PT97623A - Processo para a preparacao de proteinas por meio da utilizacao de um peptideo de sinal - Google Patents

Description

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Descrição referente á patente de invenção de HOECHST JAPAN LIΜ l TED, j aponss-s5 i ndust r :L a 1 e comercial , com sede sm 10····· ~-:lá, 8-chaínS; akasaks, Minate.....

—ku, Tokyo, Japão, <inventores s Tamotsu Hashimoto s AtsushTsíí j i mur o, rssi d en t ss no Japão) , para "PROCESSO _f'ARA A PREPARAÇÃO.....DE PRQTEiNAS.....

MEIO__________DA ........UTILIZfiggQ..........DE UM PEPTiDEQ DE SINAL", ANTECEDENTESDA INVENSgjÇ

Domínio cia técnica A presente invenção diz respeito a uma sequência de ADN que codifica para um peptídeo denominada ds sinal s á sua utilização para a produção de proteínas por msio de engenharia genética,, Mais particularmsnts5 a presente invenção diz respeito a um processo para a produção ds proteínas através do uso ds Bacillus hrsviji como hospede:;.ro h. também a uma sequência ds ADN necessária para a pratica deste processou F.P.

Tácn:l.ca reiacionada

Um método par-a apradução de proteínas heterólogas em microorganismos usando técnicas de ADN recosibinanfce tem sido largamente usado para a produção de produtos médicos s farmacfuticos. 0 ffiicroorganisiao mais popularmente usado como microorganismo hospedeiro um para este método é o Escherlehia coli. No entanto, a proteína heteróloga produzida é normalmente retida no interior de células de Eh coli quando este é usado como hospedeiro. Assim, é necessária para a purificação da proteína heteróloga a destruição das células s a remoção de um certo número de compostos tais como proteínas derivadas de E„__ Coli ou semelhantes. Adicionalmente, as proteínas heterálogas que são produzidas em abundância no espaça limitado das células formam por vezes corpos de inclusão, de modo que são muitas vezes necessários grandes esforços para regenerar as actividades das proteínas heterólogas„

Por outro lado, num sistema no qual se uti 1 izam como microorganismos hospedeiros Bac:13.lus subti 1 is, leveduras ou microorganismos semelhantes, existe a vantagem de as proteínas heterólogas produzidas serem geral mente segregadas a;-í tracei ui armsnte pelas células hospedeiras e deste modo os produtos serem facilmente rscupsráveis» Uma tal vantagem em usar Baci1lus sufatiIis ou microorganismos semelhantes como hospedeiros depende presumivslmente ds um mecanismo constitui do por o microorganismo ter um gene portador de informações genéticas específicas a produzir uma proteína desejada sob a forma ds um precursor no qual ss encontram ligadas cadeias de psptídeas, chamadas psptídsos de sinal, e o precursor é feito passar através da membrana celular a è segregado smtracei ui srmente ou no psriplasma, no qual as cadeias de psptídeos de sinal são separadas s são obtidas proteínas maduras.

Como um snemplo de um si st saia no qual se utiliza um microorganismo dc gênero Bac111us, foi descrito um exemplo coroado ds sucesso da secreção de uma

grande quantidade de produtos genéticos estranhos para um meio de cultura através do uso ds Bac i 11 us brevis 47 qus segrega uns a proteína numa quantidade ds até 12 g/1 para d meio sob a condição de cultura óptima CS» Udaka, (1976) Agric. Biol.

Chern» ç 4£, 523-528p S. Miyashiro, H» Ensi , i<» Takinami, Y» Hirass8 T. Tsuchida e S» Udaka (1980), Agric» Biol. Chem», 44, 2297-230315 ligando o promotor de um gene que codifica para liWP que é uma das proteínas segregadas pelo microorganismo a um ADN qus codifica para um peptidso de sinal com um gene estranho tal como fautor ds crescimento epidérmico humano ou semelhantes e introduzindo o ADN ligado no Baci11us brevis 47 EH» Yamagata, et al„, Cl989), Proc» Natl. Acad. Sei. USA, 86, 3589-35933.

No entanto, os produtos genéticos estranhos assim produzidos podem possiIvelmenta ser decompostos num meio de cultura devido è ocorrência de enzimas prateaiíticas segregadas bktraceiularmente em pequena quantidade pelo Bac: 111 us brevis 47.

RESUMO DA INVENÇÃO 0 objectivo da presente invenção ê o ds resolver os problemas acima descritos através do uso de um sistema de expressão por nós constituído no qual se faz uso do local de regulação de um gene que codifica para uma proteína BBRP42 qus acaba de ser descoberta s que se verificou ser segregada no estágio inicial no qual as enzimas protsolíticas ainda não foram segregadas em quantidades demasiadamente elevadas»

Deste modo, a presente invenção refere.....se a um ADN que codifica para um peptídeo de sinal e compreende uma sequência de ADN que codifica para o peptidso de sinal representado substancialmente pela seguinte sequência de âc i d os am :i. n ad os CI)

Met-Rbe-Ser.....Lys-Thr-Lys-Met-Sl y-Met-Leu-

Met-Bly-Thr—Met—AI a—Vai-Vai—Leu—Ser—Leu- íl)

Ei y-Ser-11s-Gly-Gly-Ala-Met-Ala.

A presente invenção refsre-ss também a um vector de eKp^essSa, qus compreende o acima mencionado ADN que codifica pai-·a o psptídeo de sinal s um ADN que codifica para uma proteína heteróioga desejada ligada na extremidade a jusante do ADN anterior assim como um ADN necessário para a expressão destes genes estranhos,:

Para além disso, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de uma proteína desejada, que compreende a transformação de uma célula hospedeira com o vsctor de acordg com a presente invenção, e a cultura do transformante formado no meio de cultura para produzir a proteína segregada no meio de cultura,, A ligação s a exprssão do ADN qus codifica para o paptídso de sinal de acordo com a presente invenção e o ADN que codifica para uma proteína hstsróloga desejada conduzem com sucesso à secreção extraceiular e à produção da proteína heteróloga desejada a partir da célula hospedeira„

Parti cu!armente, quando uma esti rpe do género Baci_llus é usada como hospedeira, produz-se uma proteína heteróloga desejada num meio de cultura antes da secreção de uma enzima proteolítica derivada do gênero Baci 11 u.s, de modo que proteínas homogéneas podem ser produzidas com elevado rendimento,,

BREVE DESCRIς%0 DAS FIGURftS A Fig„l mostra um resultado da s!ectroforess em gel da SDS-poliacri1amida das proteínas qus foram preparadas no Exemplo Experimental 1 s segregadas num meio de cultura num estágio inicial de cuiturap A Fi g. 2 mostra um mapa de corts por enzimas ds restrição de um fragmento de ADN que contf-m um gene que codifica para BBRP42ji . A Fig 3 mostra uma sequtncia ds ADN desde o local EcoRI até ao local Hindi II ds pBRE—í que é um dos

mutantss tíe supressão preparados no Exemplo 3, ε uma sequfncia as ácidos aminados da BBRP42, na qual os pares de bases nas posições í a 13 s 1791 a 1796 indicam os locais ds clonagsm inerentes ao vectarp I representa o ponto de inicio da transcrição, La representa a origem do sinal ds secreção (ponto de inicio da tradução), s l3 representa a origem ds BBRP42? A Fig» 4 mostra o processo ds preparação do vsctor unitário ds expressão§ A Fig, 5 mostra o processo para a construção do ' vsctor de expressão da <K -ami 1ase de B»_ Iichenxformis; A Fig, 6 mostra o processo para a construção do vsctor ds expressão do íactor epidérmico humano» A Fig» 7 ê um gráfico que ilustra a mudança na acti vidade da <x --ami lass segregada por Bac 111 us hrsvij» 47 transfarmado por ρΑΜΥ·--3 com a passagem do tempo ds cultura, no qual ··-# a - a --· representam as actividades da ami1 ase num meio ds cultura Ϊ2 contendo 10 s 200 ug/ml de sritrofnicina, respectivamente, representa a actividade da ami1 ase no meio de cultura LS contendo 200 Pg/mX de eri tromicina s --4--- representa a acti vidade da ami 1 asa no meio de cultura LS contendo 200 Pg/ml ds eritromicina s 1% ds glucose» A Fig, Sé um gráfico que ilustra a variação da h-EBF segregado por Baci 3.1 us brevis 47 transf ormado por pE8F-2 com a passagem do tempo de cultura)! A Fig, 9 mostra a sequtncia de ácidos aminadas do derivado ds proínsulína ds um macaco e a sua sequtncia ds ADNjs e A Fig, 10 mostra os resultados da análise tíe mancha ds Western da proteína segregada por Bac 11.1 us brevis 47 transformada por pINT90d2, na qual as pistas 1 s 2 correspondem a um derivado da proinsulina de macaco expresso em E, coli s Bacillus brevi_s 47 respecti vamente, s a flecha indica cs der i vad o d a p r o i nsu 1 i n a» *>««η»π»ιτΓϊ;Α '.< ~

DESCRIggQ PORMENORIZADA DA INVENggQ

Peptídeo de si nal 0 ADN de acordo com a presente invenção compreende uma sequfncia de ADN que codifica para o peptídeo de sins! , que tem uma ssqu§nt:ia de ácidos; and nados; rspressntada substancialmente pela sequfncia atrás referida (15.

Besta forma, o ADN de acordo com a presente invenção é definido por um peptídsa que compreende uma sequfncia de ácidos aminados que é codificada pelo ADN. 0 peptídeo é o chamado peptídeo de sinal que actua pela secreção sktraceiular de um produto do organismo produzido no interior de uma célula, s a sequfncia ds ácidos aminados é representada substancialmente pela sequfncia atrás referida (I), A fraseologia !!s sequfncia ds ácidos aminados representada substancial mente pela sequfncia atrás referi daíI>" significa que o psptideo pode sofrer eliminação, substituição, adição ou alterações semelhantes em um a trfs ácidos aminados desde que actue como o chamado peptídeo de sinal. A sequfncia ds ácidos aminados representada pela sequfncia (I) foi conseguida com base na análise de ganes que codificam para 8BRP42 que é uma proteína segregada no meio ds cultura num estágio inicial da cultura de Bacil lus brevi_s 47. BBRP42 ê uma nova proteína que possui as seguintes propriedades;: (15 Tem um peso molecular de cerca ds 42.000 por SBS-PAGEss (25 Tem a seguinte sequfncia de ácidos aminados correspondente às posições 4 a 20 da extremidade Ns

Ai a--Ly s-Pr a-Th r --Ser -Leu"· Asn •••-Ly s-Pr o-Va 1 “BI u··-·Vai -~Ly s-Ph e~

Lys“Thr—Bly§ e

(3) á segregada para um meio de cultura num estágio inicial anterior ao tíe MWP que é uma proteína inerente ao Baci11us brsyis 47„ ADN que codifica para um pajstidso_de sinal 0 ADN que codifica para o peptideo de sinal de acordo com a presente invenção á aquele que compreende uma ssqufncia de ADN que- codifica para a ssqufncia atrás atrás referida (I) s aquela que compreende uma sequfncia de ADN correspondente à mudança da sequfncia de ácidos aminados de um peptideo qus desempenha o papel do peptidso de sinal acima descrito.:

Uma sequfncia de ADN típica de acordo com a presente invenção ê representada pala seguinte ssqufncia (II)s ATS--TTT.....A0C-AAA--ACA--AAA.....AT6-G6A-AT6-CTG-- ATG-SGA--ACS-ATG--6CA-STA.....GTT.....TTG.....AGT-CTG..... (11) GGT-AGC.....ATA-GGC-GGA-GCJ-ATG-GCR, s»5 que ã representa A ou C e R representa A ou 8«

Par-a uma ssqufncia da ácidos aminados de um dado peptideo, a ssqufncia de ADN que codifica para esta pode facilmente ser especial içada através da rsfsrfncia á chamada tabela de códigos e várias sequfncias de ADN cus codificam para a sequfncia de ácidos aminados atrás referida podem ser apropriadaments seleccionadas» Assim, o ADN qus codifica para o peptideo de sinal de acordes com a presente invenção significa aquele em que a sequfncia de ADN & a ssqufncia atrás referida ou um seu isômero degenerado» Nesta ligação, o termo “isômero degenerado” significa um ADN que possui a mesma sequfncia de ADN s codifica para o mesmo peptideo skcapto no qus se refere ao uso de um codão na relação de degsnsreseinci a»

Obtenção de ADN que cori i t i c:a ρar a um psp t £ aso ds si naI ft sequência cio ADN de acordo com a presente % nvenção está sspsci f i cada, e portanto um meio possível para 3 obtenção do ADN é a sua produção de acordo com o método para a síntese de ácidos nucleicos» 0 ADN de acordo com a presente invenção pode ser também preparado pelo método usado para o separar a partir do gene de Baci1lus brevis. Exemplos específicos destes métodos para a obtenção do ADN incluem um método no qual o ADN derivada é obtido a partir do banco de genes inerente ao Baci11us brevis 47 por meio de um método que tem sido normal mente usado no campo da engenharia genética tal como um método de hibridação onde seja usada uma sonda apropriada,, Quanto aos exemplos específicos destes métodos, ver Exemplos Experimentais descritos seguidamente*

Uso do ADN que codifica para um peptídso de jsinal 0 ADN da acordo com a presente invenção ê um ABN que codifica para um peptídso de sinal. Desta maneira, pode produz ir--se axtraceiularmente uma proteína desejada a partir de uma célula hospedeira pela transfarmação da célula hospedeira com um ADN, particularmente sob a forma de um vector ds expressão, que compreende o ADN que codifica para um psptídeo ds sinal e um ADN ligado à extremidade a jusante do ADN num tal estado que estes ADNs possam ser copiados na célula hospedeira a estas informações genéticas possam ser igual mente expressas,, 0 ADN ds acordo com a presente invenção é adequado para a construção de um vector para ser usado num sistema hospedeiro.....vector no qual um microorganismo do género Baci1lus ê o hospedeiro e para a sua utilização na transformação com este vector do microorganismo do género Sacillus, particularmente Baci11us brevis uma vez que o ADN ds acordo com a presente invenção pode produzir uma proteína

heteróloga num meia cie; cu - tara antes de secreção de uma enzima j3roteai ítica derivada da bactéria do gênero Bac 111 us para o msi o.

Vector ds expressão de acordo com a presente invenção

Em concordlncia com o exposto, o vector de expressão de acordo com a presente invenção ê caractsrizado por conter sm si o ADN que codifica para o psptidao d® sinal referido s um ADN que codifica para uma proteína heteróloga desejada ligado à sua extremidade a jusante juntamente com um ADN necessário para a expressão destes genes estranhos.

Particularmente, o vector de expressão de acordo com a presente invenção é tis preferencia construído como um vector de expressão para ser usado num sistema hospedeiro-vsctor- no qual um microorganismo do género Bacillus ê o hospedeiro devido á razão acima exposta.

Quanto ao procedimento ou método para a construção do vector de acordo com a presente invenção, pode ser usado o procedimento ou método normal mente empregue no campo da biologia molecular, engenharia biológica ou engenharia genética.

Por exemplo, quando o ADN inerente à proteína B8RP42 atrás mencionada ê usado directamente como c ADN que codifica para o peptídso de sinal de acordo com a presente invenção, o vector de acordo com a presente invenção pode ser obtido através do procedimento que se segue. Isto é, o vector ds acordo com a presente invenção pode ser obtida por incorporação e clonagem tio ADN obtido por busca do banco ds genes tis BBRP42 acima mencionada para um vector que pode ser copiado num hospedeiro tal como E» col1, s depois pela incorporação do ADN assim obtido numa forma tal que um ADN que codifica para uma proteína heteróloga desejada esteja ligado à sua extremidade a jusante, num vector que pode ser copiado num hosDsdei ro pr é determi nado.

Ex smp 1 os espec í. f i cos dos vsctorss susceptiveis de sersni copiados em células microbianas do género Bac111us usado como hospedeiro podem incluir plasmídaas tais como ρΤΑΙΟάΟ, ρUB110, pE:L94, pC194 e semelhantes s ADNs deri vaaos destes p1 asmídsos.

Adicional mente 5 é preferível usar, como vsctor de acordo com a presente invsnção, um vector que possa ser copiado em qualquer um dos microorganismos usados para a clonsgem do ADN que codifica para d peptídso de sinal obtido a partir de um banco de genes, tal como £«__ col 1 e num microorganismo usado como hospedeiro na produção de uma proteína, tal como uma bactéria do género Bacillus, isto é um vsctor lançadeira, uma vsz que a operação de iransferfncia do fragmento de ADN pode ser omitida» Como vsctor lançadeira de E» coli a duma bactéria do género BaciIlus, é possível usar plasmídeos tais como pHP13 ou semelhantes CP,. Haima, S.Bron, G. Vsnema, Moí. Sen. Oenet., 209, 335-342, 1987)* É necessário que estes plasmídeos contenham marcadores ds sei seção tais como de resistência ao cloranf®nicol, de resistência à aritremicina, ds resistência è estrsptomici na ou ssmelhantes» É necessário que o vsctor ds expressão ds acordo com a presente invenção possua os ADNs necessários para a expressão de um gene estranho compreendendo um ADN que codifica para o peptídso de sinal s um ADN que e od i f i c a p ar a uma p r ot s í n a h e t er ô 1 og a, í st o é um p r omot or , sinais de regulação da transcrição e sinais de regulação da tradução tais como um sinal de iniciação da tradução, um local ds ligação do ribossoma, um sinal de terminação da tradução, um sinal ds terminação da transcrição e semelhantes para assegurar que o vsctor, com a introdução numa célula hospsdeirra segregará e expressará uma proteína heteróloga desejada»

Estes fautores estão por vecas contidos previamersts no vsctor original, e neste caso os factares ds regulação no vector original podem ser usados como tal» Como foi descrito anteriormente, quando o ADN que codifica para o peptídso de sinal s é obtido a partir da proteína BBRF42

ê usado direciarftssnts, ê vantajoso clonar não apenas o ADN que codifica par-a o peptídeo de sinal mas também as regiões ds regulação tais como o promotor»

Quando uma bactéria da género Baci 11 us ê usada como hospedeiro» é particular-mente preferido i ncorporar um promotor para expressar estes genes estranhos num estágio inicial da cultura» Exemplos especificas do promotor a que ê dada prefsrfncia pode incluir um promotor que possua pelo menos 30 pares de bases da seguinte sequência ds ADN < 1115 ;;

TACGATTTTCCCTCAAGTTTTCCTTTTTTCTCAAA / T r τ v CGGGAATCT AAAAATACCCATGTACACTTGGTCT7

Adicianal mente, é prefsrivel que um sinal ds regulação da tradução representado pela seguinte sequência de ADN (IV) como um ADN necessário para a expressão do gene estranho esteja compreendido sntr-e o local de iniciação da transcrição s o local de iniciação da tradução;:

T AACAAAGAACAAGCACACTACACGAGCATAGACG

AAAGGGTTGAGTGTAT Não existe limita para as proteínas heteròlogas que podem ser produzidas pala presente invenção» Exemplos típicos destas últimas podem incluir, para além do h-~-—EOF descrito na literatura atrás mencionada no qual uma proteína estranha foi produzida com Bac 111 us brevi s 47 ir.terf erões, uma variedade de interlsuquinas» insulina, N8F5 7NFs BM.....CSF, ísctor VIU de coagulação do sangue, proteínas antigánicas específicas ds várias doenças e semelhantes» Método para a preparação da proteína desejada 0 método para a preparação da proteína desejada de acordo com a presente invenção compreende, conforme é descrito atrás, a transformação cie uma célula

hospedeira com um vecior da ezpressão da acordo com a presente invenção a o cultivo do transiormanta obtido para segregar a proteína desejada no maio de cultura»

Como mi croorganismo hospedai ro, são partieu!armsnte usadas estirpes do gênero Bacilius» Como ezemplo das estirpes do gênero Baci 11 us preferidas», podem maneionar-ss estirpes de BaciI1us brevis» Exemplos típicos de

Baci 1 ius brsvis incluem o Bac 111 us brsvis 47» CFERH Ρ--72Ξ4) , 481, 144, 899 e semelhantes» A transiarmação pode ser levada a cabo pelo método convencional da técnica» A cultura do transiormanta assim obtido produz e acumula a proteína estranha desejada eztracelularfflente a partir do microorganismo hospedeiro (isto é, num meio de cultura)» A cultura e a condição da cultura do transiormante são essenc i almente as mesmas do mi croorgani smo hospedeiro usado» Igualmente, a proteína desejada pode ser recuperada do meio de cultura e puri-ficada de acordo com o método usual»

EXEMPLO EXPERIMENTAL

Investigação de proteínas no sobrsnadante do meio de cultura de Bacull_lus brsvis 47 no estágio inicial de cultura

Cu!tivaram-se células da estirpe

Baciljus hreyis 47 de um dia para o outro num meio Tlura (0,31 de KaHPCU, 0,21 de CNH^sSCU, 0,025 * de MgS04.7Ha0, 0,31 de peptona, 0,2% de ss-ítractc ds carne» 21 de glucose, 0,21 de ureia e 0,011 de uracilo)» 0 meio resultante foi diluído 100 vezes com o mesmo meio Tlura, e a cultura com agitação fax levada a cabo a 37°C enquanto a sbsorhãncia foi medida a á>ó0 nm» Após incubação durante 2a Í0 horas, as células foram

r·©tiradas da cultura por centrifugação, adiciorou—se sulfate ds amónio ao sobrenadante ds forma a este ficar saturado até 90%, s em ssguitía a mistura foi deitada em repouso a 4o C» Após centrifugação, uma porção da suspensão do precipitado resultante numa quantidade correspondente a 1 ml do fluido de cultura com uma absorbãnc:). a de 0,01. foi sujeita a slsctrolorese de gel de pol ;i. acrilami tía SDS de acordo com o método de Lasmmli CNature, 1.VT0, &5;:íO—fctíh) » A coloração do qsl com Azul Brilhante ds Coomassis originou uma banda correspondente a uma proteína com um peso molecular de cerca de 42,.000 para além das bandas ds MIaJP e Gt!P anterior-mente referidos (H„ Yamatía st al „ ,, (1981) 3-, Bacteriology, 14S, 322--332) no sobrenadante do meio ds cultura num estágio inicial da cultura,. Esta proteína foi designada por BBRP42»

Purificação ds BBRP42 e determinação da sequência de ácidos aminados da sua extremidade N-terminal Cí) Purificação de BBRP42 0 meio de cultura das células de Bacillus brevj.s 47 que tinha sido cultivado ds um dia para o outro no meio TI ura foi diluído 100 vezes com o mesmo meio Tiara tal como no Exemplo Ί ,, s a cultura com agitação foi levada a cabo a 37°C até a absorbãncia a 660 nm atingir 0,7» Ao ms 1 o d e c u 11 ur a c cn g s 3. ad o ad i c i on ou—se PMSF í f 1 uor e t o d s feniImetanossulfanilo) até uma concentração final ds 1 mM s centrifugou-se para se removerem as células» Adicionou-se 474 g de sulfato de amónio s 1 litro do sobrenadante, s a mistura foi deixada em repouso a e depois centrifugada para se remover 0 pr-ecipitado. Adicionaram—se mais 153 g de sulfato ds amónio a 1 litro deste sobrenadante, e a mistura foi deixada em repouso a 4ÍSC s depois centrif ugada para recuperar o precipitado» 0 precipitado foi dissolvido numa solução ds Tris—HC1 SOmM CpH 7,0) s NaCI lOOnsM, s fez-se passar a solução através ds urn comparti mento Ssp—pak (Waters Co») para absorver as suas

proteínas» C compartimento foi lavado com o tamplo, © as proteínas foram eluídas com acetonitriIo a 40% a 1 iofi 1:!,cadas.: Como a amostra ds proteínas ainda continha quantidades consideráveis dos componentes do msio de cultura, foi sujeita a filtração por gel através de uma coluna carregada com Bics—Ssl P60 (Biorad Co.) para recolher a fracção que continha BBRP42, que foi sujeita a diálise contra hidrogeno carbonato de amónia 0,1 H e liofilisada para proporcionar uma amostra para a determinação da sequfncia de ácidos aminados» (2) Determinação da sequ@ncia ds ácidos aminados

Uma porção ds 40 Ug da proteína obtida no parágrafo acima mencionado (1) foi sujeita a análise de ácidos aminados por um analisador de ácidos aminados 477A (Applied Biosystem Inc») para analisar 20 resíduos de ácidos ami nados da extremidades N» Como resultado, a sequfncis de ácidos aminados nas posiçõss 4 a 20 da extremidade N revelou.....se ser a seguintes A1 a—Ly s.....Pr o—Th r......Ser.....Leu-Asn—Ly s~Pr o—

Val --G1 u.....Vai “Lys-Phe-Lys-Thr......61 y»

Clonagem do gene que codifica para BBRP42 s determinação da ssqulncia de ADM (í) Construção ds um banco ds gsnss de Bacillus brevis 47»

As células obtidas por centrifugação no Exemplo 1 foram suspensas numa solução de Tris-HCl 50 mH (pH 8,05, EDTA 50 mH s 15% tís sucross» Adicionou.....se lisocima â suspensão ds forma a ter uma concentração final as 5 mg/ml, s incubou-se a mistura a 57°C durante 15 minutos. Em seguida, adiei onaram-se SD3 e Pronase K de forma a obterem-se concentrações finais de 0,51 e 50 μ-g/ml , rsspectiyarssnts, s incubou-se a mistura de um dia para o outro a 55°C» Após extracçõss repetidas com fenol s uma extraeção final com

cloraí6rmid, adic:l.onou-ss etanol numa quantidade igual a 2 vazes a da mistura para precipitar o ADN. 0 ADN foi parcialmants digerido com Sau3Al da acordo com o método ds Maniatis st al,, , (Molecular cloning 1982, Gol d Spring Harbor Laboratory) s depois sujeito a slsctroforsss em gel. de agaross, Umí gel contendo um fragmento ds ADN ds cerca ds 20 kb foi cortado e carregado num tubo ds diéliss, a o ADN foi aluído do gsl por al ectrof orese. A solução foi sujai ta a sxtracçSo com fanol , 5 a ADN foi precipitado com sstsnol , 0 ADN cromossoma! '1 Ug) e ADN de XgtlO (Stratagens Ca.) cortado com Bami-Í! (2 ug> foram precipitados com etanols dissolvidos sm 10 ul ds um tamplo ds ligaoSo CTris-HCl èè m!-1 CpH 7,6), MgC!S; 6,6 mH, D7T 10 mM s ATP 0,1 mH] e incubadas ds um dia par-1¾ o outro a lé°C apôs adição de 1igasa T4, Uma porção ds 5 pl da mistura ds incubação foi sujeita a empacotamento com um conjunto de empacotamento XADN in vitro s um Sigapack gol d (Stratagane Co„ ) , (Ξ) Sslscçlo do fago recombinants portador ds um gsne qus codifica para BBRP42

Cerca de 5,000 tagos obtidos no parágrafo supramencionados (!) foram espalhados no maio ds agar—agar com uma cultura ds células ds sstirps E» coli 0600 s raalizou"“sa uma hibridação de placa ds acordo com o método ds Manietis st al» , (Molecular cloning 1982, Cal d Spring Harbor Laboratory)„ Como sonda usa-se um ADN ds 50 nucleôtidos compreendendo SCTAAACCAACTTCTCTSAACAAACCAGTT8AABTTAAATTCAAAACTG(3, marcado com i. 3spl ATP s pol inucleótitío quinase t.4» 0 ADN foi sintetizado na base da ssqufncia ds ADN deduzida a partir da ssqufncia ds ácidos aminados das posições 4 a 20 obtida no exemplo 2 s tendo em consideração o codão usado fr-squentements nos genes qus codificam para as proteínas MNP s 0NP derivadas ds Baci11us brevis 47 qus tinham já sido clonadas (Tsuboi et * al „ (1988) J,· BsctsrioL s !70, 935), Como resultado, foram 15

clanes que hibridavam com a sonda, C3> Determinação da sequfncia de AON do gene que codifica para 3BRP42 0 ADN do fago obtido no parágrafo anter i ormente referido <2) foi cortado com EcoRI e os fragmentos resultantes foram sujeitos á hibridação de mancha de Southern» Como resultado, a sonda acima referida hibridou com um fragmento de 6,6 kh» Inserindo-se um fragmento EcoRI de um clone num local de EcoRI de pUCIS CTakara Shaxo K.K.> para preparar um ADR e preparou-se um mapa ds restrição, G ADN foi cortado com várias enzimas de restrição s depois foi sujeito a hibridação ds Southern com a sonda atrás rafsr-ida;; um fragmento de SacI-PstI de 1,7 que hibridou com a sonda. Um fragmenta de Sacl-Sphl de 3,7 kb contendo esta regi lo foi inseri do entre um local ds 8aII s um local de Spbl ds pHSG399 CTakara Shuzo K.K,:). 0 ADN do plasmádeo resultante foi cortado com Sal I s Kpnl s em seguida foram construídos mutantes ds supressão por digestão por etapas do ADN com enonaclsass III e nuclease de feijão "mung" CHainkoff, (1984), Gene, 28, 351.....) = Isolaram-se ADNs ds mutantes ds supressão individuais s determinaram-se as sequfncias da ADN usando um conjunto Sequanase 7™deaza (United States Siochemical Corporation). A Fig. 3 mostra a sequfncia da ADN desde um local EcoRI até um local HindIII de pBRE-l, que & um dos mutantes ds supressão. Conforme se mostra na Fig, 3, quando os dados da sequfncia de ADN foram analisados, o quadro de leitura livre constituído por 457 codSss foi encontrado na região dos pares d® bases número 237 a número 1607» A sequfncia ds ácidos aminados constituída por 17 ácidos aminados obtidos no Exemplo 2 foi encontrada na sequfncia de ácidos aminados entre os ácidos aminados 32 e número 48 que foi traduzida a partir deste quadro de leitura livre» 0 BBRP42 encontrado neste meio tinha um término na extremidade SM-terminal da alanina do ácido aminado número 29 s considera-se que a sequfncia entre esta posição a a extremidade N-terminal funciona como um sinal * ds secreção» Existem seis locais qus servem potencialmente como

pontos do :ι ru ci ação tís tradução, Met, dos ácidos &minados número 1 a número 28» A estrutura na qual uma Met na posição i é um ponto de inicia da tradução s bastante semelhante à estrutura comum ao sinal de secreção do género Baci11us já investigada, constituída por local hidrofílico.....local hdrófoho..... .....locais de corte, por esta ordem a partir da e?·tremidads U~ .....termi nal» (4) Determinação do ponto de inicies da transcrição

Com o fim de determinar o ponto de inicio tía transcrição do gene que codifica para BBRP42» sintetizou-se um ADN constituído por 20 nuclsôtidos complementares da sequência dos pares de bases número 2:2:5 a número 244 mostrada na Fig„ 3, e efsetou-se uma sktensão por meia ds um iniciador (Janes, K. A.:, (1985) Cel 1 42, 559.....572) »

Temperaram.....se o ARN de Baci11us brsvis 47 isolado ds acordo com o método de Μ. Z» Silman st aL (CelI, 35, 285-293) s o iniciador marcado com t 3aPI! ATP e quinase ds pol inuclsótiaos "Γ4 anteriormente referidos s sintetizou-se uma cadeia complementar com uma transeriptase inversa» 0 produto foi sujeito a slectroforess juntamsnte com marcadores de dimensão num gel de acrilamida a 10%/ureia 7 M para determinar o comprimento da cadeia» Comi::? resultado da auto.....radiografia, foram confirmadas bandas de é0 nucleótidos e os nuclsôtidos número é:l., s deste modo concluí-se que o ponto da início da transcrição do gene que codifica para BBRP42 era S na posição do nucleótido 185 a Ϊ na posição do nucleótido 184 apresentadas na Fig 3» G na posição 185 é maioritário s T na posição 184 ô menoritári o»

Ezemp1o 4

Construção do vsetor unitário ds expressão U plasmidso pBRE.....1 portador do

fragmento de ADN mostrado na Fig» 3 que foi seiecc i onado dos mutantes de supressão obtidos no Exesnplo 3 foi cortado com EcoEI a FstJ. para dar um fragmento de ADN que continha um promotor,; um pepiídso de sinal s a regi lo N-tsrminal ds BBRP42* 0 fragmento de ADN foi inserido entre um local EcoRI s um local PstI ds um vsctor plasmídeo, pUCIS, dando arigsm ao plasmídeo pBRE.....2„ Uma sequência ds ADN entre um local Bsm! s um local

PstI dssfcs plasmídeo pBRE-2 foi substituída por ADNs sintéticos complementares possuindo as seguintes sequências ds ADN, obtando-se o plasmídeo pBRE-3s

SATGBSAACGATSSCAGTAGTTTTSftSTCTBBGTABCATAGG

GACTACCCTTSCTACCGTCATCAAAACTCAGACCCATCGTATCC 3f 3'

CGGAGCCATGGCGGATCCTCTAGAGTCGAGCTGCA GCCTCSGT ACC8CCT ABSA8ATCTCASCT8B 0 plasmídeo assim constituído tem o promotor do gene que codifica para 8BRP42, codifica o peptídeo de sinal ds BBRP42, e adicionalmente transporta jusante um local ds policlonagem compreendendo locais Ncol, BamKT., Xbal, PstI, Sphl s HindiII,, Ligando um gane da proteína heterôloga dirsctamante ao local Mcol, pode ser- construída uma unidade de expressão,, Na ligação do gana, é necessário adicionar um ADN que codifica para Ala na extremidade 5' visto que o local do ADN que codifica para Ala, o ultimo ácido aminado do psptídeo de sinal, é separado pela digestão com NcoI„ Adicional mente, como o plasmídeo não ê susceptivsl ds ser copiado em Bac111us brevis, é necessário transferir a unidade de expressão constituída em pBRE.....3 para um plasmídeo que o seja Bacillus Por exemplo, é necessário inserir um fragmento de ADN, que é obtido por corte com Ecorl e Hindi11 ds um plasmídeo no qual um gene de proteína hstsrôloga á incorporado em pBRE—3, num local apropriado de um

v s c. t o r lançadeira tal c o m ο p Η P í q us s s j a ρ o s s í v s1 d s c opis r nas células das estirpes de Bacillus»

Oustrarn-se em seguida expressões típicas da amilase ds B=_ l ichenif or-mis s da fsetor de c r esc i mert t o sp i d &r mi co humana,,

Exemplo 5

Construção do vector de expressão de amilase da B„ 1 i chani for mi s s sua expressão Baci 11 us brsvi s 47 0 -fragmento de AON separado com BamHl s Bell de um plasmídeo pTNl contendo o gene de amilase de B. 1 ichsni-formis <T„ Yuuki , st al ·, , (1935), J. Biochsm,, 93, 1147.....) -foi inserido no local BamHI do pBRE—3 preparado no

Exemplo 4, s o produto na qual o gene de amilase foi disposto na dirseção corrscta foi seleccionado para a preparação da pftMY---í„ Uma porçlo sobrante foi suprimida dc plasmídso com Ncol e Eco47III, s um par da ADNs sintéticas representadas pala estrutura seguinte foi inserido no lugar da porção sobrante para preparar a plasmídso pAMY~2§ 5 !

CATS8C88CAAATCTTAAT8SSACSCTSAT0CASTATTTTSAAT

C8CC8TTTAGAATTACCCTGC6ACTAC3TCATAAAACTTA 3"

GGTACATGCGCAATGACGGCCAACATTGGAAGC

CCATGTACGGGTTACTGCCGGTTGTAACCTTCG

Zs ' peptídso ds 1iohsnifor-mis. 0 plasmídeo pAMY™2 contém um promotor da um gene que codifica para BBRP42, e uma unidade de expressão que codifica para um sinal de BBRP42 assim como amilase de Bs

Adicional mente·, preparou-ss o plasmídeo ρΑ!ΊΥ-·-3

per· corte de um ADN que continha urna unidade de supressão de pftMY 2 com EcoEI s Hindi XX s inserção num local EcoRS e HindiII de pHP13, que é um das vsctarss lançadeira de E, coi i e 5·, suhtl 1 isu 'frauBtaruíOu.....se Bac 111 us brevis 47 com o plasm!doo assim preparado de acordo com o método ds Takahashi st ai, (J,

Bscteriol», (Ί983), 15fe, 1130--1:1.34), 0 transformants resultante foi inoculado no meio ds cultura T2 íi% ds psptona» 0,5 1 da sKtracio de carne, 0,2 1 ds sxtracto as levedura» 1¾ ds glucose) contendo 10 Ug/ml ds eritromicina, e s-fectou-se a cultura com agitação a 37°C» As células fera;;· retiradas do meio ds cultura por centrifugação, s a setividads da amilase no sobrenadante foi determinada pela modificação de Matsusaki do método ds H» Fana <J, Biochsmistry, 4:U 583» 1954)» Como resultado» coníirmou-ss qus a amilase foi segregada para o meio ds cultura»

Exemplo 6

Determinação quantitativa da amilase segregada por Baci11us brevis 47 transforrsado por nfíMY-3 0 transformants de Bacillus brevis 47 contendo pAHY-3 obtido no Exemplo 5 foi inoculado no meio 72 contendo 200 uy/ml de aritromicina, no meio L3 ií% as psptona, 0,5 li de sxtracto ds levedura, 0,251 de cloreto ds sódio) contendo 200 Pg/ml de sritromicina, ou no meio LS contendo 11 de glucose e 200 Pg/nsl de sritromicina, e sfsetuou.....se a cultura com agitação a 37°C» Uma porção do meio de cultura foi retirada em cada 24 horas, e o sobrenadante no qual as células tinham sido removidas por centrifugaçlo foi usado como uma solução amostra ds amilase para a determinação da sua actividads, A actividade da amilase no sobrenadante foi determinada pela modificação tíe j-iatsusaki do método de H» Fuva tal coma na Exemplo 5» A Fig» 7 mostra as sctividadss da amilase segregada no sobrenadante com a passagem do tempo» Apôs cultura durante • 24 horas, a aísiilass foi segregada em maior quantidade na meio

LS contando 200 ug/ml da eritromicina, s a sscrsglo da amilass decrescia ssqusnc:!.&X menta no meio T2 contando 200 uc/ml de aritromicina, no maio LS contando 1¾ da glucose s 200 Ug/ml da eritremicina a no maia T2 contando 10 JJg/ml ds aritromicina=, No an t an t o ap ó s c u 11 u.r a cl uran t s ?3 h or as ,s a ac t:!. v i d a d e d a am:!. X ass dscrsscia sequencialmsnts no maio LS contando í% ds glucose a 200 Mg/ml de eritromicina, no maio LS contendo 200 ug/ml de er-itr-offlicina s no meio T2 contendo 200 pg/ml ds eritromicina. No meio T2 contendo 10 pg/ml ds sr i tromi c:!. na apôs cultura durante 72 horas, -foram segregadas 920 U/ml de amilase»

Construção tío vector ds expressão do -factor ds crescimento epidérmico humano Íh-EBF) s sKpressSo em 3aci11us bravis 47 0 factor de crescimento spidérmico humano é um pol ipept ídao comparati vamsnts pequeno compreendendo 58 ácidos aminados5 s nesta sKpsritncia o ADN usado foi um ADN sintsticado por via química que codifica para o factor ds crescimento epidérmico humano» Na síntese do ADN? sintsticaram-sa em 4 porsões um ADN que compreende uma sequência que codifica para Ala que ê o último ácido aiBinads tía ssquSncia ds sinal a montante5 um ΪΑΑ que codifica para um cocão ds término a jusante s ADNs capazes ds sersm ligados a locais Mcol s Xbal de pBRE.....3 em ambos os terminais» 0 ADN sintético foi inserido nos locais Ncol s Xbal de pBRE-3 para preparar pESF.....1» 0 fragmento ds ADN separado do plasmídeo com EcoRI s Hindlli foi inserido em ρΗΡ13 para preparar pE8F“2=. 0 vector de sxpr-asslú foi introduzido em Bacillus biqsvi_s 47 do mesmo modo do que no ·. Exemplo 5» 0 transformants resultante foi inoculado no meio T2 contendo 10 Pg/ml de eritromiei na, s sfsctuou—ss cultura com agitação a 37Í5C» Como resultado da dstscçlo da h-ESF no sobrenadaste5 ao qual as células tinham sido removidas com anticorpo anti-h.....EOF, confirmou---se a sxistlncia de h--E3F no . sobrenadaste»

Deter m i n a g la q uan t i 151 i va d o h ESF ssg r sg ad α p cr Bac: i 11 as brevis 47 transformado por pEGF-2 0 Baco._l_j.us brevis 47 transformado por pEGF-Ξ obtido no Exsmplo 7 foi inoculado no meio 72 contendo ÍO Pg/ml os eritremieins, s efectuou.....se cultura com agitagãa a 37° C„ Uma porção da meia as cultura foi retirada em cada Ξ4 horas, a a concentração do h-EGF no sobrsnadanta do qual as células tinham sido removidas foi determinada pslo método ELISA com um anticorpo monocional do f setor ds crescimento epidérmico humano (Currsni protocols :ln molecular biology, Vol, 2[i Srssn Publ ishing Associates and Wi 1 ey- “Intsrscisncs, 1989),, Como amostra padrão, foi usado um ESF humano rscombinante purificado (Ar3 Ssiysku Κ,,Κ·),. A Fig=, S mostra o asa resultado,, Enquanto que a quantidade ds h-EGF aumentou durante 43 horas ds cultura, nlo ss observou qualquer aumento da quantidade em culturas posteriores» A concentração ds h-EGF após cultura durante 48 horas era ds 10,5 Ug/mi„

Ex smpI o 9

Purificação do h-EGF segregado por Bac i11us brsvls 47 e exorv·? ir mação da sequência de ácidos amimados na ανtremidada M-·· .....terminal

Com o fim de confirmar que o pspiideo de sinal na extremidade N-terminal do h-E6F segregado por Bacillus brevis 47 tinha sido separado corrsctamente,, purificou.....ss o h-EGF·., Inoculou-se Sac i 11 us brevis 4e7 transformado par pEGF—2 obtido no Exemplo 7 no meio LS contendo 10 uy/ml ds sr1tromicina, s efectuou~ss cultura com agitação a 37°C durante 48 horas» A ao ml do sobrenadaste do meio ds cultura sdicicnar-asi-ss 9,72 g ds sulfato ds amónio, s a mistura foi deixada em repouso a 4°0 durante 1 hora» 0 resíduo foi

removido por- centrifugagScj... s o sobransdsnts -foi adsorvido numa coluna na qual tinha sida comprimi da BUTYL......TOYOPEARL 6508 (Toso

Japlo) ,, Apôs lavagem da coluna com PSS (0,8 % ds MaCl , 0,02 % do KCl , 0,144 % ds NasHPCL,., 0,024 1 ds :<HaP04, pH 7,4) contando 40 % ds sulfato ds amónio, a concsntraçlo do sul-fato ds amónio foi gradualmsnte decrescida ds 40 % até 0 % para e!uir α h-ESF entre as eiuentes par cramatagrafia liquida ds alta eficiência, a fracçlo fai adsorvida numa coluna 818 (column preparada) para cromatograf i a liquida ds alta sf i c i f n c i a ΗIGHBAR, Li Chr asphsr 100 RP 18 a !<an t o !<aga ku '<, '<* ,

Japlo), s o h.....ESF foi sluido com gradiente de 0 % a 40 % de uma soluclo ds acetonitriI o contendo 0,1 % ds ácido tri f1uoroacéti co,, As fracções contendo h EOF foram recaihidas,, s uma porcio do conjunta fai usada para a determinação da sequência ds 20 ácidos assinados na extremidade N-tsrmin&l (ABI Co„ ρ 477A) „ A ssqulnda de ácidos aminados obtida ê representada da seguinte formas

Asn-Ser.....Asp.....3sr--Sl u.....X-Rr o--L.su.....Bsr-Hi s.....Asp····· Θ1 y~Tyr.....X--Lsu~Hi s-Asp--81 y-Val -X , sm que X representa quaisquer rssiduos que nSo possam ser lidos,, C ácido ami nado residual na extremidade N.....terminal era

Asno qus estava ds acordo com o resíduo na extremidade N..... .....terminal do fautor ds crescimento epidérmico humano, s confirmou.....se que a sequência ds sinal astava separada correctaments,. Gs resíduos qus nao padsm ser lidos indicam que o ácido ami nado nSo pode ser analisado devido è. sua motíif icaçSo ou que o ácido ami nada ê um Cys residual,, Todos as resíduos de ácidos aminades do factor ds crescimento epidérmico humano correspondentes ao resídua X na ssqutncia ds ac:;.dos afamados obtida nesta expe-rifncia sSo rssiduos Cys, s X corresponde a Cys„ Desta forma, conclui—se que 20 ácidos aminados na extremidade N-terminai do h-ESF segregado por 3aci11us brevls 47 têm a sequência correcta,,

Exemplo 10 uscreçâo a siiprsssSo da dar ivado da pr á--i nsul i na inerente no macaco por 3ac11 us bravis 47

Foi sfestuado um sname relativo à sscrsoao a s:·;prsss&s da um derivado da pró—insul i na inarsnts no macaca em Baci i1us brevis 47. A Fig» 9 mostra um gsns usado no ΘΧΒΜ&* 0 d ar i vad ο ρ ossu 1 a ad i c i on a 1 mor; t s uma s 3 q u @ n c i a d s á c i d o s a m i na d os a r t i f i c i a 1 r s ρ r a s s n t a í ::l a c o m o se segue na extremidade M~ter·minai da pr-ó-insul. ina ds um macaco;! Het--Al a--7hr-Ssi·"......Thr~-Sl y~Asn-Ssr--Al a-Arg . 0 í ragmsnto ds ADW que codifica para o derivado foi inserido entre o local

Ncol s o local Sal I do vscfcor ds supressão pBR.E 3 cibtitío no Eôremplo 4 para preparar pINT?0tí:L, Uma unidade de esiprsssScs separada a partir do pissmldso com EcoRI s HindiII -foi inserida sntrs o local EcoRI s o local HindiII ds pHR13 para preparar o olasmideo pIN790d2,, Irrhrodueiu--ss α plasí?;ídso pIN790d2 em Bac:l. lius brsvis 47= 0 transf crmante resultante toi inoculada no meio ds cultura ΤΞ contendo 200 Pç/ml de eritromicina, e etsctuou--se uma cultura com sgitsçlo a 37®C durante 48 horas. Uma porolo de i ml do meio de cultura toi c:sntr:l.fugada para remover as células. 0 sobrenadants toi li utilizado, e as proteínas tosam separadas por e!setrotorsss em poliacri1amida SDS de acordo com o método ds Lasmmli (atrás descrito)„ As proteínas foram transfsridas slsetroforsticamsnis numa membrana ds nylon, s sf actuou-sa Weotsrn---Blott:!. ng o cm um anticorpo anii····· i n hu ln a.....h uman a s um an t i c or ρ o set:; un d ár.... marad o cm peroxidass de rábano bastardo CCurrent protocola :ln molecular bioloçy, vol ·. 2ii Grsen Publishins Associates and Hilsy..... I n ter se i sr; c e. 1939) » Como r ssu 11 ad o, f o i c on f i r nud a uma ú.n i c a proteína que reage com o anticorpo anti~-insulina humana conforme se mostra na Fig. 10.

Claims (1)

1. RE I v I N D.....X C A ç 8 E S Processa para a prepararão de uma proteína carscterizado por compreender as Issss de transformar uma célula hospedeira com um vsctor qus contém uma sequência de AD!M qus codifica para o psptídso ds sinal substsncislmsnts repressntado pela sequência (1);; He t.....Ph s-~Ser -Lys-Th r -~Ly s-Hs t --01 y-His t -Leu..... Het.....SI y--Thr.....Hst-Al s-Val.....Vai H....eu"~SsrH,...su·'-· (I) SIy.....Ser.....11s.....31y-Sly-Ala-Het-AIa s ds um ABN qus codifica para a proteína hsierôloga pretendida 1:1 gado na shtremidads a jusante do primeiro ADN bem como o ABN necessário para a entresslo destes genes estranhos s cultivar o transformante preparado ds modo a que a proteína pretendida seja segregada para o meio ds cultura,, Processo ds acordo com a reivindicaoSo i caractsrizado por a referida célula hospedeira ser uma estirpe do gênero Bscillus,, reivindicaçSo Bac:: i 11 us ser uma Processa de acordo com caractsrizado por a referida estirpe estirpe ds Baci 11 lis brevi s., a ds

   Processo ds acordo com a rei vindicaglo i caracterisado por- a referida ssquincia de ADN que cedi fica para o pssptídeo de sinal ser representada pela seg unts sfsqufnc:ia (XI) a ATS.....TTT-AGC.....AAA.....ACA-AAA.....AT6-GGA--ATG-CTG- ATG-8SA ACS ATS—8CAH3TA-BTT—TTS—AGT-CTB- (ϊI5 QGT-AGG-ATA-GGC.....Θ 3 A Θ C J ™ A T S - S 0 R em qa® J representa A eu C s R representa A ou G» Processa de acorda com a reivindicaçlo 1. caractar 1 tado por o referida vector conter um promotor que tem, quando ss utiliza uma célula Hospedeira que capta o ysctor 5 o referido gene estranho expresso na fase inicial da cultura da célula hospedeira,: Processo ds acordo coo qualquer das rsivindicagííss 1 a 5 caractsrisado por o referido vector conter um promotor que contêm pelo menos 30 pares de bases representado pela seguinte ssqa@nc:ia ds ADN (III) a TACGATT'i'TCCCTCAA3TTTTCCTTTTTTCTCAAA CGGGAATCTAAAAATACCCATGTAGACTTGGTCTT Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 1 a é caracterizado por o re-feridc ysctor conter um sinal ds regulação de tradução entre a ponto da inicio da irsnscriglo e o ponto ds inicio da tradução, sendo a sinal representado pela seguinte sequincis. da ADN (IV) TAACAAAGAACAAGCACAGTACACGAGCATAGACG AAAGGGTT3AGTGTAT A requerente reivindica as prioridades dos pedidos japoneses apresentados em li de Maio de 1990 s em 30 ús Nov smbro ds 1990, sob os NSs „ HE 1--2--- i 22,166 a HE l 2--334,,575, rssρ sc ti vamente» Lisboa,, 9 de