HU216069B

HU216069B - Eljárás fúziós fehérjék előállítására

Info

Publication number: HU216069B
Application number: HUP9200674A
Authority: HU
Inventors: Paul Habermann; Brian Seed; Siegfried Stengelin; Eugen Uhlmann; Wolfgang Ulmer
Original assignee: General Hospital Corp.; Hoechst Ag.
Priority date: 1989-08-29
Filing date: 1990-08-28
Publication date: 1999-04-28
Also published as: JPH05501799A; DE69032743D1; HU9200674D0; AU638277B2; GR1005153B; GR900100635A; ZA906839B; DK0489780T3; ES2124216T3; IE903120A1; CY2168B1; DE69032743T2; EP0489780B1; JP3043803B2; IL95495A; HK1012026A1; EP0489780A4; NO920774L; HUT60327A; PT95111A

Abstract

A találmány szerinti eljárással valamely kívánt fehérjét és egyballasztrészt tartalmazó fúziós fehérjét állítanak elő őly módőn, hőgya) a ballasztrészt kódőló kevert őligőnűkleőtidőt állítanak elő, ahőlaz őligőnűkleőtid DNS-szekvenciája (kódőlószál) (DCD)x részt tartalmaz, ahől D jelentése A, G vagy T és x értéke 4–12, és ahől az őligőnűkleőtid legfeljebb 100 nűkleőtidőt tartalmaz, b) akevert őligőnűkleőtidőt vektőrba építik őly módőn, hőgy fűnkciőnálisankapcsőlódjőn egy szabályőzószakaszhőz, és a kívánt fehérjét kódőlóstrűktúrgénhez, c) a kapőtt vektőrpőpűlációval gazdasejtekettranszfőrmálnak, d) a transzfőrmánsőkból egy vagy több őlyan klóntszelektálnak, amelyek a fúziós fehérjét nagy kitermeléssel kifejezik,és e) a fúziós fehérjét kifejezik. ŕ

Description

A találmány fúziós fehérjék előállítására vonatkozik.

Azokat a fehéijéket, amelyek a kívánt fehérje mellett egy nem kívánt alkotóelemet, úgynevezett ballasztrészt tartalmaznak a végtermékben, fúziós fehérjéknek nevezik. Fehérjék géntechnológiai előállítása során a fúziós fehérjék köztitermék állapotát elsősorban akkor alkalmazzák, ha a közvetlen kifejeződés során a kívánt fehérje viszonylag gyorsan lebomlik a gazda endogén proteázainak hatására, miáltal a kívánt fehérje kitermelése kisebb vagy nagyobb mértékben lecsökken.

Fúziós fehérjék előállítását ismerteti például Reidhaar-Olson és munkatársai: Science 241, 53-57 (1988), Bachmair és munkatársai: Science 234, 179-186 (1986), valamint a 4769326 számú USA-beli szabadalmi leírás.

A fúziós fehérje ballasztrészének kiterjedését általában úgy választják meg, hogy oldhatatlan fúziós fehérjét eredményezzen. Az oldhatatlanság egyrészt megfelelő védelmet nyújt a gazda endogén proteázaival szemben, másrészt lehetővé teszi a fúziós fehérjének az oldható sejtkomponensektől történő könnyű elválasztását. Általánosan elfogadott megoldás, hogy a kívánt fehéije aránya a fúziós fehéijén belül viszonylag kicsi, vagyis a sejt viszonylag nagy mennyiségű ballasztanyagot termel.

Szükség van olyan fúziós fehérjék előállítására, amelyek rövid ballasztrészt tartalmaznak. Előállítottak például olyan génfúziót, amely a B-galaktozidáz és a szomatosztatin első tíz aminosavát tartalmazó fúziós fehérjét kódolja. Azt tapasztalták azonban, hogy ez a rövid aminosavlánc nem védi meg kellő módon a fúziós fehérjét a gazda endogén proteázainak lebontó hatásával szemben (4366246 számú USA-beli szabadalmi leírás, 15. oszlop, 2. bekezdés).

A 290 005 és 292 763 számú európai közrebocsátási irat olyan fúziós fehérjét ismertet, amelynek ballasztrésze 250 aminosavnál hosszabb B-galaktozidázfragmenst tartalmaz. Ezek a fúziós fehérjék oldhatatlanok, de karbamiddal könnyen oldhatóvá alakíthatók (290 005 számú európai közrebocsátási irat).

Annak ellenére, hogy különböző fúziós fehérjék már ismertek, a megfelelő tulajdonságokkal, például proteázrezisztenciával rendelkező fúziós fehérjék előállítása mindig munkaigényes folyamat, és a kapott fúziós fehérje gyakran számos nemkívánatos jellemzővel rendelkezik. Szükség van tehát olyan eljárás kidolgozására, amely lehetővé teszi előnyös tulajdonságokkal, így proteázrezisztenciával rendelkező fúziós fehérjék előállítását, megfelelő hajtogatását, és a ballasztanyagnak a kívánt fehérjétől történő hatékony lehasítását.

A találmány tárgya új eljárás valamely kívánt fehérjéből és egy ballasztrészből álló fúziós fehérjék előállítására oly módon, hogy

a) az adott ballasztrészt kódoló kevert oligonukleotidot állítunk elő, ahol az oligonukleotid DNS-szekvenciáia (kódolószál) (DCD)_X részt tartalmaz, ahol

D jelentése A, G vagy T és x értéke 4-12,

b) a kevert oligonukleotidot vektorba építjük oly módon, hogy funkcionálisan kapcsolódjon egy szabályozószakaszhoz és a kívánt fehéijét kódoló struktúrgénhez,

c) a kapott vektorpopulációval gazdasejteket transzformálunk,

d) a transzformánsokból egy vagy több olyan kiónt szelektálunk, amelyek a fúziós fehérjét nagy kitermeléssel kifejezik, és

e) a fúziós fehéijét kifejezzük.

A találmány szerinti eljárás során tehát egy oligonukleotid könyvtárat (keveréket) állítunk elő, amely a ballasztrészt kódolja, a kevert oligonukleotidot (könyvtárat) egy vektorba építjük be úgy, hogy az oligonukleotid fúnkcionálisan kapcsolódjon egy szabályozószakaszhoz és a kívánt fehérjét kódoló struktúrgénhez, majd a kapott vektorpopulációval gazdasejtet transzformálunk. Ezután szelektáljuk a fúziós fehéijét nagy kitermeléssel kifejező transzformánsokat.

A találmány szerinti eljárás során előnyösen olyan oligonukleotidokat alkalmazunk, amelyek olyan aminosavat vagy aminosavak olyan csoportját kódolják, ami lehetővé teszi a kívánt fehéijének a ballasztrésztől történő könnyű lehasítását. A lehasítás megvalósítható enzimatikusan vagy kémiailag.

A találmány szerinti eljárás során továbbá előnyösen olyan oligonukleotidokat alkalmazunk, amelyek könnyen oldhatóvá alakítható oldhatatlan fúziós fehérjékhez vezetnek. A találmány szerint előállított fúziós fehéijék ezáltal kielégítik a proteázrezisztencia követelményét.

Emellett a találmány szerint alkalmazott oligonukleotidok kialakíthatók úgy, hogy a ballasztrész ne befolyásolja a kívánt fehéije hajtogatását.

Az 1. ábra, valamint az ennek folytatását jelentő la. és lb. ábra pINT4x plazmidpopuláció (génbank) előállítását ismerteti az ismert pH 154/25* plazmidból kiindulva a pINT40 plazmid segítségével. A további szerkezeteket grafikusan nem ábrázoltuk, mivel ezek az ábra alapján könnyen meghatározhatók.

A 2. ábra a teljes HMG CoA reduktáz gént tartalmazó pUHIO plazmid hasítási térképe.

A 3. és 3a. ábra a mini proinzulingént tartalmazó pIK4 plazmid előállítását mutatja.

A fúziós fehéijék előállítására szolgáló találmány szerinti eljárás jellemző vonása, hogy olyan kevert oligonukleotidot állítunk elő, amely a fúziós fehéije ballasztrészét kódolja. A kevert oligonukleotidot egy vektorba építjük be oly módon, hogy fúnkcionálisan kapcsolódjon egy szabályozószakaszhoz és kívánt fehéije struktúrgénjéhez. Megfelelő gazdasejteket transzformálunk a kapott plazmidpopulációval, és szelektáljuk a kódolt fúziós fehérjét nagy kitermeléssel előállító ki ónokat. A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módját az alábbiakban mutatjuk be:

Az oligonukleotid 3’-végén előnyösen olyan aminosavat vagy aminosavak olyan csoportját kódolja, amely lehetővé teszi a ballasztrésznek a kívánt fehéijétól történő könnyű, előnyösen enzimatikus lehasítását. Egy másik megvalósítási mód szerint olyan oligonukleotidot

HU 216 069 Β állítunk elő, amely olyan oldhatatlan fúziós fehérjét eredményez, amely könnyen oldhatóvá tehető. Közelebbről, előnyösen olyan oligonukleotidot állítunk elő, amely olyan ballasztrészt kódol, amely nem befolyásolja a kívánt fehérje hajtogatását.

Gyakorlati okokból a találmány szerint előállított oligonukleotid nagyon rövid ballasztrészt kódol.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a fúziós fehérjék különlegesen rövid ballasztrész esetén is kielégítik a proteázrezisztencia követelményét, és emellett nagy kitermeléssel előállíthatók, kívánt esetben oldhatatlanok, és könnyen oldhatóvá tehetők. Oldott vagy oldható állapotban a találmány szerint előállított rövid ballasztrész lehetővé teszi a kívánt fehérje szférikusán kedvező konformációjának kialakulását, és így a kívánt fehérje könnyen hajtogatható, és a ballasztrésztől könnyen elválasztható.

Ha a kívánt fehéijét pro formában állítjuk elő, a ballasztrész kialakítható oly módon, hogy annak lehasítása a proproteinnek az érett fehérjévé történő átalakítása során önmagától bekövetkezzen. Például az inzulin előállítása során a ballasztrész és a C lánc egyidejűleg eltávolítható, amelynek során az inzulin érett származéka keletkezik, amely további veszteséget okozó mellékreakciók nélkül inzulinná alakítható.

A találmány szerint előállított rövid ballasztrész gyakorlatilag rövidebb, mint a fehéijék szokásos szignálszekvenciája, és nem befolyásolja a kívánt fehéije hajtogatását. Ennek következtében nincs szükség arra, hogy a ballasztrészt az érett fehéijét eredményező utolsó előállítási lépés előtt eltávolítsuk.

A ballasztrészt kódoló oligonukleotid előnyös DNSszekvenciája (kódolószál) az alábbi képlettel ábrázolható:

(DCD)_X ahol

D jelentése A, G vagy T x értéke 4-12, előnyösen 4-8.

Közelebbről, az oligonukleotid DNS-szekvenciája (kódolószál) előnyösen

ATG (DCD)_y (NNN)_Z, ahol

N jelentése az NNN triplettben a stop kodontól eltérő, azonos vagy különböző nukleotid, z értéke 1-4, y+z értéke 6-12, előnyösen 6-10, ahol y értéke legalább 4.

Tapasztalataink szerint előnyösen alkalmazható az az oligonukleotid, amelynek DNS-szekvenciája (kódolószál)

ATG (DCD)_5Í! (NNN), előnyösen amelynek DNS-szekvenciája (kódolószál)

ATG GCW (DCD)_{4 8} CGW, vagy előnyösen

ATG GCA (DCD)₄_₇ CGW, ahol

W jelentése A vagy T.

A fent említett DNS-modellszekvenciák kielégítik a kívánt követelményeket. A DCD kodon szerin, treonin és alanin aminosavakat kódol, és így viszonylag hidrofil proteinláncot eredményez. A stop kodonok ki vannak zárva, és az aminosavak választéka egy kezelhető körön belül marad. A ballasztrészt kódoló DNS-szekvencia előnyös megvalósítási módjai az alábbi képletekkel ábrázolhatok, különösen akkor, ha a kívánt fehérje proinzulin:

ATG	GCW	(DCD)_y.	ACG	CGW
vagy
ATG	GCD	(DCD)y	ACG	CGT
ahol
y’ értéke 3-	-6, előnyösen 4-6.

A második kodon, a GCD alanint kódol, és teljessé teszi az Ncol restrikciós enzim felismerőszekvenciáját, feltéve, hogy az ezt megelőző szabályozószekvencia CC bázisokra végződik. Az utolsó előtti triplett treonint kódol, és az arginint kódoló CGT kodonnal együtt az Miül restrikciós enzim felismerőszekvenciáját eredményezi. Ennek következtében ez az oligonukleotid könnyen és problémamentesen beépíthető a génszerkezetekbe.

A (NNN)_Z csoport a 3’-helyzetben olyan aminosavat vagy aminosavak olyan csoportját kódolja, amely lehetővé teszi a ballasztrésznek az ezt követő kívánt fehéijétől történő egyszerű, előnyösen enzimatikus lehasítását. A nukleotidoknak ezt a csoportját előnyösen úgy választjuk meg, hogy a 3’-végen olyan restrikciós-enzimhasításihelyet kódoljon, amely lehetővé teszi a kívánt fehéije struktúrgénjének megkötését. Előnyös továbbá, ha az ATG start kodon, és kívánt esetben az első DCD triplett vonatkozásában olyan restrikciósenzim-felismerőszekvenciát építünk be, amely lehetővé teszi a találmány szerinti ballasztrészt kódoló génnek a szokásos vektorokba történő könnyű beépítését.

A képletben szereplő z értékének felső határát egyrészt az előállított fúziós fehérje (enzimatikus) lehasítására szolgáló kívánt hasítási hely határozza meg, vagyis olyan kodonokat, például az Ile-Glu-Gly-Arg aminosavszekvenciát kódoló kodonokat jelent, amelyeknél a hasítás Xa faktorral megvalósítható. Az y+z összeg felső határa általában 12, mivel a ballasztrésznek a lehető legrövidebbnek kell lennie, és mindenekfelett, nem szabad befolyásolnia a kívánt fehérje hajtogatását.

A géntechnológiai folyamatokban gazdaszervezetként előnyösen baktériumot vagy alacsonyabb rendű eukarióta sejtet, így élesztősejtet alkalmazunk, feltéve, ha nincs szükség magasabb rendű szervezetre. Ezekben a folyamatokban a heterológ gén kifejeződését homológ szabályozószakasz szabályozza, vagyis a szabályozószakasz hozzátartozik a gazdaszervezethez, vagy azzal kompatíbilis. Prepeptid kifejezése közben gyakran előfordul, hogy a preszekvencia heterológ a gazdasejt vonatkozásában. A „szekvenciaharmónia” hiánya a gyakorlatban gyakran változó és megjósolhatatlan fehéqekitermelést eredményez. Mivel a találmány szerinti ballasztszekvenciát a környezethez adaptáljuk, a találmány szerinti szelekciós folyamatban harmonizált szekvenciájú DNS-szerkezet keletkezik.

A ballasztrész elejét és végét az alábbiakban határozzuk meg:

HU 216 069 Β

A ballasztrész elején metionin található, míg a végén olyan aminosav vagy aminosavak olyan csoportja van, amely lehetővé teszi a ballasztrésznek a kívánt fehérjétől történő elválasztását. Ha például a kívánt fehérje proinzulin, NNN triplettként arginint kódoló kodont alkalmazunk utolsó ködönként, mivel ez lehetővé teszi, hogy a ballasztrészt a C lánc eltávolításával egyidejűleg előnyösen lehasítsuk. Természetesen a ballasztrész vége lehet olyan aminosav vagy aminosavak olyan csoportja is, amely kémiai hasítást enged meg, ilyen például a metionin, amikor is a hasítás cián-bromiddal vagy -kloriddal valósítható meg.

A köztes aminosavszekvencia a lehető legrövidebb legyen, hogy ne befolyásolja a kívánt fehérje hajtogatását. Emellett szükséges, hogy ez a lánc viszonylag hidrofil legyen, ami elősegíti a fel nem oldott fúziós fehéije szolubilizálását, és a fúziós fehérje oldható marad. A ciszteinmaradékok kevésbé előnyösek, mivel diszulfidhidak képzésére hajlamosak.

A ballasztrész kódoló DNS-t kevert oligonukleotid formájában állítjuk elő, ezt egy megfelelő kifejezőplazmidba építjük be közvetlenül a kívánt fehérje struktúrgénje elé, és az így kapott génbankkal E. coli-t transzformálunk. A megfelelő fúziós fehérjéket termelő bakteriális kiónok ezt követő kiválogatásával ily módon megfelelő génszerkezetek állíthatók elő.

Már említettük továbbá, hogy a ballasztrészt kódoló nukleotidszekvencia elején és végén található restrikciósenzim-felismerőhelyek csak példaként szolgálnak. Az ATG start kodont körülvevő felismerőszekvenciára, amelyben a további nukleotidok megfelelő aminosavakra vonatkozó kodonokat képeznek, példaként említhetők az AflIII, Ndel, NlalII, NspHI vagy Styl restrikciós enzimek felismerőhelyei. Mivel az előnyös megvalósítási módban a ballasztszekvencia végén arginin található, és hat különböző kodon kódolja az arginint, az

Miül enzim helyett további megfelelő restrikciós enzimek is találhatók, például az Nrul, AvrII, AflIII, Clal vagy Haell.

Előnyös továbbá a Saiki R. K. és munkatársai [Science, 239, 487-491 (1988)] szerinti „Polimeráz láncreakció” (PCR) alkalmazása is, ami a restrikciós enzimek speciális felismerőhelyeinek kialakítása nélkül is használható.

Mint fent említettük, a (CDC)_X DNS-szekvencia alkalmazása nem korlátozó jellegű, és nem zárja ki más kodonok, például a glicint, prolint, lizint, metionint vagy aszparagint kódoló kodonok alkalmazását.

A legelőnyösebb DNS-szekvenciák a fúziós fehérje, például a proinzulint tartalmazó fúziós fehéije előállítása vonatkozásában előnyös szekvenciák kiválogatásával nyerhetők. Ezek eredményezik a szabályozószekvencia, a ballasztszekvencia és a kívánt fehéije legkedvezőbb kombinációját, miáltal elkerülhetők a promoter, ballasztszekvencia és struktúrgén kedvezőtlen kombinációi, és az említett „szekvenciaharmónia” kialakításához szükséges minimális ráfordítás mellett is jó eredményeket biztosítanak.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány sze25 rinti ballasztrészt kódoló optimalizált gének nem mindig tartalmazzák az E. coli által előnyben részesített tripletteket. Azt találtuk, hogy a Thr esetében az ACA kodon, amely az E. coliban a legkevésbé fordul elő, gyakran jelen van a kiválasztott szekvenciákban. Ha pél30 dául az alábbi aminosavszekvenciát optimalizálnánk az E. coli szerinti előnyös kodonhasználat (preferred codon usage, p. c. u.) szerint [p. c. u.: Aota S. és munkatársai: Nucleic Acids Research 16 (kiegészítés) r315, r316, r391, r402 (1988)] a találmány szerintitől teljesen eltérő génszerkezetet kapnánk (1. táblázat):

Alá	Thr	Thr	Ser	Thr	Alá	Thr	Thr
GCG	ACC	ACC	AGC	ACC	GCG	ACC	ACC	p.c.u.
GCA	ACA	ACA	TCA	ACA	GCA	ACT	ACG	találmány

A proinzulint tartalmazó fúziós fehéijék esetében a kezdeti startpont egy tíz aminosavat tartalmazó ballasztrész. A legjobb előállítást biztosító DNS-szekvencia szolgál a szekvencia változatainak alapjaként, miáltal megfigyelhetővé vált, hogy akár három aminosav is kiiktatható anélkül, hogy a relatív kifejeződési arány jelentős mértékben csökkenne. Ez a tapasztalat nemcsak meglepő, mivel nem volt előre várható, hogy az ilyen rövid ballasztfehérje alkalmazható, hanem nagyon előnyös is, mivel a proinzulin relatív aránya a fúziós fehéijén belül természetszerűen olyan mértékben nő, ahogy a ballasztrész csökken.

A ballasztrésznek a fehérjében betöltött szignifikanciája az alábbi összehasonlításból látható:

A humán proinzulin 86 aminosavat tartalmaz. Ha a 290 005 számú európai közrebocsátási irat szerinti fúziós fehérjéhez a ballasztrész alsó határaként 250 aminosavat alkalmazunk, a fúziós fehéije 336 aminosavat tartalmaz, amelynek csak mintegy negyede jelenik meg a kívánt fehérjében. Ezzel összehasonlítva, a ballasztrészben csak hét aminosavat tartalmazó, találmány szerinti fúziós fehéije 93 aminosavból áll, amelyen belül a pro45 inzulin aránya 92,5%. Ha a kívánt fehéije a proinzulinnál sokkal több aminosavat tartalmaz, a ballaszt és a kívánt fehéije közötti arány még kedvezőbbé válik.

Hangsúlyozzuk, hogy a proinzulin a találmány szerinti kívánt fehéije egyik előnyös példája csupán. A ta50 lálmány szerinti megoldás sokkal kiterjedtebb fúziós fehérjéknél is alkalmazható, amelyre példaként a humán 3-hidroxi-3-metil-glutaril-koenzim A reduktáz (HMG) aktív doménjét tartalmazó fúziós fehéije említhető. Ez a fehérje 461 aminosavat tartalmaz, az ezt kó55 dőlő gént a 292 803 számú európai közrebocsátási irat ismerteti.

A találmány szerinti megoldást a fenti általános ismertetés után közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korláto60 zódna.

HU 216 069 Β

1. példa

Génbank előállítása és magas kifejezőképességü klánok kiválogatása

Ellenkező értelmű megjelölés hiányában a tápközegeket Maniatis T., Fritsch E. F. és Sambrook J.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) szerint állítjuk elő. A

TP közeg M9CA közeget tartalmaz egyenként 0,4 tömeg% glükózzal és kazaminosawal kiegészítve. Ellenkező értelmű megjelölés hiányában a közegek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak. A fermentálás során a baktérium növekedését a tenyészközeg 600 nm-en mért optikai sűrűsége (OD) mérésével határozzuk meg.

Kiindulási anyagként a 211 299 számú európai közrebocsátási iratból ismert pH154/25* plazmidot (1. ábra) alkalmazzuk. Ez a plazmid egy füziósfehérje-gént (D’-proint) tartalmaz, amely egy trp-promoterhez és egy ampicillin- (Amp) rezisztenciát kódoló génhez kapcsolódik. A fuziósfehérje-gén olyan fúziós fehéijét kódol, amely az E. coliból származó trpD-fehérje egy fragmensét (D’), és majomproinzulint (Proin) tartalmaz. A plazmid génszerkezete egy policisztronos mRNS-t eredményez, amely mind a fúziós fehéijét, mind a rezisztencia génterméket kódolja. A felesleges rezisztencia géntermék képződésének elnyomása érdekében a trp transzkripciósterminátor-szekvenciát (trpTer) [Pharmacia, katalógusszám: 27-4884, trp A transzkripciós terminátor néven, az 1. ábrán [(2) terminátor] építjük be a két struktúrgén közé. Ehhez a plazmidot EcoRI enzimmel felnyitjuk, és a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük. A kapott tompa végű DNS-fragmenst a (2) terminátorszekvenciához kapcsoljuk, amelynek során pINTI 2 plazmidot [1. ábra, (3) plazmid] kapjuk.

· AGCCCGCCTAATCAGCGGGCTTTTTTTT3'

3'TCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA5' (2)

A kiindulási pH 154/25* plazmid egy Pvul hasítási helyet tartalmaz az Amp génben, valamint egy HindlII hasítási helyet tartalmaz a trpD-fragmens karboxi-terminális szakaszában. Minkét hasítási hely megjelenik ezért a pINTI2 plazmidban. A (3) plazmid Pvul és HindlII enzimekkel végzett hasításával két fragmenst kapunk, amelyek közül izoláljuk a proinzulingént tartalmazó fragmenst [1. ábra, (4) fragmens]. A pGATTP plazmidot [4832959 számú USA-beli szabadalmi leírás, la. ábra, (5) plazmid], amelyet a (3) plazmiddal analóg módon állítunk elő, és amely a D’-proin gén helyett Ncol és HindlII hasítási helyeket tartalmazó gamma-interferongént (Ifn) hordoz, Pvul és HindlII enzimekkel hasítjuk, és a promoter régiót tartalmazó fragmenst [la. ábra, (6) fragmens] izoláljuk. Ezt a (6) fragmenst a (3) plazmidból származó (4) fragmenssel ligáivá pINT40 plazmidot [la. ábra, (7) plazmid] kapunk. A maradék gamma-interferongént tartalmazó kis fragmenst ez utóbbiról Nco és Miül enzimmel lehasítjuk. A nagyméretű fragmenst [lb. ábra, (8) fragmens] (9) kevert oligonukleotiddal ligáljuk,

5'CATGGCDDCDDCDDCDDCDDCDDCDA3' ¹ CGHHGHHGHHGHHGHHGHHGHTGCGC5 ' (9) ahol

D jelentése A, G vagy T és

H jelentése ezekkel komplementer nukleotid.

Ez a pINT4x plazmidpopulációt (génbank) [Ibii 0). ábra] eredményezi. A találmány szerinti oligonukleotidkeverék szakember számára ismert technológiákkal előállítható.

A (9) kevert oligonukleotidot (9a) szintetikus kevert oligonukleotidból állítjuk elő,

TTCGGGTAACCGHHGHHGHHGHHGHHGHHGHTGCGCAG5'

TTGCCCATGGC3' (9a) amelyet Klenow-polimerázzal feltöltünk, és Miül és Nco enzimmel hasítunk.

Az E. coli WS3110 törzset a (10) plazmidpopulációval transzformáljuk, és a baktériumokat LB agarlemezre szélesztjük. A kapott baktériumklónok közül hatot vizsgálunk az inzulint tartalmazó fúziós fehérje termelésének képességére. Ebből a célból a kiónokat LB közegen egy éjszakán keresztül tenyésztjük, 100 μΐ alikvot részt 10,5 ml TP közeggel keverünk, és 37 °C hőmérsékleten rázzuk. Az OD600=1 értéknél a tenyészeteket 200 pg/ml 3-B-indolil-akrilsawal (IAA) elegyítjük, majd 40 mg glükóz 100 ml vízben felvett oldatát adjuk hozzá, és a készítményt további 3 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten rázzuk. Ezt követően 6OD ekvivalens tenyészetet eltávolítunk, a bennük lévő baktériumokat centrifugálással elválasztjuk, és 300 μΐ tesztpufferben [37,5 mmol/1 Trisz (pH=8,5), 7 mol/1 karbamid, 1 vegyes% SDS és 4 térfogat% 2-merkapto-etanol] szuszpendáljuk. A szuszpenziót 5 percen keresztül melegítjük, 2 másodpercen keresztül ultrahanggal kezelve lecsökkentjük a viszkozitást, és alikvot részét ezután SDS-gél elektroforézisre visszük. A fúziós fehéijét termelő baktériumoknál egy fehérjesávra számíthatunk a 10350 D móltömegértéknél. Magától értetődő, hogy egy klón, a pINT41 plazmid (1. táblázat) a megfelelő fehéijét viszonylag nagy mennyiségben termeli, míg a többi klónnál fehéijetermelés nem mutatható ki. Inzulinspecifikus antitestekkel végzett immunfoltvizsgálattal ellenőrizhető, hogy a pINT41 plazmid által kódolt fehéije inzulint tartalmaz.

Az 1. táblázat különböző plazmidszerkezetek ballasztrészének DNS- és aminosavszekvenciáját tartalmazza. Közelebbről, az 1. táblázat a pINT41 fúziós fehérjében található ballasztrész DNS- és aminosavszekvenciáját tartalmazza.

HU 216 069 Β

1. táblázat

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

pINT

Met ATG

Alá GCA

Thr ACA

Ser TCA

Thr ACA

Alá GCA

Thr ACT

Thr ACG

—

Arg CGT

41

***

**G

Thr A*T

Ser T*G

Thr A*G

«*G

***

—

hhh

42

***

**T

Alá G**

hhh

Thr A*T

Ser T*T

Thr A*T

Ser T*A

—

hhh

43

***

hhh

—

Asn AAC

Ser T*A

hhh

—

hhh

60

***

—

**A

67d

***

**A

68d

***

hhh

***

**A

69d,

72d

***

hhh

***

hhh

***

Gly *G*

Asn *A*

Ser T**

Alá GCA

**A

90d,

91d

***

hhh

***

hhh

***

Lys AA*

**A

93d

·***

***

hhh

***

hhh

Pro C**

**A

94d

***

hhh

Met ATG

**A

95d

***

Gly *G*

**A

96d

HU 216 069 Β

2. példa

További klánok szelektálása A többi alkalmazható kiónt Helfman D. M. és munkatársai módszerével [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 31-35 (1983)] mutatjuk ki. TP agar lemezeket alkalmazunk ehhez, amelyek 40 pm/ml IAA-t tartalmaznak. Alkalmazás előtt 15 perccel az agarlemezek felületét 2 mm vastag TP felső agarréteggel vonjuk be, erre mitro-cellulóz-szűrőt helyezünk, és a frissen transzformáit sejteket a szűrőre visszük. Másolatokat készítünk arról a szűrőről, amelyen 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a baktériumtelepek növekednek, majd az eredeti szűrőről származó baktériumokat roncsoljuk. Ehhez a szűrőt egy deszikkátorban 15 percen keresztül kloroformatmoszférának tesszük ki, majd lassan mozgatjuk 6 órán keresztül szobahőmérsékleten immunpufferben [50 mmol/1 Trisz (pH=7,5), 150 mmol/1 nátrium-klorid, 5 mmol/1 magnézium-klorid és 3 vegyes% BSA], amely 1 pg/ml D-náz I-et és 40 pg/ml lizozimot tartalmaz, majd kétszer 5 percen keresztül mosópufferben [50 mmol/1 Trisz (pH=7,5) és 150 mmol/1 nátriumklorid] mossuk. A szűrőket ezután egy éjszakán keresztül 3 °C hőmérsékleten inzulinspecifikus antitesteket tartalmazó immunpufferben inkubáljuk, négyszer 5 percen keresztül mosópufferben mossuk, 1 órán keresztül protein A torma-peroxidáz-konjugátumot tartalmazó immunpufferben inkubáljuk, négyszer 5 percen keresz5 tül mosópufferben mossuk, és az antitesteket megkötő telepeket színreakcióval láthatóvá tesszük. A megfelelően nagy mennyiségű fúziós fehérjét termelő pINT42 és pINT43 kiónok 500 telepben mutathatók ki. A szekvenálással megállapított DNS-szekvencia és az ebből leszármaztatott aminosavszekvencia megfelel az 1. táblázatban megadottaknak.

3. példa pINT41dplazmid előállítása

A pINT41 plazmid a replikációs origó és a trp promoter között egy nemesszenciális DNS-szakaszt tartalmaz, amelyhez Nsp(7524)l enzim hasítási hely csatlakozik. A fenti szakasz eltávolításához a pINT41 plazmidot Nsp(7524)l enzimmel hasítjuk, a nagyméretű fragmenst izoláljuk, és ismét ligáljuk. így pINT41 d plazmidot kapunk, amelynek DNS-szekvenciáját a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

30 50

GTGTCATGGTCGGTGATCGCCAGGGTGCCGACGCGCATCTCGACTTGCACGGTGCACCAA

90 110

TGCTTCTGGCGTGAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCAC

130 150 170

TGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACA

190 210 230

TCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGT

250 270 290

TAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACCATGGCAACAACATCAACAGCAA

310 330 350

CTACGCGTTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTAGTGGAAGCTCTCTACCTGG

370 390 410

TGTGCGGGGAGCGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCCTC

430 450 470

AGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGCGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCGC

490 510 530

TGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGCGGCATCGTGGAGCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCC

550 570 590

TCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAATAGTCGACCTTTGCTTTCATTGTCGATGATA

610 630 650

AGCTGTCAAACATGAGAATTAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTAATTCTTGAAGA

670 690 710

CGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCT

730 750 770

TAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTC

790 810 830

TAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAA

850 870 890

TATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTT

HU 216 069 Β

2. táblázat (folytatás)

910 930 950

GCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCT

970 990 1010

GAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATC

1030 1050 1070

CTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTA

1090 1110 1130

TGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACAC

1150 1170 1190

TATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGC

1210 1230 1250

ATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAAC

1270 1290 1310

TTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGG

1330 1350 1370

GATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGAC

1390 1410 1430

GAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGC

1450 1470 1490

GAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTT

1510 1530 1350

GCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGA

1570 1590 1610

GCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCC

1630 1650 1670

CGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAG

1690 1710 1730

ATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCA

1750 1770 1790

TATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATC

1810 1830 1850

CTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCA

1870 1890 1910

GACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGC

1930 1950 1970

TGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTA

1990 2010 2030

CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTT

2050 2070 2090

CTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTC

2110 2130 2150

GCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGG

2170 2190 2210

TTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGTAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGT

2230 2250 2270

GCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGC

2290 2310 2330

ATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCA

2350 2370 2390

GGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATA

2410 2430 2450

GTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGG

2470 2490 2510

GGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCT

2530 2550 2570

GGCCTTTTGCTCACATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGC

TG

HU 216 069 Β

4. példa pINT41d fúziós fehérje fermentálása és előállítása

i) Fermentálás:

LB közegben rázótenyészetet állítunk elő pINT41d plazmiddal transzformált E. coli W3110 törzsből. 15 μΐ tenyészetet OD=2 értéknél 15,7 1 TP közegbe töltünk, és a szuszpenziót 16 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten fermentáljuk. A tenyészetet OD=13 értéknél 20 pg/ml IAA-val elegyítjük, majd további 5 órán keresztül fermentáljuk, amelynek során 100 ml/óra áramlási sebességgel 50 vegyes%-os maltózoldatot szivattyúzunk az elegybe. Az OD= 17,5 érték elérésekor a folyamatot leállítjuk. Végül a baktériumokat centrifugálással betakarítjuk.

ii) A sejtek roncsolása :

A sejteket 400 ml dezintegrálópufferben [10 mmol/1 Trisz (pH=8,0), 5 mmol/1 EDTA] szuszpendáljuk, és franciaprésben roncsoljuk. Az inzulint tartalmazó fúziós fehérjét ezután 30 percen keresztül 23 500 g értéken centrifugálva bekoncentráljuk, és dezintegrálópufferrel mossuk. így 134 g (nedves tömeg) üledéket kapunk.

iii) Szulfitolízis :

12,5 g (nedves tömeg) üledéket ii) 125 ml 8 mol/1 koncentrációjú karbamidoldatba keverünk 35 °C hőmérsékleten. Az elegyet 30 percen keresztül kevertetjük, majd nátrium-hidroxid-oldattal pH=9,5 értékre állítjuk, és 1 g nátrium-szulfittal reagáltatjuk. Az elegyet további 30 percen keresztül 35 °C hőmérsékleten kevertetjük, 0,25 g nátrium-tetrationátot adunk hozzá, és 30 percen keresztül 35 °C hőmérsékleten tovább kevertetjük.

iv) DEAE anioncserélő kromatográfia:

A iii) pont során kapott terméket 250 ml A pufferben [50 mmol/1 glicin (pH = 9,0)] felvesszük, és fraktogél TSK DEAE-650 töltettel töltött kromatográfiás oszlopra (oszloptérfogat 130 ml, átmérő 26 mm) visszük, amelyet A pufferrel kiegyensúlyoztunk. A pufferrel történő mosás után a fúziós fehérje S-szulfonátot egyenként 250 ml A puffért és B puffért [50 mmol/1 glicin (pH=9,0), 3 mol/1 karbamid és 1 mol/1 nátriumklorid] tartalmazó sógradienssel eluáljuk 3 ml/perc sebességgel. A fúziós fehérje S-szulfonátot tartalmazó frakciókat egyesítjük.

v) Hajtogatás és enzimatikus hasítás:

Az iv) pont egyesített frakcióit 4 °C hőmérsékleten 1:9 térfogatarányban hajtogatópufferrel [50 mmol/1 glicin (pH=10,7)] hígítjuk, és a kapott oldatot literenként 410 mg aszkorbinsawal és 165 μΐ 2-merkapto-etaTIR: 5'-CTG AAA TGA és

DTR8: 5'-CAC AAA TCG vagy

DTR9: 5'-ACA GCA ACT és

Inzull: 5'-TCA TGT TTG nollal elegyítjük 4 °C hőmérsékleten óvatos kevertetés közben. Az elegyet ezután pH=10,5 értékre állítjuk, 4 °C hőmérsékleten további 4 órán keresztül kevertetjük, majd 24 g/1 végkoncentrációig szilárd N-(2-hidroxi-etil)-piperazin-N ’ -2-etán-szulfonsavat (HEPES) adunk hozzá. A kapott elegyet (pH=8) 25 °C hőmérsékleten tripszinnel emésztjük. Az emésztési folyamat során az enzimkoncentrációt 80 Mg/1 értéken tartjuk. Az emésztés lejátszódását RP-HPLC-kromatográfiásan ellenőrizzük. Két óra elteltével a reakciót 130 pg szójabab-tripszin inhibitor hozzáadásával megállítjuk. HPLC-analízissel a iii) pont szerinti elegyből 19,8 mg di-Arg inzulin mutatható ki. A hasított termék azonosítását fehéijeszekvenálással és összehasonlító anyaggal végzett HPLC-analízissel ellenőrizzük. A di-Arg inzulin ismert módon kromatográfiásan tisztítható, és karboxi-peptidáz B segítségével inzulinná alakítható.

5. példa pINT60 plazmid előállítása

A pINT60 plazmid egy inzulinprekurzorból és csupán kilenc aminosavat tartalmazó ballasztrészből épül fel. A plazmid előállításához a pINT40 plazmidot Nco és Miül enzimmel hasítjuk, és a kapott vektorfragmenst izoláljuk. Ezután Inzul5 oligonukleotidot szintetizálunk, amelynek szekvenciája:

TTCGGGTACCGTTGTTGTAGTTTGAGTTGCGCAG 5'

TTGCCCATGGC 3'

Klenow-polimerázzal feltöltjük, és a fenti két enzimmel hasítjuk. A kapott DNS-fragmenst ezután a vektorfragmenssel ligáivá pINT60 plazmidot kapunk.

Az 1. táblázat tartalmazza a fenti fúziós fehérjében található ballasztrész DNS- és aminosavszekvenciáját.

6. példa pINT67dplazmid előállítása

A pINT67d plazmid a pINT41d plazmid származéka, amelyben a ballasztrész 9. pozíciójú aminosavának kodonját kiiktattuk. Ennek eredményeként a kapott plazmid a pINT60 plazmidhoz hasonlóan egy inzulinprekurzort és kilenc aminosavból álló ballasztrészt eredményez. Az előállításhoz Ho S. N. és munkatársa módszerét [Gene, 77, 51—59 (1989)] alkalmazzuk. Ehhez két külön PCR-t képzünk a pINT41d plazmiddal és a két oligonukleotidpárral:

GTT GAC-3'

TGC TGT TGA TGT TGT-3'

TTT GTG AAC CAG CAC-3'

GCT TAT CAT-3'.

HU 216 069 Β így két fragmenst kapunk, amelyek részlegesen komplementerek egymáshoz, és egymáshoz kapcsolva a pINT41d plazmidéhoz hasonló inzulinprekurzort kódolnak, amelyben azonban hiányzik a 9. helyzetű aminosav. A két fragmenst egyesítjük, a TIR és Insull oligonukleotidokkal egy másik PCR-t képzünk. Az így kapott DNS-fragmensből az inzulinprekurzor struktúrgénjét Nco és Sáli enzimmel végzett hasítással felszabadítjuk, és tisztítjuk. A pINT41d plazmidot ezután a fenti két enzimmel is hasítjuk, a vektorfragmenst tisztítjuk, és a PCR-ből származó struktúrgénfragmenssel ligáivá pINT67d plazmidot kapunk.

A ballasztrész nukleotid- és aminosavszekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza.

7. példa pINT68d plazmid előállítása

A pINT67d plazmidhoz hasonlóan a pINT68d plazmid is a pINT41d plazmid rövidített származéka, 5 amelyben hiányzik a ballasztszekvencia 8. és 9. aminosavainak kodonja. így olyan inzulinprekurzort kapunk, amelyhez csupán nyolc aminosavból álló ballasztrész kapcsolódik. Az előállítás során a 6. példában leírt eljárást alkalmazzuk, amelynek során az alábbi két oligo10 nukleotidpárt használjuk:

TIR: 5'-CTG AAA TGA és

DTR10: 5'-CACAAATCG vagy

DTR11: 5'-TCA ACA GCA és

Insull: 5'-TCATGTTTG

GCT GTT GAC-3'

TGC TGT TGA TGT TGT TGC-3'

CGA TTT GTG AAC CAG CAC-3'

ACA GCT TAT CAT-3'

8. példa pINT69dplazmid előállítása A pINT69d plazmid szintén a pINT41d plazmid rövidített származéka, amelyben a ballasztrész 7., 8. és

9. pozíciójú három aminosavának kodonja hiányzik, így olyan inzulinprekurzort kapunk, amelyhez csupán hét aminosavból álló ballasztszekvencia kapcsolódik.

Az eljárás során a 6. példában leírt eljárást alkalmazzuk, amelyhez az alábbi két oligonukleotidpárt használjuk:

TIR: 5'-CTG AAA TGA GCT GTT GAC-3' és

DTR12: 5'-CAC AAA TCG TGT TGA TGT TGT TGC CAT-3' vagy

DTR13: 5'-ACA TCA ACA CGA TTT GTG AAC CAG CAC-3' és

Insull: 5’-TCA TGT TTG ACA GCT TAT CAT-3'

9. példa pINT72dplazmid előállítása A pINT72d plazmid a pINT69d plazmid származéka, amelyben az első arginin aminosavkodonja kivételéTIR: 5'-CTG AAA és

Insu28: 5'-GAT GCC vagy vei a teljes C peptid gén szakasz hiányzik. Ennek megfelelően olyan miniproinzulin-származékot kapunk, amely a C lánc helyett egy argininmaradékot tartalmaz.

A pINT69d plazmidból kiindulva a 6. példában leírt eljárást alkalmazzuk, amelynek során az alábbi két oligonukleotidpárt használjuk:

TGA GCT GTT GAC-3'

GCG GGT CTT GGG TGT-3'

HU 216 069 Β

Insu27: 5'-AAG ACC és

Insull: 5'-TCA TGT

10. példa pINT73d, INT88d és pINT89dplazmidok előállítása

A pINT73d plazmid a pINT69d plazmid (8. példa) származéka, amelyben egymás után kétszer megtalálható az inzulinprekurzor-gén. A plazmid ezért olyan policisztronos mRNS-t eredményez, amely megkétszerezi a kitermelést. Előállításához egy PCR-reakciót végeztünk a pINT69d plazmiddal és a következő két oligonukleotiddal:

Insu29: 5'-CTA GTA CTC GAG TTC AC-3' és

Insull: 5'-TCA TGT TTG ACA GCT TAT CAT-3'.

így olyan fragmenst kapunk, amely az inzulinprekurzor-gént az ennek megfelelő riboszóma kötőhelyet tartalmazza, amelynek 5’-végén Xhol hasítási hely és 3’-végén Sáli hasítási hely található. A fragmenst a fenti két enzimmel hasítjuk, és tisztítjuk. A pINT69d plazmidot ezután Sáli enzimmel linearizáljuk, és a kapott két DNS-véget foszfatázzal (borjúbélfoszfatáz) defoszforilezzük, és a PCR-reakcióval kapott ífagmenssel ligáivá pINT73d plazmiddá alakítjuk.

Analóg módon állíthatók elő a pINT88d és pINT89d plazmidok, ha a pINT72d plazmidot (9. példa) hasonlóképpen módosítjuk a mini proinzulingén kétszer vagy háromszor történő összekapcsolásával.

GGC ATC GTG GAG-3'

ACA GCT TAT CAT-3'.

11. példa pINL41dplazmid előállítása

Kiindulási anyagként pRUD3 plazmidot használunk, amelynek szerkezete analóg a pGATTP plazmid szerkezetével. A trp-promoter szakasz helyett azonban egy tac-promoter szakaszt tartalmaz, amelyhez EcoRI és Nco hasítási helyek kapcsolódnak. A plazmidot EcoRI enzimmel hasítjuk, a hasítási hely túllógó végeit Klenow-polimerázzal feltöltjük, majd Nco enzimmel hasítunk, és a kapott promoterfragmenst izoláljuk.

A pINT41d plazmid trp-promoterét kiegészítjük a PvuII és Nco enzimek hasítási helyével. Mivel a plazmid egy további PvuII hasítási hellyel rendelkezik, teljesen hasítható Nco enzimmel és csak részlegesen hasítható PvuII enzimmel. Azt a vektorfragmenst, amelyből csak a promoterszakasz hiányzik, izoláljuk a kapott fragmensek közül, majd a tac-promoter fragmenssel ligáivá pINL41d plazmiddá alakítjuk.

12. példa pL41c plazmid előállítása

A pPL-lambda plazmid (Pharmacia) egy lambdapL-promoter szakaszt tartalmaz. Ez utóbbit az alábbi nukleotidszekvenciákkal kapcsoljuk:

5'GATCTCTCACCTACCAAACAAT3' és

5'AGCTAACTGACAGGAGAATCC3'.

LPL3 és LPL4 oligonukleotidokat állítunk elő.

LPL3: 5' ATGAATTCGATCTCTCACCTACCAAACAAT 3' és

LPL4: 5' TTGCCATGGGGATTCTCCTGTCAGTTAGCT 3 ' , amelyek segítségével a promoterszakaszhoz EcoRI és Nco hasítási helyeket kapcsolunk. Egy PCR-t végzünk a fenti oligonukleotidokkal és a pPL-lambda plazmiddal, majd a kapott promoterfragmenst EcoRI és Nco enzimmel hasítjuk és izoláljuk, a pINL41d plazmidot szintén a fenti két enzimmel hasítjuk, és a kapott promoteimentes vektorfragmenst a lambda-pL promoterfragmenssel ligáivá pL41c plazmiddá alakítjuk.

13. példa pL41dplazmid előállítása

A pL41c plazmidban a rezisztenciagén és a fuziósfehérje-gén között elhelyezkedő trp-transzkripciós terminátor nem hatékony a fermentációra alkalmas E. coli törzsekben (például E. coli N4830-1 törzsben). Emiatt egy policisztronos mRNS és általa nagy mennyiségű rezisztenciagén-termék képződik a fermentációban. A fenti mellékreakció kiküszöbölése érdekében a trp-terminátorszekvenciát az E. coli-rmB-operon hatékony terminátor szekvenciájával helyettesítjük. A pANGMA plazmid szerkezete hasonló a pINT41 d plazmid szerkezetéhez, de egy angiogenin gént tartalmaz a fuziósfehérjegén helyett, és egy rmB-terminátor [Borsius J. és munkatársai: Gene 27, 161-172 (1984)] szekvenciát tartalmaz (a kereskedelmi pKK223-3 plazmidból, Pharmacia) a trp-terminátor szekvencia helyett. A plazmidot Pvul és Sáli enzimekkel emésztjük, és az rmB-terminátort tartalmazó fragmenst izoláljuk. A pL41c plazmidot ezután szintén a fenti két enzimmel hasítjuk, és az inzulingént tartalmazó fragmenst izoláljuk. A két izolált fragmenst ligáivá pL4 ld plazmidot kapunk.

14. példa pINTLIplazmid előállítása

A fúziós fehérjék kifejezéséhez általánosan alkal60 mazható plazmid előállításához a pINT41d plazmid

HU 216 069 Β proinzulingénjét egy polilinkerszekvenciával helyettesítjük. Ezt a gént Miül és Sáli hasítási helyekkel farkazzuk. A plazmidot ehhez a fenti két enzimmel hasítjuk, és a vektoríragmenst izoláljuk. Ezt azután az alábbi két szintetikus oligonukleotiddal ligáivá pINTLI plazmiddá alakítjuk.

BstEII

Acél

EcoRi

Knpl

BamHI

5' CGCGCCTGGTTACCTCGAGGTATACTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC

3' GGACCAATQGAGCTCCATATGATGCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGG

Xhol SacI Xmal

Sphl Xbal

CTGCAGGCATGCAAGCTTGTCTAGAC -3'

GACGTCCGTACGTTCGAACAGATCTGAGCT-5'

Pstl Hindlll (Sáli).

15. példa

HMG CoA reduktázt kódoló gén (aktív dómén) beépítése a pINTLIplazmidba és a fúziós fehérje kifejezése

A 3. táblázat a HMG CoA reduktáz gén DNS- és aminosavszekvenciáját mutatja. A 292 803 számú európai közrebocsátási iratból ismert szintetikus HMG CoA reduktáz gén BstEII hasítási helyet tartalmaz a 3. és 4. helyzetű Leu és Val aminosavak régiójában (lásd a 3. táblázatot). A gén végén az Xbal enzimnek megfelelő túlnyúló szekvencia keletkezik (a nemkódoló szakaszban). A pINTLI plazmid polilinkerjében a megfelelő hasítási hely ugyanabban a leolvasási keretben ta20 lálható. A két hasítási hely mindkét esetben egyedülálló. A pUHIO plazmid tartalmazza a 3. táblázat szerinti DNS-szekvenciának megfelelő teljes HMG gént (HMG I, II, III és IV fragmensek). A pUHIO plazmid (2. ábra) előállítását a 292 803 számú európai közrebo25 csátási irat ismerteti. Röviden, speciális plazmidokat állítunk elő a HMG I-HMG IV génfragmensek szubklónozásához, és a teljes gén előállításához. Ezek a plazmidok a kereskedelmi forgalomban kapható pUC18, pUC19 és M13mpl8 vagy M13mpl9 vekto30 rokból származnak, ahol a polilinkerszakaszt egy VI képletű DNS-szekvenciának megfelelő új szintetikus polilinker helyettesíti.

Nco EcoRi Hindlll BamHI Xbal

Vl-la

5’ AAT TGC CAT GGG CAT GCG GAA TTC CAA GCT TTG GAT CCA TCT AGA GGG

3' CG GTA CCC GTA CGC CTT AAG GTT CGA AAC CTA GGT AGA TCT CCC TCG A

VI-lb

A fenti új plazmidok előnye, hogy a pUC és M13mp plazmidokkal ellentétben lehetővé teszik az Nco restrik- 45 ciós enzimnek megfelelő túlnyúló szekvenciákat tartalmazó DNS-fragmensek klónozását. Emellett az Nco, EcoRi, Hindlll, BamHI és Xbal hasítási helyeknek megfelelő felismerőszekvenciák a vektorokban ugyanazokban a szekvenciákban találhatók meg, mint a teljes HMG génben, ami elősegíti a szekvenciális klónozást, és a gének előállítását. így lehetővé válik a HMG I-HMG IV génfragmenseknek az új plazmidokba történő szubklónozása. A génfragmensek alkalmazása után ezek kombinációjával kinyerhető a teljes gén (lásd később).

a) VI képletű DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorok előállítása

Az V képletű DNS-szekvencia szokásos módon előállítható. A kereskedelmi forgalomban kapható pUC18 plazmidot (vagy pUC19, M13mpl9 vagy M13mpl9 plazmidot) EcoRI/HindlII restrikciós enzimekkel az enzim gyártójának előírásai szerint felnyitjuk. Az emésztési elegyet 1 tömeg%-os agarózgélen elektroforézissel frakcionáljuk. Az etidium-bromid-megfestéssel láthatóvá tett plazmidsávokat kivágjuk, és az agarózgélről elektroforézissel eluáljuk. A kapott 20 fmol maradék 50 plazmidot ezután 200 fmol hat DNS-szekvenciának megfelelő DNS-fragmenssel ligáljuk szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül. így új pSU18 klónozóvektort (vagy pSU19, M13mUS18 vagy M13mUS19 klónozóvektort) kapunk. A kereskedelmi forgalomban 55 kapható kiindulási plazmidokkal ellentétben az új plazmidok Nco restrikciós enzimmel hasíthatok. Az EcoRi és Hindlll restrikciós enzimek csak egyszer hasítják ezeket a plazmidokat, mivel az EcoRi és Hindlll hasítási helyeken keresztül beépített polilinker roncsolja az 60 eredetileg jelen lévő hasítási helyeket.

HU 216 069 Β

b) A HMGI-HMGIVgénfragmenseket tartalmazó hibrid plazmidok előállítása

i) A HMG I génfragmenst tartalmazó plazmid

A pSU18 plazmidot EcoRI és Nco restrikciós enzimekkel felnyitjuk a 15. példa a) pontjában leírt módon, majd az előzetesen foszforilezett I génffagmenssel ligáljuk.

ii) A HMG II génfragmenst tartalmazó plazmid

A HMG II-1, II—2 és II—3 gén szubfragmenseket tartalmazó plazmidokat EcoRI/MluI, MluI/BssHII vagy BssHII/HindlII restrikciós enzimekkel emésztve izoláljuk a HMG II-1, HMG II—2 vagy HMG II—3 génfragmenseket. Ezeket az EcoRI/HindlII enzimekkel felnyitott pSU18 plazmidba ligáljuk a szokásos módon.

iii) A HMG III génfragmenst tartalmazó plazmid

A HMG III-1 és ΙΠ-3 gén szubfragmenseket tartalmazó plazmidokat EcoRI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, majd Sau96I enzimmel hasítva izoláljuk a HMG III-1 ffagmenst, vagy BamHI/BanlI enzimmel hasítva izoláljuk a HMG ΙΠ-3 génfragmenst. Ezeket a fragmenseket a HMG ΙΠ-2 fragmenssel a Hindm/BamHI enzimekkel felnyitott pSU18 plazmidba építjük be.

iv) A HMG IVgénfragmenst tartalmazó plazmid

A HMG-IV-(l+2) és HMG VI-(3+4) gén szubfragmenseket tartalmazó plazmidokat EcoRI/ BamHI és EcoRI/Xbal restrikciós enzimekkel felnyitjuk, és a HMG IV-(l+2) és HMG TV-(3+4) génfragmenseket elektroforézissel tisztítjuk. A kapott fragmenseket ezután BamHI/Xbal enzimekkel felnyitott olyan pSU18 plazmidba ligáljuk, amelyben az EcoRI hasítási helyet előzetesen a később leírt módon SÍ nukleázzal roncsoltuk. így olyan hibrid plazmidot kapunk, amely a négy DNS-szekvenciában egy további AATT nukleotidszekvenciát tartalmaz. A hibrid plazmidot ezen a ponton EcoRI enzimmel emésztve felnyitjuk, és a túlnyúló AATT végeket SÍ nukleázzal eltávolítjuk. Ehhez 1 pg plazmidot az EcoRI emésztés után két egység SÍ nukleázzal inkubálunk 50 mmol/1 nátrium-acetátpufferben (pH=4,5), amely 200 mmol/1 nátrium-kloridot és 1 mmol/1 cink-kloridot tartalmaz. Az inkubálást 30 percen keresztül 20 °C hőmérsékleten végezzük. A plazmidot a tompa végeken keresztül a szokásos módon körbezáijuk. így olyan hibrid plazmidot kapunk, amely tartalmazza a IV génfragmenst.

c) Az V képletű DNS-szekvenciát tartalmazó pUHIO hibrid plazmid előállítása

A HMG I génfragmenst tartalmazó hibrid plazmidot EcoRI/HindlII enzimekkel felnyitjuk, és a megfelelő hibrid plazmid EcoRI/HindlII emésztésével kapott HMG II fragmenssel ligáljuk. A kapott plazmidot ezután HindlII/BamHI enzimekkel felnyitjuk, és a megfelelő plazmid HindlII/BamHI emésztésével kapott HMG III fragmenssel ligáljuk. Az így kapott plazmidot BamHI/Xbal enzimekkel felnyitjuk, és a megfelelő plazmid BamHI/Xbal emésztésével kapott HMG IV fragmenshez kapcsoljuk. így pUHIO hibrid plazmidot kapunk, amely tartalmazza az V képletű DNS-szekvenciának megfelelő teljes HMG gént. A 2. ábra mutatja a pUHIO hasítási térképét, amelyben az „őri” és „Apf” jelölések mutatják a pUC18 plazmidnak megfelelő eredeti orientációt.

Ha a pINTLI plazmidot BstEII és Xbal enzimekkel hasítjuk, és a nagy fragmenst izoláljuk, és ha a pUHIO plazmidot (2. ábra) ugyanezekkel az enzimekkel emésztjük, és az V képletű DNS-szekvencia nagy részét tartalmazó fragmenst izoláljuk, a két fragmens ligálásával kapott plazmid olyan fúziós fehéijét kódol, amelyben arginin követi az első nyolc aminosavat a pINT41d plazmid ballasztszekvenciájában (1. táblázat), és amelyet a Leírnál kezdődően a HMG CoA reduktáz aktív doménjének struktúrgénje követ. Összehasonlítási célból a két kezdeti plazmidot Nco és Xbal enzimekkel hasítjuk, és a megfelelő fragmenseket ligáljuk. A kapott plazmid közvetlenül a start kodon után a HMG CoA reduktáz aktív doménjét kódolja (a 292 803 számú európai közrebocsátási irat szerinti V képletű DNS-szekvenciának megfelelően, lásd a 3. táblázatot).

A kódolt fehérjék kifejezését a 4. példában leírt módon végezzük. A sejtek feltörése után centrifugálunk, majd a feltételezések szerint mintegy 55 kDa méretű fehéijét a felülúszóban gélelektroforézis alapján kimutatjuk. A fúziós fehéije sávja sokkal intenzívebb, mint a közvetlenül kifejezett fehérje sávja. A felülúszó 100 μΐes részleteiben a mevalonát képződését vizsgáljuk hígítatlan formában, 1:10 és 1:100 hígításban. További összehasonlításhoz a 4. példa szerinti fúziós fehéijét (proinzulinrészt tartalmazó fúziós fehéije) vizsgáljuk, amikor is a fent említett három koncentrációban aktivitás nem mutatható ki. A HMG CoA reduktázt tartalmazó fúziós fehérje mindhárom hígításban maximális aktivitást mutat, míg a közvetlen kifejeződés terméke a koncentráció által szabályozott lépcsőzetes aktivitást mutat. Ez azt jelenti, hogy a fúziós fehéije legalább százas faktorral jobban kifejeződik.

HU 216 069 B

VAL THR GLN GLU PRO GLU ILE GLU LEU PRO ARG GLU PRO ARG PRO ASN GLU GLU CYS LEU GLN ILE LEU OLY ASN ALA CLU §

o δ

o §

X

B §

§ g

o

X a

H ►J

U

X

3	o	§	δ
o	tt	0.	ö
3		H »3	8
u		w	<
X		01	X
3		»1 X	< o
X		«0	rf
u		X	2
ü		4	2

o

4·

O «Ο

O tt «9

X

U «0

X lj

OS u

(0 o

X a

u j

δ

X

O δ

S < 3 8 ö o

8 a δ

X < J u ο δ cc

0) lg δ

s <

a j

o «1 i-i

X «

X

O o

X o

<

o

X δ

χ u

<

s

I a

H

J «

W w

<

o

X

X υ

x « u X < X X Z X

3 « X X < X X

HU 216 069 B

3. táblázat (folytatás)

	tt H CO	U 2
	3	X 0
	Λ	0
	4	0
	rf	X
	>	0
	O 3	8 0
	to	X
	δ	8
	X	X
	►4 0	8
	0 ►4	2
	0	0
	es	rf
	X	0
	X	rf
o	OS	rf
n	X	0
r-4	X	rf
	2	3 0
	X H	8
	X	<<
	o
	es	u
	eu	0
	2	X X
	>	0
	X	0
	►4	rf
	0	0
	W	0
	X eu	8
	0 u	2
	0	0
	w
	X	2
	•4	S
	0 ►4	2
	0	0
O	Ou	X
CM	V)	rf
r4	rf	0

	0) δ	£
	3	s
	2	0
	£	§
o	o	rf	o
r*	es	0	o
r4	eu	0	CM
	0 ee	8
	»4	0
	0	X

$ 8

8 > o &

> o §

0>

X u

o «0

O in es

H w

es

H ül eu n

tt §

o ^H í 8 £ 8 X rf H 0 $

X X ►4 0 0 0

F<

Λ rf rf 2 8 0 X s δ l 8 tt o ea u n x os o ea 0 ta tt

8 rf V

X X J 0 0 0

X rf <4 0 0 0

O σ>

§ tn

H

X eu x

u

OS w

w es

B

Fi

U ea u

Ou es x

o eo

rf	o	X	o
0	n	H	X
rf	CM	X	rf
0		X	X
2		•4 O	8
B		X ea	8
i<		X	<c
0 2		rf 2	3 0
o		o<	u
<c		«1
o		rf	o
X		X	X
8		i4 0	8
*		tt	X
0		ea	0
0		w	X
2		0	rf
c		es	0
o		rf	rf
0		K	0
2		H ül	0 X
o		X	o
X		4	rf
rf		0	0
8 0	o	ea	0
CM CM	X eu	8
rf		0	X
8		2	8
0		M	0
X		U	X
X		K	rf
a		tt	X
8		8	3
2 0		» ea ►4	X B
0		X	u
0 X		01 rf	2
rf		0	0
0 rf		2	0 0
2		3	rf 0
0		0	0
0 X		3	B
0		i<	o
0		W	0
o		U	X
X		M	rf
<	O	tt	X
0		»	0
0	CM	10	rf

HU 216 069 B s

o <

<

ü u

<

§ «0 Q

S $ § B n

S í n

s s

Π z q

3. táblázat (folytatás) o

	w X o	X 8		< s	X t4 9
o	Bt	X	o	J	X	o	>4
KO	X	<	0)	2	X	CM	U
CM	X	X	CM	5	9	r>	0
	X	u			X		H
	(0	A		2	X		t4
	<	2		5	9		M
	X	X		w	n		DC
	a	9			rf		U
	9	9			2		W
	X	X		CC	□		X
	u	9		fid	o		«4
	10			10	<		0
	β	£		o	<
		X 9 X		£	U o		á
	á	δ 9		3 M	8		w X
	9	9		•4	<c		4
	H	£		4	X		M
	•4	ü		>	9		*
	H	X		-	χ		Bt
	•4	X			ö		H
	M	<		2	9		10
	X	9		*>	rf		X
	J	A			2		U
	u	9		0	9		9
	X	8		<0	X		d
	X	2		>4 ü	8		>
o in CM	9 9	2 9	O (0 ΓΜ	£	X X 9	O xM n	a u >4
	Q	9		<4	χ		2
	Bt	0		2	χ		(0
	X	υ			9		<
	g	X		Λ	χ		10
	X	X		M	5		X
	X	X		10	X		A
	Bt	X		to	rf		z
	X	«		>4	2		10
	X	X			2		<
	9	9		>4	<		W
	«4	«£		*4	9		«4
	9	9		0	9		X
	<0	U		0	χ		Z
	H	<		g	9		(0
	X	o		%	9		<
	9	X		X	9		á
	U >4	δ		«4 O	9 9		C
	W	9		o	9		a
	X tJ	2		U 0	< 9		►3 9
	Bt	u		H	χ		U
	U	o		«4	χ		U
	co	X		H	<		w
	9	X		Cu	9		X
	U	X		pg	9		w
	u	o		K	X		s
O	<	«	o	2	χ	o	<
mt	4	υ	p*	V)	rf	o	4
CM	<	9	CM	4	2	n	<

§ s

u <

X s

Λ

U

X υ

X

O δ

B

X υ

X

X <

X δ

S

O

X

X <

δ o

o in m

O <*>

HU 216 069 B

3. táblázat (folytatás)

	rt	p		►4	rt		a	rt
		o		2	X		H	X
	2	9		>	9		<4	X
	2	o		0S	9		X	X
	j	rt		X	9		to	rt
	o	CJ		X	rt		rt	2
	z	9		X	u		H	9
	u	rt		►4	a		►4	X
	o	9		9	9		w	rt
	o	rt		(0	X		CO	9
	«	υ		X	P		X	rt
	cu	u		9	X		»4	2
	a	X		»4	9		«	8
	H	X		rt	X		M	9
	u	9		>	9		(0	X
	a	bi		H	X		9	X
	H	χ		»4	X		K	8
	3	9		w	rt		rt	9
	X	y		9	rt		X	9
	CO	rt		rt	9		CO	rt
	rt			2	9		rt	2
	rf	9		rt	rt		a	9
	£	9		3	9		M	rt
	x	rt		2	9		X	9
	X	9		o	X		M	X
	»4	9		δ	X		«4	X
	9	9		•4	9		M	rt
o	X	X	o	2	rt	o	X	P
00	u	9	rd	»4	rt		H	X
tn	σ	9		9	9	*r	X	rt
		X		9	9		to	X
	>4	9		rt	9		w	rt
	O	9		rt	9		X	9
	•4	9		rt	9		X	X
	rt	X		3	9		W	b
	>	9		rt	9		to	X
	g	9		X	X		10	rf
	X	9		u	rt		X
	X	rt		rt	rt		<4
	X	X		s	rt		«4	9
	u	9		»4	rt		rt	X
	u	9		9	9		>	9
	*9	X		X	9		a	(4
	4	X		►4	0		H	(4
	H	rt		9	9		4	**	M
	9	9		O	X		C0	X
	►4	rt		K	9		w	rt	XI
	U	9		CU	9		X	9	X		X
	*9	9		X	X		X	rt		1	9
	»4	X		C0	rt		►4	9			rt
	M	rt		<	rt		9	9		1	X
	K	X		cu	X		rt	9		1	rt
	H	9		10	rt		«4	9		1	rt
	10	X		rt	9		rt	9		1	X
	O	rt		(0	rf		rt	9		rt	rt
	X	9		X	rf		•4	9		i4	9
	cu	9		4	rt		2	9		rt	9
o	X	9	o	«0	9	o	a	9	o	rt	rt
r*·	H	X	o	X	9	<n	H	X	<0	X	9
m	X	rt		5	X		>4	X		X	rt
	X	9		rt	rt		rf	9		(0	9
	X	9		«4	9			9		X	rt
	X	rt		rt	9		rt	9		►4	rt
	w	9		X	rt		rt	X		CO	9
	X	9		»4	9		t4	b		X	rt
	b	X		9	0		rt	9		4	rt
	X	9	•	X	rt		X	9		rt	9
	w	9		«4	rt		H	X		X	9
	u	rt		9	9		s	rt		X	rt
	w	9		>4	X		a	X		co	9
	4	X		rt	X		H	X		X	9
	H	rt		>	9		4	9		9	X
	X	X		X	X		rt	X		rf	X
	X	rt		u	9		u	9			9
	X	X		9	9		co	X		rt	9
	9	rt		9	9		a	o		X	9
	U	X		H	X		H	X		U	9
	>4	X		4	X		•4	X		9	9
	X	X		X	9		a	rt		2	rt
	«0	rt		H	X		►4	rt		>4	rt
	«	9		2	rt		9	9		9	9
	9	rt		X	rt		X	9		a	9
	►4	rt 9		>4	rt		>4	9		H	X
	u		9	9		9	9		kJ	9
	X	X		9	9		rt	9		CU	X
	10	rt		U	X		4	9		co	rt
	rt	rt		►4	9		rt	9		rt	9
o	X	rt	o	(0	X	O	X	9	o	2	9
φ	X	9	<n	X	9	CN	H	X	m	>4	rf
m	X	rt	m	9	X		X	rt		9	9

HU 216 069 Β

16. példa pB70plazmid előállítása

A pINT41d plazmidot Miül és Sáli enzimekkel hasítjuk, és a nagy fragmenst izoláljuk. A 3a. ábrán bemutatott pIK4 plazmid mini proinzulint kódoló gént tartalmaz, amelynek C lánca csak arginint tartalmaz.

A plazmid előállítását a 347 781 számú európai közrebocsátási irat ismerteti. Röviden, a kereskedelmi pUC19 plazmidot KpnI és PstI restrikciós enzimekkel felnyitjuk, és a nagy fragmenst [3. ábra, (1) fragmens] 0,1 tömeg% Seaplaque géllel elválasztjuk. Ezt a fragmenst T4 DNS-ligázzal reagáltatjuk a 4. táblázat szerint szintetizált DNS [3. ábra, (2) DNS] jelenlétében. A 4. táblázat az IKI génfragmens szekvenciáját mutatja, míg az 5. táblázat az IK II génfragmens szekvenciáját tartalmazza.

Ezt a ligálóelegyet ezután kompetens E. coli 79/02 sejtekkel inkubáljuk. A transzformációs elegyet

IPTG/Xgal lemezekre szélesztjük, amelyek 20 mg/1 ampicillint tartalmaznak. A plazmid DNS-t a fehér telepekből izoláljuk, és restrikciós és DNS-szekvenáló analízissel jellemezzük. A kívánt plazmidok a pIKl nevet (3. ábra) kapják.

Ennek megfelelően az 5. táblázat szerinti DNS-t [3. ábra, (5) DNS] PstI és HindlII enzimekkel felnyitott pUC19 plazmidba ligáljuk [3. ábra, (4)]. így pIK2 plazmidot (3. ábra) kapunk.

A 3. ábra (2) és (5) DNS-szekvenciáját, amelyek a

4. és 5. táblázatnak felelnek meg, izoláljuk a pIKl és pIK2 plazmidokból és KpnI és HindlII enzimekkel felnyitott pUC19 plazmidba ligáljuk [3. ábra, (7)]. Az így kapott pIK3 plazmid (3. ábra) módosított humáninzu15 lin-szekvenciát kódol.

A pIK3 plazmidot Miül és Spel enzimekkel felnyitjuk, és a nagy fragmenst [3a. ábra, (9) fragmens] izoláljuk. Ezt (10) DNS-szekvenciával ligáljuk,

B30

Al

A2

A3

A4

A5

A6

A7

A8

A9

(Thr)

(Arg)

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

(Thr)

(Ser)

(10)

5'

CG

CGT

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

A

3'

A

CCA

TAG

CAA

CTT

GTT

ACA

TGA

TG

5'

(Miül) (Spel) amely argininkodonnal kiegészíti a B lánc utolsó kodonját (B30), és helyettesíti az A lánchoz tartozó első hét aminosav kihasított kodonját, és pótolja ugyanezen lánc 30 8 és 9 aminosavának megfelelő kodont. A pIK4 plazmid (3 a. ábra) humán mini proinzulint kódol.

A 4. és 5. táblázatban az inzulinmolekula B és A láncát az első és utolsó aminosav jelöli. Az IK II génfragmens kódolószakasza mellett Sáli hasítóhely találha- 35 tó, amelyet a következő szerkezetben alkalmazunk.

A pIK4 plazmidot Hpal és Sáli enzimekkel hasítjuk, és a mini proinzulint kódoló gént izoláljuk. Ezt a gént a pINT41d fent említett nagy fragmensével és a következő szintetikus DNS-szekvenciával ligáljuk. 40

(Thr)	Arg	Met	Gly	Arg	Phe
CG	CGT	ATG	GGC	CGT	TTC	GTT
	A	TAC	CCG	GCA	AAG	CAA
(Miül)						(Hpal)

így pB70 plazmidot kapunk, amely olyan fúziós fehérjét kódol, amelyben a ballasztrészt (1. táblázat 1. vonal) Met-Gly-Arg aminosavszekvencia, és ezt a mini proinzulin aminosavszekvenciája követi.

HU 216 069 Β

4. táblázat

Β’

Phe

20 30

CT TTG GAC AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT CAC CAT GGA AAC CTG TTC TCT AAG CAA TTG GTT GTG AAC ACA CCA AGA GTG (Kpnl) Hpal

60 70 80 90 • · · · · —> <----------------------------------------------4-----TTG GTG GAA GCG TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAG CGT GGT TTC TTC AAC CAC CTT CGC AAC ATG AAC CAA ACA CCA CTC GCA CCA AAG AAG <----------------------------------------------3-----------B³⁰

Thr Arg Lys Gly Ser Leu 100 110 120

---------------------------------------->

TAC ACT CCA AAG ACG CGT AAG GGT TCT CTG CA ATG TGA GCT TTC TGC GCA TTC CCA AGA G

---------------------------------->

Miül (Peti)

HU 216 069 Β

5. táblázat

A¹

Gin Lys Arg Gly

130 140 150 160 • · · ·

G AAG CGT GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT AGT ATC TGT TCT AC GTC TTC GCA CCA TAG CAA CTT GTT ACA ACA TGA TCA TAG ACA AGA (Pstl) Spel

A”

Asn

170 180 190 200 210

------------------------------------------------------------>

TTG TAC CAG CTG GAA AAC TAC TGT AAC TGA TAG TCG ACC CAT GGA

AAC ATG GTC CAC CTT TTG ATG ACA TTG ACT ACT AGC TGG GTA CCT TCG A

----------------------------------------------------------------->

(Hindlll)

17. példa

Az alábbi oligonukleotidokkal pINT90d-pINT96d plazmidokat állítunk elő az előbbi példákban megadott módon. Az oligonukleotidoknál * jelöli a pINT41d ballasztrészével azonos aminosavakat.

A pINT92 a pINT72d plazmid által kódolt inzulinszármazék kettős mutációját kódolja, mivel a ballasztrész végén és a mini C láncban található Arg kodont Met kodon helyettesíti. Ennek következtében a kifejezett előtermék cián-bromiddal hasítható.

pINT90d: ******GNSA* (pINT69d változat)

TIR: 5'-CTGAAATGAGCTGTTGAC-3 és

Insu5 0: 5'-TGCCGAATTTCCTGTTGATGTTGTTGC-3' vagy

Insu49: 5'-GGAAATTCGGCACGATTTGTGAACCAG-3' és

Insull: 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' pINT91d: ******GNSA* (pINT72d változat)

TIR: 5'-CTGAAATGAGCTGTTGAC-3' és

Insu50: 5¹-TGCCGAATTTCCTGTTGATGTTGTTGC-3¹ vagy

HU 216 069 Β

Insu49: 5¹-GGAAATTCGGCACGATTTGTGAACCAG-3

	es
Insull:	5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3'
pINT92d:	(pINT72d kettős mutáns)
Insu56:	5'-TCGACCATGGCAACAACATCAACAATGTTTGTG-3
Insu58:	és 5'-GATGCCCATGGTCTT-3'
Insu57 :	vagy 5'-AAGACCATGGGCATC-3'
Insull:	és 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3'

pINT93d: ****** (piNT68d változat)

Insu53:	5' -ACCATGGCAACAACATCAACAAAACGATTTGTG-3 '
Insull:	és 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3'

pINT94d: ****** (pINT68d változat)

Insu54:	5'-ACCATGGCAACAACATCAACACCACGATTTGTG-3'
Insull:	és 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3'
pINT95d:	****** (piNT68d változat)
Insu55:	5'-TCGACCATGGCAACAACATCAACAATGCGATTTGTG-3
Insull:	és 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3'

pINT96d: ****** (pINT68d változat)

Insu71:

5' -ACCATGGCAACAACATCAACAGGACGATTTGTG-3' és

Insull: 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3 '

Claims

1. Eljárás valamely kívánt fehérjéből és egy ballasztrészből álló fúziós fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) ballasztrészt kódoló kevert oligonukleotidot állítunk elő, ahol az oligonukleotid DNS-szekvenciája (kódolószál) (CDC)_X részt tartalmaz, ahol

D jelentése A, G vagy T és x értéke 4-12, és ahol az oligonukleotid legfeljebb 100 nukleotidot tartalmaz,

b) a kevert oligonukleotidot vektorba építjük oly módon, hogy funkcionálisan kapcsolódjon egy szabályozószakaszhoz, és a kívánt fehérjét kódoló struktúrgénhez,

c) a kapott vektorpopulációval gazdasejteket transzformálunk,

e) a fúziós fehérjét kifejezzük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amely a kódolószál 3’-végén a kívánt fehérjének a ballasztrésztől történő könnyű lehasítását lehetővé tévő hasítóhelyet eredményező aminosavat vagy aminosavcsoportot kódol.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimatikus hasítóhelyet kódoló oligonukleotidot alkalmazunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amely viszonylag hidrofil aminosavszekvenciát kódol, és így oldható vagy könnyen szolubilizálható fúziós fehérjét eredményez.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelynél a ballasztrész nem befolyásolja a kívánt fehérje hajtogatását.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol x értéke 4-8.

7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid

ATG (DCD)_y (NNN)_Zszekvenciát (kódolószál) tartalmaz, ahol N jelentése az NNN-re vonatkozó stop kodontól eltérő, azonos vagy különböző nukleotid, z értéke 1 -4, és y+z értéke 6-12, ahol y értéke legalább 4.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol y+z értéke 6-10.

9. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol y értéke 5-8, és z értéke 1.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott oligonukleotid

ATG GCW (DCD)_{4 8} CGW szekvenciát (kódolószál) tartalmaz, ahol W jelentése A vagy T.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid

ATG GCA (DCD)_{4 7} CGW szekvenciát tartalmaz.

12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt fehérje proinzulin, és az alkalmazott oligonukleotid

ATG GCW (DCD)_y. ACG CGW vagy

ATG GCD (DCD)_y. ACG CGT szekvenciát (kódolószál) tartalmaz, ahol D jelentése A, G vagy T,

W jelentése A vagy T és y’ értéke 3-6.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol y’ értéke 4-6.

14. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt fehérje proinzulin.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a proinzulin a humán proinzulintól eltérő C láncot tartalmaz.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ballasztrésszel együtt történő lehasítást biztosító hasítóhelyet tartalmazó, C láncot kódoló gént alkalmazunk.

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a C lánc arginint tartalmaz.