN-terminális szekvenciája van a fenilalanin gyökhöz rögzítve, amely az autentikus pGH első aminosava. A fentebb említett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben a pRec-pig24-ről leírják, hogy különösen előnyös kifejezője a pGH analóg fehérjének.
Abból a célból, hogy független pGH kifejező plazmidot alkossunk meg, a pGH analógot kódoló DNSt eltávolítjuk a pRec-pig 24-ből és a független pFSAL-130-B27 bGH kifejező plazmidba iktatjuk, amelyből a bGH analóg kódoló szekvenciát előzőleg kimetszettük. Ez alakítja ki a pEFF-902 plazmidot.
(ii) A pEFF-902 plazmidot tartalmazó E. coli ATCC 12435 törzs termelő léptékű növesztése és kifejezése
A pEFF-902 plazmidot Escherichia coli ATCC 12435-be vezetjük be (prototróf, vad típusú törzs) és 30 °C hőmérsékleten minimál táp közegen növesztjük (lásd 2. példa), amely 0,2% glükózt tartalmaz 25-30 ml térfogatban. Amikor az OD^o eléri a 0,9-1,0 értéket, a hőmérsékletet felemeljük 42 °C-ra és a lombikot 4-6 órán át rázatjuk; a hőmérséklet-változtatás előtt metionint adunk a tenyészethez 100 mg/liter végső koncentrációra. 1 órás időközönként 1,0 OD-nek megfelelő egység mintákat veszünk és SDS poliakrilamid gélelektroforézissel elemezzük. A Coomassie kékkel festett gélek feltárják, hogy a pGH analóg fehérje egészen a 4. óráig progresszíven gyülemlik fel az indukció kezdetétől számítva, és ezen a szinten marad még legalább a 6. óráig az indukció kezdetétől számítva.
A 35S-metioninnal végzett impulzus-jelzéses és impulzus-követő kísérletek azt igazolják, hogy a pGH analóg fehérje de novo szintézise akár 6 óráig is megy tovább az indukció kezdetétől számítva, és hogy az így termelt pGH analóg nagyon stabil.
A párhuzamosan nőtt pEFF-902 és pRec-pig24 tenyészetekből származó fehérje termékek, amelyeket 125Ivel jelzett anti-pGH antitesttel kezelünk, Western folt elemzése feltárja, hogy a két plazmid által termelt pGH analóg együtt vándorol. A125I jelzés intenzitása alapján arra a következtetésre jutunk, hogy a pEFF902 sokkal több pGH analógot termel, mint a pRec-pig24.
(iii) A pEFF-902 plazmidot tartalmazó Escherichia coli ATCC 124535 törzs nagyobb tételű fermentálása
A pEFF-902 plazmidot tartalmazó Escherichia coli ATCC 12435 törzset 1 liter minimál tápközegben (2. példa) növesztjük egy 2 literes edényben 30 °C hőmérsékleten, glükóz betáplálás és 15%-os NH^H-val végzett szabályozás körülményei között. 1 órás időközönként mintát veszünk 5 órán át, és az 1,0 DDööo egységnek megfelelő mintákat SDS poliakrilamid gélen futtatjuk. A Coomassie kékkel festett csíkok denzitometriás elemzése feltárja, hogy az indukció beindítása után 4 órával a pGH analóg a teljes fehérje 23-25%-át teszi ki. Ezenkívül mérjük a teljes száraz sejttömeget, valamint meghatározzuk a termelt pGH fehérje mennyiségét is ugyanebben a fermentációban ismert mennyiséggel, amely azonos gélen párhuzamosan fut, összehasonlítva; ez adja meg a fajlagos termelékenységet (gramm fehérje termék/gramm száraz sejttömeg), amely három különböző meghatározásban 0,12 között van.
A II. táblázat bemutatja a pEFF-902 és pRecpig24 plazmidok kifejeződési szintjeinek összehasonlítását a termelési léptékű, illetve nagyobb tételű fermentációkra alapozva.
(b) pEFF-9021 és EFF-9022 plazmidok
Már korábban úgy találtuk, hogy a λ Pl promotor rendszer által elősegített SÓD kifejeződés javítható, ha a plazmidban levő ampicillin rezisztencia gént tetraciklin rezisztencia génnel helyettesítjük. Ezt a megközelítést alkalmazzuk arra, hogy megkíséreljük tovább emelni a hőindukálható független plazmidban Pl promotor szabályozása alatt kifejezett pGH analóg kifejezését. Ennek megfelelően a pEFF-902 plazmidban az ampicillin rezisztencia gént a pBR322-böl származó tetraciklin rezisztencia génnel helyettesítjük, amint ezt a 37. ábrában bemutatjuk. Ennek a ligálásnak a termékeit Escherichia coli ATCC 12435 törzsbe transzformáljuk; két, tetraciklin rezisztenciával bíró konstrukciót állítunk elő, a pEFF-9021 -et és a pEFF-9022-t. Ezek mindketten független plazmidok, amelyek pGH analógot fejeznek ki a λΡ[ promotor szabályozása alatt, hőindukáltan ellenőrizve a cl 857 represszor révén; a plazmidok egymástól csak a tetraciklin rezisztencia gén orientációjában különböznek (37. ábra).
A minimál tápközegen (2. példa) végzett indukciós kísérletek feltárják, hogy mindkét tetraciklin rezisztens plazmid magas szinten fejez ki pGH analógot. A különböző pGH analógokat kifejező plazmidok kifejezési szintjeinek összehasonlítását a II. táblázatban mutatjuk be.
A fenti eredményekből világos, hogy a pEFF-902, pEFF-9021 és pEFF-9022 független plazmidok sokkal magasabb szinten fejeznek ki pGH analógot, mint a pRec-pig24 plazmid. A 20. példában egy további, pGH analógot kifejező független plazmid megalkotását újuk le.
II. TÁBLÁZAT pGH és bGH analógok kifejezőplazmidjai és gazdaszervezetei
Gazdaszervezet* Plazmid Antibiotikum reziszencia Promotorok Riboszomális kötőhelyek Klónozott gén és relatív kifejeződés ***
A4255 pRec-pig24 AMP λ Pl cll pGH+
ATCC 12435 pEFF-902 AMP λ Pl, deo Pl cll pGH+++
ATCC 12435 pEFF-9021 TÉT λ Pl, deo Pl cll pGH-’
ATCC 12435 pEFF-9022 TÉT λ Pl, deo Pl cll pGH+
S0732 pEFF-905 AMP deo P1-P2 deo, cll pGH++++
S0732 pEFF-920** AMP deo P1-P2 deo, cll pGH++++
S0732 pMFS-5603 AMP deo P1-P2 deo, cll bGH+
S0732 pMFS-5605** AMP deoPl-P2 deo, cll bGH+++
*Az E. coli gazdaszervezeteket az I. táblázatban írjuk le.
**PAR+.
***A kifejeződési szinteket relatív tartományok szerint fejezzük ki az alacsony szintű kifejezőktől (+) a magas szintű kifejezőkig (++++).
MEGJEGYZÉS: lásd meg a III. táblázatot es IV. tablá
13. PÉLDA
Sertés növekedési hormon (pGH) analóg fehérjét kifejező deo P1-P2 vektorok megalkotása
Az alábbi fejezetek részletezik egy sor, a pGH analóg termelését irányító deo P1-P2 kifejező plazmid megalkotását.
(a) pEFF-905 plazmid
Amint a 38. ábrában bemutatjuk, azt a fragmentumot, amely 5’—>3’ irányban tartalmazza a cll riboszomális kötőhelyet, a pGH szekvenciát és a T|T2 terminátor szekvenciát, eltávolítjuk a pEFF-902 plazmidból és beiktatjuk a pMF5531 plazmidba, amelyből a hSOD szekvenciát részlegesen eltávolítottuk. (A pMF 5531 plazmid hSOD analóg fehérjét fejez ki a deo P1-P2 promotor szabályozása alatt - lásd a 4. ábrát).
Az így létrejövő pEFF-905 plazmidot Escherichia coli S0732-be (amelyet az I. táblázatban írunk le) transzformáljuk. A pEFF-905 plazmid a pGH analógot a deo P1-P2 promotor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt fejezi ki. A termelt pGH analóg szintje nagyon magas és meghaladja a pRec-pig24 λΡ[. kifejező vektor által termelt szintet, és azt a szintet, amelyet a λΡβ-független pEFF-902, pEFF-9021 és pEFF-9022 kifejező vektorok termelnek (lásd a 12. példát). Az ezek által a plazmidok által irányított pGH analóg fehérje kifejezési szintek összehasonlítását a II. táblázatban mutatjuk be (12. példa).
A pEFF-905 plazmidot magában foglaló sejtek kifejeződése azonban drámai módon csökken számos átvitel után, jelezve, hogy ez a konstrukció nem stabil. A pEFF-905-öt magában foglaló Escherichia coli S0732 sejtek növesztése dús tápközegben (LB + 0,3% glicerin + ampicillin) a fokozott csökkenést a pGH analóg termelésében csak 15 generáció után mutatja. [1 liter LB tápközeg 10 gtriptont, 5 g élesztőkivonatot, 10 gNaCl-t tartalmaz és a pH 7,5-re van beállítva NaOH-val; ezt a tápközeget Maniatis T., Fritsch E.F. és Sambrook J. írják a 18. illetve 19. példákban.
le az alábbi szakkönyvben: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”; Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]. Ez az instabilitás valószínűleg a nem megfelelő eloszlás vagy nem megfelelő replikáció miatt, vagy más okok miatt lehetséges, amelyet mind a nagyon magas kifejeződési szint idéz elő.
(b) pEFF-920 plazmid (i) A pEFF-920plazmid megalkotása
Abból a célból, hogy növeljük a plazmid stabilitását, a PÁR (megoszlási) szekvenciát tartalmazó, a p5 C101 plazmidból származó 350 bp-s fragmentumot bevezetjük a pEFF-905-be, amint ezt a 39, ábrában bemutatjuk. A pS C101 plazmid az ATCC-nél rendelkezésre áll, és ezt Cohen S. írja le a J. Bact. 132, 734-737 (1977) és a J. Bact. 134, 1141-1156 (1978) irodalmi helyeken. Az így létrejövő plazmid, amelyet pEFF-920-nak nevezünk, a pGH analóg fehérjét a deo P1-P2 promotor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt termeli, továbbá, magában foglalja a PÁR szekvenciát. A pEFF 920 plazmidot Escherichia coli S093O törzsben az ATCCnél deponáltuk ATCC 67706 számon.
(ii) A pEFF-920 plazmidot magában foglaló Escherichia coli S0732 növesztése és kifejezése
A pEFF-920 plazmidot Escherichia coli S0732-be vezetjük be (ezt a törzset az I. táblázatban ismertetjük) és külön-külön kísérletekben dús tápközegben (LB + 0,3% glicerin + ampicillin) és minimál tápközegben (MM + ampicillin + 0,2% glükóz) növesztjük. Az LB tápközeg összetételét a fenti (a) pontban ismertetjük; a minimál tápközeg (MM) összetételét a 2. példában adjuk meg. A plazmid stabilitását és a kifejeződési szinteket követjük. A dús tápközegben a plazmidok stabilan megmaradnak mintegy 60 generáción keresztül, ezután viszont éles csökkenés van a kifejeződésben; ez már nagy javulás a pEFF-905 plazmid kifejeződéséhez képest, amely a csökkentett kifejeződési szintet már a 15. generáció után mutatja [lásd a fenti (a) fejezetet].
Minimál tápközegben (amelyhez glükózt adtunk) a plazmid több, mint 80 generáción át fennmarad, bár alacsony kifejeződési szinten termel. Amikor azonban a glükóz kimerül és szénforrásként glicerint adunk, pGH gyülemlik fel a sejtekben és megfigyelhető mikroszkóp alatt nagy, fénytörő testek formájában. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy a plazmidban levő PÁR szekvencia növeli a teljes plazmid megfelelő replikációjának valószínűségét. A deo P1-P2 által elősegített kifejeződés fentebb leírt alacsony szintje glükóz jelenlétében valószínűleg a „glükóz-hatás-nak tulajdonítható, amelyet a technika állásában írtunk le. Amikor glükóz van jelen, a géntermék deo P2 promotor által elősegített kifejeződése nagyon alacsony; mivel a deo Pl promotor gyenge, itt kevés géntermék termelődik a deo P1-P2 promotorok révén glükóz jelenlétében. A glicerin, mint energiaforrás jelenlétében azonban a kifejeződés a deo P2 promotortól magas (lásd a 2. példát). így amikor a glükóz kimerül és glicerint adunk energiaforrásként, a deo P1-P2 által elősegített átírási szintek emeltté válnak és nagy mennyiségű pGH analóg termelődik.
(iii) A pEFF-920 plazmidot magában foglaló E. coli S0 732 törzs nagyobb tételű fermentálása
Az S0732/pEFF-92 törzs nagyobb tételű fermentálását 2 literes fermentorban hajtjuk végre 37 °C hőmérsékleten, minimál tápközeg oldatban (lásd a 2. példát), amely még 2% glükózt tartalmaz. Ilyen körülmények között a megkettőződési idő 60 perc. Amikor a glükóz kimerül, a tenyészetet glicerinnel növesztjük, hogy lehetővé tegyük a deo P1-P2 által elősegített pGH analóg átírás létrejöttét [lásd a fenti (ii) pontot]. A glicerines fermentálást 4-86rán át hagyjuk végbemenni. Ekkor, a kinyerés időpontjában OD66o érték a 30-80 OD egység/ml tartományban van a növesztés elindításakor adott glükóz mennyiségétől függően. A kinyerés időpontjában a minták SDS-PAGE elektroforézise azt jelzi, hogy a pGH analóg kifejeződése meghaladja a más XPL kifejező rendszereknél megfigyelt szintet (lásd a II. táblázatot a 12. példában), és hogy a termelt pGH analóg mennyisége több, mint 25%-a a teljes sejtfehéijének. A pGH analóg fehérje ezekből a vektorokból való kifejezésének optimalizálására vonatkozó további tanulmányokkal kapcsolatban lásd a 16. példát.
14. PÉLDA
További, szarvasmarha növekedési hormon (bGH) analógot kifejező deo P1—P2 plazmidok
Az alábbi fejezetek valamely bGH analógot a deo P1-P2 promotorok szabályozása alatt kifejező plazmidok előállítását részletezik. Ezek a plazmidok elsősorban a T]T2 átírás terminációs szekvenciák jelenlétében különböznek a 6. példában leírt plazmidtól (pMFS-5600). Azt vártuk, hogy ez megnöveli a plazmidok stabilitását; a pMFS-5600 plazmid ugyanis, úgy tűnik, nem stabil a szokásos növesztési körülmények között.
(a) bGH analógot kifejező plazmidok megalkotása (i) pMFS-5627plazmid
A pFSAL-13O-B27-ből (ATCC 67071) a bGH és TiT2 szekvenciákat tartalmazó 1750 bp-s fragmentumot eltávolítjuk és beiktatjuk a deo Pl-P2-t tartalmazó pMF558-26 plazmidba (lásd a 6. ábrát). Az így létrejövő pMFS-5627 plazmidot, amelyet a 40. ábrában mutatunk be, Escherichia coli 50732-be (lásd az I. táblázatot) transzformáljuk. A pMFS-5627 a met-asp-gln-bGH analóg kifejeződését irányítja a deo P1-P2 promotor és a deo riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A pMFS-5627 a bGH analóg alacsony szintű kifejezője.
(ii) pMFS-5603
A pMFS-5603 plazmidot a pMFS-5627 plazmidból állítjuk elő a deo riboszomális kötőhelyet a cll riboszomális kötőhellyel helyettesítve, amint ezt a 41. ábrában bemutatjuk. A pMFS-5603 plazmidot Escherichia coli S0732 törzsbe visszük át, és a bGH analóg fehérje közepes szintű kifejeződését érjük el (lásd a
II. táblázatot).
(iii) pMFS-5605 plazmid
Abból a célból, hogy a bGH analógnak jobb deo P1-P2 kifejezőjét állítsuk elő, a pEFF-920 plazmidból származó PÁR fragmentumot a pMFS-5603 plazmidba ligáljuk. Az így létrejövő pMFS-5605 plazmid (42. ábra) meglepően magas szinten irányítja a bGH analóg kifejeződését (a teljes sejtfehéije 20-25%-a) a deo P1-P2 promotor és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A bGH analóg kifejeződés eredményeit a II. táblázatban mutatjuk be. A pMFS-5607 plazmidot (46. ábra) a pMFS-5605 plazmidból állítjuk elő az ampicillin rezisztencia gént tetraciklin rezisztencia génnel helyettesítve. A pMFS-5607 plazmidot Escherichia coli S093O (F“) törzsben az ATCC-nél deponáltuk ATCC 67704 számon. Az Escherichia coli F törzseket a 21. példában írjuk le.
(b) bGH analógot kifejező plazmidokat magában foglaló Escherichia coli S0732 növesztése
Escherichia coli S0732-ben levő, bGH analógot kifejező pMFS-5627, pMFS-5603 és pMFS-5605 plazmidok növesztését tanulmányozzuk nagyobb léptékű szinten. A plazmidokat először mind LB tápközegben növesztjük (13b. példa), amely még ampicillint és 0,2-0,3% glicerint is tartalmaz. Ezt követően ezeket mind minimál tápközegen (2. példa) növesztjük, amely még 0,2% glükózt is tartalmaz; amikor a glükóz kimerül, 0,2%-0,3% glicerint adunk hozzá (lásd a 13b. példát).
15. PÉLDA
A példák során alkalmazott standard technikák
Az Escherichia coli transzformálását, valamint a plazmid DNS izolálását és tisztítását Maniatis és munkatársai szerint végezzük [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1982)]. A DNS fragmentumokat alacsony olvadáspontú agárból (FMC) készített gélekről izoláljuk és fenollal tisztítjuk. A DNS szekvenciaelemzést Sanger és munkatársai didezoxi módszerével hajtjuk végre [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74, 5463-5467 (1977)]. A fehérjét Lowry és munkatársai módszerével határozzuk meg [J. Bioi. Chem. /93, 265-275 (1954)]. Az elektroforézishez az SDS-poli-akrilamid gélt úgy állítjuk elő, amint ezt Laemmli U.K. leírta [Natúré, 227, 680-685 (1970)], és Coomassie kék R-rel festjük. 15 μΐ teljes sejtkivonatot alkalmazunk csíkonként, hacsak másképpen nem jelezzük.
A szuperoxid diszmutáz enzimaktivitását nyers kivonatokban McCord és munkatársai eljárása szerint méljük [J. Bioi. Chem. 244, 6049-6055 (1969)]. Standardként nagy mértékben tisztított, mintegy 4000 egység/mg fehérje tisztaságúvá tett SOD-t alkalmazunk.
A telephibridizációt lényegében úgy végezzük, amint ezt Grunstein és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961-3965 (1975)]. A hibridizálást 8*SSC-ben hajtjuk végre 42 °C hőmérsékleten 18 óra alatt, és a mosást 5 xSSC/0,1% SDS-sel végezzük ugyanilyen hőmérsékleten. Hogy az eljárás szigorúságát változtassuk, mind az SSC koncentrációt, mind a hőmérsékletet szükség szerint változtatjuk, A tisztított DNS fragmentumok hézag(nick) transzlációját úgy végezzük, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták (fentebb idézett munka). A hibridizálást úgy végezzük, hogy 5XSSCalkalmazunk 60 °C hőmérsékleten 18 órán át, majd 1 xSSC/0,1 % SDS-sel mossuk. Általában Agfa röntgensugár-filmeket teszünk ki a nitrocellulóz szűrők hatásának 4-6 órával az előhívás előtt.
A restrikciós endonukleázokat, T4 ligázt, T4 DNS polimerázt és Escherichia coli DNS polimerázt (Klenow fragmentum) a New England Biolabs-tól szerezzük be és úgy alkalmazzuk, ahogyan azt a gyártó javasolja. A Y32P-ATP-t, y32P-dezoxi-CTP-t és Y32P-dezoxi-ATP-t az Amershamtól szerezzük be.
Baktériumnövesztés és extrakció
Az ebben a találmányban alkalmazott Escherichia coli törzseket az I. táblázatban soroljuk fel. Hacsak másképpen nem jelezzük, a tenyészeteket LB tápközegben vagy minimál sóoldatokban (Vogel és Bonner 1556) növesztjük, amelyek ki vannak egészítve ampicillinnel 100 μ g/ml) vagy tetraciklinnel (12,5 μπι/ml), és egyedüli szénforrásként 0,2-0,3% glicerin van bennük.
A hSOD analógot kifejező plazmidot magában foglaló Escherichia coli sejteket olyan tápközegben növesztjük, amelybe rutinszerűen Cu2+ és Zn2+ ionokat adunk (általában 75, illetve 10 pg/ml mennyiségben, hacsak másképpen nem jelezzük). A Cu hozzáadása azért szükséges, hogy lehetővé tegye az enzimesen aktív hSOD analóg előállítását, amint ezt a 4,742,004 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik. A sejteket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten növesztjük és 1,0 OD66o értéknek megfelelő mennyiségét vesszük ki. A bakteriális üledéket újra szuszpendáljuk 100 μΐ 50 mmól/1-es trisz.HCl-ben (pH 8) és 3x„mintavevő puffer-ben lizáljuk, amely 30% (térfogat/térfogat) glicerint, 9% SDS-t, 2,1 mól/1 merkaptoetanolt, 187,5 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 6,8) és 0,5% brómfenolkéket tartalmaz, majd 5 percig melegítjük forrásban levő vízben. Az SÓD enzimaktivitás meghatározásához az extraktumokat a sejtek ultrahanggal végzett roncsolásával készítjük elő.
Oligonukleotid szintézis
Az oligonukleotidokat szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, a foszfoamidit kémiát alkalmazva. Az alkalmazott szintéziseljárás lényegében azonos azzal, amelyet Adams és munkatársai [J. Am. Chem. Soc. 105,661-663 (1983)] és Beaucage és munkatársai [Tetrahedron Letts. 22, 1859-1862(1981)] írtak le.
A szintetikus oligomereket gélelektroforézissel tisztítjuk, amelyet C18 kromatográfia követ. Az egyes, védőcsoportoktól megszabadított liofilezett termékek egy ötödét feloldjuk 20 ml, 80% (térfogat/térfogat) formamidot tartalmazó gél-pufferban, 40 cm-es 20% akrilamid /7 mól/ 1 karbamid gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá 300 V-nál 15 órán át. A teljes hosszúságú termékeket úgy lokalizáljuk, hogy a gélt átvisszük Sárán burkolattal egy fluoreszcens [254 nm-es fluoreszcens indikátorral (Merck) ellátott] TLC (vékonyréteg-kromatográfiás) lemezre, és elemezzük az UV árnyékok kimutatásával. A kimetszett gélfragmentumokat összezúzzuk és átvisszük szilikonozott csövekbe, amelyek 3 ml 0,5 mól/literes ammónium-acetátot tartalmaznak, majd 60° C hőmérsékleten melegítjük 60 percen át. A DNS oldatot szűréssel távolítjuk el. Sep-Pak C|8 gyertyákat (Waters Associated) nedvesítünk meg 10 ml 50%-os (térfogat/térfogat) acetonitrillel és 10 ml desztillált vízzel öblítjük a géleluátumok felvitele előtt. 5 ml desztillált vízzel végzett öblítés után az oligonukleotidokat az oszlopról 1 ml 60%-os metanol külön-külön háromszori felvitelével nyerjük ki, majd liofilezzük.
16. PÉLDA
A sertés növekedési hormon (pGH) és szarvasmarha növekedési hormon (bGH) deo P1-P2 szabályozása alatti kifejeződése kémiai indukciójának optimalizálása
Az alábbiakban leírjuk a növekedési hormonok Escherichia coli sejtekben való termelésének optimalizálását, ahol a sejtek olyan plazmidot foglalnak magukban, amely növekedési hormont fejez ki a deo P1-P2 promotorok szabályozása alatt. Az alapvető cél az, hogy elérjük az Escherichia coli sejtek kívánt biomasszáját glükózon végzett kezdeti növesztéssel, úgy, hogy az erős deo P2 promotor által szabályozott kifejeződés a katabolit repressziónak legyen alávetve. Ezt követően, a glükóz kimerülése után, valamilyen nem-glükóz szénforrást adunk hozzá, így téve lehetővé a deo P2 promotor kémiai indukcióját és a növekedési hormon termelését.
A kémiai indukció módszere, amint ez kiderült, következetes eredményeket adott a hormontermelésnél, és ez arra az elhatározásra vezetett, hogy hasonló módszereket fejlesszünk ki a fermentációs edényekben való növesztésre és kifejeződésre is. Meg kell jegyeznünk, hogy a nem oldható növekedési hormonok konstitutív termelése szegényes eredményeket ad. Az oldható polipeptideknél, mint pl. a hSOD analógoknál azonban magas szintű kifejeződést érhetünk el (lásd a 2. példát).
Nagyobb léptékű optimalizálás
Kísérleteket végzünk abból a célból, hogy optimalizáljuk a pGH analóg és a bGH analóg kifejeződését a korábbi példákban leírt, deo P1-P2 promotorokat tartalmazó plazmidokat alkalmazva. A pGH kifejeződéshez alkalmazott plazmid elsősorban a pEFF-920 plazmid (39. ábra és 13b. példa), amely met-asp-gln-pGH analógot fejez ki. A bGH kifejeződéshez alkalmazott plazmidok a pMFS 5607 plazmid (46. ábra) és pMFS 5605 plazmid (14b. példa és 42. ábra), amelyek tetraciklin-rezisztensek, illetve ampicillin-rezisztensek, és amelyek mindegyike met-asp-gln-bGH analógot fejez ki. Mind a két plazmid tartalmazza a PÁR fragmentumot. Összehasonlítjuk a kifejeződést két különböző gazdaszervezetben, az S0732- ben, amely cyt R“ deo R~ (nincs funkcionális deo represszora, de tartalmaz deo enzimeket), és az S093O-ban, amely cyt R~, és ki vannak iktatva belőle a deo enzimek. (Lásd az I a. táblázatot ezeknek a sejtvonalaknak a teljesebb leírásával kapcsolatban). Tenyészeteket növesztünk egy éjszakán át 50 ml minimál tápközegben (lásd alább), amelyhez glükózt is adtunk (végső koncentráció 0,2-0,4%). A glükóz kimerülésekor más szénforrást, pl. nátriumlaktátot, fruktózt, szukcinátot, vagy nátrium-malátot adunk hozzá 0,2-0,4% végső koncentrációban, és a tenyészetet további 3-4 órán át növesztjük 37 °C hőmérsékleten. 2 órás időközönként mintát veszünk (1 OD^o értéknek megfelelő mennyiségben) és SDS poliakrilamid gélre terheljük.
Az eredmények azt mutatják, hogy a fruktóz és a nátriumlaktát a legjobb szénforrások a megvizsgáltak közül. A pGH analóg kifejeződés következetesen valamivel magasabb, mint a bGH analóg kifejeződés ugyanabban a gazdaszervezetben. Az S093O-at jobbnak találjuk, mint az S0732-t, ezért minden 2 literes fermentorban végzett kísérletet S093O gazdaszervezettel végzünk.
A deo rendszer optimalizálása 2 literes fermentoredényben.
A tápközeg összetétele
Ennek a tápközegnek az összetételét g/literben adjuk meg, hacsak másképpen nem jelezzük. Az alább leírt minimál tápközeg hasonló ahhoz, amelyet a 2. példában leírtunk. Meg kell jegyeznünk, hogy a tápközegeket módosítjuk vagy változtatjuk a különböző baktériumtörzsek szükségletei szerint.
K2HPO4 8
KH2PO4 2
Na-citrát 2
NRC1 3
*Na-acetát 3
K2SO4 0,6
FeNR-citrát 0,02
CaCl2 0,04
Nyomelemek 3 ml/liter
Nyomelem-törzsoldat
MnSO4.H2O 1 g
ZnSO4.7H2O 2,78 g
CoCl2. 6H2O 2g
NaMoO4. 2H2O 2g
CaCl2. 2H2O 3 g
CuSO45H2O 1,85 g
h3bo3 0,5 g
Konc. HC1 100 ml
Ionmentesített H2O 900 ml
* Csak bizonyos kísérletekben hozzáadva
Az MnSC>4-et sterilizálás után adjuk hozzá 400 mg/1 végső koncentrációban. A glükózt a fermentor beoltásakor adjuk hozzá. 10 g/1 végső koncentrációban (20 ml-t 50%-os törzsoldatból). Ampicillint is adunk 100 pg/ml végső koncentrációban.
Oltótenyészet előállítása
200 ml minimál tápközeget, amely glükózt (0,8 ml 50%-os törzsoldatból), ampicillint és MgSÖ4.7H2Ö-t is tartalmaz, beoltunk Escherichia coli S093O/pMFS 5605-tel, vagy S093O/pMFS 5607-tel (bGH analóg) vagy S093O/pEFF 920-szal (pGH analóg) egy frissen nőtt, glükózt is tartalmazó LB agar lemezről, így 0,05 OD66o értéket kapunk. A tenyészetet egy éjszakán át növesztjük 37 °C hőmérsékleten 200-250 fordulat/percnél (New Brunswick rázóberendezés), hogy 2-3 OD66o értéket érjünk el.
Fermentor
Az alkalmazott 2 literes fermentor munkatérfogata 1 liter és a hőmérsékletet 36-37 °C hőmérsékleten tartjuk. A fermentort 200 ml egy éj szakán át nőtt tenyészettel +20 ml 50%-os glükózzal oltjuk. Ez a glükóz-koncentráció elegendő a 10-12 OD660 érték elérésére. Egy másik módszer szerint a feltöltést 10 ml glükózzal és a pH szabályozással párhuzamosan betáplált glükózzal lehet elérni. A pH-t 7,2 értéken tartjuk a kezdettől a végig, és 10%-os NH4OH betáplálásával szabályozzuk. Általában 20 vagy 40 ml glükóz előre meghatározott térfogatát alkalmazzuk, hogy 10, illetve 20 OD egységet érjünk el. A glükózzal végzett növekedési fázis során az oldott oxigént 20%-nál nem alacsonyabb szinten kell tartani, amely a biomassza termeléséhez a levegőzésnek nem korlátozó szintje. Ha szükséges, habgátlót is adagolunk. Az oldott oxigén szintben (D.0) való hirtelen emelkedés mintegy 70%-ra jelzi azt a pontot, amelynél a glükóz teljesen kimerül. Ennél a stádiumnál 20 ml 50%-os fruktózt adunk hozzá és a szivattyút összekötjük egy 100 mles tartállyal, hogy 50%-os fruktóz oldatot tudjunk táplálni. Néhány perc múlva az oldott oxigénszint elkezd csökkenni és 5-15% között marad, ennél nem magasabban; ez a növekedési hormon analóg termelés alacsony szintű levegőzésének szakasza. Az indukció fruktózzal mintegy 3-4 órán át tart. Fontos, hogy meghatározzuk a fruktóz-fogyasztást, mivel más gyors módszer nincs arra, hogy ennek koncentrációját becsüljük. Úgy méijük fel, hogy a fruktóz-fogyasztás sebessége hasonló a glükózfogyasztás sebességével.
A III. táblázat mutatja be az S093O/pEFF 920, S093O/p MFS 5605 és S093O/pMFS 5607 gazdaszervezet-vektor rendszerek fermentálásával kapott fajlagos növekedési hormon termelékenységet. Az S093O/
HU 213 418 Β pEFF92O rendszer pGH-ra 0,1 fajlagos termelékenységet mutat, amely éppen olyan jó, mint az az eredmény, amelyet a XPL rendszerrel kapunk. A bGH fajlagos termelékenysége az ampicillin vagy tetraciklin rezisztens törzsekből szintén nagyon hasonlónak tűnik (a pMFS 5605, illetve pMFS 5607 plazmidoknál).
Megjegyezzük, hogy a fajlagos termelékenységet úgy határozzuk meg, mint 1 gramm száraz sejttömeg által termelt fehérje grammját.
III. TÁBLÁZAT
A gazdaszervezet/plazmid rendszerek által termelt növekedési hormon fajlagos termelékenység különböző fermentációkban
Törzs ODéóo to od660 te Száraz sejttömeg (D.W.) te Fajlagos termelékenység (S. P) A glükóz után adott szénforrás
S0732/pMF 5607 8,5 15,25 8,5 0,050 Nátrium-laktát
Tef (bGH) 10,2 20,00 6,5 0,080
S093O/pMF 5605 12,2 45,00 14,1 0,124 Fruktóz (43 g)
Ampr (bGH) 12,8 48,00 14,8 0,093 Fruktóz (43 g)
S093O/pMF 5607 11,9 40,75 15,1 0,140 Fruktóz
S093O/pEFF 920 - 50,00 11,8 0,143 Fruktóz a rajttól
Ampr (p GH) 8,0 50,00 15,9 0,127 a végig (75 g) Fruktóz (30 g)
0,1 38,50 13,8 0,099 Fruktóz (33 g)
12,2 56,00 17,4 0,125 Fruktóz (45g)
8,3 56,00 17,2 0,096 Fruktóz (45 g)
S093O/pEFF 920 12,7 52,00 17,0 0,101 Fruktóz (40 g)
(pGH) ATCC 12435 13,0 36,00 12,5 0,108
pEFF 902 (pGH) (λΡι, rendszer)
Megiegyzések:
t<, - ODfiéo a fruktóz vagy nátrium-laktát betáplálás rajtjánál - ODööo a fermentáció végén
Száraz sejttömeg (D.W.) te - Száraz tömeg mg-ban a fermentáció végén Fajlagos termelékenység (5.P.) - Fajlagos termelékenység 1 gramm száraz sejttömeg által termel gramm/fehérjeként meghatározva
17. PÉLDA bGH-t kifejező nagy kópiaszámú plazmid megalkotása
Elhatároztuk, hogy megalkotunk egy nagy kópiaszámú, bGH-t kifejező plazmídot, és ezt a plazmídot magában foglaló Escherichia coli-t fermentáljuk, a 16. példában leírt optimalizált körülményeket alkalmazva
A bGH-t kifejező, nagy kópiaszámú plazmid megalkotását a 48. ábrában mutatjuk be. A pMFS 2005-ben (9. ábra és ATCC 67362 törzs) levő hSOD gént helyettesítjük a pMFS 5605-ből (42. ábra) származó bGH génnel. Az így létrejövő plazmid, amelyet pMFS 2006-nak nevezünk, tetraciklin-rezisztens, és ezt a plazmídot vezetjük be Escherichia coli S093O-ba.
Növesztés és kifejeződés fermentorban
Ennek a tenyészetnek a fermentálást körülményei lényegében azonosak azzal, amelyet a 16. példában leírtunk. Mivel a pMFS 2006-ot tartalmazó sejtek tetraciklin-rezisztensek (és ezért szegényesen nőnek minimál tápközegen), az oltótenyészetet 1 ml LB tápközeg45 gél egészítjük ki, hogy elősegítsük a jó növekedést. Az egy éjszakán át nőtt tenyészet OD66o értéke mintegy 2-3. A fermentor 800 ml tápközeget tartalmaz és a Z oltótenyészet teljes 200 ml-ét (vagy közel a teljes mennyiséget) adjuk a fermentorhoz, hogy 0,2-0,4 OD660 értéket kapjunk. A hozzáadott glükóz mennyisége függ a kívánt OD értéktől a fruktóz betáplálás előtt. 10-12 OD értékhez 10 g-ot adunk, míg 30 OD értékhez 30 g-ot adunk (általában a kapcsolat 1 g glükóz 1 OD egységhez).
Az oldott oxigénben (D. O.) való hirtelen növekedés j elzi a glükóz elfogyásának időpontj át. Ebben a stádiumban 20 ml ffuktózt adunk hozzá és a szivattyút összekötjük egy 100 ml-es tartállyal, amely 50%-os fruktózt tartalmaz. A D. O. néhány perccel a fruktózbeadagolás után csökkenni kezd és eléri a mintegy 20-30%-ot; ennél a pontnál a kevertetést csökkentjük, hogy a D.O. érték ne legyen nagyobb, mint 15%. Ezt a kémiai indukciót mintegy 3 órán át végezzük.
AIV. táblázat mutatja a különböző fermentációkban kapott bGH fajlagos termelékenységét. Az eredmények azt demonstrálják, hogy acetát hozzáadása a tápközeghez hozzájárul a fajlagos termelékenység növekedéséhez mintegy 0,2 értékkel; az alkalmazott acetát-koncentrációt a tápközegek összetételénél adjuk meg aló. példában.
IV. TÁBLÁZAT
Fermentorban létrejött bGH fajlagos termelékenységek (S.P.) Escherichia coli S<Z)920/pMFS 2006-ot alkalmazva különböző fermentációkban
OD660 to Száraz tömeg to OÜ660 te Száraz tömeg te Fajlagos termelékenység (S.P.) Hozzáadás a tápközeghez Fruktóz hozzáadás a rajtnál (g)
8,8 25,5 20,5 5,5 0,143 acetát nélkül 25
N.D. N.D. 18,6 5,5 0,220 acetát 30
11,0 4,3 34,7 10,7 0,153 acetát nélkül 35
11,4 3,8 30,0 9,9 0,164 acetát nélkül 30
N.D. N.D. 36,5 12,1 0,160 acetát nélkül 25
N.D. N.D. 16,5 5,9 0,160 acetát nélkül 25
N.D. N.D. 39,5 11,7 0,230 acetát 25
N.D. N.D. 25,0 7,2 0,220 acetát 27
N.D. N.D. 33,0 10,7 0,200 acetát 33
N.D. N.D. 14,0 4,7 0,190 acetát 20
Megjegyzések (rövidítések) t0 - OD660 a fruktóz betáplálás rajmánál te - ODé6o a fermentáció végén
Száraz tömeg (D. W)t0 - száraz tömeg mg-ban a fruktóz betáplálás rajtjánál Száraz tömeg (D.W)te - száraz tömeg mg-ban a fermentáció végén
Fajlagos termelékenység (S.P) = fajlagos termelékenység 1 g száraz sejttömeg által termelt gramm fehérjében meghatározva
N. D. = nem határoztuk meg
18. PÉLDA
Transzláció-fokozót tartalmazó deo kifejező vektorok megalkotása
A deo P1-P2 promotorokat és a kevéssé módosított deo riboszomális kötőhelyet magában foglaló pMF 5531 plazmid (1. példa és 4. ábra) hSOD analóg fehérje alacsony szintű kifejeződését irányítja. Olins P.O. és Rangwala S.H. beszámoltak arról a Molecular Genetics of Bacteria and Phages elnevezésű találkozón, 1987-ben (Cold Spring Harbor Laboratory, New York), hogy az AT-ben gazdag szekvenciák a riboszomális kötőhelytől fölfelé fokozhatják a prokarióta gének kifejeződését bizonyos körülmények között.
Elhatároztuk, hogy megvizsgáljuk, vajon az AT-ben gazdag szekvenciák fokozzák-e a prokarióta promotorok, mint pl. a deo promotor által irányított eukarióta gén kifejeződést.
Abból a célból, hogy ezt elérjük, a pMF 5534 plazmidot alkotjuk meg a pMF 5531-ből olyan módon, ahogyan ezt a 43. ábrában és az ábrák magyarázatában leírjuk. Ez a plazmid 5’—>3’ irányban tartalmazza a teljes deo P1-P2 promotor szekvenciát, beleértve egy további, AT-ben dús szekvenciát, egy Ndel restrikciós helyet és a hSOD gént. A pMF 5534 plazmidot Escherichia coli MC 1061 törzsbe vezetjük be transzformációval. Számos egyedi telepet veszünk fel és vizsgálunk meg kifejeződésre 0,3% glükózt és 100 egység/ml ampicillint is tartalmazó LB tápközegben, ahol az LB tápközeg M9 minimál sóoldattal van pufferolva [az LB tápközeget a 13a példában írjuk le; az M9 minimál sóoldatot Miller J.M. írja le az „Experiments in Molecular Genetics” című kiadvány (Cold Spring Harbór Laboratory, 1972) 431. oldalán]. Ezek a pMF 5534-et tartalmazó sejtek meglepő módon nagyon magas szinten fejeznek ki hSOD-t, míg a pMF5531 szülő plazmid nagyon gyenge kifejezője a hSOD analógnak.
Meg kell jegyeznünk, hogy az egyetlen különbség e között a két plazmid között az, hogy a pMF 5534 tartalmazza az AT-ben gazdag szekvenciát, és ez azt demonstrálja, hogy az AT-ben gazdag szekvencia nagy mértékben fokozza a kifejeződést. A pMF 5534 plazmidot Escherichia coli S093O (F ) törzsben deponáltuk az ATCC-nél ATCC 67703 számon. A hSOD analóg pMF 5534 plazmidot alkalmazó termelésének további részleteit a 19. példában adjuk meg; meglepő módon úgy találjuk, hogy a hSOD analóg termelési szintje 2-5-ször magasabb 30 °C hőmérsékleten, mint 37 °C hőmérsékleten.
Abból a célból, hogy megvizsgáljuk, vajon a megnövekedett kifejeződés társul-e magas szintű mRNS szintézissel vagy megnövekedett transzlációval, mRNS-t izolálunk késői lóg fázisú növekvő sejtekből, különböző gazdaszervezet-plazmid rendszerekből pl. ATCC 12435/pMF 5531-ből, ATCC 12435/pMF 5534-ből, és kontroliokból, pl. ATCC 12435-ből és S093O-ból (Adeo, deo R“). A tisztított mRNS-t az összes mintából először átvisszük azonos koncentrációba, majd keresztülvisszük egy nitrocellulóz szűrőt tartalmazó pont-folt („dot-blot”) készüléken. A nitrocellulóz szűrőt hibridizáljuk a #2913 szintetikus DNS vizsgáló mintához (amelyet a 4. ábra leírásánál mutatunk be), amely tartalmazza a deo P2 átírt üzenet 5' végi nem transzlatált szekvenciáját. A röntgensugár filmen megfigyelt pontokat egyeztetjük a nitrocellulóz szűrővel, és a nitrocellulóz szűrő szegmenseit kimetszük és szcintillációs számlálón megszámoljuk. Az Escherichia coli S093O mRNS-t alkalmazva kialakult számot használjuk zéró kontrollnak, mivel az S093O nem tartalmaz deo szekvenciákat; az ATCC 12435 mRNS által produkált számokat úgy tekintjük, mint a plazmidot nem tartalmazó gazdasejtekben jelen levő deo mRNS mennyiségét, és ezt kivonjuk a pMF 5531 -et és pMF 5534-et tartalmazó gazdasejtekből kapott számokból. Az eredmények összehasonlítása a pMF 5531-et és pMF 5534-et tartalmazó gazdasejtek között azt mutatja, hogy a pMF 5534et tartalmazó gazdasejtekben az mRNS szintek 1,5-2,5szörösen nagyobbak, mint a pMF 5531-ben. Ha azonban ugyanezt az összehasonlítást a fehérje csík intenzitás alapján végezzük, ez 15-20-szoros növekedést tár fel az S093O/pMF 5534 extraktumában. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a hSOD kifejeződés növekedése a transzláció szintjén történik.
A hSOD-nek deo Pl által elősegített kifejeződése Amint ezt a technika állásában megtárgyaltuk, a deo
Pl-et gyenge promotomak tekintjük. Ezenkívül azt is tudjuk, hogy a deo Pl a hSOD analóg fehérje gyenge promotora, mivel a pMF 5516 plazmid (3. ábra), amely a deo Pl-et tartalmazza (de a deo P2-t nem a 48 bp-s szakasz kiiktatása miatt), nem fejez ki mérhető mennyiségben hSOD analóg fehérjét. Abból a célból, hogy megvizsgáljuk azt a lehetőséget, vajon az AT-ben gazdag szekvencia fokozhatja-e a deo Pl által elősegített kifejeződést, a pMF 5534 plazmidból a deo P2-t eltávolítjuk. Ezt úgy étjük el, hogy a pMF 5534-et elhasítjuk AvrII-vel és BglII-vel, amely eltávolít mintegy 500 bp-t a deo Pl és a deo RBS között. A kohezív végek Klenow enzimmel végzett betöltési reakciója után a nagy fragmentumot izoláljuk agaróz gélről, tisztítjuk, és T4 ligázzal ligáljuk. Az új plazmidot, amelyet pMF 5540nek nevezünk (44. ábra) transzformációval különböző gazdaszervezetekbe vezetjük és ampicillint, valamint 0,3% glükózt is tartalmazó LB tápközegben növesztjük. Az SDS elektroforézis feltár egy váratlanul erőteljes csíkot, amely a tisztított hSOD-vel együtt vándorol. A pMF 5540-et vagy pMF 5534-et tartalmazó gazdaszervezetek teljes sejt fehérje csík intenzitásainak összehasonlítása SDS gélen meglepő módon azt tárja fel, hogy az egyedül deo 1 -et tartalmazó pMF 5540 pMF 5534nél megfigyelt hSOD termelés mintegy 50-75%-át termeli.
Az itt levont következtetés az, hogy a deo Pl által elősegített szinte elhanyagolható hSOD kifejeződés az AT-ben gazdag fokozó szekvencia révén annyira megnövekedett, hogy egy ilyen konstrukciót tartalmazó plazmidot magában foglaló sejtek a hSOD analóg fehérje jó kifejezői.
A pMF 5540-et tartalmazó Escherichia coli gazdasejtek nincsenek alávetve a katabolit-repressziónak, mivel a promotor a deo P1. Az ilyen sejtek ennél fogva a hSOD analóg kifejezése céljából növekednek glükóz jelenlétében is, és nincs szükség átváltani fruktózra (lásd a katabolit represszió tárgyalását a 13. példában).
Az A T-ben gazdag terület nem rendelkezik öröklődő promotor aktivitással
Annak bizonyítására, hogy a pMF 5534-ben jelen levő AT-ben gazdag fragmentum (a fokozó) nem rendelkezik öröklődő promotor aktivitással, a pMF 5534-et elhasítjuk, hogy eltüntessük a teljes deo P1-P2 promotort a módosított, AT-ben gazdag terület és a riboszomális kötőhely kivételével, amint ezt a 44. ábrában bemutatjuk. Az így létrejött plazmidot, a pMF 5541et, Escherichia coli S093O-ba vezetjük be, és az egyes kiónokat megvizsgáljuk hSOD kifejezésesre. A deo Pl-P2-vel nem rendelkező plazmidokat magában foglaló kiónok SDS gélelektroforézise nagyon gyenge csíkot mutat, amely a hSOD-vel vándorol együtt. A kifejeződésnek ez a nagyon alacsony szintje valószínűleg a „kiolvasási” aktivitásnak tulajdonítható, amely rendkívül alacsony szinten termel mRNS-t, és amelyet fokozni lehet az AT-ben gazdag fokozó szekvencia nagy transzlációs aktivitásával. így a kísérletek azt jelzik, hogy az AT-ben gazdag területnek valószínűleg nincs öröklődő promotor aktivitása.
A fokozó aktivitást kimutatjuk a pMF-945 plazmidot tartalmazó gazdaszervezetekben is, amely plazmid magas szinten termel pGH analógot (45. ábra). Egy hasonló konstrukció (46. ábra), amely a pMF 5608 plazmidban bGH gént foglal magában, alacsony szinten termel bGH analógot.
19. PÉLDA
A humán szuperoxid diszmutáz (hSOD) és a szarvasmarha növekedési hormon (bGH) kiválasztása a tápközegbe réz és cink ionok jelenlétében
Az 1. és 2. példákban kimutattuk, hogy hSOD analóg magas szintű termelését érhetjük el olyan plazmidokat tartalmazó Escherichia coli gazdasejtek révén, amelyek a hSOD gént a deo P1-P2 promotorok szabályozása alatt tartalmazzák. Ezt követően úgy találjuk, hogy az ilyen, szénforrást és Cu2+/Zn2+ ionokat tartalmazó minimál só tápközegben fermentorban nőtt Escherichia coli sejtek meglepő módon a hSOD analógot a tápközegbe bocsátják. Ezt olyan tenyészeteknél figyeljük meg, amelyek 16 óránál tovább nőnek fermentorban. A sejtmentes tápközeg mintáinak SDS gélelektroforézise feltár Coomassie festés után egy olyan csíkot, amely a tisztított hSOD analóg fehérjével együtt vándorol. Ennek a csíknak az intenzitása növekszik az idővel egészen 40-60 óráig a fermentáció kezdetétől számítva.
Az egyik kísérletben Escherichia coli S093O, amely pMF 2OO5-öt, egy nagy kópiaszámú SÓD kifejezőt (9. ábra) foglal magában, tenyészetét először szénforrásként glükózon növesztjük, majd amikor a glükóz kifogy OD660 = 24 értéknél, fruktózt adunk hozzá. A tenyésztés körülményei a hSOD analóg termesztéshez hasonlóak a kis levegőztetési körülményekhez (lvvm) pH 7,4-nél és 37 °C hőmérsékleten.
Amint fentebb leírtuk, egy olyan csíkot találunk a sejtmentes tápközeg SDS géljén, amely együtt vándorol a tisztított hSOD analóggal. Abból a célból, hogy bizonyítsuk: ez a csík valóban a hSOD analógnak felel meg, Westem-folt vizsgálatot végzünk és a nitrocellulóz szűrőt radioaktívan jelzett anti-hSOD antitesttel reagáltatjuk. Az antitesttel reagál a megfigyelt csík, így igazolva, hogy a fehéije egy hSOD analóg. Abból a célból, hogy megvizsgáljuk, vajon a hSOD analóg enzimesen aktív-e, a hSOD-t in vitro megvizsgáljuk McCord és munkatársai eljárása szerint (15. példa). Az SDS gélen látható fehérje csík és az enzimes aktivitás mennyiségi értékei szoros megegyezésben vannak. ODf,6o = 30 értéknél a hSOD enzimaktivitás a tápközegben 0,45 g/liter.
A kontroll kísérletekben, ahol Cu2+/Zn2+-t nem adunk a tápközegbe, hSOD analóg fehéije nem bocsátódik ki a tápközegbe.
Drámaibb megfigyelést teszünk a 30 °C hőmérsékleten, glükózt és Cu2+/Zn2+ ionokat tartalmazó minimál tápközegben nőtt, pMF 5534 plazmidot magában foglaló Escherichia coli S093O-cal. Ez a gazdaszervezet-vektor rendszer, amely konstitutíven fejez ki hSOD analógot, végig képes glükózon növekedni; nyilvánvaló kifejeződést érünk el a deo P1+ fokozóval, és talán részben deo P2+ fokozóval. A hSOD a sejtben gyülemlik fel mintegy 24 óráig a fermentáció rajtjától, így termelve 3 g/1 hSOD analógot OD660 = 25-nél.Ennél a stádiumnál a hSOD kezd kijutni a tápközegbe. További 12-15 óra múlva a gélelektroforézis feltárja, hogy a hSOD analóg fehérje mintegy 1,1 g/1 koncentrációban van a tápközegben, míg a sejtekben a szint kb. 2,0 g/1. A tápközegben találunk kevés nem hSOD fehérjét is.
Meg kell jegyeznünk, hogy a pMF 5534-et magában foglaló Escherichia coli fermentációjához alkalmazott hőmérséklet 30 °C. Meglepő módon azt tapasztaljuk, hogy a fokozó szekvenciát tartalmazó plazmidok 2-5ször több hSOD analógot termelnek, amikor 30 °C hőmérsékleten nőnek, mint 37 °C hőmérsékleten.
Ezt követően rájöttünk arra, hogy a fehéije kibocsátása a tápközegbe Cu2+/Zn2+ ionok jelenlétében nem tűnik egyedinek kizárólag a hSOD-t túltermelő sejtek számára. A pMF 5608-at (46. ábra), egy szarvasmarha növekedési hormon (bGH) gént deo promotorok szabályozása alatt magában foglaló plazmidot tartalmazó Escherichia coli gazdaszervezet, amely azonos körülmények között nőtt a fentebb leírtakkal (beleértve Cu2+/Zn2+ hozzáadását is) egy sor fehérjét bocsát ki a tápközegbe. Mivel azonban a szarvasmarha növekedési hormon könnyen aggenerálódik in vivő, a bGH aránya ebben a kiválasztott fehérjében nagyon alacsony. Kontroll kísérletekben, ahol Cu2+/Zn2+-t nem adunk, nagyon kevés fehérje választódik ki.
Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a fehéije kiválasztása a tápközegbe függ a Cu2+/Zn2+ ionok jelenlététől. Ennek a kibocsátásnak a mechanizmusa nem világos. Bár nem kívánunk egyetlen teóriához sem kötődni, úgy véljük, hogy ezek az ionok megváltoztatják a sejtek pórusait úgy, hogy az oldható fehérjék kivándoroljanak a sejtből. Lehetséges, hogy a réz ionok egyedül vagy a cink ionok egyedül, vagy más kétértékű ionok képesek kialakítani ugyanezt a hatást.
20. PÉLDA pGH „független kifejező plazmidok megalkotása szintetikus kapcsolók nélkül
A független pGH kifejező plazmidok megalkotását a
12. példában írtuk le. Elhatároztuk, hogy hasonló plazmidot alkotunk meg szintetikus kapcsolók alkalmazása nélkül.
Egy ilyen plazmid megalkotásának vázlatos körvonalait adjuk meg a 4951. ábrákban. A klónozáshoz a kulcsok az NlalII restrikciós enzim alkalmazása, és az a tény, hogy a pGH N-terminális és C-terminális részei azonosak a bGH hasonló részeivel. Fragmentumokat készítünk úgy, ahogyan ezt a 49. ábrában bemutatjuk, és a fragmentumokat tartalmazó (30. ábra) ligáit plazmidot Escherichia coli MC 1061 -be transzformáljuk és LB+Tet agar lemezekre szélesztjük. Abból a célból, hogy az Smal-NlalII fragmentumot magában foglaló telepeket azonosítsuk, a pl07 plazmid (49A. ábra) Pstl-PstI fragmentumát izoláljuk és Xmal-gyel hasítjuk, amely az Smal helynél hasít (lásd a 49. ábrát). Az így létrejövő 340 bp-s fragmentumot gélről tisztítjuk, hézag (nick) transzlációnak vetjük alá, és 32P dCTP-vel jelezzük; ezt használjuk fel azután a hibridizáláshoz a kiónok azonosítására. A hibridizálás 5*SSC-ben történik. Számos pozitív kiónt veszünk fel és plazmid DNS-t készítünk belőlük Bimbóim és munkatársai módszerével [J. Nucl. Acid. Rés. 7, 1513 (1979)]. Ezeket a mini készítményeket azután különböző restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, pl. EcoRI-gyel, Scalgyel, Pstl-gyel, hogy igazoljuk: az EcoRI és Seal restrikciós helyek jelen vannak. Két kiónt veszünk fel, plazmidjukat CsCl sűrűséggradiens centrifugálással tisztítjuk; ezeket pGH 30-2nek és pGH 30-19-nek nevezzük (50. ábra). Abból a célból, hogy a végső konstrukciót kialakítsuk, a pFSAL B27 és pGH 30-2 plazmidokat hasítjuk a fragmentumokat tisztítjuk, majd ligáljuk, amint ezt az 51. ábrában bemutatjuk.
A ligáit keveréket alkalmazzuk Escherichia coli MC 1061 transzformálására. Ennek a transzformálásnak számos kiónját vesszük fel és vizsgáljuk meg kifejeződésre. A kifejeződést úgy követjük, hogy sejteket növesztünk 30 °C hőmérsékleten 1 ml LB tápközegben, majd ezt követi: a „hő-sokk” 42 °C hőmérsékleten 2 órán át, majd az elemzés SDS gélen. Két kiónt emelünk ki további elemzésre, plazmid DNS-t készítünk CsCl gradiens centrifugálással, és az egyik plazmidot felhasználjuk Escherichia coli ATCC 12435 törzs transzformálására. Számos kiónt vizsgálunk át kifejeződésre, és az egyiket, amelyet pMFS 928-nak nevezünk, kiemeljük az új, független pGH kifejező vektorok képviselőjeként. Az
EcoRI-HindlII fragmentum (amely a cll RBS-t és a pGH analóg szekvenciát tartalmazza) szekvenciaelemzése igazolja a publikált szekvenciát.
A pGH analóg kifejeződése ebből a plazmidból magas, és a fajlagos termelékenység mintegy 0,12.
Ezt követően arra jöttünk rá, hogy az ez által a plazmid által kifejezett met-asp-gln-pGH analógnak valószínűleg van 1 glicin gyök belső kiiktatása (lásd az 51. ábra leírását). Ennek megfelelően a pMFS 929 plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt az 52. ábrában bemutatjuk, hogy a pMFS 928-hoz hasonló plazmidot alkossunk meg, amely azonban tartalmazza a teljes pGH analóg szekvenciát. A pMFS 929 plazmidot, amely független plazmid és met-asp-gln-pGH analóg fehéqét fejez ki magas szinten, Escherichia coli (F-) W3110 törzsben az ATCC-nél deponáltuk ATCC 67705 deponálási számon. (Az Escherichia coli F~ törzsek leírásával kapcsolatban lásd a 21. példát).
21. PÉLDA
A plazmidokhoz gazdaszervezetként alkalmazott Escherichia coli F törzsek
A következő Escherichia coli F törzseket alkotjuk meg úgy, ahogy az alábbiakban leírjuk, és ezeket alkalmazhatjuk gazdaszervezetként a jelen leírás más részeiben leírt alábbi plazmidokhoz: A4275, A5277, A4278, A4280, A4255(F“) és S093O(F). Azt aS093O(F“) törzset, amely pMF 5534 plazmidot foglal magában, az ATCC-nél 67703 számon deponáltuk, míg a pMFS 5607 plazmidot magában foglaló azonos törzset ATCC 67704 számon deponáltuk.
(a) Az A4275, A5277, A4278 és A4280 törzsek előállítása
A fentebb felsorolt hat Escherichia coli F_ törzset az Escherichia coli Genetic Stock Center-tői (C.G.S.C) (Department of Biology, Yale University, P.O.B. 6664, New Haven, Connecticut) szerezzük be. Ezeket úgy transzformáljuk, hogy hordozzák a Xcl 857 N+ ABamHIA Hl kriptikus profágot, és „kínálással” megszabadítjuk a TnlO transzpozontól. Ezeket ellenőrizzük a hőmérséklet-érzékeny represszor j elenlétére (az immunitás elvesztése 42 °C hőmérsékleten) és az Ν' gén jelenlétére (egy N-defektív fág kiegészítése).
C.G.S.C törzsek száma A törzs elnevezése Az előállított BTG törzs
6300 F-MG 1655 A 4275
4474 F-W3110 A 5277
5290 F-W 2637 A 4278
6315 FÁIM 294 még nem áll rendelkezésre
4452 FN007 A 4280
4448 F-1100 még nem áll rendelkezésre
Meg kell jegyeznünk, hogy a C.G.S.C 4474 számmal jelzett (F_) W 3110 törzset, amely a pMFS 929 plazmidot foglalja magában, az ATCC-nél ATCC 67705 számon deponáltuk.
(b) Az A4255(F ) és S093O(F) törzsek előállítása
Az Escherichia coli A4255 és S093O törzseket, amelyeket a leírásban már ismertettünk (I. táblázat), „kúráljuk” hogy az Escherichia coli 4255(F~) illetve S093O(F) törzseket állítunk elő. Az alkalmazott „kúrálási” eljárást Miller J.H. írja le az „Experiments in Molecular Genetics” című kiadványban (Cold Spring Harbor Laboratory), 104-106. oldal (1972).
22. PÉLDA
A λ cl857 represszor gént a deo Pl szabályozása alatt tartalmazó független humán növekedési hormon (hGH) kifejező plazmid megalkotása
A pTV 104(2) plazmidot (ATCC 39384; letétbe helyezve: 1983. június 29-én) a 34. ábrában mutatjuk be. Ez tartalmazza a humán növekedési hormon teljes szekvenciáját, és a hGH fehérje analóg fehéije magas szintű kifejezője a ?.PL promotor szabályozása alatt. A pTV 104(2) plazmidot a hGH szekvencia 3' végétől közvetlenül lefelé és az Ndel, helytől éppen felfelé levő Smal helynél elhasítjuk; a plazmidok így létrejövő teljes hosszúságú lineáris formáját ligáljuk a megcsonkított deo Pl-et és a cl 857 represszor szekvenciát tartalmazó kis fragmentumhoz, amelyet úgy kapunk meg, hogy a pFSAL-B27 plazmidot (ATCC 67071, és 24. ábra) elhasítjuk Sspl-gyel.
Az így létrejövő plazmid, amelyet pTVR 723-6-nak nevezünk független a gazdaszervezet kromoszómáin levő λ génektől. Ez 5'—>3' irányban és az óramutató járásának megfelelően tartalmazza a XPL-t, a hGH kódoló szekvenciát, a megcsonkított deo Pl-et és a cl 857 represszor szekvenciákat. A pTVR 723-6 plazmidot az Escherichia coli ATCC 12435 gazdaszervezetbe transzformáljuk, ez magas szintű hGH analóg fehérje kifejeződést mutat, amikor hőindukálható módon 42 °C hőmérsékleten indukáljuk.
23. PÉLDA
A szarvasmarha növekedési hormon (bGH) kifejeződések összehasonlítása a teljes hosszúságú deo Pl-et vagy megcsonkított deo Pl-et tartalmazó független plazmidokból
A pFSAL-B27 (24. ábra, és ATCC 67071) „független” plazmid (független a gazdaszervezet kromoszómáiban levő λ génektől). Ez bGH analógot fejez ki a λ promotor szabályozása alatt, hőindukcióval van ellenőrizve a cl 857 represszor révén a megcsonkított deo Pl promotor szekvencia szabályozása alatt (amint ezt a
9. példában leírjuk).
Új plazmidot alkotunk meg, amely azonos a pFSALB27-tel, azzal a különbséggel, hogy a teljes hosszúságú deo Pl szekvenciát foglalja magában.
(a) A pMF-B27plazmid megalkotása
A pMFDC plazmidot (24. ábra), amely a teljes hosszúságú deo Pl szekvenciát tartalmazza, valamint a pFSAL-B27 plazmidot egyaránt hasítjuk az AatlI és Nsil restrikciós enzimekkel. Az egyes plazmidok egyedi AatlI helye az ampicillin rezisztencia szekvenciában, és az egyedi Nsil hely a cl 857 szekvenciában van, vagyis a deo Pl szekvenciától lefelé. A pFSAL-B27-ből kapott nagy fragmentumot T4 ligázzal ligáljuk a pMF 54DCből kapott, a deo Pl szekvenciát magában foglaló kis AatlI-Nsil fragmentumhoz. Az így létrejövő plazmid transzformálását követően Escherichia coli F W2637 törzsbe (21. példa) egy kiónt tisztítunk és ebben a plazmidban, amelyet pMF-B27-nek nevezünk, a teljes hosszúságú deo Pl promotor jelenlétét igazoljuk.
(b) A bGH kifejeződés összehasonlítása MF-B27 és FSAL-B27 plazmidokból
W2637 tenyészeteit, amely törzs vagy apFSAL-B27 plazmidot, vagy az új pMF-B27 plazmidot tartalmazza, összehasonlítjuk. Ezeket 30 °C hőmérsékleten növesztjük 0,8 OD660 értékig, majd a hőmérsékletet 42 °C hőmérsékletre emeljük, hogy a bGH szintézist indukáljuk. 1 órás időközönként 1 OD-ekvivalens sejtet távolítunk el az egyes tenyészetekből, üledékbe visszük, feldolgozzuk és elemezzük SDS poliakrilamid gélelektroforézissel. Az eredmények azt mutatják, hogy az új pMFB27-et magában foglaló tenyészetek a bGH-t 5-8-szor alacsonyabb szinten fejezik ki, mint a pFSAL27-et magában foglaló tenyészetek.
Abból a célból, hogy ezt a felfedezést igazoljuk, ezt a két tenyészetet 2 literes fermentorokban, minimál tápközegben növesztjük. A kifejeződési szintek, amint ezt a Coomassie kékkel festett SDS poliakrilamid gél denzitometriás leolvasásával és lpg standard bGH fehéqevel való összehasonlításával megítéljük, ismét azt mutatják, hogy a pMF-B27 által termelt bGH szintek 5-7-szer alacsonyabbak, mint azok a szintek, amelyeket pFSALB27-tel kapunk.
így tehát az a tény, hogy a deo Pl konstrukció meg van csonkítva, meglepő előnyt ad át a kifejezett növekedési hormon szintjében az ezt magában foglaló plazmidnak.
Hasonlóképpen bármilyen megcsonkított deo Pl-tői, amely a deo Pl szekvencia egy részét magában foglalja, de ki van iktatva belőle az EcoRI helyen levő ismert operátor-promotor terület (lásd 9. példa), elvárható, hogy szabályozza a λ cl 857 represszor termelését.

Claims (91)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás kívánt eukarióta eredetű polipeptid vagy azonos biológiai aktivitású polipeptid-analógja vagy ezek fúziós polipeptidjének előállítására, mely eljárás szerint alkalmas - expressziós plazmidként a kívánt eukarióta polipeptidet, analógját vagy a fúziós polipeptidet kódoló DNS-részletet magában foglaló plazmidot tartalmazó Escherichia coli gazdasejteket tenyésztünk, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként
    i) egy 5'—>3’ irányban a deoPl és deoPl tandem promotereket magába foglaló DNS-részletet;
    ii) egy riboszómakötőhelyet magába foglaló DNSrészletet;
    iii) egy ATG iniciációs kódont;
    iv) a kívánt polipeptidet, analógját vagy a fúziós polipeptideket az ATG iniciációs kódonnal azonos leolvasási fázisban kódoló DNS-részletet;
    v) egy, a gazdasejtekben működőképes, bakteriális plazmidból származó replikációs origót tartalmazó DNS-részletet; valamint vi) egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos sajátsággal kapcsolt gént magába foglaló DNS-részletet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli gazdasejtként S0732-, S0744-, MCI061-, S054O-, S0928-, S0929-, S093O- vagy vadtípusú sejteket (ATCC nyilvántartási szám: 12435) alkalmazunk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként zárt cirkuláris expressziós plazmidot tartalmazó gazdasejteket alkalmazunk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként a t/eo-operonból származó természetes deo-riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként a afeo-operonból származó természetes űfeo-riboszómakötőhely mutánsát tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy expressziós plazmidként a λ-bakteriofágból származó
    TAAGGAAATACTTACAT
    ATTCCTTTATGAATGTA szekvenciájú cll-riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként a λ-bakteriofágból származó, TAAGGAAGTACTTACAT
    ATTCCTTCATGAATGTA szekvenciájú cll-riboszómakötőhely mutánsát tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként a pBR322-plazmidból származó, természetben előforduló β-laktamáz-riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként
    AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA
    GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT szekvenciájú szintetikusan előállított riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként
    AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG
    GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT szekvenciájú szintetikusan előállított riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként
    GACAAGCCTAGGTTTGTTTAACTTTAAGGAGAAATCATA CTGTTCGGATCCAAACAAATTGAAATTCCTCTTTAGTAT szekvenciájú szintetikusan előállított riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként a pBR322- vagy pOPlA6-plazmidból származó replikációs origót tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként gyógyszer-rezisztenciát - mint szelektálható vagy azonosítható fenotípusos sajátságot kiváltó gént tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként ampicillin- vagy tetraciklinrezisztenciát kiváltó gént tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eukarióta polipeptidként az alábbiak valamelyikét állítjuk elő: humán réz/cink szuperoxid diszmutáz, humán mangán szuperoxid diszmutáz, humán glutation peroxidáz, humán növekedési hormon, marha növekedési hormon, sertés növekedési hormon és humán apolipoprotein-E.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló, pMF-5531 megjelölésű,
    4. ábrán látható restrikciós térképü expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  17. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként egy humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló, pMF-5519 megjelölésű,
    5. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  18. 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló, pMF-558-26 megjelölésű,
    6. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  19. 19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló, pMF-5536 megjelölésű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  20. 20. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló, pMF-5520 megjelölésű,
    7. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  21. 21. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló, pMF-2005 megjelölésű, 9. ábrán látható restrikciós térképű, ATCC-67362 nyilvántartási számon letétbe helyezett expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  22. 22. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló, pMFS-5533A megjelölésű,
    17. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  23. 23. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló, pMFS-5538 megjelölésű,
    18. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  24. 24. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként humán növekedési hormon analógot kódoló, pTVR-568-4 megjelölésű, 11. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  25. 25. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként marha növekedési hormon analógot kódoló, pMFS-5600 megjelölésű, 12. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  26. 26. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként marha növekedési hormon analógot kódoló, pMFS-5627 megjelölésű, 40. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  27. 27. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként marha növekedési hormon analógot kódoló, pMFS-5603 megjelölésű, 41. ábrán látható restrikciós térképü expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  28. 28. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként marha növekedési hormon analógot kódoló, pMFS-5605 megjelölésű, 42. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  29. 29. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként sertés növekedési hormon analógot kódoló, pEFF-905 megjelölésű, 38. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  30. 30. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként sertés növekedési hormon analógot kódoló, pEFF-920 megjelölésű, 39. ábrán látható restrikciós térképü expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  31. 31. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként marha növekedési hormon analógot kódoló, pMFS-2006 megjelölésű, 48. ábrán látható restrikciós térképű expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  32. 32. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fúziós polipeptidként mangán szuperoxid diszmutáz - glutation peroxidáz fúziós polipeptidet állítunk elő, és gazdasejtekként a pDGE4—3-jelű, 10. ábrán látható restrikciós térképű plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazzuk.
  33. 33. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fúziós polipeptidként humán növekedési hormon apolipoprotein-E fúziós polipeptidet állítunk elő, és gazdasejtekként a pTVR-580-35-jelű, 19. ábrán látható restrikciós térképű plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazzuk.
  34. 34. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként F~-sejteket alkalmazunk.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F~-sejtekként F“ MG1655-jelü sejteket alkalmazunk.
  36. 36. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F-sejtekként F W3110-jelű sejteket alkalmazunk (ATCC nyilvántartási szám: 67705).
  37. 37. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F-sejtekként F W2637-jelű sejteket alkalmazunk.
  38. 38. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F“-sejtekként F~ MM294-jelű sejteket alkalmazunk.
  39. 39. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F“-sejtekként F 1000-jelű sejteket alkalmazunk.
  40. 40. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F~-sejtekként F“ 1100-jelű sejteket alkalmazunk.
  41. 41. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejteket kis mértékű levegőztetés mellett tenyésztjük.
  42. 42. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejteket nem-glükóz szénforrást tartalmazó táptalajban tenyésztjük.
  43. 43. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként glicerint vagy fruktózt alkalmazunk.
  44. 44. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként szukcinátot alkalmazunk.
  45. 45. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként nátrium-laktátot alkalmazunk.
  46. 46. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként nátrium-malátot alkalmazunk.
  47. 47. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli gazdasejteket, glükózt tartalmazó táptalajban, majd a glükóz elfogyása után nem-glükóz szénforrást tartalmazó táptalajban tenyésztjük.
  48. 48. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként glicerint alkalmazunk.
  49. 49. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként szukcinátot alkalmazunk.
  50. 50. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként nátrium-laktátot alkalmazunk.
  51. 51. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként fruktózt alkalmazunk.
  52. 52. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy nem-glükóz szénforrásként nátrium-malátot alkalmazunk.
  53. 53. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli gazdasejteket oly módon tenyésztjük, hogy a tenyészethez kétértékű fémionokat is adunk.
  54. 54. Az 53. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy kétértékű fémionként Cu2+-ionokat alkalmazunk.
  55. 55. Az 53. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kétértékű fémionként Zn2+-ionokat alkalmazunk.
  56. 56. Az 53. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy kétértékű fémionként Cu2+- és Zn2+-ionok elegyét alkalmazzuk.
  57. 57. Az 53. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az Escherichia coli gazdasejteket 30 °C körüli hőmérsékleten tenyésztjük.
  58. 58. Eljárás kívánt eukarióta eredetű polipeptid vagy azonos biológiai aktivitású polipeptid-analógja előállítására, mely eljárás szerint alkalmas - expressziós plazmidként a kívánt eukarióta polipeptidet vagy analógját kódoló DNS-részletet magában foglaló expressziós plazmidot tartalmazó - Escherichia coli gazdasejteket hőérzékeny cl-represszor inaktiválódását kiváltó hőmérsékleten tenyésztünk, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként
    i) egy λ-bakteriofágból származó PtOL-promotert és PL,OL-operátort magába foglaló DNS-részletet;
    ii) egy riboszómakötőhelyet magába foglaló DNSrészletet iii) egy ATG iniciációs kódont;
    iv) a kívánt polipeptidet vagy annak analógját az ATG iniciációs kodonnal azonos leolvasási fázisban kódoló DNS-részletet;
    v) egy 5'->3' irányban a űfeoPl-promotert vagy működőképes részét, valamint a űfeoPl-promoter vagy működőképes része expressziós szabályozása alatt álló ZPL-promoter hőérzékeny represszorát kódoló szekvenciát magába foglaló DNS-részletet;
    vi) egy, a gazdasejtekben működőképes, bakteriális plazmidból származó replikációs origót tartalmazó DNS-részletet; valamint vii) egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos sajátsággal kapcsolt gént magába foglaló DNS-részletet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  59. 59. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként cI-857 hőérzékeny represszort tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  60. 60. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy Escherichia coli gazdasejtekként vad típusú Escherichia coli sejteket (ATCC nyilvántartási szám: 12435) vagy Escherichia coli MC1061 -sej teket alkalmazunk.
  61. 61. Az 58 igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként zárt cirkuláris plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  62. 62. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként a λ-bakteriofágból származó, TAAGGAAATACTTACAT
    ATTCCTTTATGAATGTA szekvenciájú cll-riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  63. 63. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként a λ-bakteriofágból származó, TAAGGAAGTACTTACAT
    ATTCCTTCATGAATGTA szekvenciájú cll-riboszómakötőhely mutánsát tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  64. 64. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként a pBR322-plazmidból származó, természetben előforduló β-laktamáz-riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  65. 65. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként
    AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA
    GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT szekvenciájú szintetikusan előállított riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  66. 66. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként
    AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG
    GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT.
    szekvenciájú szintetikusan előállított riboszómakötőhelyet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  67. 67. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként a pBR322- vagy pO PlA6-plazmidból származó replikációs origót tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  68. 68. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként gyógyszer-rezisztenciát -- mint szelektálható vagy azonosítható fenotípusos sajátságot kiváltó gént tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  69. 69. A 68. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként ampicillin- vagy tetraciklinrezisztenciát kiváltó gént tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  70. 70. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy eukarióta polipeptidként az alábbiak valamelyikét állítjuk elő: humán réz/cink szuperoxid diszmutáz, humán mangán szuperoxid diszmutáz, humán glutation peroxidáz, humán növekedési hormon, marha növekedési hormon, sertés növekedési hormon és humán apolipoprotein-E.
  71. 71. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként pFSAL-B27 megjelölésű, 24. ábrán látható restrikciós térképű, ATCC-67071 nyilvántartási számon, pFSAL-130-B27 néven letétbe helyezett, marha növekedési hormon analógot kódoló expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  72. 72. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként pEFF-902 megjelölésű, 36. ábrán látható restrikciós térképű, sertés növekedési hormon analógot kódoló expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  73. 73. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként pEFF-9021 megjelölésű, 37. ábrán látható restrikciós térképü, sertés növekedési hormon analógot kódoló expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  74. 74. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként pMFS-929 megjelölésű, 52. ábrán látható restrikciós térképü, ATCC-67705 nyilvántartási számon letétbe helyezett sertés növekedési hormon analógot kódoló expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  75. 75. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként ρΞΟϋβΜΑΧ-Π-οΙ megjelölésű, 25. ábrán látható restrikciós térképű humán réz/cink szuperoxid diszmutáz analógot kódoló expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  76. 76. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekkéntpTVR-700-2 megjelölésű, 26. ábrán látható restrikciós térképü, apolipoprotein-E analógot kódoló, expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  77. 77. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekkéntpTVR-590-4 megjelölésű, 27. ábrán látható restrikciós térképű, apolipoprotein-E analógot kódoló, expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  78. 78. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként pTVR-714 (vagy pTVR-721-4) megjelölésű apolipoprotein-E analógot kódoló expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  79. 79. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként F~-sejteket alkalmazunk.
  80. 80. A 79. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F'-sejtekként F“MG1655-jelü sejteket alkalmazunk.
  81. 81. A 79. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F'-sejtekként F'W3110-jelű sejteket alkalmazunk (ATCC nyilvántartási szám: 67705).
  82. 82. A 79. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F'-sejtekként F“W2637-jelü sejteket alkalmazunk.
  83. 83. A 79. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F'-sejtekként F'MM294-jelü sejteket alkalmazunk.
  84. 84. A 79. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F'-sejtekként FlOOO-jelű sejteket alkalmazunk.
  85. 85. A 79. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F'-sejtekként az F“11 OO-jelü sejteket alkalmazunk.
  86. 86. Eljárás kívánt eukarióta eredetű polipeptid vagy azonos biológiai aktivitású polipeptid-analógja előállítására, mely eljárás szerint alkalmas - expressziós plazmidként a kívánt eukarióta polipeptidet vagy analógját kódoló DNS-részletet magában foglaló plazmidot tartalmazó - Escherichia coli gazdasejteket tenyésztünk, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként
    i) egy 5’—>3' irányban a deoPl és deoP2 tandem promotereket magába foglaló DNS-részletet;
    ii) egy transzláció mértékét fokozó AT-gazdag szekvenciarészletet;
    iii) egy Ndel restrikciós hasítóhelyet;
    iv) egy ATG iniciációs kódont;
    v) a kívánt polipeptidet vagy annak analógját az ATG iniciációs kodonnal azonos leolvasási fázisban kódoló DNSrészletet;
    vi) egy, a gazdasejtekben működőképes, bakteriális plazmidból származó replikációs origót tartalmazó DNS-részletet; valamint vii) egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos sajátsággal kapcsolt gént magába foglaló DNS-részletet tartalmazó expressziós plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
    HU 213 418 Β
  87. 87. A 86. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként humán réz/cink szuperoxid diszmutázt kódoló expressziós plazmídot hordozó gazdasejteket alkalmazunk.
  88. 88. A 86. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy gazdasejtekként az ATCC-67703 nyilvántartási számon, S093O(F')-jelű Escherichia coli törzsben letétbe helyezett pTMF-5534-plazmidot hordozó gazdasejteket alkalmazzuk.
  89. 89. A 86. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli gazdasejtekként az alábbi sejtek valamelyikét alkalmazzuk: S0744-, S0732-, vad típusú sejtek (ATCC nyilvántartási szám: 12435), S045O-,
    5 S0928-, S0929-, MC1061 és S093O.
  90. 90. A 86. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként F-sejteket alkalmazunk.
  91. 91. A 86. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli gazdasejteket 30 °C körüli hő10 mérsékleten tenyésztjük.
    HU213418B Int. Cl.6: C 12 N 15/73 xci 857:
    deo DNS
    1. BamHI
    2. A 900 bp-os fragmens visszailgálása BamHI-gyel hasított pBR322-be
    1. ábra
    HU213 418B Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    Mind a 4 konstrukció esetén
    1. Feltöltés T« polimerázzal
    2. T. ligáz
    T
    A: Deléció az ampicillin-rezisztenciagénben B: A deo P1P2 régió deléciója C: Vad típusú pJBF 5401 D: Mutáns pJBF5401, jele: pMF 5416
    2. ábra
    HU213418B Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    Ndel-hasítóhely kialakítása szintetikus kapcsoló oligonukleotid alkalmazásával (helyspecifikus mutagenez is)
    1. Ndel + Aatil
    2. A nagy fragmens Izolálása
    1. Nder+Aatll
    2. A deo-prom ótereket tartalmazó fragmens Izolálása
    T4 DNS ligáz
    Megjegyzés: a pMF-5416 és a pMF-5516-plazmidokban a deo P2promóterben egy V jellel jelölt, 48 bp-os deléció található
    3. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    Megjegyzés: a pMF 5516-plazmidban a deoP2-promóterben egy T jellel jelölt deléció található
    1. BamHI 1. Bgl II * NDel
    2. A BamHl/BamHI kis deo-fraqmens izolálása 2. A nagy fragmens Izolálása
    3. Hasítás: Bgl IH Taql
    4. A 450 bp-os Bglll/Taql deo-fraamens Izolálása
    80 bp-os szintetikus kapcsoló
    Taql ------ Ndel
    --—- I. foszforllát
    T* DNS ligáz
    4. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    1. Ndel-hasítás
    2. Feltöltée T*-polimerázzal
    T4 DNS ligáz
    5. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73 <Λ *
    I ε
    <2 w
    ffi
    0*
    Í5 o
    N > Ό
    X ce c g> X Jx + 4) 2 3 S ε □> CB 2 c <? o = ® « Ί5 > σι «' o φ < CB = o CB X N-· c < CM •5 «η - <· (0 U y 2. J CB
    e« x
    •3 o
    (B ce <α ο
    N •
    C
    4) ε
    σι <s (V ce
    3 θ ?S + « = 6 o (B ff<b
    X < ci s >» 5 O) «· 2
    CB C
    X <
    -Ω ‘TO cd
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    1. Aatll + PstI
    2. 3'-végek leemésztése T« DNS polimerázzal
    3. A nagy fragmens Izolálása
    Λ Λ T τ c C T C G 0
    TTAAG~-| | CAGCC
    BamHI Sáli
    7. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    PjU
    Hasítás Clal * EcoRI Feltöltés T4-pollmerázzal A nagy fragmens izolálása
    1. Hasítás EcoRI + Aval
    2. Feltöltés T«-pollmerázzal
    3. Az 1450 bp-os fragmens Izolálása
    8. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    1. Hasítás: PstI
    2. 3’-végek gek emésztése T4-polimerázzal
    3. A nagy fragmens izolálása
    1. Hasítás: BamHI
    2. Feltöltés T4-polimerázzal
    3. A kis fragmens izolálása
    T4 DNS ligáz
    9. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    EcoRI
    1. NSil
    2. 3*-végek eltávolítása T4 DNS polimerázzal
    3. Sspl
    4. A nagy (4 kb) fragmens Izolálása
    1. Ndel
    2. Feltöltée Klenow-enzimmel
    3. Sspl
    4. A deo-fraomens (1,3 kb) izolálása
    T« DNS ligáz
    10. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73 deoP!P2
    1. Ndel ♦ Pvull
    2. Az Ndel/Pvull nagy fragmens izolálása
    1. Ndel *Smai
    2. Az Ndel/Smal hGH-fragmens izolálása
    T* DNS llgáz
    11. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73 θοσιΗΙ
    Pstl
    Pstl
    1. Hasítás Ndel
    2. Pvull
    3. A nagy fragmens izolálása
    1. Hasítás: Hindii!
    2. Klenow-enzim
    3. Ndel
    4. A 750 bp-os bGH-fragmens izolálása
    T« DNS ligáz
    Pstl
    BamHI
    12. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl6: C12N 15/73
    9omH 1
    Avaí
    1/Ndel
    BamHI
    Szintetikus kapcsoló oligonukeotid
    3‘- AATTCCCGGGTCTAGATCT -3'
    3‘— GGGCCCAGATCTAGACTAG -3'
    1. EcoRI
    2. Részleges emésztés BamHI-gyel
    3. A nagy EcoRI/BamHI-fragmens izolálása
    1. Kináz
    2. Hibridizáiás
    13. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    I Szintetikus kapcsoló oligonukleotid . 1 'ffi1
    5 attgaaaaaggaagagtat’ccatatgc 3* TAACTTTTTCCT7CTCATAGGTA7ACG77AA
    14. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    SamHI
    BamHI
    1. Ndel + BamHI
    2. Az Ndel-BamHI SOD-fragmens izolálása
    1. Ndel + Bgll,
    2. A nagy fragmens izolálása
    T4 DNS ligáz
    15. ábra aamHI
    Szintetikus kapcsoló oligonukleotid
    3’ AT7GAAAAAGGAAGAG7A7(Á)aG 3*
    3* TAAC7777TCC77C7CATA(?)7CA7 3
    1. Foszforilális
    Sgl E/ 3amHI
    1. Ssp, + Nde,
    2. A nagy fragmens izolálása
    16. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    1. Hasítás Aatli + Pstl
    2. 3’-végek emésztése Klenow-vel
    3. A nagy fragmens izolálása | T4 DNS ligáz
    1. Hasítás: EcoRI ♦ Aval
    2. Feltöltés Klenow-vel
    3. Akis fragmens izolálása
    17. ábra
    Int Cl.6: C12 N 15/73
    1, Hasítás: Sáli * Sspt
    2. Az SOO-ezekvenciókat tartalmazó kisebb fragmens Izolálása
    1. Hasítás: Ndel, feltöttés: Klenow
    2. Hasítás: Sáli
    3. A deo B,Pr6zekvenciát tartalmazó
    1800 bp-os fragmens izolálása
    T+ DNS Jlgáz
    18. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    EcoRI
    1. Hasítás: Pvull
    2. A nagy Pvull-fragmens izolálása
    1. Hasítás: Pvull
    2. Hasítás: Smal
    3. A Pvull-Smal hGH - ApoE fragmens izolálása
    T4 DNS ligáz
    EcoRI
    19. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    dezoxi citidin inozin RIBÓZ -s-p ADENOZIN GUANOZIN A A | A deo R II 1 cytR II C X ] || II V II V II y
    deo F1 deo PZ^I deo C deo A deoP3 deo β
    mRNS Γ I--—— m RNS H I--— mRNS UI I
    20. ábra
    HU213418B Int. CL6: C 12 N 15/73
    t. Hasítás: Bglll
    2, Hasítás: Cla I
    3. A nagy fragmens izolálása
    1. Hasítás: Bglll
    2. A λΟ-857-gént tartalmazó 2392 bp-os fragmens Izolálása
    3. Hasítás Clal
    4. Az 1137 bp-os BglIVCIal-fragm ens izolálása
    T4 DNS ligáz
    21. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    1. Hasítás: Aatll * Bglll
    2. A nagy fragmens izolálása
    1. Hasítás: Aatll + Bglll
    2. Az 1200 bp-os Cl-fragmens Izolálása
    T4 DNS ligáz
    22. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    1. BglII + Pvull ♦ Aval
    2. A nagy BglIUPvull-fragmene izolálása
    2. DNS polimeráz - Klenow
    3. CJal
    4. A d-gént tartalmazó fragmens (1668 b.p.)
    23. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    1. Részleges Accl-emésztés
    2. BamHI
    3. Klenow-feltöltée
    4. Az 1300-1350 bp-os P1-CI-fragmens izolálása
    1. Clal
    2. Klenow-feltöltée
    3. A llnearlzáit plazm id izolálása
    T4 DNS ligáz
    M
    24. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    SamHI
    Τ·/«
    HindU
    Aval
    Hindiit
    XmnI
    1. Aval
    2. Klenow-feltöltés
    1. Sspl + XmnI
    2. Az 1850 bp-os fragmens izolálása
    25. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    Megjegyzés: A pTVR 700-2- és pTVR 596-1-plazmidok azonos plazmidok, melyek különböző gazdasejtekbe vannak transzformálva (lásd az ábra magyarázatát a leírásban)
    1. Hasítás: Clal
    2. Itlenow-feltöltés
    1. Hasítás: Sspl
    2. Hasítás: Xmnl
    3. Az Sspl/Xmní kis fragmens izolálása
    T. DNS «gáz
    26. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N15/73
    Megjegyzés: A pTVR 590-4-és pTVR 583-17-plazmidok azonos plazmidok, melyek különböző gazdasejtekbe vannak transzformálva (lásd az ábra magyarázatát a leírásban)
    1. Hasítás: Clal
    2. Klenow-feltöltís
    1. Hasítás: Sspl
    2. Hasítás: Xmnl
    3. Az SspVXmnl kis fragmen* Izolálása
    T. DNS ligáz
    27. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    AZ MNSOO-GPX FÚZIÓS PLAZMID
    ELŐÁLLÍTÁSA
    3. Sepl
    4- A GPX-fragmens Izolálása
    1. Tt DNS lígáz
    2. Stuf
    3- Transzformálás
    28. ábra
    HU2134I8B Int. Cl.6: C12 N 15/73
    EcoRI
    1. Ndei
    2. Feltöltés DNS pollmerázzal (Klenow)
    3. EcoRI
    4. A nagy fragmens Izolálása
    1. Alul ♦ EcoRI
    2. A 200 öp-os EcoRUAlul-fragmens Izolálása
    T, DNS llgáz
    29. ábra
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    HU 213 418 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73 .*οΐ
    Wndm
    1. EcoRI
    2. A foszforizált kapcsoló oligonukleotidok ligáiása TATGGATC
    ACCTAGTTAA
    3. Ndel * Hlndlll
    4. A bGH-fragmens izolálása
    Hin.il!
    31. ábra
    HU 213 418 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    32. ábra
    HU 213 418 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    33. ábra
    HU 213 418 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    34. ábra
    HU 213 418 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73 *
    «af koRI
    EcoSf
    1- Részleges Ndel-eméeztés
    2. Feltöltés
    3. EcoRI *· A nagy fragmens Izolálása
    t. Alul + EcoRI 2. A 200 bp-os fragm
    Izolálása
    Clal
    Híndis — Τι-η- *7d γ-*ζ^ο8ΐ
    35. ábra
    HU 213 418 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    EcoRI
    3amHI/aqi2
    B„HZ
    Pvufl Ndel
    1. Hasítás: Ndel + Pvull
    2. A 600 bp-os fragmens izolálása
    8<jlH
    Ndel-lpvun
    X- Hindin v\ i-Hindin
    T< DNS llgáz ctrtHindin Pvull
    1. Részleges Ndel-emésztés, teljes Pvuli-emésztés
    2. A nagy fragmens izolálása
    36. ábra
    HU 213 418 Β
    Int. Cl.6; C 12 N 15/73
    EcoRI
    1. Hasítás: Aatll + PstI
    2. 3*-végek emésztése Klenow- val
    3. A nagy fragmens Izolálása
    1. Hasítás: EcoRI + Avat
    2. Feltöltés Klenow-val
    3. A kis fragmens Izolálása
    T* DNS ligáz
    O
    37. ábra
    HU213418B Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    PstI
    Sgl H
    Hindin
    Hindin
    Ndel
    EcoRI
    PstI
    1. Hasítás: EcoRT/Dral + PstI
    2. Az EcoRT/Dral-fragmens izolálása
    3. Az EcoRI-heiy 5*-végeinek eltávolítása Mung bean nukleázzal
    1. Hasítás: Ndel + Stul
    2. A nagy fragmens izolálása
    3. Az Ndel-hely kezelése Mung bean nukleázzal
    T4 DNS llgáz
    PstI
    38. ábra
    HU213 418Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    Hpol
    Pstl
    1. Hasítás: Sspl + Pvull + EcoRI
    2. A nagy fragmens Izolálása
    3. Az Izolált fragmens hasítása Hln cll-vel
    4. A 350 bp-os Sspl/HIncll-fragmens izolálása
    T4 DNS ligáz
    Hasítás: EcoRV
    39. ábra
    PstI
    HU213418B Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    EcoRI
    Ndel -BglII
    PstI· meghosszabbított RBS Ndel
    HindHI cHRbsl
    SamHI
    Ndel
    1. Hasítás: Ndel + Stul
    2. A nagy fragmens Izolálása
    1. Hasítás: Ndel + Órai * BglII
    2. Az 1750 bp-os fragmens izolálása
    T« DNS ligáz
    40. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6; C 12 N 15/73
    1. Hasítás: Bglll + Ndel
    2. A kis fragmens izolálása
    41. ábra
    HU 213 418 Β Int, Cl.6: C 12 N 15/73 | 1. Hasítás: AatlI * BglII j 2. A nagy fragmens izolálása
    T«DNS
    1. Hasítás: AatlI + BglII
    2. A kis fragmens izolálása
    42. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73 j1. Hasítás: BamHI, a kis fragmens Izolálása
    2. Hasítás: BglII + Tagi, a 440 bp-οβ fragmens izolálása
    3ψα
    1=
    Nd«I
    9qi tt taql S4I3 i---—I + oligonukleotldok +# <>2912
    Ugáz
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    EcoRI
    8amHI
    1. Hasítás: Bglll + Avrll
    2. A nagy fragmens Izolálása
    3. Feltöltés Klenow-val
    4. Τ» ligáz
    EcoRI
    1. Hasítás: EcoRI * Avrll
    2. Feltöltés Klenow-val
    3. A nagy fragmens Izolálása
    4. T4 ligáz
    HU213418B Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    EcoRI
    PstlNarl
    BamHI
    HlndHI Drol/Stut
    EcoRI
    PstI
    BamHI dvr Jl
    Enhoncer
    Ndel
    BamHI
    1. Hasítás: Bglll + Ndel
    2. A nagy fragmens izolálása
    1. Hasítás: Bglll + Ndel
    2. Az 540 bp-οβ fragmens izolálása
    T* ligáz
    PstI
    EcoRI
    Avrll
    Enhoncer
    Ndel
    Hindin
    BomHI
    45. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C12 N 15/73
    1. Hasítás: Ndel * Bglll
    2. A nagy fragm ens Izolálása j η I
    1. Hasítás: Ndel + Bglll
    2. Az 540 bp-os fragmens Izolálása
    T« ligáz
    46. ábra
    HU213418B Int. Cl.6; C 12 N 15/73
    1. Ndet* Aatll
    2. A nagy fragmens Izolálása
    T4 DNS ligáz
    EcoRf
    47. ábra
    HU213418B Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    Sglir
    1. Hasítás: Bgiil + styl
    2. A nagy fragmens Izolálása , 09(11 * Sty·
    2. A kis fragmens Izolálása
    T« DNS ligáz
    48. ábra
    HU 213 418 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/73
    Pstl NloH H-4HinfJ
    Hasítás: Pstl T
    A kis fragmens bolálása
    Peti
    -1-1
    Smal
    Hasítás: Smal Nlálll
    A 325 bp-os fragmens izolálása
    NlaHI Smal
    A. I-1
    Q
    EcoRI „NlaHI Pstl
    Ugj-,
    Ndel
    Hasítás; EcoRI 4
    Pstl
    A 340 bp-os fragm ens
HU884331A 1987-08-14 1988-08-12 Process for producing polypeptides using bacterial host cells containing expression plasmids with deo promoter HU213418B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8615987A 1987-08-14 1987-08-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT48681A HUT48681A (en) 1989-06-28
HU213418B true HU213418B (en) 1997-06-30

Family

ID=22196678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU884331A HU213418B (en) 1987-08-14 1988-08-12 Process for producing polypeptides using bacterial host cells containing expression plasmids with deo promoter

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0303972B1 (hu)
JP (1) JP2752092B2 (hu)
KR (1) KR970000594B1 (hu)
AT (1) ATE161888T1 (hu)
AU (1) AU607249B2 (hu)
CA (1) CA1309043C (hu)
DE (1) DE3856101T2 (hu)
DK (1) DK175537B1 (hu)
ES (1) ES2112240T3 (hu)
FI (1) FI104429B (hu)
GR (1) GR3026136T3 (hu)
HU (1) HU213418B (hu)
IL (1) IL87409A (hu)
NO (1) NO302185B1 (hu)
NZ (1) NZ225760A (hu)
PT (1) PT88271B (hu)
ZA (1) ZA885983B (hu)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0676472A1 (de) * 1987-03-14 1995-10-11 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Humane Mangan-Superoxiddismutase (hMn-SOD)
US5260204A (en) * 1987-03-14 1993-11-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD)
US5210180A (en) * 1989-10-27 1993-05-11 American Cyanamid Company Enhancement of porcine somatotropin activity
US6165465A (en) * 1990-05-15 2000-12-26 American Cyanamid Company Immunologic enhancement of the somatogenic effect of somatotropin with an antibody

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU569043B2 (en) * 1982-09-16 1988-01-21 Benzon Pharma A/S Plasmids with conditional uncontrolled replication behaviour

Also Published As

Publication number Publication date
EP0303972A3 (en) 1991-12-18
ES2112240T3 (es) 1998-04-01
EP0303972A2 (en) 1989-02-22
NO883611L (no) 1989-02-15
AU2098288A (en) 1989-03-09
NZ225760A (en) 1991-02-26
DE3856101D1 (de) 1998-02-12
NO883611D0 (no) 1988-08-12
PT88271B (pt) 1995-07-18
FI883749A0 (fi) 1988-08-12
KR970000594B1 (ko) 1997-01-14
DK454988A (da) 1989-02-15
PT88271A (pt) 1989-06-30
EP0303972B1 (en) 1998-01-07
IL87409A0 (en) 1989-01-31
NO302185B1 (no) 1998-02-02
AU607249B2 (en) 1991-02-28
KR890003953A (ko) 1989-04-19
GR3026136T3 (en) 1998-05-29
DK175537B1 (da) 2004-11-29
IL87409A (en) 1998-03-10
ZA885983B (en) 1989-05-30
CA1309043C (en) 1992-10-20
FI104429B (fi) 2000-01-31
DK454988D0 (da) 1988-08-12
JPH01157391A (ja) 1989-06-20
HUT48681A (en) 1989-06-28
DE3856101T2 (de) 1998-07-23
FI883749A (fi) 1989-02-15
ATE161888T1 (de) 1998-01-15
JP2752092B2 (ja) 1998-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5922583A (en) Methods for production of recombinant plasmids
KR930001117B1 (ko) Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법
EP0200590B1 (fr) Procédé de préparation microbiologique de la sérum-albumine humaine
Yang et al. Translation of trpG in Bacillus subtilis is regulated by the trp RNA-binding attenuation protein (TRAP)
EP0764202B1 (en) EXPRESSION PLASMIDS REGULATED BY AN osmB PROMOTER
KR100356581B1 (ko) 플라스미드의안정화
JP3577075B2 (ja) ビオチンの生物工学的製造方法
EP0487541B1 (en) Dna encoding a lipase and a lipase modulator
EP0483113B1 (en) A method of producing an enzymatically active polypeptide analog of human Cu/Zn SOD
BR112014014950A2 (pt) cepa tohama de bordetella pertussis, métodos para produzir uma cepa de bordetella pertussis e antígenos de bordetella pertussis, antígeno, uso de um antígeno, e, vacina acelular
Rule et al. Overproduction and nucleotide sequence of the respiratory D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli
HU213418B (en) Process for producing polypeptides using bacterial host cells containing expression plasmids with deo promoter
US6010875A (en) Expressions plasmids containing the deo promoter, and bacterial hosts containing the plasmids
JPS5951793A (ja) 新規クロ−ニングビヒクル
JP4732348B2 (ja) 非抗生物質耐性選択マーカー含有選択システム
JP2903414B2 (ja) 抗酸菌分泌発現ベクター及び抗酸菌
JP2007259787A (ja) 遺伝子発現制御ポリヌクレオチド
JPH08507218A (ja) 一重鎖分子の過剰発現
US5830720A (en) Recombinant DNA and expression vector for the repressible and inducible expression of foreign genes
US5059529A (en) Stabilized expression vectors containing λPL promoter and the gene for the cI434 repressor, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods
US5151364A (en) Expression vectors containing lambdapl promoter, T1 T2 RRNA termination sequence, and origin of replication derived from a constitutive high copy number plasmid, and hosts containing the plasmids
KR970009082B1 (ko) 인간 알파 아트리알 나트리 우레틱 인자(human α-arterial natriuretic factor; α-hANF)의 미생물학적 제조방법
JPH02501259A (ja) 合成遺伝子を使用したサケ成長ホルモンの製造方法
JPH02219570A (ja) ヒト５―リポキシゲナーゼの製造方法
Cohen Regulation of Amino Acids Biosynthesis in Prokaryotes

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SAVIENT PHARMACEUTICALS, INC., US