KR900006998B1

KR900006998B1 - 합성유전자에 의한 대장균으로부터 연어 성장호르몬의 제조방법

Info

Publication number: KR900006998B1
Application number: KR1019860011709A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 이용범; 이태규; 이태호; 정현호; 박영우; 한규범
Original assignee: 주식회사 럭키; 허신구
Priority date: 1986-12-31
Filing date: 1986-12-31
Publication date: 1990-09-25
Also published as: KR880007722A

Abstract

내용 없음.

Description

합성유전자에 의한 대장균으로부터 연어 성장호르몬의 제조방법

제 1 도는 전체 연어 성장호르몬 유전자에 해당되는 28종류의 합성 올리고 뉴클리오티드의 염기순서를 5' 말단에서 3' 말단순서로 나타낸 것이며,

제2도는 제 1 도의 올리고 뉴클리오티드의 접합전략을 도시한 것이며,

제3도는 합성 올리고 뉴클리오티드의 접합을 위해 대장균 운반체 pUC18에로의 전체 연여성창 호르몬유전자 재조합 과정을 나타낸 것이고,

제4도는 확인된 연어 성장 호르몬의 염기 배연 순서 및 아미노산 배열순서를 나타낸 것이고,

제5도는 재조합된 전체 연여 성장호르몬 유전자를 대장균 발현 운반체로 재조합시키는 과정을 나타낸 것이고,

제6도는 대장균 내에서 대량 생성된 연어 성장호르몬을 SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동 방법으로 확인한 결과이다.

본 발명은 유전공학 기출을 이용하여 대장균(Escherichiacoli)대에서 연여의 성장을 촉진시키는 연어 성장호르몬(Salmon Grow℃h Honnone)을 대량 생산하는 제조방법에 관한 것이다.

현재 자연상태에서 수확되는 어류양에는 점차 한계가 있어, 식량 문제 해결 방편으로 인공 양어장에서 어류를 키우고 있는데. 이같이 양어할 경우 발생되는 문제로서는 연어를 일정 크기로 키우는데 시간이 장기간소요되며, 또한 사료의 비용이 큰 몫을 차지하고 있다. 따라서 경제적인 측면에서 볼때 먹이 전환효율(Feed conversion efficiency)을 증가시켜야 할 필요성이 절실히 요구된다.

지금까지 사용되고 있는 방식으로는 단백질과 지방의 적정배합을 통해 사료의 효율을 높이고 있지만, 이는 가격면에서 바람직하지 못하다. 한편, 아나볼릭 스테로이드(anabolic s℃eroid), 티로이드 호르몬(℃hyroid hormone)을 먹이에 섞은 결과 좋은 결과를 얻었고(Higgs, D.A. e℃ al.,(1982) Comp.Biochem.Physiol.73B : 143), 소 성장호르몬과 맑 성장호르몬을 이용한 결과 역시 높은 효과를 얻었다는 보고가 있다.(Gill,J.A.,e℃ al(1985) Bio℃echnology 3,643).

본 발명자들은 이와같은 문제점들을 해결하고자 대장균에서 강력한 프로모터로 작용하는 트립트판 프로모터를 이용하여 연어 성장호르몬 유전자를 대장균 대에서 대량 발현시켜 연어 성장 호르몬을 대량 생산할 수 있도록 하였다.

즉, 본 발명의 방법은 다음과 같다.

본 발명은 연어 성장호르몬의 유전자 염기배열 순서에 따라 올리고, 뉴클리오티드를 합성한 후 이를 대장균 운반체에 클로닝하여 아미노 말단 유전자가 없는 연어 성장호르몬 유전자를 제조한 다음 이 유전자를 아미노 말단 합성유전자와 함께 대장균 운반체에 접합시켜 연어 성장호르몬 전체 유전자를 ℃rp 프로모터가 있는 발현운반체에 접합시킨 최종 발현운반체를 만든후, 이를 합성 연결체와 함께 대장균내에서 발현시킴을 특징으로 하는 연어 성장호르몬의 제조방법으로서, 상기 합성 올리고 뉴클리오티드에는 제한효소 XbaI, HindIII, SalI의 인지부위가 존재하고 상기 아미노 말단의 일부가 없는 연어 성장호르몬 유전자는 합성 올리고 뉴클리오티드의 카복시쪽 HindIII/SalI의 절편과 아미노쪽 XbaI/HindIII의 절편을 XbaI, HinIII, SalI의 제한효소인 인지부위가 존재하는 대장균 운반체(pUC18)에 각각 재클로닝시켜, 증식시킨 후 이 절편들을 다시 분리하여 접합시킨 후 대장균 운반체(pUC18)에 재클로닝시켜 제조된 것이며, 상기 아이노 말단합성유전자는 제한효소 NdeI과 XbaI의 인지부위가 존재하는 읫가닥 38mer(5'-℃ A℃G A℃C GAA AA℃ CAG CG℃ ℃℃A ℃℃C AAC A℃℃ GCA A℃℃ ℃-3')와 아랫가닥 40mer(3'-AC ℃AG C℃℃ ℃℃A G℃C GCA AA℃ AAG ℃℃G ℃AA CG℃ CAA AGA ℃C-5')이며, 상기 최종발현 운반체는 ℃rp 프로모터가 있는 발현 운반체를 제한효소 HpaI와 SalI으로 절단시킨 후 여기에 연어 성장 호르몬과 합성연결체를 접합시켜서 된 것이며, 상기 합성연결체는 제한효소 HpaI과 NdeI의 인지부위가 존재하는 윗가닥 36mer(5'-AAC ℃AG ℃AC GCA AG℃ ℃CA CG℃ AAA AAG GG℃ AA℃ ACA-3')와 아랫가닥 38mer(3'-℃℃G A℃C A℃G CG℃ ℃CA AG℃ GCA ℃℃℃ ℃℃C CCA ℃℃A ℃G℃ A℃-5')이다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

지금까지 알려진 연어 성장 호르몬(Salmon grow℃h hormone)의 아미노산 배연 순서를 기초(Sekine S.e℃ al(1g85) PNAS 82-4306)로 하여 유전자 배연을 설정한 뒤 유전자대에 제한효소 XbaI, EcoRI,HindIII 부위가 생겨나도록 고안하여 포스포라미디트(Phosphoramidi℃e)방법에 따라 유전자 합성기(Applied biosys℃em Mode1 380B, U.S.A.)로 합성한 다음 합성된 올리고 뉴클리오티드(Oligonucleo℃ied)를 제2도에서와 같이 접합시키기 위해 대장균 운반체 pUC18[Norrander 등 Gene 36(1983)101]를 이용하여 제3도에서와 같이 571 염기쌍의 전체 유전자중 533 염기쌍연 제한효소 XbaI, SalI 절편을 얻은 뒤 시작 코돈(codon)인 A℃G 부위가 제한효소 NdeI으로 절단되어 질 수 있고 대장균에서 주로 쓰이는 코돈으로 설계된 아미노 말단 유전자를 상기 절편과 함꼐 대장균 운반체 pBR 322에서 최종 접합시켰다.(실시예 1참조).

연어 성장 호르몬 전체 유전자를 지닌 571 염기쌍의 제한효소 NdeI, SalI 절편을 m-RNA 이차구조 형성이 안 생기도록 SD 배열(Shine Dalgarno Seguence)과 시작 코돈인 A℃G 사이의 염기를 적절히 배열시킨 제한효소 HpaI, NdeI 부위가 생겨나는 올리고 뉴클리오티드와 항꼐 제한효소 HpaI과 SalI으로 절단된 대장균 발현 운반체인 p℃rp 322에 [Pharmacia Pica℃away, N.J.08854, U.S.A.Russe1,D.R.ε Benne℃,G.

N.Gene,20,23(1981)]접합단응시킨 뒤 대장균주인 `V 3110(A℃CC 27325)에 형질절환시켰고 (실시예 2 참조). M 9 배지에서 IAA(Indole acrylic acid)를 유도체로 이용하여 대장균에서 발현시킨 뒤 이를 SDS-폴러아크릴아마이드 겔 전기 영동법으로 확인하있다. (실시예 3 참조).

[실시예 1]

운반체 pUC18을 이용한 합성 연어 성장 호르몬을 올리고 뉴클리오티드들의 접합반응(Liga℃ion) 및 운반체 pBR322에로의 클로닝(Cloning)

전체 연어 성장 호르몬 유전자를 얻기 위해 제 1 도와 같은 방식으로 올리고 뉴클리오티드를 유전자 합성기(Applied Biosys℃em Model 380B, U.S.A.)로 합성한 뒤 제 3 도에서와 같이 이들 올러고머(Oligomer)들을 접합시켰다.

즉, 전체 유전자중 카복시쪽의 제한효소 HindIII-SalI 절편에 해당되는 올리고 뉴클리오티드들을 각각 260nm에서 홈광도가 0.05되게 취한 뒤, 각각 건조시켰고 이어 올리고 뉴클리오티드의 5'-말단 잔기를 인산화시키기 위해 ℃₄폴리뉴클리오티드 키나제(Polynycleotide Kinase)와 반응시켰다. 반응액 조건은 50mM Tri-HCl(pH7.5), 1mM ATP,1mM MgCl₂T₄폴러뉴클리오티드 키나제 4 units하에 전체부피 30μl에서 37℃, 30분간 반응시켰다. 이어서 이들 올리고 뉴클리오티드를 전부 모아 페놀과 클로로포름을 처리한 뒤 에탄올로 침전시켰고, 건조시킨 뒤 완충액(60mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM DTT, 10mM MgCl₂)53μl에 녹인 후, 95℃ 물탱크에서 온도가 서서히 내려가는 상태로 6시간 방치한뒤 여기에 T₄DNA ligase 20units와 10mM ATP 5μl를 가하여 상온에서 10분간 반응시켜서 올리고머(Oligomer)의 5' 말단과 3' 말단을 연결시킨 뒤 페놀과 클로로포름 처리후 에탄올로 침전시켰고, 건조시킨 이들 DNA를 60mM tris(pH7.6), 10mM MgCl₂, 100mM NaC1 완충액 조건하에 HindIII 및 SalI 제한효소 각각 10unit씩 가하여 37℃ 1시간 반응시킨 후 7% 폴리아크릴 아마이드셀 전기영동을 시켰다. 이어 겔에서 230-270 염기쌍에 해당되는 부분을 도려내어 전기 용출시킨 뒤 일루팁(elutip-, Schileicher Schuell U.S.A.)를 통과시킨 후 에탄올로 침전시켜 20μl 증류수에 녹였다. 이 DNA 3μl와 제한효소 HindIII 및 SalI으로 절단된 운반체pUC18(10ng)을 접합 반응조건(60mM Tris-HC1 pH7.5, 10mM DTT, 10mM MgC1₂, 1mM ATP, 10units T₄DNA ligase) 하에서 14℃에서 16시간 접합 반응시켰다.

이어 하나한(Hanahan)의 방법(J.Mol.Biol(1983)116, 557)에 따라 E.col JMl03[BRL, U.S.A., Messing J.(1983)101, 99, 20-73 Methods in Enzymology]에 형질전환(Transfornntion) 시킨뒤, 바른보임 과 돌리 의방법(Naucleic Acids Research(1g7g),7,1513)으로 재조합된 운반체 p3·-SGH를 지닌 대장균 클론(clone)을 선변하였다.

한편, 전체 연어 성장 호르몬 유전자중 아미노쪽의 XbaI-HindIII 절편에 해당되는 올리고 뉴클리오티드들도 상기 연급한 동일한 방식우루 접합시켜 XbaI, HindIII로 절단된 pUC18에 클로닝시켜 p5'-SGH를지닌 대장균 클론을 찾아냈다. 이어서 571 염기쌍의 전체 유전자중 533 염기쌍에 해당되는 XbaI-SalI 절편을 얻기 위해 p3'-SGH'를 HindIII, SaII으로 처리한 뒤 얻은 251 염기쌍의 DNA 절편과 p5'-SGH를XbaI, HindIII로 처리한 뒤 얻은 282 염기쌍의 DNA 절편을 제한 효소 XbaI과 SalI으로 처라한 pUC18에접합 반응시켜 533 염기쌍의 XbaI-SalI 절편이 들어간 운반체 pSGH를 얻었다

이와같이 접합시킨 XbaI-SalI 절편을 M13 다이데옥시 시퀴엔싱(dideoxy sequencing)방법으로 염기 서열을 확인하있다.

이어서 전체 유전자중 제한효소 XbaI 앞부분에 해당되는 DNA를 대장균에서 주로 쓰이는 코돈(codon)위주로 설계하였고, 또한 시작코돈인 ATG 부위가 제한효소 NdeI 부위와 상보적이고 반대쪽은 제한효소 XbaI 부위와 상보적이 되도록 고안한 윗가닥 38mer(5'-T AG ATC GAA AAT CAG CGT TTA TTC AAC ATT GCA GTT T-3')와 아랫가닥 40mer(3'-AC TAG CTT TTA GTC GCA AAT AAG TTG TAA CGT CAA AGA TC-5')를 합성한뒤 pSGH에서 얻은 533 염기쌍의 XbaI-SalI 절편과 함께NdeI과 SalI으로 절단시킨 대장균 운반체 pBR322[ATCC 37017]에 클로닝시켜 연어 성장 호르몬 전체 유·전자를 지닌 pBR SGH 클론을 얻었다.(제3도 참고).

[실시예 2]

연어 성장 호르몬 전체 유전자를 대장균 발현 운반체로 클로닝시키는 유전자 조작 기술 과정

연어 성장 호르몬을 대장균에서 trp 프로모터(promoter)를 이옹하여 대량 발현시키기 위하여 제 5 도와같은 방식으로 실시하였다.

즉, trp 프로모터가 있는 발현운반체 ptrp 322를 제한효소 HpaI과 SalI으로 절단시킨 뒤 아가로스겔 전기영동으로 2.3^k의 절편을 전기용출 및 에탄올 침전으로 얻은 뒤 pBR SGH를 NdeI과 SalI으로 처리하여얻은 571 염기쌍의 절편과 trp 프로모터의 SD 배열(5'-AA GG-3')과 연어 성장 호르몬 유전자 시작코돈인 ATG 사이가 9개 염기가 되고, 이 부분에 해당되는 m-RNA 부위에서 이차구조 형성이 안되도록 고안하였고 양쪽 끝이 제한효소 HpaI과 NdeI 부위와 상보적이 되도록 고안한 윗가닥 36mer(5'-AAC TAG TAC GCA AGT TCA CGT AAA AAG GGT AAT ACA-3')와 아랫가닥 38mer(3'-TTG ATC ATG CGT TCA AGT GCA TTTTTC CCA TTATTGT AT-5')를 같이 접합반응 조건(실시예 1 참고)하에서진행시킨 뒤 E.Coli HB101[ATCC 33694]에 형질전환시켜 trp 프로모터 뒤에 연어 성장호르몬 유전자가배열된 클론을 얻었고, 이 발현 운반체를 ptrp 322 H SGH라 명하였으며(제 5 도 참고) 이를 다시 대장균발현 숙주인 W31l0(ATCC 27325)에 형질전환시켰다.

[실시예 3]

대장균 숙주 W3110에서 연어 성장호르몬의 대량 발현 및 에스디에스 폴리아크릴 아마이드겔 전기영동법으로 확인 과정

발현운반체 ptrp 322 H SGH를 지닌 W3110을 앰피실린(Ampicillin)이 40μg/mL 포함된 LB 배지에서16시간 37℃에서 키운 뒤 M9 배지에 650nm에서의 흡광도가 0.02되게 옮겨준 뒤 37℃에서 혼들어 주면서배양하여 650nm에서 흡광도가 0.5되는 지점에서 IAA(Indole acrylic acid)를 60μ/g/m1되게 첨가한 후 24시간 37℃에서 배양하였다. 흡광도 650nm에서 1.0 해당되는 배양된 균을 원심분리하여 얻은 뒤 l00μl의 람리 완충용액(Lamemmli sample buffer ; Laemmli D. K.(1g70) Nature 227, 680)에 녹인 뒤 100℃에서 5분간 가연후 10μl를 12.5% SDS 폴리아크릴 아마이드젤 전기영동시켰다. 그 절과 제6도에서 볼 수 있듯이 연어 성장 호르몬 유전자가 들어있지 않는 ptrp 322, W 3110에서는 롤 수 없는 22, 000 dalton의 밴드가ptrp 322 SGH, W 3110에서 대장균 전체 단백질의 20% 이상되는 양으로 나타났다. Mg 배지는 40mM K₂HPO4, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaC1, 18.7mM NH₄C1, lmM MgSO₄, 0.lmM CaCl₂, 10μg/ml ViTB₁, 0.4% CAA(Casamino acid), 1% 글루코즈, 40μg/ml 앰피시린의 조성으로 되어 있다.

Claims

연어성장호르몬의 아미노산 배열 순서에 따라 올리고 뉴클리오티드를 합성한 후 이를 대장균 운반체에 클로닝하여 아미노 말단 유전자가 없는 연어 성장호르몬 유전자를 제조한 다음 이 유전자를 아미노 말단 합성유전자와 함께 대장균 운반체에 정합시켜 연어 성장호르몬 전체 유전자를 만든 후 이를 합성연결체와 항께 trp 프로모터가 있는 발현운반체에 접합시켜 최종발현 운반체를 만든후 이를 대장균내에서 발현시킴을 특징으로 하는 연어 성장호르몬의 제조방법.
제 1 항에 있어서 합성 올리고 뉴클리오티드에는 제한효소 XbaI, HindIII, SalI의 인지부의가 존재함을 특징으로 하는 연어 성장호르몬의 제조방법.

제 1 항에 있어서, 아미노 말단의 일부가 없는 연어 성장호르몬 유전자는 합성 올리고 뉴클리오티드의카복시쪽 HindIII/SalI의 절편과 아미노쪽 XbaI/HindIII의 절편을 XbaI, HindIII, SalI의 제한효소 인지부위가 존재하는 대장균 운반체(pUC18)에 각각 클로닝시켜, 증식시킨 후 이 절편들을 다시 분리하여 접합시킨 후 대장균 운반체(pUC18)에 제클로닝시켜 제조된 것임을 특징으로 하는 연어 성장 호르몬의 제조방법.
제1항에 있어서, 아미노 말단의 일부가 없는 연어 성장 호르몬 유전자는 합성 올리고 뉴클리오티드의 카복시쪽 HindⅢ/saⅡ의 절편을 XbaⅠ, HindⅢ, SaⅡ의 제한효소 인지부위가 존재하는 대장균 운반체(pU18)에 각각 클로닝시켜, 증식시킨 후 이 절편들을 다시 분리하여 접합시킨 후 대장균 운반체(pUC18)에 재클로닝시켜 제조된 것임을 특징으로 하는 연어 성장 호르몬 제조방법.
제1 항에 있어서, 아미노 말단 합성 유전자는 제한효소(NdeI과 XbaI의 인지부위가 존재하는 윗가닥38mer(5'-T ATG ATC GAA AAT CAG CGT TTA TTC AAC ATT GCA GTT T-3′)와 아랫가닥40mer(T'-AC TAG CTT TTA GTC GCA AAT AAG TTG TAA CGT CAA AGA TC-5')로 구성된것임을 특징으로 하는 연어 성장호르몬의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 최종발현 운반체는 trp 프로모터가 있는 발현 운반체를 제한효소 HpaI와 SalI으로절단시킨 후 여기에 연어 성장호르몬과 합성연결체를 접합시켜서 된 것임을 특징으로 하는 연어 성장호르몬의 제조방법.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 합성연결체는 제한효소 HpaI과 NdeI의 인지부의가 존재하는 윗가닥36mer(5'-AAC TAG TAC GCA AGT TCA CGT AAA AAG GGT AAT ACA-3')와 아랫가닥 38mer(3'-TTG ATC ATG CGT TCA AGT GCA TTT TTC CCA TTA TGT AT-5')로 구성된 올리고 뉴클리오티드임을 특징으로하는 연어 성장호르몬의 제조방법