JPH02501259A - 合成遺伝子を使用したサケ成長ホルモンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成遺伝子を使用したサケ成長ホルモンの製造方法［発明の背景］ この発明は酵母またはエシェリヒア・コリに合成遺伝子を使用してサケ成長ホル モンを製造する方法に関するものである。

今日まで養魚場では、飼料効率を高めるため、使用する飼料に高タンパク質含有 飼料またはホルモン性ステロイドを添加してきた。

しかし米国を含めて文明国では、ステロイドがすぐに代謝されず投与後前体内に 長期間残留するため、ステロイドの存在が魚を食べた止するところが増加してき た。

一方、サケの成長ホルモンは投与後前体内に残留せず、またそれがサケ自身のタ ンパク質であるから種特異性を有するため、飼料効率を増大し得るのに最も好ま しい物質である。

この発明者は、遺伝子操作技術により酵母またはエシェリヒア・コリでサケの成 長ホルモンを経済的かつ大量に生産し得ることを発見した。

［発明の要約］ この発明の一目的は、酵母を発現ベクターの宿主として使用し、サケの成長ホル モンを生産する方法を提供することにある。

この発明のもう一つの目的は、エシェリヒア・コリを発現ベクターの宿主として 使用し、サケの成長ホルモンを生産する方法を提供することにある。

第一に、酵母を発現ベクターの宿主として使用するサケ成長ホルモンを生産する 方法は （ａ）　サケの成長ホルモン遺伝子を操作するため、ＸｂａＩ、　Ｔ（ｉｎｄＩ ［［および５ａｉｌ制限酵素部位を有するオリゴヌクレオチドを合成し、（ｂ） 　ライゲーション・ストラテジーにしたがった、Ｘｂａｌ／Ｈｉｎｄ■部位を有 する一断片およびＨｉｎｄＩ［Ｉ／　Ｓ　ａｌ　Ｉ部位を有する他の断片をそれ ぞれプラスミドｐＵｃ１Ｂへつなぎ、（ｃ）２個のクローン化した断片をプラス ミドｐＵｃ１８へ再ライゲーションして、Ｎ−末端部分を欠いたサケ成長ホルモ ン遺伝子を得、（ｄ）プロモーターおよびターミネータ−からなるプラスミドへ 部分サケ成長ホルモン遺伝子およびＮ−末端合成アダブタ−を挿入して、Ｎ−末 端合成アダブタ−・ターミネータ−を有するプロモーター・サケ成長ホルモンカ セットを作成し、（ｅ）　酵母に形質発現するためのエシェリヒア・コリー酵母 −シャトルベクターへカセットを挿入し、（ｆ）　得られたベクターを酵母細胞 で形質発現することからなる。

Ｎ−末端合成アダブタ−は下記のＮｃｏＩ部位およびＸｂａＩ部位を有するヌク レオチド配列である。

肋工部位　Ｘｈａ工部位 酵母形質発現ベクターは、Ｎ−末端合成アダブタ−・ターミネータ−１完全な２ ミクロン、Ｌｅｕ２ｄ遺伝子および複製起源を有するプロモーター−サケ成長ホ ルモン遺伝子からなるカセットを含有し、ｐｃ１／１−５ＧＨと命名される。

第二に、エシェリヒア・コリを発現ベクターの宿主として使用するサケ成長ホル モンを生産する方法は （ａ）　サケの成長ホルモン遺伝子を操作するため、Ｘｂａｌ、　Ｈｉｎｄ■お よび５ａｉ１制限酵素部位を有するオリゴヌクレオチドを合成し、（ｂ）　ライ ゲーション・ストラテジーにしたがったＸ　ｂａ　Ｉ　／　Ｈ１ｎｄＩ［［面位 を有するＮ−末端断片およびＨ１ｎｄＩｆｆ／　Ｓ　ａｌ　１部位を有するＣ− 末端断片をそれぞれプラスミドｐＵｃ１８へつなぎ、（ｃ）２個のクローン化し た断片をプラスミドｐＵｃ１８へ再ライゲーションして、Ｎ−末端部分を欠いた サケ成長ホルモン遺伝子を得、（ｄ）　部分サケ成長ホルモン遺伝子およびＮ− 末端合成アダブターをプラスミドｐＢＲ３２２へ挿入し、（ｅ）　得られたサケ 成長ホルモン遺伝子および合成アダプターをｔｒｐプロモーターを有する形質発 現ベクターへライゲーションし、（ｆ）　作成した合成アダプターを含有するベ クターをエシェリヒア・コリで形質発現することからなる。

エシェリヒア・コリ形質発現ベクターのＮ−末端合成アダブタ−はＮｄｅｌおよ びＸｂａＴ部位を有し、３８量体（５’−Ｔ　ＡＴＧ　ＡＴＣＧＡＡ　ＡＡＴ　 ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＴＴＡ　ＴＴＣＡＡＣＡＴＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　Ｔ−３’）か らなる上流鎖および４０量体（３°−ＡＣＴＡＧ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＣ Ａ　ＡＡＴＡＡＧ　ＴＴＧ　ＴＡＡ　ＣＧＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣ−５°）か らなる下流鎖を含んだヌクレオチド配列である。

部分プロモーター配列のもう一つの合成アダプターは、ＨｐａＩおよびＮｄｅ１ 部位を有し、３６量体（５°−ＡＡＣＴＡＧ　ＴＡＣＧＣＡ　ＡＧＴ　ＴＣＡ　 ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＡＣＡ−３’）からなる上流鎖およ び３８量体（３°−ＴＴＧ　ＡＴＣＡＴＧ　ＣＧＴ　ＴＣＡ　ＡＧＴ　ＧＣＡ　 ＴＴＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＴＡ　ＴＧＴ　ＡＴ−５°）からなる下流鎖を含んだ ヌクレオチド配列である。

この発明についてさらに理解を深めるため、この発明の好ましい態様を説明した 添付図面ならびに記載事項について説明する。

［図面の簡単な説明］ 第１図は５゛−末端から３°−末端へ塩基配列によって示したサケ成長ホルモン 遺伝子に対応する合成オリゴヌクレオチドである。

第２図は第１図の合成オリゴヌクレオチドのライゲーション・ストラテジーであ る。

第３図は合成オリゴヌクレオチドをプラスミドｐＵｃ１８ヘクローンするクロー ニング手順を示した略図である。

第４図は確認したサケ成長ホルモン遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列で ある。

第５図は酵母でサケ成長ホルモンを生産するための酵母形質発現ベクター（ｐｃ ｔ／１）へのクローニング手順である。

第６図はサケ成長ホルモン遺伝子をエシェリヒア・コリで形質発現するためのク ローニング・ストラテジーである。

第７図は酵母細胞で生産されたサケ成長ホルモンをＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル電気泳動によって確認した成績である。

第８図はエシェリヒア・コリで生産されたサケ成長ホルモンをＳＤＳポリアクリ ルアミドゲル電気泳動によって確認した成績である。

［好ましい態様の詳細な説明］ この発明では、セキネら［プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・才ブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８２巻（１９８５年）、４３０ ８頁］によって報告されたサケ成長ホルモンのアミノ酸配列に基づき、酵母細胞 によって優勢に利用されるアミノ酸コドンを有するサケ成長ホルモンの塩基配列 を選び、ＤＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステム・モデル３８０Ｂ 。

ＵＳＡ）を使用し、ホスホルアミデート法によって成熟サケ成長ホルモンの完全 な遺伝子を化学的に合成した。

エシェリヒア・コリのベクター、ｐＵｃ１８［ノーランダー、Ｊ。

ら、ジーン、３６巻（１９８３年）、１０１頁コに合成オリゴヌクレオチドをラ イゲーションして挿入し、５３３ｂｐのＸｂａＩ／５ａｌＩ制限断片を含んだｐ ＳＧＨ（５３３）を作成したが、このものは完全なサケ成長ホルモン遺伝子のＮ −末端領域を有していない（第３図参照）。

第一に酵母細胞でサケ成長ホルモンを生産する方法は、下記のように、合成アダ プターを有する完全なサケ成長ホルモンを含んだクローンをプロモーターおよび ターミネータ−遺伝子を有するベクター、ｐＢｓｌｏｏ［イースト、２巻、７２ 頁（１９８６年）；シロン・コーポレーション、エマリービル、ＣＡ９４６０８ 、ＵＳＡ］のＮｃＯ■部位および５ａ１１部位の間にライゲーションして酵母で 形質発現する（ここで該アダプターはＮｃｏＩ制限酵素部位、開始コドンおよび サケ成長ホルモンのＮ−末端領域に対応する若干のアミノ酸コドンを含んでいる ）。得られたベクターはｐＢＳ−９ＧＨである。

ベクターｐＢＳ−ＳＧＨをＢａ＋ｎＨＩ制限酵素で処理し、プロモーター、サケ 成長ホルモン遺伝子およびターミネータ−を含んだＢａａＨ１断片（約２．７Ｋ ｂ）を分離した。エシェリヒア・コリおよび酵母自動的に複製される酵母形質発 現ベクターｐｃ１／１［ＡＴＣＣ３７１１５ニブレークら、プロシーディングズ ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ 、８１巻（１９８４年）、４６４２頁］のＢａ１ｉＨ■制限酵素部位へこのＢａ ｍＨＩ断片を挿入してｐｃｉ／１−８ＧＨを作成した（第５図参照）。

上記の酵母形質発現ベクターを、ヒネンらの方法により、酵母株ＤＣＯ４［ブロ ーチ、Ｊ、Ｒ，＆ヒックス、Ｊ、Ｂ、、セル、２１巻、５０１頁（１９８０年） ；イースト・ジェネティック・ストック・センター・ユニバージティー・オブ・ カリホルニア、バークレイ、ＵＳＡ］にクローンした。形質転換した酵母細胞を 実施例４に示したように２％グルコースを含有するＹＥＰＤ培地で４８時間培養 した。

グルコース濃度が消耗されるとサケ成長ホルモンは自動的に誘導され、０Ｄｌ１ ５ｏ＝１５で培養１リットル当り約５０ｍｇのサケ成長ホルモンが生産された。

第二にエシェリヒア・コリでサケ成長ホルモンを生産する方法は、下記のように 、Ｘｂａｌ／５ａｌＩ制限酵素断片およびコドンとして設計されたＮ−末端合成 アダブタ−［ここで、ＡＴＧ領域（開始コドン）はＮｄｅｌ制限酵素で切断され てもよく、エシェリヒア・コリ内で優勢に使用されるコをエシェリヒア・コリの ベクターｐＢＲ３２２へ最終的にライゲーションする（実施例３参照）。

ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列およびＡＴＧ（開始コドン〕間の塩基がｍＲ ＮＡの二次構造を生じないよう好適に配置されている合成オリゴヌクレオチドを 有する完全成長ホルモン遺伝子を含んだ５７１塩基対のＮｄｅ　Ｉ　／　Ｓ　ａ ｌ　Ｉ制限酵素断片を、エシェリヒア・コリに形質発現するベクターｐｔｒｐ３ ２２　［ラッセル、Ｄ、Ｒ，＆ペンネット、Ｇ、Ｎ、、ジーン、２０巻、２３頁 （１９８１年）：ファルマシアＩｎｃ、ビカタウエイ、Ｎ、Ｊ、０８８５４、Ｕ ＳＡコにライゲーションし、これをＨｐａＩおよび５ａｌＩ制限酵素で切断した 。その後、得られたベクター（ｐｔｒｐ３２２　ＨＳ　Ｇ　Ｈ）をエシェリヒア ・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）にクローニングした（実施例３参照） 。Ｍ９培地中、ＩＡＡ（インドールアクリル酸）を誘導剤として使用することに より、サケ成長ホルモン遺伝子はエシェリヒア・コリで発現され、５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動によって成長ホルモンを同定した（実施例５参照） 。

以下に実施例をあげてこの発明を説明する。実施例は単に発明を説明するための ものであって、発明の範囲を限定する目的をもつものではない。

実施例】 サケ成長ホルモン遺伝子の合成オリゴヌクレオチドのライゲーションおよびクロ ーニング 第１図に示した配列を有する合成オリゴヌクレオチドから完全なサケ成長ホルモ ン遺伝子を得るため、第２図に示したライゲーション・ストラテジーおよびベク ターｐＵｃ１８を使用した。

サケ成長ホルモン遺伝子のＣ−末端Ｈｉｎｄｎｌおよび５ａ１１制限断制限対応 する各オリゴヌクレオチド（Ｕ８−Ｕ１４／Ｌ９−Ｌ１４）をそれぞれ０．０５ （ＯＤｚｓｏ）量取り、別々に乾燥した。５０ａＭトリスーＭＣＩ（ｐＨ７，５ ）、１ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴおよびｌＯｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２を含有 する全量３０μｍにＴ４　ポリヌクレオチドキナーゼ４単位を添加し、各オリゴ ヌクレオチドの５°−末端残基をリン酸化するため、これらを３０分間反応した 。

オリゴヌクレオチドをプールし、これと同量のフェノールおよびクロロホルム混 合液（２４：Ｌｖ／ｖ）で処理し、エタノールで沈殿する。沈澱を６０ｍＭ）リ ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１μＭＤＴＴおよび１０ｍＭ　ＭｇＣＬからなる緩 衝液５３μｍに溶解した。この溶液を９５℃の水浴に入れ、ついで温度が室温に 戻るまで６時間室温に保った。

Ｔ４　ＤＮＡ２０単位および１０ｍＭ　ＡＴＰ５μｌをこの溶液に加え、室温で １０分間ライゲーション反応を実施した。この反応液を前記と同様にフェノール およびクロロホルム混合液で処理し、エタノールで沈殿させた。

６０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　ＭｇＣＩｔおよび１００ｍ ＭＮａＣ１からなる緩衝液の存在で、この沈殿にＨｉｎｄＤＩおよび５ａｉｌ制 限酵素各ｌθ単位を加え、３７℃で１時間反応する。

７％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、２２０〜３００塩基対に対応するバ ンドをゲルから切り出す。電気溶出後、沈殿を蒸留水２０μｌに溶解した。

ＤＮＡ３μ】およびＨｊｎｄｍおよび５ａｌＩ制限酵素で切断したベクターｐＵ ｃ１８　１０ｎｇを、６０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０　ｉ＋Ｍ 　ＭｇＣＩｔおよび１ｍＭＡＴＰからなる溶液中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼｌＯ単 位の存在で１４℃で１６時間、ライゲーションした。

エシェリヒア・コリＪＭＩ　Ｏ３［ＢＲＬ、ＵＳＡ、メッシング、Ｊｌ、メソッ ズ・イン・エンザイモロジー、１０１巻、２０頁（１９８３年）］受容細胞をラ イゲーション混合液に加え、ハナハンの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー ・バイオロジー、１１８巻、５５７頁（１９８３年）］により３７℃で一夜形質 転換した。

バーンボイムおよびドリーの方法［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、７巻、 １５１３頁（１９７９年）コにより、白色コロニーから組換え体ベクターｐ３° −５ＧＨを選び出した。

一方、合成オリゴヌクレオチドのＮ−末端ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩ［制限断 片に対応するオリゴヌクレオチド（Ｕｌ−Ｕ７／Ｌ２−Ｌ８）を上記と同様の方 法によってそれぞれライゲーションし、ｐＵｃ１８へ挿入して、Ｘｂａｌおよび ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断することにより、第３図に示した方法によってｐ ５′−５ＧＨを得た。

最後に、サンガー・ジデオキシ・チェイン・ターミネーション法［プロシーディ ンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ ＵＳＡ、７４巻、５４７３頁（１９７７年）］ニより、ｐ３’−５ＧＨおよびｐ ５°−５Ｇ）（ｃ）ＤＮＡ配列を確認した（第４図参照）。

ｐ３°−５ＧＨからのＨｉｎｄＩ［［／　Ｓａｌ　Ｉ制限断片およびｐｓ’−５ ＧＨからのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩ［Ｉ制限断片をそれぞれ単離し、これらをベク ターｐＵｃ１Ｂにライゲーションし、ＸｂａＩおよび５ａｌｌ制限酵素で切断し てｐＳＧＨ（５３３）を作成した（第３図参照）。

実施例２ 酵素細胞で形質発現する合成サケ成長ホルモン遺伝子の操作ｐＳＧＨ（５３３） には完全なサケ成長ホルモン遺伝子の５°−末端欠損部分が存在しており、ＤＮ Ａシンセサイザーによってこれを合成した。この合成アダプターには、酵母細胞 で優勢に使用される選択コドンによりＮｃｏｌ制限酵素部位、開始コドンおよび サケ成長ホルモンのＮＨ，−末端１２アミノ酸に対応するコドンを合成した（第 ５図参照）。

クローニングの手順は、下記のようにＸｂａＩおよび５ａｉｌ制限酵素でｐＳＧ Ｈ（５３３）を処理して、５３３ｂｐに対応する制限酵素切断断片を得、アガロ ース電気泳動によってこの断片を分離することからなる。

合成アダプターを、前記と同様にＴ４　ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し た。リン酸化したアダプター試薬ｌμ１１成長ホルモン遺伝子のＸｂａＴ／５ａ ｌＩ断片３　μｌ（３０ｎｇ）およびＮｃｏＩおよび５ａｌｌ制限酵素で切断し たベクターｐＢｓＩｏｏ［イースト、２巻、７２頁（１９８６年）］　１　ｕ　 ｌ（７ｎｇ）を１０ｍＭ　ＡＴＰ２μｌ、１０倍濃厚なライゲーション反応緩衝 液２μ１１　リガーゼｌμｌおよび蒸留水ｌＯμｌの存在で混合し、１４℃で１ ６時間インキュベートした。

実施例■の記載と同様に、ライゲーション混合物をエシェリヒア・コリ細胞ＨＢ １０１（ＡＴＣＣ３３６９４）にクローニングし、酵母で形質発現するプロモー ター、完全なサケ成長ホルモン遺伝子およびターミネータ−からなる組換え体ベ クターｐＢ　Ｓ　−Ｓ　Ｇ　Ｈを得た。

上記のベクターｐＢｓＩｏｏはアルコールデヒドロゲナーゼ■プロモーターおよ びグリセルアルデヒド−３°−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターのハイブリ ッドプロモーターを含有している。

ベクターｐＢＳ−ＳＧＨをＢａｍＨＴ制限酵素で処理して、ハイブリッドプロモ ーター、サケ成長ホルモン遺伝子およびグリセルアルデヒド−３°−リン酸デヒ ドロゲナーゼのターミネータ−を含んだ約２７００ｂｐのＢａｍＨＩ制限断片を 分離した。このＢａｍＨＩ制限断片を酵母形質発現ベクターｐｃｉ／１（ＡＴＣ Ｃ３７１１５）のＢａａＨＩ制限酵素部位へ挿入し、ｐｃｉ／１−５ＧＨを得た （第５図参照）ｐｃｔ／１−５Ｇ）（遺伝子ｌＯμｇを、ヒネンの方法［プロシ ーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンシズ・オブ ・ザ・ＵＳＡ、７５巻（１９７８年）、１９２９頁］により、酵母株ＤＣＯ４［ イースト・ジェネティック・ストック・センター、ユニバージティー・オブ・カ リフォルニア、バークレイ、ＵＳＡ。

ブローチ、Ｊ　、Ｒ，＆　ヒックス、Ｊ、Ｂ、、セル、２１巻、５０１頁（１９ ８０年）コにクローニングし、１リットル当り、アミノ酸無含有酵母窒素塩基６ 　、７　ｇ、ソルビット−２％グルコース１８２ｇ、Ｌｅｕ−サブプルメント０ ．２５ｇおよびバタトアガール２０ｇを含有するロイシン無含有寒天プレートで これを培養した。

形質転換３〜５日後に、サケ成長ホルモン遺伝子を含んだ組換え体クローンが認 められた。

実施例３ 完全な成長ホルモン遺伝子をエシェリヒア・コリ形質発現ベクターへ挿入する操 作 完全なサケ成長ホルモン遺伝子のＮ　Ｈを−末端に相当するＤＮＡ配列として、 エシェリヒア・コリで優勢に使用されるコドンを選んだ。

３８量体（５°−Ｔ　ＡＴＧ　ＡＴＣＧＡＡ　ＡＡＴ　ＣＡＧＣＧＴ　ＴＴＡ　 ＴＴＣＡＡＣＡＴＴ　ＧＣＡ　ＧＴＴ　Ｔ−３°）からなる上流績および４０量 体（３’−ＡＣＴＡＧ　ＣＴＴＴＴＡ　ＧＴＣＧＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＴＴＧ 　ＴＡＡ　ＣＧＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣ−５°）からなる下流績を含んだＮｄ ｅｌおよびＸｂａＩアダプターを合成した。ｐＳＧＨから分離した５３３塩基対 からなるＸｂａｌ／５ａ１１断片および合成アダプターをエシェリヒア・コリに 対するベクターｐＢＲ３２’２［ＡＴＣＣ３７０１７コヘ挿入し、これをＮｄｅ ｌおよび５ａｉｌ制限酵素で切断して完全なサケ成長ホルモン遺伝子を含んだｐ ＢＲＳＧＨクローンを得た（第６図参照）。

ｔｒｐ−プロモーターを有する形質発現ベクターｐｔｒｐ３２２をＨｐａＩおよ び５ａｌＩ制限酵素で切断した。２．３Ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動に 掛けて電気溶出し、エタノールで沈殿した。

上記のｐＢＲＳＧＨをＮｄｅＩおよび５ａｉｌ制限酵素で処理して５７１ｂｐの 断片を得た。ｔｒｐプロモーターのＳＤ配列（５’−ＡＡＧＧ−３′）およびサ ケ成長ホルモン遺伝子の開始コドンの間に９塩基対が存在し、該領域に対応する １ＲＮＡが２次構造を形成しないように合成アダプターを設計した。両末端がＨ ｐａｌおよびＮｄｅｌ制限部位に適合するように、３６量体（５′−ＡＡＣＴＡ Ｇ　ＴＡＣＧＣＡ　ＡＧＴ　ＴＣＡ　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡＴ ＡＣＡ−３°）からなる下流績および３８量体（３°−ＴＴＧ　ＡＴＣＡＴＧ　 ＣＧＴ　ＴＣＡ　ＡＧＴ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＴＡ　ＴＧＴ　Ａ Ｔ−５°）からなる下流績を含んだアダプターを設計した。

５７１ｂｐのＮｄｅｌ／５ａｌＩ制限断片および合成アダプターをｐｔｒｐ３２ ２にライゲーションし、ＨｐａＩおよび５ａｌｌ制限酵素で切断した。

エシェリヒア・コリＨＢ　１０１（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換して、サケ 成長ホルモン遺伝子およびｔｒｐ−プロモーターを含有する組換え体クローンを 得、これはｐｔｒｐ３２２ＨＳＧＨと呼ばれる（第６図参照）。さらにこのクロ ーンをエシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）に形質発現する宿 主へ導入する。

実施例４ 酵母細胞にサケ成長ホルモンを生産する培養およびその同定ベクターｐｃｉ／１ −９ＧＨを導入した酵母細胞各３ｍｌをロイシン無含有培地（培地１リットル当 り）、アミノ酸無含有酵母窒素塩基６．７ｇ、Ｌｅｕ−サツプルメント０．２５ ｇおよび６％グルコース含有）中、３０℃で２４時間培養した。１夜培養物１ｍ ｌを２％ペプトン、１％酵母抽出物および２％グルコースを含有するＹＥＰＤ培 地（１００ｍｌ）に接種し、３０℃で２４時間培養した。これにエタノール４０ ｍ１を加え、さらに溶液を２４時間培養した。

得られた０Ｄｅｓｏは約４０であった。その１０（１ｍｌ当り０Ｄａｓａ）を取 り、遠心した。これを１０＋ｎＭ）リス−ＨＣＩ（ＰＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＦＭＳＦ）および８Ｍ尿素 を含有する緩衝液４００μｌに溶解し、さらにこれと同量の直径０．４５ｏｎの ガラスピーズを加えて激しく振とうした。細胞壁を破壊し、サケ成長ホルモンを 緩衝液に溶出した後、溶出液の４μｍを１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動に掛けて測定した。

その結果を第７図に示す。

１枠はバイオ・ラド社の蛋白質の標準分子量を表す。

２枠はサケ成長ホルモン遺伝子を含有しないベクターｐｃ１／１を導入した酵母 細胞の全蛋白質を表す。

３枠はサケ成長ホルモン遺伝子を含有するベクターｐＣＩ／１−９ＧＨを導入し た酵母細胞の全蛋白質を表す。

ゲルスキャンニングにより、第７図の３枠に示されたようにサケ成長ホルモンは 総蛋白質量の５％に相当する量で約２２Ｋｄのバンドに出現する。

精製したサケ成長ホルモンのペプチド配列決定によると、これは開始コドンがイ ソロイシンである成熟サケ成長ホルモンである。

実施例５ エシェリヒア・コリＷ３１１０におけるサケ成長ホルモンの高水準形質発現およ び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による確認 形質発現ベクターｐｔｒｐ３２２Ｈ９ＧＨを含むＷ３１１０をアンピシリン４０ μｇ／ｍｌを含有するＬＨ培地中、３７℃で１６時間培養し、ついでＭ９培地へ 接種した。

０Ｄｓｓｏが０．５に達したら、Ｉ　ＡＡ（インドールアクリル酸）６０μｇ／ ｌ１１１を添加してさらに３７℃で２４時間培養した。０Ｄａｓｏが１゜０に相 当する培養菌を遠心し、ラエムリのサンプル緩衝液［ラエムリ、Ｄ、に、（１９ ７０年）、ネーチャー、２２７巻、６８０頁］１００μｌに溶解した。溶液を１ ００℃で５分間加温し、ついでそのｌ０μ】を１２，５％５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動に掛けた。

その結果を第８図に示す。

１枠はＢＲＬ低分子量マーカーである。

２〜９枠はＩＡＡによって誘導されたサケ成長ホルモン遺伝子を含有する（ｐｔ ｒｐ３２２ＨＳＧＨ）Ｗ３１１０株の結果を示す。

ｌＯ〜１３枠はＩＡＡによって誘導されたサケ成長ホルモン遺伝子を含有しない （ｐｔｒｐ３２２）Ｗ３１１０株の結果を示す。

第８図から判るように、サケ成長ホルモン遺伝子を含有しないｐｔｒｐ３２２− Ｗ３１１０では認められなかった２２Ｋｄのバンドが、ｐｔｒｐ３２２　Ｓ　Ｇ Ｈ−Ｗ３１１０ではエシェリヒア・コリ総蛋白質量の２０％を超える量で出現す る。

Ｍ９培地は４０　ｍＭ　Ｋ　ｔ　ＨＰ　Ｏ４，２２ｍＭ　Ｋ　Ｈｔ　Ｐ　Ｏ４， ８、５ｍＭＮａＣｌ、１８．７ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、１　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４ ，０，１ｍＭＣａＣｌ３．１０μｓ／ｍｌビタミンＢ、、０．４％カザミノ酸、 １％グルコースおよびアンピシリン４０μｇ／ｍｌを含有している。

ヌコ（５’　−３’）　：遺伝子配へ ＳＧＨ：ライゲーション・ストラテジーＦｉｇ、３ Ｘｈａｌ　、・、　Ｈｉｒｄ［ Ｆｉｇ、４ Ｆｉｇ、６ ＩＮＴｔｊｌＮム〒１０〜ムＬ　（ｆＡＤＦｌｊ　（ｌＩＩｌ＋１６＃〒

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）サケの成長ホルモンのアミノ酸配列にしたがってＸｂａＩ、Ｈｉｎ ｄＩＩＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を有するオリゴヌクレオチドを合成し、（ ｂ）ライゲーション・ストラテジーにもとづきＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを有す る−断片およびＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩを有する他の断片をそれぞれエシェリ ヒア・コリのベクターにつなぎ、（ｃ）２個のクローン化した断片をエシェリヒ ア・コリのためのベクターヘライゲーションして、Ｎ−末端部分を欠いたサケ成 長ホルモン遺伝子を得、（ｄ）プロモーターおよびターミネーターからなるエシ ェリヒア・コリのベクターヘ部分サケ成長ホルモン遺伝子およびＮ−末端合成ア ダプターを挿入して、プロモーター−サケ成長ホルモン遺伝子ターミネーターカ セットを得、（ｅ）酵母で形質発現するためのエシェリヒァ・コリ酵母ーシャト ルベクターヘカセットを挿入し、（ｆ）得られたベクターを酵母細胞で発現する ことからなるサケ成長ホルモンの生産方法。
2. （２）Ｎ−末端合成アダプターが下記の【配列があります】 で示されるＮｏｃＩおよびＸｂａ１制限酵素部位を有するヌクレオチド配列であ る請求の範囲第１項記載のサケ成長ホルモンの生産方法。
3. （３）得られた形質発現ベクターが、プロモーター−完全サケ成長ホルモン遺伝 子ターミネーターを含んだカセットをクローン化したベクター（ｐＣ１／１−Ｓ ＧＨ）である請求の範囲第１項記載のサケ成長ホルモンの生産方法。
4. （４）合成アダプターが、酵母によって優勢に使用されるアミノ酸コドンによっ て合成されたものである請求の範囲第１項記載のサケ成長ホルモンの生産方法。
5. （５）（ａ）サケの成長ホルモンのアミノ酸配列にしたがってオリゴヌクレオチ ドを合成し、（ｂ）ライゲーション・ストラテジーに、もとづく二つの断片をそ れぞれエシェリヒア・コリのためのベクターにつなぎ、（ｃ）２個のクローン化 した断片をエシェリヒァ・コリのベクターヘ再ライゲーションして、Ｎ−末端部 分を欠いたサケコリのベクタ 成長ホルモン遺伝子を作成し、（ｄ）エシェリヒア・コリのベターヘ部分サケ成 長ホルモン遺伝子およびＮ−末端合成アダプターを挿入し、（ｅ）得られたサケ 成長ホルモン遺伝子および合成アダプターをｔｒｐプロモーターを有する形質発 現ベクターヘライゲーションし、（ｆ） 得られたベクターをエシェリヒア・コリで発現することからなるサケ成長ホルモ ンの生産方法。
6. （６）合成オリゴヌクレオチドがＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１制限 酵素部位を含んでいる請求の範囲第５項記載のサケ成長ホルモンの生産方法。
7. （７）ライゲーション・ストラテジーによってつながれたＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩ ＩＩを有するＮ−末端断片およびＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩを有するＣ−末端断 片をＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を含んだエシェリヒ ア・コリのベクターｐＵＣ１８にそれぞれクローニングし、ＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａＩＩ制限酵素で切断した、二つのクローン化 した断片をそれぞれエシェリヒア・コリのベクターｐＵＣ１８に再クローニング する方法によってＮ−末端を欠いたサケ成長ホルモン遺伝子を合成することから なる請求の範囲第５項記載のサケ成長ホルモンの生産方法。
8. （８）Ｎ−末端ヌクレオチド合成アダプターがＮｄｅＩおよびＸｂａＩ制限酵素 部位を有し、 ３８量体（【配列があります】）からなる上流鎖および４０量体（【配列があり ます】）からなる下流鎖を含んだヌクレオチド配列である請求の範囲第５項記載 のサケ長ホルモンの生産方法。
9. （９）ｔｒｐプロモーターを有する形質発現ベクターをＨｐａＩおよびＳａｌＩ 制限酵素で切断し、合成アダプターを有するサケ成長ホルモンをこれにつなげる 方法によって目的の形質発現ベクターを得ることからなる請求の範囲第５項記載 のサケ成長ホルモンの生産方法。
10. （１０）合成アダプターがＨｐａＩおよびＮｄｅＩ制限酵素部位を有し３６量体 （【配列があります】）からなる上流鎖および３８量体（【配列があります】） からなる下流鎖を含んだヌクレオチド配列である請求の範囲第５項または第９項 記載のサケ成長ホルモンの生産方法。