PT95111B

PT95111B - Processo para a preparacao de proteinas de fusao

Info

Publication number: PT95111B
Application number: PT95111A
Authority: PT
Inventors: Brian Seed; Siegfried Stengelin; Wolfgang Ulmer; Paul Habermann; Eugen Uhlmann
Original assignee: Hoechst Ag; Gen Hospital Corp
Priority date: 1989-08-29
Filing date: 1990-08-28
Publication date: 1998-10-30
Also published as: ZA906839B; DK0489780T3; FI113183B; WO1991003550A1; AU6287290A; ATE173018T1; JPH05501799A; NO920774L; PT95111A; GR1005153B; HU9200674D0; FI920923A0; IE903120A1; EP0489780A1; EP0489780B1; NO308667B1; ES2124216T3; GR900100635A; NO920774D0; CA2065146C

Description

As proteínas que, para além da proteina pretendida, têm também um constituinte indesejável ou constituinte de balastro no produto final são designados como proteínas de fusão. Quando as proteínas são preparadas por engenhariagenética, a fase intermédia de uma proteina de fusão é utilizada particularmente se, na expressão directa, a proteína de fusão for decomposto de forma relativamente rápida por proteases endógenas do hospedeiro, dando origem a rendimentos baixos ou totalmente inadequados da proteína pretendida.

A quantidade do constituinte de balasto da proteina de fusão é habitualmente escolhida de forma a ser obtida uma proteína de fusão insolúvel. Esta insolubilidade não apenas proporciona a protecçao pretendida contra as proteases endógenas do hospedeiro mas permite também a fácil se. paração dos componentes insolúveis da célula. É geralmente con1 siderado aceitável que a proporção de proteína pretendida na proteína de fusão seja relativamente pequena/ isto é, que a célula produza uma quantidade relativamente grande de balasto,

Foi tentada a preparação de proteínas fusão com um pequeno constituinte de balasto. Por exemplo, foi preparado um gene de fusão que codifica para uma proteina de fusão a partir dos dez primeiros aminoácidos de ^-galactosidase e somatosina. Contudo, foi observado que esta pequena cadeia de aminoácidos não protegia adequadamente a proteína de fusão contra a decomposição pelas proteases endógenas do hospedeiro (US-A 4 336 246, Coluna 15, Parágrafo 2).

A partir de EP-A 0 290 005 e 0 292 763, são conhecidas proteinas de fusão cujo constituinte de balasto consiste num fragmento de ^-galactosidase com mais de 250 aminoácidos. Estas proteínas de fusão são insolúveis, mas elas podem ser facilmente solubilizadas com ureia (EP-A 0 290 005).

A invenção refere-se a um processo para a preparação de proteínas de fusão caracterizado por se construir um oligonucleótido misto que codifica para o constituinte de balasto da proteína de fusão, se introduzir este oligonucleótido num vector de forma a que seja funcionalmente ligado a uma região de regulação e ao gene estrutural para a proteína pretendida, que se transformem células de hospedeiro adequadas com a população de plasmídio obtida desta forma e que sejam escolhidos os clones que produzem um alto rendimento de proteína de fusão. As melhores realizações desta invenção são explicadas a seguir:

plasmídeo codifica vantajosamente na extremidade 3' um aminoácido ou um grupo de aminoácidos que permite a fácil, e de preferência enzimática, clivagem do constituinte de balasto da proteína pretendida. De acordo com uma outra forma de implementação, é construído um oligonucle2 *1

ótido que produz uma proteina de fusão insolúvel que pode ser facilmente solubilizada. Em particular, é de preferência construído um oligonucleótido que codifica para um constituinte de balasto que não peturba a dobragem da proteína pretendida.

Devido a razões práticas, a construção, de acordo com a invenção, do oligonucleótido para o constituinte de balasto faz com que este último seja muito pequeno.

É surpreendente observar que, mesmo quando elas possuem um constituinte de balasto extremamente pequeno, as proteínas de fusão não apenas cumprem os requisitos estabelecidos para a resistência à protease, mas são também introduzidas a uma elevada taxa de expressão e, se desejado, se a proteina de fusão for insolúvel, ela pode ser facilmente solubilizada. No estado dissolvido ou solúvel, o pequeno constituinte de balasto de acordo com a invenção permite então uma conformação estericamente favorável da proteína pretendida de forma a que possa ser adequadamente dobrada e facilmente separada do constituinte de balasto.

Se a proteína desejada for formada numa pró-forma, o constituinte de balasto pode ser constituído de modo a que a sua clivagem possa ocorrer simultaneamente com a transformação da pro-proteína em proteína madura. Na preparação da insulina, por exemplo, o constituinte de balasto e a cadeia C podem ser removidas simultaneamente, dando origem a um derivado da insulina madura que pode ser transformado em insulina sem qualquer reacções laterais que envolvam grandes perdas.

pequeno constituinte de balasto de acordo com a invenção é realmente mais pequeno que as habituais sequências de sinal de proteínas e não peturba a dobragem da proteína pretendida. Ele não necessita assim de ser eliminado antes da fase de processamento final que dá origem á proteína madura.

oligonucleótido que codifica para o cons tituinte de balasto contem de preferência a sequência de ADN (cadeia de codificação) (dcd)_x na qual D representa A, G ou T e x é 4-12, de preferência 4-8

Em particular, o plasmídeo é caracterizado por uma sequência de ADN (cadeia de codificação)

ATG (DCD)_y (NNN)_Z na qual N no triplete NNN representa nucleótidos iguais ou diferentes, excluindo as paragens de códoes, Z é 1-4 e y+z é 6-12 de preferência 6-10, em que y é pelo menos 4. Revelou-se vantajoso para o oligonucleótido ter a sequência de ADN (cadeia de codificação)

ATG (DCD)5_g (NNN) especialmente se a sequência de ADN (cad de codificação)

ATG GCW (DCD)4__B CGW ou, vantajosamente

ATG GCA (DCD)4_7 CGW em que W representa A ou T.

As sequências modelo de ADN acima referidos cumprem todos estes requisitos. Os cod&es CDC codificam para os aminoácidos serina, treonina e alanina e portanto para uma cadeia relativamente hidrofílica de proteína. Os códoes de paragem são excluídos e a escolha do aminoácidos permanece fácil. Apresenta-se a seguir uma realização particularmente preferida da sequência de ADN para o constituinte de balasto, especialmente se a proteina pretendida for a pró-insulina:

ATG GCW (DCD)y, CGW ou

ATG GCD (DCD)y¹ CGT

na qual y' significa 3 a 6, especialmente 4 a 6.

segundo códao, GCD, codifica para a alanina e completa a sequência de reconhecimento para a enzima de restrição Ncol, desde que a sequência anterior de regulação termine com CC. 0 triplete próximo do último codifica para a treonina e, juntamente com o códão CGT para a arginina, representa a sequência de reconhecimento para a enzima de restrição Mlul. Consequentemente, este oligonucleótido pode ser facilmente e sem ambiguidade incorporado nas construções de genes .

grupo (NNN)_Z codifica na posição 3' para um aminoácido ou um grupo de aminoácidos que permite a simplesz e de preferência enzimática/ separação do constituinte de balasto da proteína subsequente pretendida. É aconselhável escolher os nucleótidos neste grupo de forma a que na extremidade 3' elescodifiquem o local de clivagem de uma enzima de restrição que permite a ligação do gene estrutural da proteína pretendida. É também vantajoso para o códão de partida ATG e se necessário o primeiro tripleto DCD ser incorporado na sequência de reconhecimento de uma enzima de restrição de forma a que o gene para o constituinte de balasto de acordo com a invenção possa ser facilmente inserido nos vectores habituais .

limite superior de z é obtido por um lado no local de clivagem pretendida para a clivagem (enzimática) da proteína de fusão obtida, isto é, ele engloba códões, por exemplo, para a sequência de aminoácidos Ile-Glu-Gly-Arg, no caso de a clivagem ser efectuada com o factor Xa. Em geral, o limite superior para a soma de y e z é 12, dado que o constituinte de balasto deve obviamente ser tão pequeno quanto possível e, acima de tudo, não interferir com a dobragem da proteína pretenida.

Por razões práticas, sao preferidas bac5

terias ou células eucarióticas inferiores como por exemplo fungos como organismos hospedeiros em processos de engenharia genética, desde que não sejam necessários organismos superiores. Nestes processos, a expressão do gene heterólogo por uma região de regulaçao homologa, isto é, a que é mais intrínseca para o hospedeiro ou compatível com a célula hospedeiro. Se for expresso um pré-péptido, acontece também com frequência que a pré-sequência é também heteróloga para a célula hospedeiro. Na prática, esta falta de harmonia de sequência resulta frequentemente em rendimentos de proteína variáveis e emprevisiveis. Dado que a sequência de balasto de acordo com a invenção é adaptada ao ambiente, o processo de selecção de acordo com a invenção produz uma construção de ADN que é caracterizado por esta harmonia de sequência.

principio e fim do constituinte de baj lasto são estabelecidos nesta construção: a etionina está no í principio, e um aminoácido ou grupo de aminoácidos que permite a separaçao pretendida ao constituinte de balasto da proteína pretendida está no fim. Se, por exemplo, proteína pretendida for a pro-insulina, vantajosamente escolhido de um triplete NNN que codifica para a arginina como último códão, dado que isto permite a separação por clivagem simulta! nea particularmente favorável do constituinte de balasto com a remoção da cadeia de C. Obviamente, a extremidade do constituinte de balasto pode também ser um aminoácido ou um grupo de aminoácidos que permite uma clivagem química, por exemplo metionina, de forma a que a clivagem seja possível com brometo ou cloreto de cianogénio.

A sequência intermédia de aminoácidos deve ser tao pequena quanto possível de forma a que nao seja afeetada a dobragem da proteina pretendida. Além disso, esta cadeia deve ser relativamente hidrofilica de forma a que a solubilização seja facilitada com proteínas de fusão não dissolvidas e a proteína de fusão permanece solúvel. Os resíduos de cisteína são indesejáveis dado que eles podem interferir com a formação de pontes de dissulfureto.

ADN que codifica para o constituinte de balasto é sintetizado sob a forma de um oligonucleótido misto; ele é incorporado num plasmídeo de expressão adequada imediatamente em frente de gene estrutural para a proteína pretendida e a E.coli é transformada com o conjunto de genes obtidos desta forma. As estruturas adequadas de genes podem ser obtidas desta forma. As estruturas de genes adequadas podem ser obtidas por selecçâo dos clones bacterianos que produzem as proteínas de fusão correspondentes.

Foi anteriormente referido que os locais de clivagem para as enzimas de restrição no início e fim de sequência de nucleótidos que codificam para o constituinte de balasto devem ser encaradas como apenas exemplos. As sequências de reconhecimento que englobam o códão de partida ATG e em que quaisquer nucleótidos que se sigam podem incluir o códão para aminoácidos adequados são, por exemplo, também para o utilizador para as enzimas de restrição AflIII, Ndel,

Nlalll, NspHI ou Styl. Dado que na realização preferida a arginina deve estar no fim da sequência de balasto e dado que existem seis códões diferentes para a arginina, podem também ser encontrados aqui enzimas de restrição adicionais para serem utilizados em vez de Mlul, por exemplo Nurl, Avrll, AflIII Clal ou Haell.

Contudo, é também vantajoso utilizar uma reacção em cadeia de polimerase (PCR) de acordo com Saiki, R.K. e col., Science 239:487 491, que pode dispensar a construção de locais de reconhecimento específicos para as enzimas de restrição.

Foi previamente indicado que a limitação para a sequência de ADN (DCD)x é por razões de facilidade e isto não elimina outros códões como por exemplo, os da glicina, prolina, lisina, metionina ou asparagina.

A realização mais eficaz desta sequência de ADN é obtida por selecção de bons produtores de proteína de fusão, isto é, por exemplo, da proteína de fusão contendo pro-insulina. Isto produz a combinação mais favorável de sequência de regulação, sequência de balasto e proteína pretendida, e em resultado da qual são evitadas combinações desfavoráveis de promotor, sequência de balasto e gene estrutural e são obtidos bons resultados com o gasto minimo em termos da harmonia de sequência acima referido.

Foi observado, com surpresa, que os genes optimizados para o constituinte de balasto de acordo com a invenção não continham sempre os tripletes preferidos por E.coli. Foi verificado que para Thr, o códão ACA, que é utilizado menos frequentemente por E. coli, ocorre realmente e frequentemente nas sequências escolhidas. Se, por exemplo, as seguintes sequência de aminoácidos forem optimizadas de

acordo com o códão preferido	utilizado por E. coli.(pcu; cf.
Aota,	S. e	cal:	Nucleic	Acids Research 16	(suplemento) r315,
r316,	r391,	r402	[1988])	, obtem-se uma estrutura	de gene to-
talmente diferente da obtida	de acordo com	a invenção.
(Cf.	Tabela	1):
Ala	Thr	Thr	Ser	Thr	Ala Thr	Thr
GCG	ACC	ACC	AGC	ACC	GCG ACC	ACC	pcu
GCA	ACA	ACA	TCA	ACA	GCA ACT	ACG	invenção
			No caso	das proteínas	de fusão com um cons-

tituinte de pro-insulina, o ponto de partida inicial era um constituinte de balasto com 10 aminoácidos. A sequência de ADN ; do melhor produtor servia então como base para as variações nesta sequência, tendo sido notado que até 3 aminoácidos podem ser eliminados sem uma perda notável na taxa de expressão relativa. Esta conclusão nao é apenas surpreendente, dado que é inesperado que uma proteína de balasto tão pequena seja adequada, mas também muito vantajosa dado que obviamente a proporção relativa de pro-insulina na proteína de fusão aumenta à medida que o constituinte de balasto diminui.

A importância do constituinte de balasto na proteína é aparente a partir da seguinte conclusão : a pro -insulina humana contém 86 aminoácidos. Se, para uma proteína de fusão de acordo com EP-A 0 290 005, se tomar o limite de 250 aminoácidos para o constituinte de balasto, a proteína de fusão tem 336 aminoácidos, dos quais apenas cerca de um quarto ocorrem na proteína pretendida. Em comparação, uma proteína de fusão de acordo com a invenção com apenas 7 aminoácidos noconstituinte de balasto tem 93 aminoácidos, isto é, o constituinte de pro-insulina constitui 92,5%. Se a proteína pretendida tiver muito mais aminoácidos do que a pro-insulina, a relação entre o balasto e a proteína pretendida torna-se ainda mais favorável.

Foi já referido algumas vezes que uma pro teína pretendida de pro-insulina representa apenas uma realização preferida da invenção. Contudo, a invenção também funciona com proteínas de fusão muito maiores ’das quais se menciona comoexemplo uma proteína de fusão com o domínio activo de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A-redutase. Esta proteína contém 461 aminoácidos. É conhecida da EP-A 292 803 um gene que codifica para esta última.

Breve Explicação do Desenho:

A figura 1 e á sua continuação na Figura la e Figura lb mostra a construção de uma população de plasmidio (conjunto de genes) plNT4x do plamídio conhecido pH154/25* através do plasmidio pINT40.

As outras construções não foram apresentadasgraficamente dado que elas são facilmente aparentes para um especialista a partir das Figuras.

A invenção será explicada com maior detalhe nos exemplos seguintes. Os dados de percentagem referem -se a peso se nao for referido outra coisa.

Γ.

Se não for indicado o contrário, todos os meios são preparados de acordo com Maniatis, T; Fritsch, E. F. e Sambrook, J.; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). 0 meio TP consiste em meio M9CA mas com um teor de glicose e casaminoácido de 0,4% cada um. Se não for indicado o contrário, todos os meios contêm 50 ^tig/ml de ampicilina. 0 crescimento bacteriano durante a fermentação e determinado por medida da densidade óptica das culturas a 600 nm (0D).

Exemplo 1: Construção do conjunto clone com elevada expressão.

de genes e selecção de um material de partida é o plasmídio pH154/ /25* (1), que é conhecido de EP-A o 211 299. Este plasmídio contém um gene de proteína de fusão (D'-Proin) ligado a um promotor-trp e a um gene de resistência para resistência contra o antibiótico ampicilina (Amp). 0 gene da proteína de fusão que contém um fragmento da pr-trpD de E. coli (D') e pro-insulina de macaco (Proin). A estrutura do gene do plasmáio resulta em ARNm policistrónico, que codifica para a proteína de fusão e para o produto do gene da resistênca. Para suprimir a formaçao do produto do gene de resistência em excesso, é inicialmente introduzia a sequência terminadora de transcriçao-trp (comercial) entre os dois genes estruturais. Para isso, o plasmídio é aberto com EcoRI e os terminais salientes são preenchidos com polimerase de Klenow. 0 fragmento de ADN resultante com terminais cegos é ligado com a sequência terminadora (2).

5' AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTT3'

3'TCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA5¹ (2) que resulta no plasmídio pINTl2 (3).

plasmídio de partida pHl54/25* contem um local de clivagem para a enzima Pvul no gene de Amp, bem como um local de clivagem Hindlll na área do terminal carboxi do fragmento trp-d. Ambos os locais de clivagem estão assim também contidos em pINT12 (3). Cortando o plasmídio (3) com Pvul e Hindlll, ele é dividido em dois fragmentos em que é isolado o que contém o gene da pro-insulina (4). 0 plasmídio pGATTP 5, que eestruturado de forma analoga a (3) mas que em vez do gene de D'-Proin contem um gene de interferão gama (Ifn) contendo locais de clivagem de restrição Ncol e Hindlll, é também cortado com Pvul e Hindlll e o fragmento (6) contendo a região promotora é isolado. Por ligação deste fragmento (6) com o fragmento (4) obtido de (3), é obtido o plasmídio pINT40 (7). 0 pequeno fragmento com a parte restante do gene do interferão gama é cortado do último com Ncol e Mlul. 0 gran de fragmento (8) é ligado com plasmídio misto (9).

5'CATGGCDDCDDCDDCDDCDDCDDCDA3'

3'CGHHGHHGHHGHHGHHGHHGHTGCGC 5' (9) no qual D representa A, G ou T e H significa o nucleótico complementar. Isto resulta numa população de plasmídio (conjun to de genes) pINT4x (10).

oligonucleótido misto (9) é obtido a par_ tir do oligonucleótido misto sintético (9a)

TTCGGGTACCGHHGHHGHHGHHGHHGHHGHTGCGCAG5'

TTGCCCATGGC3' (9a) que é preenchido com a polimerase de Klenow e cortado com Mui e Ncol.

A estirpe E. coli WS3110 é transformada com a população de plasmídio (10) e as bactérias são colocadas em disco de agar LB. Seis dos clones bacterianos resultantes são ensaiados para determinar a sua capacidade para produzirem uma proteína de fusão com um constituinte de insulina. Para este fim, são preparadas culturas durante a noite em meio LB são misturadas alíquotas de 100 ml das culturas com 10,5 ml de meio TP e são agitadas a 37^SC. A OD600 = 1 as culturas são

ajustadas a 20 pg/ml de ácido 3-p-indolacrílico (IAA), é adicionada uma solução de 40 mg de glicose em 100 ml de água e a preparação é agitada durante mais três horas a 37²C. Posteriormente são removidos 6 OD equivalentes da cultura, as bactérias neles contidas sao recolhidas por centrifugação e ressuspensas em 300 jul de tampão de ensaio (37,5 mM tris de pH 8.5, 7 M ureia, 1% (P/V) SDS e 4% (V/V) 2-mercaptoetanol). A suspensão é aquecida durante cinco minutos, tratada durante dois segundos com ultrassons para reduzir a viscosidade e são depois submetidas as suas aliquotas a electroforese de gel-SDE. Com as bactérias que produzem a proteína de fusão, e de esperar uma banda de proteína com um peso molecular de 10 350 D. É evidente que um dos clones, pINT411 (11), produz uma proteína adequada em quantidades relativamente grandes enquanto que não é observada essa formação de proteína com os clones restantes. Uma experiência com revelação imune com anticorpos específicos da insulina confirma que a proteína codificada por (11) contem um constituinte de insulina.

A Tabela 1 ilustra a sequência de ADN e de aminoácidos do constituinte de balasto nesta proteína de fusão (bem como outras variantes destas sequências).

Exemplo 2: Selecção dos clones adicionais

Para, detectar os clones adequados adicionais, é utilizado um processo de acordo com Helfman, D.M. ecol. (Proc. Natl, Acad. Sei. USA 80:31-35, 1983). Os discos de agar-TP e o meio que contem mais 40 jum/ml de IAA são utilizados para este fim. Quinze minutos antes da utilização, a superfície de ágar dos discos é coberta com uma camada superior de ágar TP com a espessura de 2mm, é colocado um filtro de nitrocelulose noúltimo e são colocadas célula recentemente transformadas nofiltro. São feitas cópias dos filtros em que cresceram colónias de bactérias após incubação a 37^SC, e as bactérias do filtro original são lisadas. Para conseguir isto, os fií> tros são expostos a uma atmosfera de clorofórmio num exsicador durante 15 minutos, posteriormente movidas lentamente durante seis horas à temperatura ambiente num tampão imune (50 mM tris de pH 7,5,150 mM de NaCl, 5 mM de MgCl₂. e 3% (P/V) de BSA), que contem mais 1 jug/ml de DNase I e 40 jag/ml de lisozima, e em seguida lavada duas vezes durante cinco minutos com tampão de lavagem (50 mM tris de pH 7.5 e 150 mM de NaCl) Os filtros são em seguida incubados durante a noite a 3^SC em tampão imune com anticorpos específicos da insulina, lavados quatro veses durante cinco minutos com tampão de lavagem, incubados durante uma hora em tampao imune com um conjugado de proteína A- peroxidase de rábano, lavados de novo por quatro vezes durante cinco minutos com tampão de lavagem e são visualisadas as colónias que têm anticorpos ligados com uma reacção colorida. Os clones pINT42 e pINT43, que também produzem quantidades relativamente grandes de proteína de fusão, sao descobertos desta forma em 500 colónias. 0 ADN obtido por sequênciação e as sequências de aminoácidos derivadas dele foram também reproduzidas na Tabela 1.

Exemplo 3·. Preparação do plasmídio pINT41d

Entre a origem de replicaçao e o promotor-trp, o plasmídio, pINT41 contém uma região de ADN não essencial que é flanqueada por locais de clivagem para a enzima Nsp(7524) 1: Para remover esta região do plasmídio, o pINT41 é cortado com NSP(7524)1, e o maior dos fragmentos resultantes é isolado e religado. Isto dá origem ao plasmídio pINT41d, cuja sequência de ADN é reproduzida na Tabela 2.

Exemplo 4; Fermentação e processamento de proteína de fusão pINT41d (i) Fermentação: é preparada uma cultura de agitação em meio LB a partir de E. coli W3110 transformada com pINT41d. são em seguida colocados quinze microlitros desta cultura, que tem um valor de OD = 2, em 15,7 1 de meio TP e a suspensão é fermentada durante 16 horas a 37^SC.

A cultura, que nesta altura tem um valor de OD = 13, é

V

Ι^χ·

em seguida ajustada a 20 jug/ml de IAA, e até ao fim da fermentação, outras cinco horas, é continuamente bombeada uma solução a 50 (p/v) de maltose a um taxa de 100 ml/hora. É atingido um valor de 0D = 17,5 neste processo. No final, as bactérias são recolhidas por centrifugação.

(ii) Rotura das células; As células são ressuspensas em 400 ml de tampão de desintegração (10 mM tris de pH 8.0, 5 mM de EDTA) e rompidas numa prensa de French. A proteína de fusão contendo a insulina é posteriormente concen trada durante 30 minutos de centrifugação a 23 500 g e lavada com tampão de desintegração, são obtidos 134 g de sedimento, (substância húmida).

(iii) Sulfitólise: são agitados 12,5 g de sedimento (substância húmida) de (ii) em 125 ml de uma solução de ureia 8M a 35^ec. Após se agitar durante 30 minutos,a solução é ajustada a pH 9,5 com solução de hidróxido de sódio e é feita reagir com 1 g de sulfito de sódio. Após mais trinta minutos de agitação a 35^SC, são adicionados 0,25 g de tetrationato de sódio e a mistura é de novo agitada durante trinta minutos a 35^eC.

(iv) DEAE. cromatografia de permuta aniónica: 0 lote inteiro de (iii) é diluido com 250 ml de tampão A (50 mM de glicina, pH 9,0) e colocado numa coluna de cromatograf ia que contem Fractogel (R) TSK DEAE-650 (volume da coluna 130 ml, diâmetro da coluna 26 mm) equilibrada com tampão A. Após se lavar com o tampão A, a proteína de fusao-S-sulfonato é eluida com um gradiente salino consistindo em 250 ml cada de tampão A e tampão B (50 mM de glicina de pH 9,0, 3M de ureia e 1M de NaCl) a um caudal de 3 ml/minuto. As fracções contendo a proteína de fusão-S-sulfonato são em seguida combinadas.

(v) Dobragem e clivagem enzimática; As fracções combinado (iv) são diluidas a 4^SC numa proporção de volume de 1+9 com tampe© de dobragem (50 mM de glicina, pH 10,7) e por cada litro da diluição resultante são adicionados 410 mg de ácido escórbico e 165 ml de 2-mercapoetanol a 42c com agitação moderada. Após correcção do pH a 10,5, é continuada a agitação durante mais 4 horas a 4^Qc. Posteriormente, é adicionado o ácido N-(2~hidroxietil)-piperazino-N'-2-etanossulfónico (HEPES) para uma concentração final de 24 g por litro de lote. A mistura que tem agora um pH 8 é digerida com tripsina a 252C. Durante o processç a concentração da enzima na mistura de digestão é de 80 pg/1. 0 decurso da clivagem é seguido analiticamente por RP-HPLC. Passadas duas horas, a digestão pode ser parada por adição de 130 jig de inibidor de tripsina de soja. 0 ensaio de HPLC revela a formação de 19,8 mg de di-Arg insulina a partir de uma mistura de acordo com (iii). A identidade do produto de clivagem é confirmada por sequênciação e HPLC comparativa com substâncias de referência.

A di-Arg insulina pode ser purificada cromatograficamente de acordo com processos conhecidos e transformada em insulina com carboxípeptidase B.

Exemplo 5: Construção do plasmídio pINT60 plasmídio pINT60 resulta num precursor de insulina cuja sequência de balasto consiste em apenas nove aminoácidos. Para a construção deste plasmídio, o plasmidio pINT40 e cortado com Ncol e Mlul e o fragmento do vector resultante é isolado. 0 plasmidio Insul5

TTCGGGTACCGTTGTTGTAGTTTGAGTTGCGCAG 5'

TTGCCCATGGC 3' é então sintetizado, preenchido com polimerase de Klenow e também cortado com estas duas enzimas. 0 fragmento de ADN resultante é em seguida ligado com o fragmento vector para sr obter o plasmidio pINT60.

A tabela 1 mostra a sequência de ADN e de aminoácidos do constituinte de balasto nesta proteina de fusão.

Exemplo 6: Construção do plasmidio pINT67d plasmidio pINT67d é um derivado de pINT41D em que o códão do aminoácido na posição nove da sequência de balasto é eliminado. Isto justifica porque, tal como o pINT60, ele resulta num precursor de insulina com uma sequência de balasto de nove aminoácidos. É utilizado um processo de acordo com Ho, S.N. e col, (Gene 77:51-59,1989) para a sua construção. Para este fim, são em primeiro lugar efectuados dois PCR separados com o plasmidio pINT41d e os dois pares de oligonucleótidos

TIR: DTR8:	5' 5'	-CTG AAA TGA -CAC AAA TCG	GCT AGT	GTT TGC	GAC-3'	e
TGT	TGA	TGT	TGT-3' ou
DTR9:	5'	-ACA GCA ACT	CGA	TTT	GTG	AAC	CAG	CAC-3' e
Insull:	5'	-TCA TGT TTG	ACA	GCT	TAT	CAT-	3'
Isto produz	dois	fragmentos que são parcialmente	complementa-

resum do outro e quando estabilizados um com o outro codificam um precursor semelhante de insulina como o pINT41d em que, contudo, se encontra ausente o aminoácido na posição nove. Para completar, os dois fragmentos são combinados e submetidos a outro PCR em conjunto com os oligonucleótidos TIR e Insull. A partir dofragmento de ADN obtido desta forma, o gene estrutural do precursor da insulina é libertado com Ncol e Sall e purificado. 0 plasmidio pINT41d é em seguida também cortado com estas duas enzimas, o fragmento vector é purificado e posteriormente ligado com o fragmento do gene estrutural do PCR para se obter o plasmidio pINT67d.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos para a região de balasto foram reproduzidos na Tabela 1.

Exemplo 7: Construção do plasmidio pINT68d

Tal como o plasmidio pINT67d, o plasmidio pINT68d é um derivado reduzido do plasmidio pINT41d em que os códoes dos dois aminoácidos nas posições oito e nove das sequências de balasto são eliminados. Resulta assim um precursor de insulina com uma sequência de balasto com apenas oito aminoácidos. 0 procedimento anteriormente descrito no Exemplo 6 é utilizado para a sua construção mas com os pares de oligonucleótidos.

TIR:	5'	-CTG	AAA	TGA	GCT	GTT	GAC-3'	e
DTR10:	5'	-CAC	AAA	TCG	TGC	TGT	TGA TGT TGT	TGC-3'	ou
DTR11:	5'	-TCA	ACA	GCA	CGA	TTT	GTG AAC CAG	CAC-3'	e
Insull:	5'	'-TCA	TGT	TTG	ACA GCT TAT CAT-3'

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos para a região de balasto foram reproduzidas na Tabela 1.

Exemplo 8: Construção do plasmídio pINT69d plasmído pINT69d é também um derivado reduzido do plasmidio pINT41d em que, contendo, os câões dos três aminoácidos nas posições sete, oito e nove da sequência de balasto foram eliminados. Resulta assim um precursor de insulina com uma sequência de balasto com apenas sete aminoácidos. 0 procedimento descrito no Exemplo 6 é também utilizado para a sua construção mas com os dois pares de oligonucleótidos.

TIR:	5'	-CTG	AAA	TGA	GCT	GTT	GAC-	-3'		e
DTR12:	5'	-CAC	AAA	TCG	TGT	TGA	TGT	TGT	TGC	CAT-3'	ou
DTR13:	5'	'-ACA	TCA	ACA	CGA	TTT	GTG	AAC	CAG	CAC-3'	e
Insull:	5’	'-TCA	TGT	TTG	ACA	GCT	TAT	CAT-	-3'

As sequências de nucleótidos de aminoácidos para a região de balasto foram reproduzidas na Tabela 1.

Exemplo 9: Construção do plasmidio pINT72d

Ο plasmidio pINT72d é um derivado do plasmídio pINT69d em que toda a região C-péptido do gene,, com a excepção do primeiro códão do aminoácido arginina é eliminado. Resulta assim, consequentemente, um derivado de minipro-insulina com um resíduo de arginina em vez de uma cadeia-C. Com o plasmidio pINT69d como ponto de partida, o procedimento descrito no Exemplo 6 é também utilizado para a sua construção, mas com os dois pares de oligonucleõtidos.

TIR:	5'-CTG	AAA	TGA	GCT	GTT	GAC-	-3'
Insu28:	5'-GAT	GCC	GCG	GGT	CTT	GGG	TGT-3
Insu27:	5'-AAG	ACC	CGC	GGC	ATC	GTG	GAG-3
Insull:	5'-TCA	TGT	TTG	ACA	GCT	TAT	CAT-3

Exemplo 10: Construção dos plasmídios pINT73d, pINT88d epINT89d plasmidio pINT73d é também um derivado do plasmidio pINT69d (Exemplo 8), em que o precursor de insulina é disposto duas vezes em sucessão. 0 plasmidio resulta assim na formação de um ARNm policistrónico, que pode duplicar o rendimento. Para a sua construção é efectuada uma reacção PCR com o plasmidio pINT69d e os dois oligonucleõtidos.

Insu29: .5'-CTA GTA CTC GAG TTC AC-3’ e

Insull: 5'-TCA TGT TTG ACA GCT TAT CAT-3'

Isto dá origem a um fragmento com o gene precursor da insulina e o sitio de ligação de ribosoma pertinen te que na sua região terminal-5' tem um local de clivagem para a enzima Xhol e na sua extremidade terminal 3' um local de clivagem para Sall. 0 fragmento é cortado com as duas enzimas acima referidas e purificado. 0 plasmidio pINT69d é em seguida linearzado com Sall, os dois ADN terminais produzidos são desfoforilados com fosfatase (de intestino de vitela) e ligados com o fragmento da reacção de PCR para se obter o plasmidio pINT73d.

Sao obtidos de forma análoga os plasmídios pINT88d e pINT89d quando o plasmidio p.INT72d (Exemplo 9) é modificado analogamente por arranjo do gene de minipro-insulina duas ou três vezes em sequência.

Exemplo 11: Construção do plasmidio pINL41d plasmidio de partida pRUD3 tem uma estrutura análoga à do plasmidio pGATTP. Contudo, em vez da região promotora-trp, ele contem uma região promotora-tac que é flanqueada por locais de clivagem para as enzimas EcoRI e Ncol. 0 plasmidio é cortado com EcoRI, após o que as extermidades salientes do local de clivagem são preenchidas com a polimerase de Klenow. 0 corte é efectuado posteriormente com Ncol e o fragmento promotor resultante é isolado.

promotor-trp do plasmidio pINT41d é flanqueado por sitios de clivagem para as enzimas PvuII e Ncol.

Dado que o plasmidio tem um sitio de clivagem adicional para PvuII, ele é compeltamente cortado com Ncol, mas apenas parcial, mente com PvuII. 0 fragmento vector, a que lhe falta apenas a região promotora, é em seguida isolado dos fragmentos resultantes. Ele é em seguida ligado com o fragmento promotor-tac para se obter o plasmidio pINL41d.

Exemplo 12: Construção do plasmidio pL41c plasmíio pPL-lambda (que pode ser obti- | do de Pharmacia) tem uma região lambda-pl-promotora. A última é flanqueada por sequência de nucleótidos:

5'GATCTCTCACCTACCAAACAAT3' e

5'AGCTAACTGACAGGAGAATCC3'.

5'ATGAATTCGATCTCTCACCTACCAAACAAT 3' e 5'TTGCCATGGGGATTCTCCTGTCAGTTAGCT 3'

Oligonucleíidos LPL3:

LPL4:

são preparadas por flanqueamento adicional da região promotora com sitios de clivagem para enzimas EcoRI e Ncol. É efectuado um PCR com estes plasmidio e pPL-lambda e o fragmento promotor resultante é cortado com EcoRI e Ncol e isolado. 0 plasmidio pINL41d é em seguida também cortado com estas duas enzimas e o fragmento vector resultante, que não tem promotor, é em seguida ligado com o fragmento lambda-pl-promotor para se obter o plasmi dio pL41c.

Exemplo 13: Construção do plasmidio pL41d terminador de transcriçao-trp localizado entre o gene de resistência e o gene da proteína de fusão no plasmídio pL41c não é eficaz em estirpes de E. coli que são adequadas para fermentação (por exemplo E. coli N4830-1). Por esta razão, são formados na fermentação um mARN policistrónico e com uma grande quantidade de produto de gene de reistência. Para evitar esta reacção lateral, a sequência do terminador-trp é substituída por uma sequência terminadora eficaz do operador E. coli-rrnB. 0 plasmidio pANGMA tem uma estrutura semelhante à do plasmidio pINT41d, mas tem um gene de angiogenina em vez da proteína de fusão e uma sequência rrnB (do plasmidio comercial pkk223-3, que pode ser obtida de Pharmacia) em vez da sequência terminadora-trp. 0 plasmidio é cortado com Pvul e Sall e o fragmento contendo o terminador rrnB é isolado. 0 plasmidio pL41c é em seguida também cortado com estas duas enzimas· e o fragmento contendo o gene de insulina é isolado. Os dois fragmentos isolados são em seguida ligados para se obter o plasmidio pL41d.

Exemplo 14: Construção do plasmidio pINTI

Para preparar um plasmídio para utilização geral na expressão das proteínas de fusão, o gene de pro-insulina do plasmidio pINT41d é substituído por uma sequência poliligante. Este gene é flanqueado por sitios de clivagem para as enzimas Mlul e Sall. 0 plasmídio é assim cortado com a ajuda das duas enzimas acima referidas e o fragmento é isolado. Este é em seguida ligado, para se obter o plasmídio pINTLI, com os seguintes dois plasmidios sintéticos

BstEII Accl EcoRI Kpnl BamHI

5' CGCGCCTGGTTACCTCGAGGTATACTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC

GGACCAATGGAGCTCCATATGATGCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGG

Xhol Saci Xmal sphl Xbal

CTGCAGGCATGCAAGCTTGTCTAGAC -3'

GACGTCCGTACGTTCGAACAGATCTGAGCT-5'

PstI HindIII (Sall).

Exemplo 15: Inserção de um gene que codifica para HMG CoA-redutase (domínio activo) em pINTLI e expressão da proteína de fusão.

gene sintético para HMG coA-redútase conhecido de EP-A o 290 803 contém um sítio de clivagem para BstEII na região dos aminoácidos Leu e Vai nas posições 3 e 4 (Tabela 5 de EP 0 292 803 A2). Uma sequência saliente correspondente à enzima Xbal ocorre na extremidade do gene (na área não codificante). Os sítios de clivagem correspondentes no poliligante do plasmídio pINTLI estão no mesmo quadro de leitura. Ambos os sítios de clivagem são em cada caso singulares.

Se o pINTLI for cortado com BstEII e Xbal e o fragmento grande for isolado, e se, por outro lado, o piasmí£io pUHIO (EP-A 0 292 803) for digerido com as mesmas enzimas e o fragmento que contem a maior parte da sequência de ADN deste plasmídio for isoladq após ligação dos dois fragmentos, é obtido um plasmídio que codifica uma proteína de fusão em que a arginina se segue aog oito primeiros aminoácidos na sequência de balasto de pINT41d (Tabela 1), que é seguida partindo de Leu^ , pelo gene estrutural do dominio activo de HMG CoA-redutase.

L_.

Para fins de comparaçao, os dois plasmídios iniciais são cortados com as enzimas Ncol e Xbal e os fragmentos correspondentes são ligados em conjunto, para se obter um plasmidio que codifica, imediatamente após o câáo de partidé. o domínio activo da HMG CoA-redutase (de acordo com a sequêncié. V de ADN de EP-A 0 292 803)

Ά expressão das proteínas codificadas ocor re de acordo com o Exemplo 4. Após a rotura das células, é efectuada a centrifugação após o que a proteína esperada com aproximadamente 55 kDa é determinada no sobrenadante por electroforese de gel. A banda para a proteína de fusão é muito mais intensa aqui do que para a proteína expressa directamente. As partes individuais de 100 pl do sobrenadante são ensaiadas na forma não diluida, numa diluição de 1:10 e numa diluição de 1:100 para a formaçao de mevalonato. Como comparação adicional ensaiada à proteína de fusão de acordo com o Exemplo 4 (proteína de fusão com o constituinte de insulina); não é observada actividade para qualquer das três concentrações. A proteína de fusão com o constituinte HMG CoA-redutase apresenta actividade máxima em todas as três diluições, enquanto que o produto da expressão directa mostra actividade graduada ditada pela concentração. Isto indica uma melhor axpressão que a proteína de fusão de um factor de pelo menos 100.

Exemplo 16: Construção do plasmidio pB70 plasmidio pINT41d é dividido com Mlul e Sall e o fragmento maior é isolado. 0 plasmidio pIK4 (EP-A 0 347 781, publicada em 27 de Dezembro de 1989, ou AU-A 3671/ /89 ou ZA-A 89/4742 ou o Pedido de Patente Alemã P 38 21 159.9 ou o PedidoUS 07/369 686, apresentado em 21 de Junho de 1989; em qualquer destes documentos Figura la) contem um gene para mini-pro-insular, cuja cadeia-C consiste apenas em arginina.

A construção deste plasmidio é descrita no Exemplo 2, Partes a) e b) de EP-A 0 347 781 (ou num documento correspondente). Elesforam reproduzidos no apêndice em conjunto com ambas as ta^belas em fragmentos de genes Ik I e Ik II, bem como nas Figu22 ras 1 e la. Nestas tabelas, as cadeias B e A da molécula da insulina são em cada caso indicadas pelo primeiro e pelo último aminoácido. A seguir à região de codificação no fragmento gene Ik II,existe um sítio de clivagem para Sall que será utilizado na construção sguinte.

plasmídio plk4 é cortado com Hpal e Sall e o gene que codifica a mini-pro-insulina é isolado. Este gene é ligado com o grande fragmento acima referido de pINT41d e a seguinte sequência de ADN sintético.

B'

	Arg	Met	Gly	Arg	Phe
CG	CGT	ATG	GGC	CGT	TTC	GTT
A	TAC	CCG	GCA	AAG	CAA

(Mlul) (Hpal)

Isto dá origem ao plasmídio pB70, que codifica uma proteína de fusão em que a sequência de balasto (Tabela 1, linha 1) é seguida pela sequência de aminoácidos Met-Gly-Arg que é seguida pela sequência de aminoácidos da mini-pro-insulina.

Exemplo 17

Utilizando os oligonucleõtidos abaixo referidos são obtidos plasmídios pINT90d até pINT96d em analogia com os exemplos anteriores. Um asterisco indica o mesmo aminoácido codificado no constituinte de balasto tal como em pINT41d.

pINT92 codifica uma dupla mutaçao no derivado de insulina codificado pio plasmídio pINT72d desde que o códão para Arg na extremidade do constituinte de balasto e na mini cadeia-C seja substituído pelo códão para Met. Assim o pré-produto expresso pode ser clivado com brometo de cianogénio.

pINT90d

TIR:

Insu50: Insu49:

Insull:

pINT91d TIR: InsuSO: Insu49: Insull:

pINT92d Insu56: Insu58: Insu57: Insull:

pINT93d Insu53: Insull:

pINT94d Insu54: Insull:

pINT95d Insu55: Insull:

pINT96d Insu71: Insull:

pedidos tadas a ******GNSA* (variante de pINT69d)

5'-CTGAAATGAGCTGTTGAC-3 e

5'TGCCGAATTTCCTGTTGATGTTGTTGC-3' ou 5'-GGAAATTCGGCACGATTTGTGAACCAG-3' e 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' ******GNSA*'(variante de pINT72d)

5'-CTGAAATGAGCTGTTGAC-3 e

5'-TGCCGAATTTCCTGTTGATGTTGTTGC-3' ou 5'-GGAAATTCGGCACGATTTGTGAACCAG-3' e 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' (duplo mutante de pINT72d)

5'-TCGACCATGGCAACAACATCAACAATGTTTGTG-3 e 5'-GATGCCCATGGTCTT-3' ou ' -AAGACCATGGGCATC-.3 ' e

5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' ******(variante de pINT68d)

5'-ACCATGGCAACAACATCAACAAAACGATTTGTG-3' e 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' ******(varianye de pINT68d)

5'-ACCATGGCAACAACATCAACACCACGATTTGTG-3' e 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' ******(variante de pINT68d)

5'-TCGACCATGGCAACAACATCAACAATGCGATTTGTG-3' e 5'-TCATGTTTGACACGTTATCAT-3' ******(variante de pINT68d)

5'-ACCATGGCAACAACATCAACAGGACGATTTGTG-3' e 5'-TCATGTTTGACAGCTTATCAT-3'

Foram mencionados no texto anterior algu de patente Europeia publicados (EP-A). Sao apresenseguir as correspondentes Patentes da África do Sul (ZA-A), pedidos de patentes Australianas publicadas (AU-A) e pedidos de patentes Norte-Americanas (USSN):

-A		ZA-A	AU-A	USSN
211	299	86/5556		889,176
290	005	88/3208	15631/88	190,082
292	763	88/3517	16379/88	194,914
292	803			196,599

Tabela 1

123456789 10 11 ρΙΝΤ

Met Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Arg

ATG GCA ACA ACA TCA ACA GCA ACT ACG --- CGT 41d

Thr Ser Thr --*** *** *** **g A*T T*G A*G **G *** ___ *** 42

Ala Thr Ser Thr Ser --*** **φ g** *** A*T T*T A*T T*A *** ___ *** 43

--- Asn Ser --*** *** *** ***___AAC T*A ***___*** g,Q *** *** *** *** *** *** *** *** ___ --- **A 67d *** *** *** *** *** *** *** --- **A 68d *** *** *** *** *** ***--- **a, 69d,72d

Gly Asn Ser Ala *** *** *** *** *** *** *a* T** GCA **A 90d, 91d

Lys--------*** *** *** *** *** *** AA* ___ ___ ___ **A 93d

Pro------— *** *** *** *** *** *** ç;**---------**A 94d

Met--------*** *** *** *** *** *** ATG --- --- --- **A 95d

Gly --- --*** *7* *** *** *** *** *g* ___ ___ ___ **A 96d

Tabela 2: Sequência de ADN de Plasmideo pINT41c

30 50

GTGTCATGGTCGGTGATCGCCAGGGTGCCGACGCGCATCTCGACTTGCACGGTGCACCAA

90 110

TGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCAC

130 150 170

TGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACA

190 210 230

TCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGT

250 270 290

TAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACCATGGCAACAACATCAACAGCAA

310 330 350

CTACGCGTTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTAGTGGAAGCTCTCTACCTGG

370 390 410

TGTGCGGGGAGCGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCCTC

430 450 470

AGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGCGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCGC

490 510 530

TGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGCGGCATCGTGGAGCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCC

550 570 590

TCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAATAGTCGACCTTTGCTTTCATTGTCGATGATA

610 630 650

AGCTGTCAAACATGAGAATTAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTAATTCTTGAAGA

670 690 710

CGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCT

730 750 770

TAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTC

790 810 830

TAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAA

850 870 890

TATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTT

910 930 950

GCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCT

970 990 1010

GAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATC

1030 1050 1070

CTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTA

1090 1110 1130

TGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACAC

1150 1170 1190

TATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGC

1210 1230 1250

ATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAAC

1270 1290 1310

TTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGG

1330 1350 1370

GATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGAC

1390 1410 1430 *

GAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGC

1450 1470 1490

GAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTT

1510 1530 1550

GCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGA

1570 1590 1610

GCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAACCCCTCC

1630 1650 1670

CGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAG

1690 1710 1730

ATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCA

1750 1770 1790

TATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATC

1810 1830 1850

CTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCA

1870 1890 1910

GAC C C C GTAGAAAAGATCAAAGGATC TTCTTGAGATC CTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGC

1930 1950 1970

TGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTA

1990 2010 2030

CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTT

2050 2070 2090

CTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTC

2110 2130 2150

GCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGG

2170 2190 2210

TTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGTAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGT

2230 2250 2270

GCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGC

2290 2310 2330

ATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCA

2350 2370 2390

GGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATA

2410 2430 2450

GTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGG

2470 2490 2510

GGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCT

2530 2550 2570

GGCCTTTTGCTCACATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGC

Claims

REIVINDICAÇÕES . lâ .

Processo para a preparação de proteínas de fusão, caracterizado por se construir um nucleósido misto que codifica para o constituinte de balasto da proteína de fu são se introduzir este oligonucleótido num vector de tal maneira que é funcionalmente ligado a uma região de regulação e ao gene estrutural para a proteína pretendida, se transformarem células hospedeiras apropriadas com a população de plasmí dios obtida desta maneira e se escolherem os clones que apresentam um elevado rendimento de proteína de fusão codificada.

-
2^ Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de o oligonucleótido codificar na ex tremidade
3' um aminoácido ou um grupo de aminoácidos que per mite ou permitem a fácil e preferivelmente enzimática separação do constituinte do balasto da proteína pretendida.

- 3a _

Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se construir um oligonucleótido que origina uma proteína de fusão que pode facilmente ser solubilizada.

_
4a _

Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações anteriores, caracterizado por se construir um oligonucleótido que não interfere com a dobragem da proteína pretendida.
5Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o oligo nucleótido conter a sequência de ADN (cadeia de codificação) (DCD)_x na qual

D representa A, G ou T e x é 4 - 12, preferivelmente, 4-8.

- 6^a Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o oligonucleótio ter a seguinte sequência de ADN (cadeia de codificação)

ATG (DCD)y (NNN)_X na qual

N no triplete NNN representa nucleótidos iguais ou diferentes excluindo codões de interrupção, z significa 1 - 4 e y+z significa 6-12, preferivelmente, 6-10 em que y é pelo menos 4.

- 7^a Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o oligonucleíido ter a seguinte sequência de ADN (cadeia de codificação)

ATG (DCD)₅_₈ (NNN) preferivelmente,

ATG GCW (DCD)₄„₈ CGW em que W é A ou T.

_ 8^ Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o olinucleótido ter a seguinte sequência de ADN (cadeia de codificação)

ATG GCW (DCD)y, ACG CGW preferivelmente

ATG - GCA - (DCD)_y, CGW em que Y' é 3-6, preferivelmente, 4-6.

- 9- Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a proteína pretendida ser uma pró-insulina.

As requerentes reivindicam a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 29 de Agosto de 1989, sob o número de série 399,874.

Lisboa, 28 de Agosto de 1990

As

RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO

A invenção refere-se a um processo para a preparação de proteínas de fusão, que compreende construir-se um nucleósido misto que codifica para o constituinte de balasto da proteína de fusão, introduzir-se este oligonucleótido num vector de tal maneira que é funcionalmente ligado a uma região de regulação e ao gene estrutural para a proteína pretendida, transformarem-se células hospedeiras apropriadas com a população de plasmídios obtida desta maneira e escolherem-se os clones que apresentam um elevado rendimento de proteína de fusão codificada.