PT93031A - Processo para a preparacao de glucagona - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de SHIONOGI & CO., LTD. japonesa, industrial e comercial, com sede em 3-1-8, Dosho-ma-chi, Chuo-ku, Osaka-shi, Osaka, Japão, (inventores; Jun ISHIZAKI Mikio TAMAKI, Masaru SHIN, Hiro-shi TERAOKA, Nobuo YOSHIDA e Hi-roshige TSUZUKI, residentes no Japão), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE GLUCAGONA».

Descrição

ENQUADRAMENTO GERAL DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um processo eficiente para a preparação de glucagona por preparação de uma proteína de fusão de glucagona seguida por tratamento enzimático e recuperação de glucagona, uma sequência de ADN que codifica a glucagona usada no referido processo de preparação, um vector de expressão que compreende a mencionada sequência de ADN e um transformante que transporta este vector de expressão. 2. Descrição da Técnica Anterior A glucagona é um péptido hormonal segregado por células A das ilhotas de células pancreáticas de Langerhans e, juntamente com a insulina segregada pelas células B das ilhotas de células pancreáticas, desempenha um papel importante no metabolismo dos hidratos de carbono. A glucagona é também conhe-

cida como factor glicogenolítico hiperglicémico (HGF); enquanto que a insulina reforça o metabolismo da glucose diminui os níveis de glucose no sangue, a glucagona actua de maneira a libertar glucose para o sangue e, assim, eleva as concentrações de glucose no sangue.

Em virtude destas propriedades, a glucagona é útil nos ensaios da secreção da hormona do crescimento, diagnose de insulinoma, ensaio de armazenagem de glicogénio, tratamento de emergência de hipoglicemia,. pré-tratamento em exames radiográ-ficos e endoscópicos do canal digestivo e outras aplicações clínicas. A sequência de aminoácidos da glucagona é também já conhecida; a molécula é um péptido de cadeia única, que consiste em vinte e nove resíduos de aminoácidos que começam com his-tidina na extremidade de amino e terminam com treonina na extremidade de carboxilo (ver Figura 11).

As sequências de aminoácidos das glucagonas humana, porcina e bovina são idênticas e, portanto, a glucagona é industrialmente produzida por isolamento e purificação de pâncreas de gado bovino ou suíno. Encontram-se à venda no comércio produtos de glucagona preparados desta maneira.

Além disso, a sequência de ADN que codifica a glucagona foi elucidada por James W. White e Grady F. Saunders (Nucleic Acids Research, J_4, 4719 - 4730 (1986) (veja-se Figura 11). Por consequência, a atenção dirigiu-se no sentido da possibilidade da produção em massa económica da glucagona usando técnicas de ADN recombinante.

No entanto, como se mencionou acima, a glucagona é um péptido de cadeia curta constituído por vinte e nove resíduos de aminoácidos e, portanto, tem um peso molecular baixo. Quando essas proteínas de peso molecular baixo são directamente expressas em células hospedeiras por técnicas de ADN recombinante podem degradar-se por acção de enzimas proteolíticas (proteases presentes nas células hospedeiras. Assim, a expressão dessas proteínas de baixo peso molecular em combinação com outras pro- 2 ça*ei«££***;

teínas sob a forma de proteínas de fusão mais estáveis de tamanho apropriado é vantajosa. A proteína que se pretende obter pode então ser isolada por tratamento químico ou enzimático destas proteínas de fusão.

Por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente Japonesa Número 63-284196 refere um processo para a recuperação de proteínas pretendidas por tratamento químico de proteínas de fusão. No entanto, o tratamento químico é muitas vezes acompanhado por reacções secundárias indesejáveis. 0 exemplo de um processo para o isolamento de proteínas pretendidas por tratamento enzimático de proteínas de fusão é descrito na Publicação da Patente de Invenção Japonesa Número 62-246600. Esta publicação refere a recuperação de factor de crescimento epidérmico (EGF) por tratamento de uma proteína de fusão que contém EGF com uma protease específica de ácido glutâmico.

No entanto, sabe-se que a molécula de EGF contém quatro resíduos de ácido glutâmico e, portanto, a recuperação de EGF de forma completa usando esta enzima é difícil e o rendimento é pequeno. Até ao presente, não se conhecia qualquer processo eficiente de isolamento de glucagona a partir de proteínas de fusão por este tipo de tratamento enzimático.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 processo para a preparação de glucagona de acordo com a presente invenção, que evita os inconvenientes e as deficiências da técnica anterior acima referidos e muitos outros compreende as operações que consistem em: prepara-se uma proteína de fusão representada pela seguinte fórmula X-Glu-Glucagona (I) na qual X é uma sequência de sinal de setenta a cento e setenta aminoácidos, Glu é um resíduo de ácido glutâmico e Glucagona representa a sequência de aminoácidos da glucagona, e tratar-se a citada proteína de fusão com uma enzima - 3 - que hidrolisa especificamente as ligações de péptido nas extremidades de carboxilo dos resíduos de ácido glutâmico, tendo como resultado a clivagem da referida proteína de fusão.

Numa forma de realização preferida, a glucagona é recuperada por intermédio do seguinte modo operatório, que compreende as operações que consistem em: a) solubilizar-se a mencionada proteína de fusão com um agente desnaturante ou tensio-activo apropriado, b) diminuir-se a concentração do citado agente desnaturante ou tensio-activo, c) adicionar-se a enzima à mistura obtida na operação b), obtendo-se dessa forma uma mistura reaccional que contém o produto intermediário solúvel resultante da decomposição parcial da referida proteína de fusão, d) des-salinizar-se a mencionada mistura reaccional para se obter uma fracção que contém os citados produtos intermediários e a referida enzima e não contém nem o mencionado a-gente desnaturante nem o citado agente tensio-activo, e) permitir-se que a reacção prossiga por meio da enzima contida na referida fracção até libertar a glucagona, e f) isolar-se a glucagona libertada.

Um vector de expressão de acordo com a presente invenção possui uma sequência de ADN que codifica a proteína de fusão acima mencionada e expressa eficientemente a referida proteína de fusão em células hospedeiras de Escherichia coli.

Os transformantes de acordo com a presente invenção obtêm-se introduzindo o vector de expressão acima mencionado numa célula de E. coli.

Uma sequência de ADN de acordo com a presente invenção que codifica glucagona é representada pela seguinte fórmula 51-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAA TACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAG TGGCTGATGAACACC-3 ’ (III) - 4 - 1

venção tem um grau de pureza igual a 99$ ou superior, sendo a citada pureza determinada por cromatografia em fase líquida de elevado rendimento.

Assim, a invenção descrita na presente memória descritiva torna possível atingir os objectivos que consistem em 1) proporcionar-se um processo para a produção de glucagona no qual se prepara uma proteína de fusão contendo glucagona e a glucagona é recuperada por tratamento enzimático com elevada eficiência; 2) proporcionar-se um processo económico para a produção de glucagona que é idêntica à glucagona natural, pelo método acima referido, usando uma pequena quantidade de enzimas; 3) proporcionar-se um vector de expressão que possui uma sequência de ADN que codifica a acima mencionada proteína de fusão e permite a expressão eficiente de citada sequência de ADN em E, coli, assim como um transformante em que se introduz o referido vector de expressão; 4) proporcionar-se uma sequência de ADN que codifica glucagona, sendo a sequência de ADN constituída por codões que podem ser utilizados com elevada frequência em E. coli; e 5) proporcionar-se uma glucagona purificada com uma pureza de 99$ ou superior.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A presente invenção pode ser melhor compreendida e os seus numerosos objectivos e vantagens tornar-se evidentes aos peritos no assunto por referência aos desenhos anexos seguintes nos quais a Figura 1 representa a sequência de ADN que codifica glucagona humana; a Figura 2a é um diagrama esquemático que mostra a construção do plasmídio pGAl utilizado na construção do vector - 5 - £

de expressão Trp pAT huIFN^glucagona de acordo com a presente invenção; a Figura 2b é um diagrama esquemático que mostra a construção do plasmídio Trp pAT huIFN^/kallikrein utilizado na construção do vector de expressão Trp pAT huIFN^f/ glucagona de acordo com a presente invenção; a Figura 2c é um diagrama esquemático que mostra a construção do vector de expressão Trp pAT huIFN^glucagona de acordo com a presente invenção; a Figura 3 representa a sequência de base do ADN que codifica glucagona contida no vector de expressão Trp pAT huIFN#7glucagona, assim como as regiões adjacentes dos lados de montante e de jusante do ADN; a Figura Ha é um diagrama esquemático que representa a construção do plasmídio Trp pAT Cys huIFN^, utilizado na construção do vector de expressão Trp pAT Δ Cys huIFN^/glucagona de acordo com a presente invenção; a Figura Hb é um diagrama esquemático que mostra a construção do vector de expressão Trp pAT ^\Cys huIFN^/glucago-na de acordo com a presente invenção; a Figura 5 é um diagrama esquemático que mostra a construção do vector de expressão Trp pAT Δ Cys curto huIFNJV glucagona de acordo com a presente invenção; a Figura 6 é um diagrama esquemático que representa a construção do vector de expressão Trp pAT huIFN«<80A2/glucagona de acordo com a presente invenção; a Figura 7a é um diagrama esquemático que representa a síntese pelo método de PCR do fragmento de ADN que contém a sequência de bases que codifica IFNoC80A2 humana; a Figura 7b é um diagrama esquemático que mostra a amplificação pelo método de PCR da sequência de genes que codifica glucagona, assim como os segmentos de ADN a montante e a jusante na construção do vector de expressão Trp pAT ACysII huIFN^/glucagona de acordo com a presente invenção; - 6 -

a Figura 7c é um diagrama esquemático que mostra a construção do vector de expressão Trp pAT CysII huIFN /gluca-gona de acordo com a presente invenção; a Figura 8 representa a sequência de ADN de IFN 80A2 humana e a correspondente sequência de aminoácidos; as Figuras 9a e 9b são diagramas que mostram os resultados da HPCL em fase inversa e a análise de HPCL em permuta de iSes da glucagona obtida pela técnica de ADN recombinante de acordo com a presente invenção; as Figuras 10a e 10b são diagramas que mostram os resultados da HPCL em fase inversa da glucagona obtida usando as técnicas de ADN recombinante pelo processo de acordo com a presente invenção; a Figura 10c representa um diagrama que mostra o resultado da HPCL em fase inversa da glucagona natural comercialmente disponível; e a Figura 11 representa a sequência de aminoácidos de glucagona humana e a sequência de ADN humano que codifica a referida glucagona.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Na proteína de fusão X-Glu-Glucagona, preparada de a-cordo com o processo da presente invenção, escolhe-se uma sequência de aminoácidos que origine um elevado nível de expressão como sequência de sinal designada por X. A escolha da sequência de sinal X deve ser de tal maneira que, quando se introduz a sequência que codifica X em L coli, hospedeiro apropriado, para induzir a expressão, a citada proteína de fusão constitua 20# ou mais da proteína preparada e, além disso, de tal maneira que a referida proteína de fusão forme grânulos (isto é, corpos de inclusão) na célula hospedeira. 0 peso molecular apropriado de X de 10 - 20 quilodal-ton (correspondendo a 70 - 170 aminoácidos). As escolhas espe-. cificas apropriadas para X incluem, por exemplo, interferão-ga- - 7 - '1

ma, delta-Cys-interferão-gama, interferão-alfa 80A2, interferão·· -beta, interferão-sigma, interleucina-1 beta, hormona de crescimento bovina, beta-galactosids.se, interleucina-8 humana, pi-ruvato quinase I de L coli, aminoglicosidase 3’-fosfo-trans-ferase (APH) e várias sequências que contêm extremidades amino destes polipéptidos , etc. São particularmente apropriadas as sequências que contêm um segmento de noventa a cento e quarenta aminoácidos da extremidade aminada do interferão-gama, delta-Cys-interferão--gama e interferão-alfa 80A2,

Um vector de expressão que possui uma sequência de ADN que codifica um polipéptido de uma forma tal que as sequências acima mencionadas sejam ligadas com glucagona é construído e coli é transformado com este vector de expressão, permitindo dessa forma a expressão com elevada eficiência do mencionado polipéptido sob a forma de grânulos de proteína de fusão estáveis.

Seguidamente, o processo de preparação da glucagona de acordo com a presente invenção é descrito de acordo com a ordem do processo de preparação. As técnicas de ADN recombinan-te empregadas neste processo podem ser realizadas, por exemplo, por meio das maneiras de proceder descritas em "Molecular Cio-' ning" (Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, 1982).

Concepção e Síntese Química das Sequências de ADN que Codificam Glucagona

As sequências de aminoácidos de glucagonas humana, porcina e bovina são idênticas, sendo representadas pela seguinte fórmula:

His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr

Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin

Asp Phe Vai Gin Trp Leu Met Asn Thr (II) A sequência de ADN que codifica glucagona humana foi, - 8 -

por exemplo, elucidada por James ¥. White e Grady F. Saunders (supra). A sequência de aminoácidos de glucagona humana e a sequência de ADN humano que codifica a citada glucagona estão representadas na Figura 11. Embora esta sequência de ADN possa ser usada na presente invenção, a utilização de sequência de ADN que preferivelmente empregam codões que são utilizados com elevada frequência em ooli é particularmente vantajosa. Por consequência, os inventores conceberam e sintetizaram uma sequência de ADN que contém, o mais possível, codões utilizados com elevada frequência em E_j_ coli. Esta sequência de ADN é representada na Figura 1. A sequência de ADN que codifica glucagona I comparativamente curta e pode obter-se, consequentemente, por exemplo, por síntese química. Este ADN sintético pode preparar-se, por exemplo, sintetizando em primeiro lugar os quinze fragmentos indicados na Figura 1 (Fr 1 - 15) com um sintetizador automático de ácidos nucleicos, purificando estes fragmentos por croma-tografia, tal como cromatografia em fase líquida de alto rendimento (HPLC), tratando cada fragmento com quinase e ligando os fragmentos com ADN ligase, por processos convencionais. 0 ADN obtido por ligação dos referidos fragmentos é em seguida isolado por processos convencionais, tais como extracção com fenol, precipitação com etanol, electroforese em gel de agarose, etc. Os fragmentos de ADN podem ser recuperados a partir do gel de agarose por eluição, de acordo com a maneira de proceder descrita em Nucleic Acids Pies., 8, 253 - 264 (1980).

Então, constroem-se plasmídios recombinantes (isto é, vectores de expressão), utilizando estas sequências de ADN que codificam glucagona.

Construção de Vectores de Expressão A construção dos vectores de expressão de acordo com a presente invenção, isto é, (a) Trp pAT huIFN^f/glucagona; (b) Trp pAT Acys huIFN<$7glucagona; (c) Trp pAT Acvs curto huIFN£7 . glucagona; (d) Trp pAT huIFN o^80A2/glucagona e (e) Trp pAT [ Z^CysII huIFNà7glucagona será descrita em seguida. - 9 -

a) Construção de Trp pAT huIFNffiglucagona . Como se representa na Figura 2c, o vector de expressão Trp pAT huIFN^f/glucagona de acordo com a presente invenção é construído usando os seguintes três componentes: 1) um fragmento de dezanove pb que contém uma sequência de base que codifica a metade anterior da sequência de aminoáci-dos de glucagona; 2) um fragmento que contém uma sequência de base que codifica a metade posterior da sequência de aminoácidos da glucagona; e 3) o vector Trp pAT huIFN^/kallikrein. A estrutura do fragmento de ADN (1) é representada pela seguinte fórmula: 12 3 4

GluHisSerGlnGly(Thr)

GCGAACACTCTCAGGGTAC

ACGTCGCTTGTGAGAGTCC

PstI ΚρηΙ (IV)

Este fragmento é constituído por uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos da extremidade N da glucagona, compreendendo histidina (His), serina (Ser), gluta-mina (Gin), glicina (Gly) e mais uma porção de treonina (Thr) na extremidade 5’ da qual está ligado o ácido glutâmico (Glu) do codão GAA. Também, o fragmento tem um sítio de clivagem para PstI na extremidade 5' e que tem um sítio de clivagem para Knpl na extremidade 3’. Este fragmento é obtido sintetizando quimicamente e em seguida analizando os dois tipos de oligonucleóti-dos de dezanove bases de cadeia única que constituem o fragmento . 0 fragmento (2) é obtido por clivagem com enzima de restrição do vector de clonagem pGAl construído a partir de ptac12 (Amman e col., Gene 2j5, 167, 1983), como protótipo, de acordo com a maneira representada na Figura 2a. 10

Especificamente, constrói-se o pGAl a partir de ptac-12, por meio da seguinte maneira de proceder.

Em primeiro lugar, insere-se o ligador sintético (V) representado pela seguinte fórmula, no sítio de clivagem PvuII em ptac12.

5'- CTGAâGCTTGGATCC -3T 3' -gacttcgaJacctagg -5' (V)

HindIII 0 plasmídio assim obtido (isto é, ptac12/SL1); que possui um sítio de clivagem de HindIII a jusante do sítio de clivagem PvuII) é em seguida clivado com PvuII e com HindIII e depois insere-se o gene sintético com aproximadamente cem pb representado na Figura 1. Então, como se mostra na Figura 2c, o plasmídio pGAl, obtido desta maneira, é clivado com HindIII, as extremidades são insensibilizadas por tratamento com fragmento de Klenow e o fragmento de ADN assim obtido é então clivado com Kpnl, obtendo-se como resultado um fragmento de 90 pb Kpn--HindlII/Klenow. 0 vector Trp pAT huIFN^/kallikrein (3) é obtido procedendo da seguinte forma.

Em primeiro lugar, como se representa na Figura 2b, trata-se o plasmídio de expressão para PSTI fundido com inter-ferão-gama humano (isto é, Trp pAT huIFNfc?PSTI, J. Biochem. 102 607 - 612, 1987) com Sall e BAP e recupera-se o maior dos dois fragmentos resultantes (isto é, o fragmento Sall-Sall).

Separadamente, digere-se o plasmídio Trp pAT huIFNâf com Sall e XbaI, obtendo-se desta forma um fragmento Sall-Xbal. Em seguida, sintetiza-se o seguinte adaptador de oligonucleóti-dos VI (contendo uma sequência de ADN que codifica 0 sítio de reconhecimento (Phe-Arg) do plasma humano kallikrein).

Sall Asp Pro Phe Arg PstI Xbal | TC GAC CCG TTT CGC TGC a|}T

Jg ggc aaa gcgJacg TCa GATC I (VI) 11 £

0 fragmento Sall-Sall acima mencionado, o fragmento Sall-Xbal e o adaptador sintético de oligonucleótidos VI são então ligados com T4 ADN ligase para se obter o vector do plas-mídio Trp pAT huIFNftVKallikrein. Este vector Trp pAT huIFN^? Kallikrein possui uma sequência que codifica o segmento de in-terferão-gama humano até ao resíduo de serina na posição 135 sob o controlo de promotor de triptofano, seguido da sequência representada na parte inferior da Figura 2b, na área de jusante. 0 vector Trp pAT huIFN^/Kallikrein (3) acima mencionado é tratado com Xbal, fragmento de Klenow e PstI e o maior dos fragmentos assim obtidos é ligado aos fragmentos antes mencionados (1) e (2), usando T4 ADN ligase, de acordo com a maneira de proceder convençrional, obtendo-se dessa forma o vector de expressão Trp pAT huIFN$7glucagona (Figura 2c). As sequências de bases adjacentes às extremidades 5’ e 3* do ADN que codifica glucagona neste vector de expressão estão répresentadas na Figura 3· b) Construção de Trp pAT .Acys huIFNfl7Glucagona

Como se representa na Figura 4b, o vector de expressão Trp pAT Δ Cys huIFN#?glucagona de acordo com a presente invenção é construído usando os seguintes três componentes: 1) um fragmento que contém uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos do terminal N (metade anterior) de i^Cys huIFN^ ; 2) um fragmento que contém uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos da extremidade C (metade posterior) de /\Cys huIFNff e uma sequência que codifica glucagona; e 3) um vector Trp pAT.

Como se mostra na Figura 4b, obtém-se o fragmento de ADN (1) a partir do plasmídio de expressão huIFN^Trp pAT ^Cys huIFN^ (veja-se Figura 4a), construído a partir de Trp pAT huIFN^fcomo protótipo (Kiso Rinsho, Vol. 20, páginas 4029 -4034 • (1986), Japão). A construção de Trp pAT Z\Cys huIFN^Ta partir 12 de Trp pAT huIFN^, realizar-se da seguinte maneira.

Em primeiro lugar, digere-se Trp pAT huIFN^fcom Ciai, Avall e Sphl, obtendo-se assim um fragmento Clal-Sphl e um fragmento Avall-Sphl. Em seguida, sintetiza-se o seguinte oligonu-cleótido (VII):

MetGln(Asp) 5 1-CGATACTATGCAG -3' 3'- TATGATACGTCCTG -5'

Ciai Avall (VII)

Este adaptador de oligonucleótido sintético (VII) codifica a primeira parte de ^Cys huIFN^f , que começa a partir dos resíduos de glutamina (Gin) e de ácido aspártico (Asp) na extremidade amino de ACys huIFN^f. Obtém-se o oligonucleótido (VII) sintetizando os dois oligonucleótidos de cadeia única indicados, com os comprimentos respectivos de 13 e 14 bases e a-nalizando os dois referidos oligonucleótidos de cadeia simples.

Constrói-se então o vector de plasmídio Trp pAT huIFNjjf ligando o fragmento Clal-Sphl acima mencionado, o fragmento Avall-Sphl e o adaptador sintético (VII) com T4 ADN liga-se. Em seguida, digere-se este vector Trp pAT Cys huIFN com as enzimas de restrição Ciai e AsuII, obtendo-se desta forma um fragmento de 275 pb. Este fragmento Clal-AsuII codifica a parte do interferão-gama humano a partir do resíduo de glutamina na 4i posição até um ponto que corresponde ao sítio de clivagem AsuII na sequência de bases. 0 fragmento de ADN (2) é o mais pequeno dos fragmentos que resultam da clivagem com AsuII e Sphl do vector de expressão Trp pAT huIFNftVglucagona (Figura 2c), obtidos na alínea a). Este fragmento de AsuII-Sphl contém uma sequência de base que codifica a metade posterior da sequência de aminoácidos do interferão-gama humano, começando a partir do ponto que corresponde ao sítio de clivagem AsuII dentro da sequência de bases que codifica interferão-gama humano e também, a jusante deste, uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos - 13 -

da glucagona. 0 fragmento de ADN (3) é o maior dos fragmentos que resultam da clivagem com Ciai e Sphl do plasmídio de expressão Trp pAT huIFN$/glueagona antes mencionado, representado na Figura 4b, Este fragmento Clal-Sphl contém a sequência de bases do promotor de triptofano.

Obtém-se o vector de expressão Trp pAT Acys huIFNtf'/ glucagona ligando o fragmento Clal-AsuII acima mencionado (1), o fragmento AsuII-Sphl (2) e o fragmento Clal-Sphl (3), de maneira convencional, utilizando T4 ADN ligase (veja-se Figura 4b).

Este vector Trp pAT ZiCys huIFN&Vglucagona possui uma sequência que codifica o segmento do interferão-gama humano a partir do resíduo de Gin na 4^ posição em relação ao resíduo Ser na posição 135 sob o controlo do promotor de triptofano, seguido da sequência representada na parte inferior da Figura 4b, na área a jusante. As sequências de base adjacentes às extremidades 5' e 3’ do ADN que codifica glucagona neste vector de expressão são as mesmas que em Trp pAT huIFN$7glucagona, que são representados na Figura 3· c) Construção de Trp pAT /Vcvs curto huIFN^glucagona

Como se mostra na Figura 5, o vector de expressão Trp pAT Z\Cys curto huIFN^?glucagona de acordo com a presente invenção é construído a partir do vector de expressão Trp pAT ^Cys huIFN^Vglucagona obtido na alínea b) (Figura 4b).

Especificamente, Trp pAT Δcys curto huIFNflf/glucagona é obtido por meio da seguinte maneira de proceder.

Em primeiro lugar, cliva-se o vector Trp pAT Δcys huIFN^f/glucagona com as enzimas de restrição AsuII e PstI e insensibiliza-se com fragmento de Klenow. 0 maior dos fragmentos assim obtidos (AsuII/Klenow-PstI/Klenow) é então ligado de a-cordo com a maneira de proceder convencional com T4 ADN ligase, obtendo-se assim o vector Trp pAT Z^Cys curto huIFNfl?glucagona. - 14 -

Este vector Trp pAT Z^Cys curto huIFN^glucagona possui uma sequência de genes que codifica o segmento do interfe-rão-gama humano do resíduo de glutamina na quarta posição em relação ao resíduo de fenil-alanina (Phe) na posição 95 do in-terferão-gama humano sob o controlo do promotor de triptofano e no lado de jusante a seguir a uma sequência interposta que codifica resíduos de glicina e de ácido glutâmico, contêm uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos de glucagona. A sequência de base adjacente à extremidade 5’ do ADN que codifica glucagona neste vector de expressão é representada na parte direita inferior de Figura 5. d) Construção de Trp pAT huIFN<X«80A2/glucagona

Como se representa na Figura 6, constrói-se o vector de expressão Trp pAT huIFN©<80A2/glucagona da presente invenção usando os seguintes três componentes: 1) um fragmento que contém uma sequência de bases que codifica huIFNOC80A2; 2) um fragmento que contém uma sequência de bases que codifica glucagona? e / 3) um vector Trp pAT.

Como se representa na Figura 7a, o fragmento de ADN (1) é obtido pelo método da reacção de cadeia de polimerase (PRC) (Saiki e col., Science, 239, página 487, 1988), com Trp pBR huIFNC(80A2 (Publicação da Patente de Invenção Japonesa Número 61-56199) como modelo. Para esta finalidade, em primeiro lugar, sintetizam-se quimicamente dois oligonucleótidos de cadeia única, isto é, o primário sensor de vinte nucleótidos (VIII) e o primário de vinte e cinco nucleótidos anti-sensor (IX) , representados pelas seguintes fórmulas:

Sensor primário: 5’-AGTTAACTAGTACGCAAGTT-3’ (VIII)

Anti-sensor primário: 5’-CAACCCTGCAGGCACAAGGGCTGTA-3' (IX) 15

Como se representa na Figura 7a, o primário sensor (VIII) corresponde à parte posterior do promotor triptofano, enquanto que o primário anti-sensor (IX) corresponde à parte posterior de huIFN 80A2. Usando estes primários, obtém-se um fragmento de ADN que contém uma sequência que codifica hUIFNoí-80A2 por amplificação do fragmento com Taq polimerase. Esta sequência de ADN é clivada com Ciai e PstI, obtendo-se assim um fragmento Clal-PstI. Este fragmento Clal-PstI contém sequência genética que codifica IFN©4.80A2 humano até ao resíduo de alani-na na posição 140. 0 fragmento de ADN (2) é o fragmento menor resultante da clivagem do plasmídio de expressão Trp pAT huIFN^glucagona (Figura 2c), obtido na alínea a) acima referida, com PstI e BamHI, como se mostra na Figura 6. Este fragmento PstI-BamHI possui uma sequência de bases de ADN que codifica cisteína, se-rina e ácido glutâmico, assim como uma sequência de ADN que codifica glucagona. 0 fragmento de ADN (3) é o maior dos fragmentos que resultam da clivagem do plasmídio de expressão Trp pAT huIFN^ glucagona (Figura 2c), obtido na alínea a) acima referida com Ciai e BamHI, como se mostra na Figura 6. Este fragmento de Clal-BamHI contém a sequência de bases do promotor de triptofano . 0 vector de expressão Trp pAT huIFN O(80A2/glucagona é obtido ligando o fragmento de Clal-PstI acima mencionado (1), o fragmento de PstI-BamHI (2) e o fragmento de Clal-BamHI (3) da maneira convencional, usando T4 ADN ligase (Figura 6). Este vector Trp pAT huIFNo^80A2/glucagona possui uma sequência de genes que codifica o segmento de IFNpC80A2 humano até ao resíduo de alanina (Ala) na posição 140 sob o controlo do promotor de triptofano, sendo esta sequência unida no lado de jusante pela sequência indicada na parte direita inferior da Figura 6. A sequência completa de huIFNo<80A2 é representada na Figura 8. e) Construção de Trp pAT ACysII huIFNdf/glucagona 16

Como se mostra na Figura 7c, o veotor de expressão Trp pAT Z^CysII huIFN^glucagona de acordo com a presente invenção é formado pelo vector de e pressão Trp pAT ZlCys huIFN$7 glucagona, descrito na alínea anterior b). Quer dizer, obtém-se o referido vector transformando a sequência de bases CTGCAG, que constitui o único sítio de clivagem PstI neste plasmídio, em CTCGAG pelo método PCR (supra), usando um oligonucleótido que contém uma incompatibilidade. Especificamente, o fragmento de ADN (1) que codifica glucagona e as sequências adjacentes e o fragmento maior (2) do vector Trp pAT /Vcvs huIFN^ (ambos a serem descritos mais adiante) são ligados com T4 ADN ligase para se obter Trp pAT ZlCysII huIFN^/glucagona.

Em primeiro lugar, sintetizam-se dois oligonucleóti-dos de cadeia única, isto é, o primário sensor de vinte e um nucleótidos (X) e o primário anti-sensor de vinte e um nucleó-tidos (XI), representados pelas seguintes fórmulas:

Primário sensor: 5'-CCGTTTCGCTCGAGCGAACAC-3’ (X)

Primário anti-sensor: 5’-AGCTCTAGAGCTTTTATTAGG-31 (XI)

Como se mostra na Figura 7b, o primário sensor (X) corresponde a uma sequência na junção de huIFN^f e glucagona, enquanto que o primário anti-sensor (XI) corresponde a uma sequência a partir da região da extremidade de carboxilo da glucagona e que inclui uma parte da região a jusante.

Obtém-se um fragmento de ADN (1) que codifica glucagona e as sequências adjacentes procedendo de acordo com a seguinte maneira.

Utilizando os dois primários acima mencionados, am-plifica-se um fragmento de ADN que codifica glucagona e as sequências adjacentes pelo método de PCR acima mencionado com Trp pAT Z^Cys huIFN^f/glucagona como modelo. Como o primário sensor • (X) contém uma incompatibilidade, a sequência de base dos frag- 17 -

mentos de ADN amplificados difere em parte da sequência do vec-tor modelo. Assim, o sítio de clivagem PstI (CTGCAG), que está presente na sequência de bases que codifica a região adjacente ao interferão-gama e glucagona é transformado no sítio de clivagem Xhol (CTCGAG) na sequência de ADN amplificada. Como resultado, o codão de cisteína TGC é transformado em TCG, que codifica o resíduo de serina. Os fragmentos de ADN amplificados são clivados com Xhol e as extremidades clivadas são insensibilizadas com fragmento de Klenow. Em seguida, este é clivado com Xbal, obtendo-se dessa forma o fragmento de ADN (1).

Como se representa na Figura 7c, o fragmento maior (2) do vector Trp pAT /^Cys huIFN^ é obtido por clivagem do vector Trp pAT ACvs huIFN&Vglucagona com PstI, seguida pelo tratamento com fragmento de Klenow. Esta sequência é em seguida clivada com Xbal e o maior dos fragmentos resultantes é o fragmento pretendido (2). 0 vector de expressão Trp pAT AcysII huIFNjf/glucago-na é então obtido ligando o fragmento Xho/Klenow acima mencionado (1) e o fragmento Pstl/Klenow (2) com T4 ADN ligase, procedendo de maneira convencional.

Este vector Trp pAT AcysII huIFN^f/glucagona possui uma sequência de genes que codifica o segmento do interferão--gama humano a partir do resíduo de glutamina na 4^ posição até ao resíduo de serina na posição 135 sob o controlo do promotor de triptofano, sendo esta sequência unida no lado de jusante pela sequência representada na parte direita inferior da Figura 7c.

Transformação de Células Hospedeiras e Expressão

Os plasmídios de expressão acima mencionados, isto é, a) Trp pAT huIFN^glucagona, b) Trp pAT ACys huIFN$?glucagona c) Trp pAT Δcys curto huIFNtf/glucagona, d) Trp pAT huIFNfe<80A2 /glucagona e e) Trp pAT AcysII huIFN$7glucagona são introduzidos em células hospedeiras apropriadas, de acordo com os mé-• todos descritos em "Molecular Cloning" (supra). Os transforman- 18 -

tes são escolhidos pela resistência a tetraciclina.

Os transformantes obtidos por introdução dos plasmí-dios de expressão acima mencionados a) , b), c) e e) originam uma proteína de fusão que contém glucagona humana e um interfe-rão-gama humano ou um dos seus análogos. 0 transformante obtido por introdução do plasmídio de expressão acima mencionado d) origina uma proteína de expressão que contém glucagona humana e IFNo<80A2.

Os organismos hospedeiros aplicáveis incluem as estirpes C600, JM103, AG-1, etc. de E: coli K12 a estirpe K12 C600 é especialmente apropriada e a utilização desta estirpe permite a produção particularmente eficiente de proteínas de fusão contendo glucagona humana.

Um transformante obtido por introdução do vector de expressão acima mencionado Trp pAT huIFN^glucagona em Ej_ coli K12 estirpe C600 foi designado Trp pAT huIFN$?glucagona fundida /C600 e depositado na Fermentation Research Institute Agency for Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, em 20 de Janeiro de 1989, sob o número de acesso FERM BP-2250, de acordo com o Tratado de Budapeste.

Depois de se cultivarem os transformantes de acordo com a presente invenção e da recolha das células, a análise de manchamento de Western empregando electroforese em gel de poli-acrilamida SDS (SDS-PAGE) e os anticorpos policlonais de anti-glucagona confirmaram que a glucagona humana é efectivamente expressada nas células hospedeiras sob a forma de uma proteína de fusão. Isto á, o ensaio de SDS-PAGE revelou bandas aproxi-madamente a 21 quilodalton e aproximadamente a 14 quilodalton, que correspondem às proteínas de fusão com interferão-gama humano e interferão-alfa, respectivamente. A reacção imunológica destas proteínas de fusão não modificadas com anticorpos policlonais antiglucagona foi confirmada por análise de manchamento de Western. Utilizando o processo de acordo com a presente invenção, 1 litro da mistura 19 - ÇsasCSl'.AJ**<®

de· cultura em que os transformantes foram desenvolvidos originou aproximadamente 3,06 gramas, 2,43 gramas, 3,64 gramas, 0,24 grama e 2,45 gramas de proteína de fusão, quando se utilizaram os acima mencionados vectores de expressão a), b), c), d) e e) para transformar o hospedeiro.

Solubilizagão da Proteína de Fusão, Hidrólise por V8 Protease, Isolamento e Purificação da Glucagona A fim de recuperar glucagona a partir das proteínas de fusão acima mencionadas (X-Glu-Glucagona), como a proteína de fusão se acumula nas células hospedeiras sob a forma de proteína granular, esta proteína granular é primeiramente recuperada e solubilizada.

Para realizar isso, por exemplo, as células são primeiramente colectadas centrifugando a mistura da cultura de a-cordo com a maneira convencional, esmagando depois as células e peletizando-as. Estes peletes são solubilizandos por adição de um agente desnaturante ou tensio-activo.

Os agentes desnaturantes aplicáveis para esta finalidade incluem guanidina (cloreto de guanidina), ureia, etc. Este agente desnaturante é utilizado depois da adição de uma solução tampão numa quantidade suficiente para solubilizar os peletes. Podem utilizar-se soluções saturadas de guanidina ou de ureia mas, geralmente, preferem-se concentrações da ordem de grandeza de 6 a 8M. Tween 80 (marca registada) é um agente tensio-activo apropriado para a presente finalidade e deve normalmente ser utilizado em concentrações de 0,05 a 0,2$ em peso.

Tendo em consideração o processo seguinte de tratamento enzimático, o pH da solução tampão deve, preferivelmente, ser regulado na vizinhança do pH óptimo de enzima a ser utilizada no referido processo. Por exemplo, quando se utiliza protease V8 (Sigma Chemical Co., Número P-8400), derivada de Sta-phylococcus aureus, como enzima, então é desejável um pH igual a 7,8 e, portanto, uma solução tampão com forte capacidade de tamponização na vizinhaça de pH 7,8, por exemplo, um tampão de 20

Se a enzima a ser utilizada no tratamento enzimático contiver impurezas tais como enzimas neutras, etc, então pode também adicionar-se um inibidor de enzimas, tal como EDTA à citada solução tampão a fim de inibir a actividade das referidas impurezas. A mistura que contém material solubilizado obtida desta maneira contém agentes desnaturantes ou agentes tensio--activos numa concentração suficientemente elevada para impedir a acção da enzima a ser utilizada no tratamento enzimático seguinte. Nesses casos, a mistura deve normalmente ser diluída com um diluente apropriado, tal como a solução tampão acima mencionada sem agentes desnaturantes ou tensio-activos. 0 grau de diluição deve ser tal que o estado solubilizado da proteína se possa manter mas de tal maneira que as enzimas a serem utilizadas no tratamento enzimático abaixo descrito possam actuar com eficácia suficiente. Por exemplo, quando se utiliza guani-dina ou ureia como agente desnaturante, então a mistura deve ser diluída de tal maneira que a concentração do mencionado a-gente desnaturante seja 4 M ou menor e, preferivelmente, cerca de 2 M ou menor. No entanto, deve notar-se a concentração de proteína na mistura que contém material solubilizado deve ser 1-5 mg/ml e, mais preferivelmente, 2-3 mg/ml.

Em seguida, a glucagona é separada da proteína X por tratamento enzimático. A glucagona pretendida encontra-se presente sob a forma parcialmente desnaturada fundida com a proteína X por intermédio de um resíduo de ácido glutimico interposto. Como a glucagona em si própria não contém resíduos de á-cido glutâmico, a glucagona pode ser libertada da proteína de fuão sob a forma completa por tratamento com uma enzima que es-pecificamente cliva a ligação do péptido na extremidade de car-boxilo do resíduo de ácido glutâmico.

As enzimas apropriadas para esta finalidade incluem a protease V8 (Sigma Chemical Co., Número P-8400) , derivada de Staphylococcus aureus, mas esta escolha de maneira nenhuma é a • única escolha possível e, em princípio, qualquer enzima que es- 21

pecificamente clive o pepfcido na extremidade de carboxilo do resíduo de ácido glutâmico pode ser empregada para a presente finalidade. Por exemplo, a ptotease V8 derivada de Staphylococ-cus aureus, ATCC Número 12600, pode ser preferivelmente utilizada. A quantidade de enzima utilizada I de 1/50 a 1/1,000 (peso/peso), preferivelmente cerca de 1/500 (peso/peso), em relação à quantidade total de proteína existente na preparação de células diluídas acima mencionada. A mistura reaccional obtida adicionando esta enzima à preparação de células diluída acima mencionada desta maneira é feita reagir enquanto se agita suavemente a mistura a uma temperatura compreendida entre a temperatura ambiente e 40°C, durante um intervalo de tempo de trinta minutos a sete horas. 0 tempo de reacção varia de acordo com a quantidade de enzima adicionada. Por exemplo, se a enzima tiver sido adicionada numa proporção de, aproximadamente, 1/500 (peso /peso), então é desejável um tempo de reacção de cerca de quatro horas. A reacção enzimática é terminada por adição de um á-cido, tal como ácido clorídrico, ácido acético, etc., preferivelmente diminuido o pH para cerca de 3· A mistura reaccional enzimática assim obtida contém o produto final, glucagona, e produtos intermediários de menor peso molecular do que o da proteína de fusão X-Glu-Glucagona. Estes produtos intermediários resultam, presumivelmente, da clivagem de resíduos de ácido glutâmico dentro da proteína X. Estes produtos intermediários também permanecem solúveis mesmo se os agentes desnaturantes e tensio-activos contidos na mistura foram eliminados.

Os seguintes factores, por exemplo, podem possivelmente contribuir para a formação destes produtos intermediários: i) uma desnaturação transiente da enzima contida na mistura reaccional acima citada por acção do agente desnaturante ou tensio-activo, tendo como resultado a pronunciada redução da actividade enzimática; 22 ii) inibição da acção enzimática pelos produtos de decomposição de baixo peso molecular produzidos por clivagem dos resíduos de ácido glutâmico dentro da proteína X; ou iii) o sítio de clivagem pretendido no resíduo de ácido glutâmico pretendido na proteína de fusão torna-se menos sus-ceptível à acção enzimática por causa da dobragem ou de outras alterações da estrutura de ordem superior da proteína. 0 rendimento da glucagona pode ser aumentado por posterior tratamento e clivagem destes produtos intermediários. Um meio efectivo para facilitar isso inclui a eliminação da mistura de reacção enzimática dos agentes desnaturantes ou tensio--activos, assim como dos produtos de decomposição de baixo peso molecular formados por clivagem dos resíduos de ácidos glutâmico da proteína X. A eliminação destas substâncias pode conseguir-se de maneira eficaz por procedimentos de des-salinização, tal como filtração em gel, diálise, etc., sendo a filtração através de gel um método particularmente apropriado. A filtração através de gel deve realizar-se, preferivelmente, sob condições tais que, no processo de eliminação do agente desnaturante ou ten-sio-activo e dos produtos de decomposição de baixo peso molecular, a enzima e os produtos intermediários sejam eluídos na mesma fracçâo. As fracções que contém os produtos intermediários e a enzima obtidos por filtração através de gel são colecta-das e, ajustando o pH ao valor de pH óptimo da enzima, a enzima é desnaturada e feita sobre os produtos intermediários solubi-lizados. A glucagona é então libertada realizando uma reacção enzimática sob as mesmas condições que se mencionaram acima. A glucagona clivada desta maneira a partir da proteína de fusão é purificada por uma combinação apropriada de técnicas convencionais, por exemplo, vários formas de oromatogra-fia, tais como cromatografia com filtração através de gel, cro-matografia de afinidade, cromatografia de permuta de iões, cromatografia através de gel hidrofóbico ou processos de separação por centrifugação, etc. 23 -

0 processo para a recuperação da glucagona acima descrito necessita de uma quantidade de enzima relativamente pequena para clivar os resíduos de ácidos glutâmico e é económico por conseguinte.

Utilizando o processo de acordo com a presente invenção, 1 litro de meio de cultura em que se desenvolveram os transformantes originou aproximadamente 150 mg, 160 mg e 170 mg de glucagona purificada quando se utilizaram respectivamente os acima referidos vectores de expressão a), b) e e) para transformar o hospedeiro. Também se obteve glucagona purificada da mesma maneira a partir de proteína de fusão que foi expressa quando se utilizou tranformante que contém o vector de expressão c) ou d). 0 grau de pureza, a composição dos aminoácidos, a sequência de aminoácidos e a actividade biológica da glucagona purificada obtida de acordo com a maneira de proceder acima mencionada foram determinados e os resultados confirmaram que esta substância era realmente glucagona humana, não contendo impurezas e completamente idêntica à glucagona natural no que diz respeito à composição dos aminoácidos assim como à actividade biológica. A glucagona obtido pelo processo acima descrita pode ser utilizada, portanto, completamente da mesma maneira para finalidades tais como os ensaios de secreção da hormona do crescimento, diagnose de insulinoma, ensaio de armazenagem de glicogénio, tratamento de emergência de hipoglicemia, tratamento prévio para exame radiográfico e endoscópico do tubo digestivo e outras aplicações clínicas. A presente invenção não se limita aos processos de preparação de glucagona humana sob a forma de proteína de fusão. A presente invenção também inclui no seu âmbito os vectores para a expressão da citada proteína de fusão e transformantes obtidos por introdução desses vectores, assim como certas sequências de ADN que codificam a glucagona.

Assim, a presente invenção proporciona um processo, - 24

como se descreve acima, para obtenção de glucagona idêntica à glucagona natural a partir de proteínas de fusão da forma X--Glu-glucagona por um processo simples, eficientes e económico, utilizando apenas pequenas quantidades de enzimas. Esta glucagona é preparada por utilização de técnicas de ADN recombinante e pode, portanto, ser produzida em massa a baixo custo. Além disso, como a sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção do produto é completamente idêntico à da glucagona humana natural, a administração clínica não tem o risco de originar quaisquer reacções alérgicas e, por consequência, o produto pode ser utilizado inteiramente da mesma maneira que as preparações de glucagona até agora convencionalmente empregadas na prática clínica.

EXEMPLO

As experiências de recombinação genética abaixo descritas foram realizadas de acordo com os métodos indicados em "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbot Laboratory, 1982). Todas as enzimas empregadas foram adquiridas em Takara Shuzo Co.,

Ltd. A) Concepção e Síntese Química da Sequência de ADN que Codifica Glucagona A sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos de glucagona humana foi concebida usando, em princípio, os codões utilizados com maior frequência por coli. A sequência de ADN assim concebida, que codifica a sequência de aminoácidos a partir do resíduo inicial de histidina até ao resíduo de treonina na 29â posição está representada na Figurai.

Os quinze fragmentos de cadeia curta indicados na Figura 1 foram sintetizados quimicamente com um sintetizador de ácidos nucleicos automático. Estes fragmentos foram então ana-lizados, obtendo-se desta forma a sequência de ADN com a estrutura de cadela dupla representada na Figura 1. Esta sequência . de ADN possui um codão ATG que codifica metionina, assim como o - 25 -

sítio de clivagem Alui na extremidade 5' e dois codões de acabamento TAA e um sítio de clivagem HindIII na extremidade 3’· B) Construção do Vector de Expressão

Construiram-se cinco vectores de plasmídios capazes de experimirem glucagona humana em coli, isto é, a) Trp pAT huIFN^glucagona, b) Trp pAT Acys huIFN^glucagona, c) Trp pAT Acys curto huIFN^flucagona, d) Trp pAT huIFNoCgOA2/glucagona e e) Trp pAT ACysII huIFN^glucagona, utilizando a seguinte maneira de proceder. a) Construção de Trp pAT huIFN^Glucagona

Construíu-se este vector de expressão ligando os tris fragmentos de ADN obtidos nas alíneas 1), 2) e 3) abaixo referidas. A construção deste vector de expressão é esquematicamente representada nas Figuras 2a - 2c. 1) Preparou-se um fragmento de dezanove pb, PstI-Kpnl contendo a sequência de bases de acordo com a metade anterior da sequência de aminoácidos da glucagona. Esta sequência de bases foi construída adicionando o codão GAA para ácido glutâmi-co e um sítio de clivagem PstI à extremidade 5T da sequência de ADN que codifica a metade anterior da glucagona que consiste em histidina, serina, glutamina, glicina e uma porção de um codão de treonina e proporcionando um sítio de clivagem Knpl na extremidade 3’· Esta sequência de base é representada na fórmula (IV) do texto precendente.

Em seguida sintetizaram-se os dois oligonucleótidos de 19 resíduos que formam esta sequência de base quimicamente e analizaram-se, obtendo-se assim um fragmento de dezanove pb que contém uma sequência de bases que codifica a metade anterior da sequência de aminoácidos da glucagona, assim como o sítio de clivagem PstI no lado de montante e um sítio de clivagem Kpnl no lado de jusante. 2) Preparou-se um fragmento Kpnl-HindIII/Klenow de plasmídio pGAl procedendo da seguinte maneira. - 26

Como se representa na Figura 2a, construíu-se o vec-tor de clonagem pGAl usando o plasmídio ptac12 (supra) como protótipo, procedendo da seguinte maneira. Em primeiro lugar, inseriu-se o ligador sintético de 15 pb representado pela fórmula anteriormente referida (V) no sítio de clivagem PvuII de ptac12, construindo dessa forma um plasmídio (ptac12/SL1) com um sítio de clivagem HindIII a jusante em relação ao sítio de clivagem PvuII. Este plasmídio ptac12/SL1 foi clivado com PvuII e HindIII e inseriu-se o gene sintético com aproximadamente cem pb obtido na alínea precedente (A) isto é, a sequência de ADN representada na Figura 1), obtendo-se assim um plasmídio designado por pGAl.

Em seguida, como se representa na Figura 2c, digeriu--se o plasmídio pGAl com HindIII e tratou-se com fragmento de Klenow para insensibilizar as extremidades clivadas, depois do que se digeriu o plasmídio de corte com Kpnl e se recuperou o mais curto dos fragmentos assim obtidos, isto é, o fragmento de 90 pb de Kpnl-HindIII/Klenow. Como se representa na Figura 1, este fragmento Kpnl-HindIII/Klenow codifica a extremidade posterior da sequência de aminoácidos de glucagona, a partir do sítio de clivagem Kpnl numa posição intermédia na sequência de bases acima mencionada que codifica a sequência de aminoácidos da glucagona. 3) Preparou-se um fragmento Xbal-PstI do vector de plasmídio Trp pAT huIFN^Kallikrein procedendo da seguinte maneira .

Como se mostra na Figura 2b, digeriu-se o plasmídio de expressão para uma proteína de fusão formada por interferão--gama humano e PSTI (Trp pAT huIFN^PSTI, J. Biochem. 102, 607-- 612, 1987 (supra), com SalI, a 37°C durante uma hora, depois do que se tratou o produto com BAP a 37°C durante duas horas e se isolou 0 fragmento maior (fragmento Sall-Sall)♦

Numa operação separada, digeriu-se o plasmídio Trp pAT huIFN com Sall e Xbal e recuperou-se o fragmento mais pe-. queno Xbal-Sall. Em seguida, ligaram-se o fragmento acima men-| cionado Sall-Sall, 0 fragmento acima mencionado Xbal-Sal e o - 27 - (

adaptador do oligonucleótido sintético indicado pela fórmula (VI) no texto precendente (contendo uma sequência de ADN que codifica o sítio de reconhecimento (Phe-Arg) de plasma humano Kallikrein) com T4 ADN ligase. 0 vector de plasmídio obtido desta maneira foi designado como Trp pAT huIFNjf/Kallikrein. Este vector Trp pAT huIFN^f/Kallikrein contém uma sequência de genes que codifica o segmento do interferão-gama humano até ao resíduo de serina na posição 135 sob o controlo do promotor de triptofano, seguido no lado de jusante pela sequência representada na parte inferior da Figura 2b.

Depois da clivagem deste vector Trp pAT huIFN^Kalli-krein com Xbal, como se mostra na Figura 2c, as extremidades clivadas foram insensibilizadas com fragmento de Klenow. Em seguida, clivou-se este fragmento com PstI e isolou-se o maior dos fragmentos de ADN resultantes (fragmento Xbal-PstI, com 3,6 kbp).

Os fragmentos de ADN acima mencionados (1) - (3) (tendo cada um deles sido isolado por electroforese em gel de agarose de acordo com o método descrito em Nucleic Acids Res., 8, 253 - 264, 1980) foram ligados com T4 ADN ligase, como se mostra na Figura 2c, obtendo-se assim o vector de expressão que foi designado por Trp pAT huIFN^glucagona.

Em seguida, a sequência de base do fragmento de ADN que tinha sido introduzida no plasmídio de expressão foi examinada de acordo com o processo indicado em Proc. Natl. Acad.

Sei. U. S. A., 74.; 5464 - 5467, 1977, verificando-se desta forma que o referido fragmento de ADN codifica efectivamente de maneira correcta a sequência completa de vinte e nove aminoáci-dos da glucagona humana. b) Construção de Trp pAT Acys huIFN^glucagona

Construíu-se este vector de expressão ligando os três fragmentos de ADN obtidos como se indica nas alíneas 1) - 3) \ abaixo referidas. A construção deste vector de expressão é es- - 28 -

quemáticamente representada nas Figuras 4a e 4b. 1) Preparou-se um fragmento Clal-AsuII do plasmídio de expressão de interferão-gama humano Trp pAT Δϋγε huIFN^ procedendo da seguinte maneira.

Construíu-se o mencionado plasmídio Trp pAT /\Cvs huIFNjjf de expressão do interferão-gama humano com Trp pAT ACvs huIFN^f (supra) como protótipo, como se mostra na Figura 4a. Em primeiro lugar, digeriu-se Trp pAT huIFN^ com Çlal, Avall' e Sphl, obtendo-se assim um fragmento Clal-Sphl e um fragmento Avall-Sphl. Além disso, sintetizou-se o adaptador de oligonu-cleótido sintético acima mencionado (VII). Em seguida, ligou-se este fragmento Çlal-Sphl, o fragmento Avall-Sphl e o adaptador sintético (VII) com T4 ADN ligase. 0 plasmídio assim obtido foi designado como Trp pAT ^CYS huIFN^f .

Em seguida, como se mostra no lado direito na Figura 4B, digeriu-se este plasmídio Trp pAT ^Cys huIFNiâf com Çlal e AsuII, a 37°C durante uma hora e isolou-se um fragmento com 275 pb (fragmento Çlal-AsuII) a partir do produto. 2) Preparou-se um fragmento AsuII-Sphl do plasmídio de expressão Trp pAT huIFN^/glucagona obtido na alínea a) acima referida digerindo Trp pAT huIFN^f/glucagona com AsuII e Sphl, a 37°C durante uma hora e, em seguida, isolou-se o fragmento menor. 3) Além disso, preparou-se um fragmento Çlal-Sphl do plasmídio de expressão Trp pAT huIFN$?glucagona obtido na alínea a) acima referida por digestão de Trp pAT huIFN$/glucagona com Çlal e Sphl a 37°C durante uma hora e, em seguida, isolando o fragmento maior.

Ligaram-se os fragmentos de ADN acima mencionados (1) - (3) (tendo cada um sido isolado por electroforese em gel de agarose de acordo com o processo indicado em Nucleic Acids Res. , Ç, 253 - 264, 1980) com T4 ADN ligase, como se mostra na Figura 4b, obtendo-se assim um vector de expressão que foi designado como Trp pAT /\Cys huIFN^glucagona. Em seguida, examinou-se a [ sequência de bases do fragmento de ADN que foi introduzida nes- - 29 -

te plasmídio de expressão Trp pAT ^\Cys huIFN$?glucagona, de a-cordo com o processo indicado em Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 74, 5464 - 5467, 1977), verificando-se desta forma que o referido fragmento de ADN codifica na realidade correctamente a sequência completa de vinte e nove aminoácidos de glucagona humana . c) Construção de Trp pAT ACys curto huIFN?f/Glucagona

Construíu-se um vector de expressão procedendo de a-cordo com a maneira de proceder seguinte (a maneira de proceder para a construção deste vector de expressão está esquematicamente representada na Figura 5). 0 plasmídio de expressão Trp pAT Acvs huIFN^fgluca-gona obtido na alínea b) acima referida foi digerido com AsuII e PstI, a 37°C durante uma hora e as extremidades clivadas foram insensibilizadas por tratamento com fragmento de Klenow. Então, religou-se o maior dos fragmentos resultantes (AsuII/ Klenow-Pstl/Klenow) com T4 ADN ligase, obtendo-se assim um vector de expressão que foi designado como Trp pAT ACvs curto huIFN^/glucagona. Em seguida, examinou-se a sequência de bases do fragmento de ADN que foi introduzido neste plasmídio de expressão Trp pAT ^Cys curto huIFN^/glucagona, de acordo com o método indicado em Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 74., 5464 -- 5467, 1977), verificando-se dessa forma que o citado fragmento de ADN realmente codifica de maneira correcta a sequência completa de vinte e. nove aminoácidos da glucagona. d) Construção de Trp pAT huIFN c<80A2/glucagona

Construíu-se este vector de expressão ligando os três fragmentos de ADN obtidos como se indica nas alíneas (1) - (3), abaixo referidas. A construção deste vector de expressão está esquematicamente representada na Figura 6. 1) Preparou-se um fragmento de Clal-PstI contendo uma sequência de bases que codifica huIFNcs<80A2 procedendo de acordo com a seguinte maneira. - 30 -

Primeiramente, sintetizaram-se dois oligonucleótidos de cadeia única, isto é, um primário sensor.de vinte nucleóti-dos (fórmula (VIII) acima) que corresponde à última parte do promotor de Trp do plasmídio de expressão de IFNCK80A2 humano Trp pBR huIFNo(80A2 (supra) e um primário anti-sensor de vinte e cinco nucleótidos (fórmula (IX) acima) que codifica a última porção de huIFNO(80A2.

Usando estes primários e Taq polimerase, obteve-se um fragmento de ADN contendo uma sequência de bases que codifica huIFN 80A2 por amplificação do fragmento de acordo com o processo PCR (supra). Digeriu-se com Ciai e PstI este fragmento amplificado a 37°C durante uma hora e isolou-se o fragmento ClaE-PstI resultante. 2) Preparou-se um fragmento PstI-BamHI contendo uma sequência de bases que codifica glueagona digerindo o plasmídio de espressão Trp pAT huIFN^/glucagona obtido na alínea a) acima referida com PstI e BamHI a 37°C durante uma hora e isolando o fragmento menor (Figura 6). 3) Preparou-se igualmente um fragmento Clal-BamHI do plasmídio vector Trp pAT huIFN^glucagona digerindo o plasmídio de expressão Trp pAT huIFN^glucagona obtido na alínea a) acima referida com Ciai e BamHI, a 37°C durante uma hora e isolando o fragmento maior (Figura 6).

Os fragmentos de ADN acima mencionados (1) - (3) (tendo cada um sido isolado por electroforese em gel de agarose de acordo com o método indicado em Nucleic Acids Res., 8, 253 -- 264, 1980) foram ligados com T4 ADN ligase, como se mostra na Figura 6, obtendo-se assim um vector de expressão que foi designado como Trp pAT huIFN«<80A2/glueagona.

Em seguida, examinou-se a sequência de bases do fragmento de ADN que tinha sido introduzida neste plasmídio de expressão Trp pAT huIFN®C80A2/glucagona, de acordo com o método indicado em Proo. Natl. Acad. Sei. U. S. A., V\_, 5464 - 5467, verificando-se desta forma que o referido fragmento de ADN de • facto codifica de maneira correcta a sequência de vinte e nove - 31

aminoácidos de glueagona humana. e) Construção de Trp pAT /^CysII huIFN^Gluoagona

Derivou-se este vector de expressão a partir do plas-mídio Trp pAT ,Acys huIFN^ glueagona obtido na alínea b) acima referida. A construção do mencionado vector de expressão é esquematicamente representada na Figura 7c.

Em primeiro lugar, sintetizaram-se um primário sensor de vinte e um nucleótidos (fórmula (X) acima referida) e um primário anti-sensor de vinte e um nucleótidos (fórmula (XI) acima referida). Usando estes primários e Taq polimerase com Trp pAT Acvs huIFN^/glucagona como modelo, amplificou-se um fragmento de ADN com aproximadamente 130 pares de bases de a-cordo com o método PCR. Digeriu-se este fragmento de ADN amplificado com Xhol a 37°C durante uma hora, tratou-se com fragmen- o to de Klenow e em seguida digeriu-se com Xbal a 37 C durante uma hora, obtendo-se assim um fragmento de ADN (1) com aproximadamente 110 pb.

Em seguida, preparou-se um fragmento de ADN (2) a partir do vector Trp pAT /Xcys huIFN^glucagona digerindo o citado vector Trp pAT f\Cys huIFN^glucagona com PstI, a 37°C durante uma hora, seguido de tratamento com fragmento de Klenow, digerindo em seguida com Xbal a 37°C durante uma hora e recuperando o fragmento maior (2).

Construíu-se o vector de expressão Trp pAT /\CvsII huIFN|5?glucagona ligando os fragmentos de ADN assim obtidos com T4 ADN ligase. Em seguida, examinou-se a sequência de base do fragmento de ADN que foi introduzida no vector de expressão de acordo com o método indicado em Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 74, 5464 - 5467, 1977, verificando-se dessa forma que o referido fragmento de ADN codificava na realidade de maneira correcta a sequência inteira de 29 aminoácidos de glueagona humana. C) Transformação de Células Hospedeiras e Expressão de Genes - -1

Utilizando E_;_ ooli K12, estirpe C600 (F , thi , - 32 -

thr“1? leuB6, lacY1, tonA21, supE44) como células hospedeiras, efectuou-se a transformação com cada um dos plasmídios de expressão construídos segundo a maneira de proceder acima descrita, isto é, a) Trp pAT huIFN^f/glucagona, b) Trp pAT Acys huIFN^/glucagona, c) Trp pAT Δογε curto huIFN^glucagona, d) Trp pAT huIFN°(.80A2/glucagona e e) Trp pAT ^CysII huIFN^f/ glucagona.

Como os transformantes em que estes plasmídios de expressão foram introduzidos adquiriram todos resistência a te-traciclina, cultivaram-se as células durante a noite a 37°C num meio contendo tetraciclina (meio de placa LB contendo 15 micro-gramas/mililitro de tetraciclina) e seleccionaram-se as células que formaram colónias. Em seguida, cultivaram-se as células num meio M9 modificado, durante vinte e quatro horas a 37°C, depois do que se colectaram as células por centrifugação e se suspenderam numa solução tampão (0,1 M de Tris-HCl, 1$ de SDS, 20$ de sacarose e 1$ de beta-mercapto-etanol, pH = 6,8) apropriada para análise de gel SDS.

Submeteu-se esta suspensão a SDS-PAGE e examinou-se a preparação de uma proteína de fusão contendo glucagona manchando o gel com azul brilhante R de Coomassie, assim como por análise de manchamento de Western usando anticorpos policlonais antiglucagona. Os resultados mostraram que se obteve uma proteína granular de peso molecular aproximadamente igual a 21 qui-lodalton nos hospedeiros transformados com os plasmídios de expressão acima mencionados a), b), d) e e), enquanto os hospedeiros transformados com o plasmídio de expressão acima mencionado c) produziram uma proteína granular com aproximadamente 14 quilodalton e, além disso, as mencionadas proteínas de uma forma tal que sem modificação posterior reagiram com anticorpos antiglucagona. Assim, os resultados confirmaram que todos os transformantes produziram uma proteína de fusão contendo a glucagona pretendida. D) Solubilização da Proteína de Fusão, Hidrólise por Protease | V8; Isolamento e Purificação da Glucagona - 33 -

^\£viIÍl^KlS«6«Wtí4U»*^

Depois de se ter "cultivado as células hospedeiras transformadas com os vectores de expressão acima mencionados a), b), c), d) e e) em meio M9 modificado a 37°C durante vinte e quatro horas, colectaram-se as células por centrifugação e suspenderam-se em solução tampão A (8 g/1 de cloreto de sódio, 0,2 g/1 de cloreto de potássio, 2,9 g/1 de hidrogenofosfato de dissódio. 12H 0, 0,2 g/1 de di-hidrogenofosfato de potássio, 5 mM de EDTA, 10 mM de beta-mercapto-etanol e 10 mM de benzamidi-na, pH 6,65).

Depois de se agitar continuamente, centrifugou-se a suspensão e lavaram-se as células assim obtidas. Estas ressus-penderam-se em seguida na solução tampão A acima mencionada. Depois, adicionou-se lisózima de modo a atingir-se uma concentração final de 2 mg por grama de células (peso húmido) e deixou-se reagir a 35°C durante uma hora. Em seguida, submeteu-se a mistura reaccional à acção de ultra-sons e centrifugou-se e recuperou-se a fracção granular sob a forma de um precipitado peletizado. Finalmente, isolou-se a glucagona destas peletes de fracção granular por uma reacção enzimática num andar ou em dois andares, a ser descrita mais adiante nas alíneas (D—1) e (D-2) , respectivamente. (D-1) - Isolamento por Reacção Enzimática em um Andar

Suspenderam-se as peletes da fracção granular obtidas de células hospedeiras transformadas pelo vector de expressão acima mencionado (a) numa solução de tampão A (contendo clori-drato de guanidina 6 molar), sendo a quantidade da citada solução tampão 1/6 do volume inicial da cultura de células utilizada. Depois de se agitar cuidadosamente e de se submeter à acção de ultra-sons, deixou-se repousar a mistura à temperatura ambiente durante duas horas, para efectuar a solubilização. Em seguida, separou-se por centrifugação a fracção que não se solu-bilizou por esta maneira de proceder e, em seguida, dialisou-se o líquido sobrenadante durante a noite com solução de tampão B (50 mM de bicarbonato de amónio, 5 mM de EDTA, pH 7,8), contendo 2 M de cloridrato de guanidina. Misturou-se em seguida o - 34 _ 4

produto da diálise com uma quantidade igual de solução de tampão B de modo a alcançar uma concentração de cloridrato de gua-nidina igual a 1 M e designou-se a amostra resultante como (a). A análise pelo processo de SDS-PAGE da amostra (a) revelou que se produziu 1 grama (aproximadamente 50 micromoles) de interferão-gama humano por litro de caldo de cultura.

Adicionou-se protease V8 (Sigma Chemical Co., Numero P-8400), derivada de Staphylococcus aureus e que cliva especi-ficamente as ligações de péptidos de resíduos de ácido glutâmico, à amostra (a) na proporção de 1/10 (peso/peso), baseando-se a proporção na quantidade total de proteína presente nesta mis- o tura e deixou-se reagir a mistura a 37 C durante uma hora. Como a glucagona pretendida se funde o interferão-gama por intermédio de um resíduo de ácido glutâmico e como não se encontram presentes resíduos de ácido glutâmico dentro da molécula de glucagona, este tratamento com protease V8 permite realizar a separação da molécula completa de glucagona sob a forma completa e não modificada.

No entanto, a amostra (b) obtida desta maneira continha também uma mistura de péptidos de vários comprimentos resultantes da composição de glucagona e de interferão-gama humano. A fim de eliminar estes vários tamanhos de impurezas constituídas por péptidos, centrifugou-se a amostra (b), separou-se o precipitado e submeteu-se o sobrenadante a HPLC em fases inversa usando uma coluna C^g (4,6 milímetros de diâmetro interno x 250 milímetros). 0 eluente inicial utilizado foi um dissolvente constituído por 32$ de acetonitrilo-0,1$ de ácido triflú-or-acético misturados e a eluição realizou-se enquanto se aumentou a concentração de acetonitrilo de 0,5$ por minuto a partir de cinco minutos depois de se iniciar a eluição até se ter atingido uma concentração igual a 42$.

Os resultados obtidos estão representados na Figura 9a.

Analisou-se uma glucagona padrão por HPLC sob condi-. ções idênticas e detectou-se a sua presença numa posição cor-I respondente a um tempo de retenção de 19,7 minutos. Por conse- - 35 - f

quência, a fracção eluída na posição que corresponde a cerca de 20 minutos na Figura 9a foi colectada, depois do que se purificou esta fracção por HPLC com permuta de iSes.

Introduziu-se a fracção que contém glucagona numa coluna (7,5 mm de diâmetro interno x 75 mm) cheia com a resina de permuta de ides DEAE-5PW tamponizada com 10 mM de Tris-HCl (pH 8.5) contendo 20$ de acetonitrilo (solução tampão C). Em seguida, depois de se lavar com solução tampão C durante cinco minutos , o material foi eluído com solução de tampão C sob um gradiente de concentração linear de 0 - 0-1 M de cloreto de sódio (isto é, a concentração do cloreto de sódio aumentou de 0 até 0,1 M durante um período de trinta minutos, com um caudal de 1,0 ml/minuto). 0 resultado foi como se representa na Figura 9b.

Com base na posição eluída do padrão de glucagona, o principal componente do produto analisado (tempo de retenção = 19,3 minutos, amostra (b)) foi confirmado como sendo glucagona. A amostra (b) foi então submetida a análise da composição de aminoácidos por sequenciamento de aminoácidos pelos processos descritos mais adiante. Os resultados destas análises estão representados respeetivamente nas Tabelas 1 e 2.

Análise da Composição dos Aminoácidos 0 material a analisar foi des-salinizado por HPLC (coluna Aquapore RP-300, Brownlee) e hidrolisado com ácido me-tano-sulfónico 4M (contendo 0,2$ de 3-(2-amino-etil)-indol), a 110°C durante vinte e quatro horas. Determinou-se a composição de aminoácidos deste produto hidrolisado por meio de um analisador de aminoácidos Hitachi, modelo 835.

Sequenciamento de Aminoácidos

Depois da des-salinização por HPLC (coluna Aquapore RP-300, Brownlee), determinou-se a sequência dos aminoácidos do produto analisado usando um sequaenciador de proteínas Applied Biosystems 477A.

No processo de purificação acima referido, obtiveram- - 36 -

-se aproximadamente 33 mg (cerca de 10 mole) de glucagona purificada a partir de 1 grama (aproximadamente 50 moles) de proteína de fusão, isto é, aproximadamente 33 mg de glucagona purificada por litro de caldo de cultura. No entanto, o presente processo de purificação necessita uma grande quantidade de enzima para clivar a ligação do péptido do resíduo de ácido glu-tâmico. - 37 -

TABELA 1

Composigão dos Aminoácidos

Aminoácido Número de Determinado aminoácidos Calculado Asp 4,0 4 Thr 2,7 3 Ser 3,6 4 Glu 3,0 3 Gly 1,2 1 Ala 1,1 1 Vai 1,0 1 Met 1 ,0 1 Leu 2,2 2 Tyr 2,0 2 Phe IV) o 2 Lys 1,2 1 Hls 1,0 1 Arg 1,9 2 Trp 1,1 1 Total 29 38

..... TABELA V '

Análise da Sequência dos Aminoácidos

Operação de degradação Resíduo do aminoácido Recuperação (%) 1 His 9,6 2 Ser 77,9 3 Gin 27,5 4 Gly 29,6 5 Thr 52,2 6 Phe 28,2 7 Thr 47,4 8 Ser 58,6 9 Asp 19,6 10 Tyr 16,1 11 Ser 42,5 12 Lys 8,7 13 Tyr 14,0 14 Leu 12,0 15 Asp 11,3 16 Ser 25,4 17 Arg 9,9 18 Arg 7,8 19 Ala 7,7 20 Gin 7,9 21 Asp 6,3 22 Phe 3,2 23 Vai 2,9 24 Gin 6,6 25 Trp 1,0 26 Leu 1,8 27 Met 1,0 28 Asn 2,9 29 Thr 0,8 - 39 -

(D-2) - Isolamento por Reacção Enzimática em Dois Andares

Preparou-se glucagona por meio do processo seguinte, a partir de peletes de fracção granular obtidos a partir de E. coli transformado com cada um dos vectores de expressão antes mencionados a), b), c), d) e e).

Em primeiro lugar, dissolveu-se 1 grama de fracção granular peletizada em 35 ml de solução de tampão 1 (cloridrato de guanidina 8 M, 50 mM de bicarbonato de amónio, 5 mM de EDTA e 10 mM de DTT, pH 7,8). Em seguida, adicionaram-se 105 ml de solução tampão 2 que não contém cloridrato de guanidina (50 mM de bicarbonato de amónio, 5 mM de EDTA e 10 mM de DTT, pH 7,8), ajustando desta forma a concentração de cloridrato de guanidina da solução de modo a ser 2 M e a concentração de proteína de maneira a ser 2-3 mg/ml (medido com um Proteinassay Kit, BioRad Co.).

Em seguida, adicionou-se protease V8 (Sigma Chemical Co., Número P-8400), derivada de Staphylococcus aureus a esta solução numa quantidade igual a 1/500 (peso/peso) da proteína presente nesta mistura e efectuou-se a reacção a 25°C, enquanto se agitava suavemente a mistura. Depois de quatro horas, interrompeu-se a reacção por adição de ácido clorídrico, ajustando--se o pH da solução a 3,0.

Examinaram-se os produtos da reacção por amostragem da mistura tanto durante como depois de terminada a reacção en-zimática e submetendo as amostras a HPLC em fase inversa utilizando uma coluna Vydac Protein C^ (0,46 milímetros de diâmetro interno x 15,0 centímetros). 0 eluente inicial utilizado era constituído por uma mistura contendo 255¾ de acetonitrilo/0,1 % de ácido triflúor-acético como dissolvente e realizou-se a eluição aumentando linearmente a concentração de acetonitrilo até 35$ durante um período de vinte e cinco minutos começando a partir do início da eluição.

Os resultados destes ensaios mostraram que se formaram progressivamente produtos intermediários resultantes da decomposição parcial da proteína de fusão, assim como pequenas - 40 - quantidades de glucagona, à medida que a reacção prosseguia.

Por consequência, depois da reacção enzimática, separou-se a matéria insolúvel existente na mistura reaccional por centrifugação e des-salinizou-se o líquido sobrenadante por cromatografia por filtração de gel usando uma coluna Sephadex G—15 (5 cm de diâmetro interno x 30 cm, capacidade = 590 ml). 0 eluente utilizado foi tampão de solução de ácido acético 50 Mm (pH 3,3), contendo 5 mM de EDTA e recuperou-se a fracção de elevado peso mulecular contendo os produtos intermediários e protease V8. Ajustou-se esta fracção a pH 7,8 com hidróxido de , o amonio e realizou-se de novo uma reacção a 25 C enquanto se a- gitava suavemente a mistura. Assim, a protease V8 existente na mistura reaccional foi renaturada e actuou sobre os produtos intermediários e ao fim de aproximadamente cinco horas a glucagona estava completamente libertada dos referidos produtos intermediários .

Adicionou-se então ureia a esta mistura reaccional para alcançar uma concentração final de ureia igual a 6 M e, em seguida, ajustou-se o pH da mistura a 5,0 com ácido acético, trazendo o volume final para aproximadamente 200 ml. Em seguida submeteu-se a mistura a cromatografia com permuta de iões, u-sando uma coluna Sephadex (2,0 centímetros de diâmetro interno x 20,0 centímetros, capacidade 63 ml, tipo de caudal rápido) equilibrada previamente com solução de tampão 3 (6 M de solução de ureia ajustada a pH 5,0 com ácido acético). Separou-se a fracção não absorvida por lavagem da coluna sucessivamente com 120 ml de solução de tampão 3 e em seguida com 120 ml de solução tampão contendo 0,05 M de cloreto de sódio. Em seguida, re-alizou-se a eluição sob um gradiente linear de concentração de cloreto de sódio, aumentando a concentração de cloreto de sódio na solução tampão 3 de 0,05 até 0,15 M (utilizando um volume de eluente igual a duas vezes a capacidade da coluna) e eluiu--se a glucagona com tampão contendo aproximadamente 0,1 M de cloreto de sódio. A fracção de glucagona (aproximadamente 70 ml) foi rapidamente des-salinizada por cromatografia com filtração a- - 41

través de gel usando uma coluna Sephadex G—15 equilibrada com ácido acético 50 mM (5 cm de diâmetro interno x 30 cm, capacidade 590 ml). Neste andar, a pureza da glucagona era aproxima-damente igual a 97 - 98% e, por consequência, o produto foi purificado por fraccionamento com HPLC.

Introduziu-se a fracção contendo glucagona, obtida por filtração através de gel como se descreve acima numa coluna Vydac Protein (2,2 centímetros de diâmetro interno x 25 centímetros, enchimento 10 - 15 micrómetros com tamanho de poros de 300 angstrom), equilibrada com 25% de acetonitrilo/0,1 % de ácido triflúor-acético, em que a separação e a purificação da glucagona se efectuou por meio de um gradiente de concentração linear, subindo a concentração de acetonitrilo desde 25 a 30% durante um período de cento e vinte minutos, com um caudal de 4 ml/minuto. A glucagona foi eluída dessa forma a cerca de 90 minutos depois do começo do processo. 0 rendimento de glucagona purificada por grama de fracção granular peletizada obtida desta maneira foi aproxima-damente de 16,3 mg, aproximadamente 21,9 mg e aproximadamente 23,1 mg para coli tranformado com os vectores de expressão a), b) e e), respectivamente, enquanto os correspondentes rendimentos por grama de proteína de fusão foram 49,0 mg, 65,8 mg e 69,4 mg, respectivamente. Obteve-se também glucagona purificada procedendo de maneira semelhante quando se utilizaram os vectores de expressão c) e d) para a transformação.

Analisou-se a glucagona purificada obtida a partir de E. coli transformado com o vector de expressão a) relativamente a i) pureza, ii) composição de aminoácidos, iii) sequência de aminoácidos e iv) actividade biológica, usando as seguintes maneiras de proceder. i) Pureza

Examinou-se a pureza por cromatografia em fase inversa, usando uma coluna Vydac Protein (0,46 cm de diâmetro interno x 15,0 cm). 0 eluente inicial utilizado foi de dissolven- - 42 -

te misturado contendo 25# de aeetonitrilo/0,1 # de ácido triflú-or-acético e realizou-se a eluição aumentando linearmente a concentração de acetonitrilo até 35# durante um intervalo de vinte e cinco minutos a começar no início da eluição. 0 diagrama da HPLC assim obtido está representado na Figura 10a, enquanto a Figura 10c mostra o correspondente diagrama para glucagona natural comercialmente disponível (Sigma Chemical Co.). Como se observa a partir da Figura 10a, o diagrama de eluição da presente variedade de glucagona purificada apresenta apenas um único pico e, portanto, esta glucagona não continha impurezas (isto é, tem uma pureza de 100#). Além disso o tempo de retenção (23,016 minutos) para a eluição da presente variedade de glucagona purificada é quase idêntico ao correspondente tempo para glucagona natural, como se mostra na Figura 10c, isto é 23,088 minutos, demostrando que a variedade de glucagona presente é idêntica, na verdade, ao produto natural. 0 diagrama de HPLC de outra amostra de glucagona obtida de acordo com o processo mencionado acima está representado na Figura 10b. 0 tempo de retenção para a eluição da presente variedade de glucagona purificada é igual a 20,404 minutos. A pureza desta glucagona é de 99,3#. A análise das preparações de glucagona purificada obtidas a partir dos transformantes criados com os vectores de expressão (b) - (e) derem essencialmente os mesmos resultados. ii) Composição dos Aminoácidos

Antes da análise da composição dos aminoácidos, hi-drolisou-se o líquido a analisar com uma solução 4 M de ácido metano-sulfónico (contendo 0,2# de 3-(2-amino-etil)-indol), a 110°C durante vinte e quatro horas. Determinou-se então a composição de aminoácidos desta amostra por meio de um analisador de aminoácidos Hitachi, modelo 835. Os resultados desta análise indicados na Tabela 3, demonstram que as respectivas proporções de aminoácidos da glucagona purificada obtida a partir de E. coli transformado com 0 vector de expressão a) eram idênticos aos valores teóricos. A análise das preparações de glucagona * purificada obtidas a partir dos transformantes criados com vec- - 43 -

tores de expressão (b) - (e) deram essencialmente os mesmos resultados . iii) Sequenciamento de Aminoácidos

Determinou-se a sequência de aminoácidos da glucagona purificada obtida a partir de células hospedeiras transformadas com o vector de expressão (a) usando um sequenciador de proteínas Applied Biosystems 477A. Os resultados desta análise, representados na Tabela 4, demonstram que as sequências de aminoácidos da glucagona purificada obtida a partir de Ε_^ coli transformado com o vector de expressão (a) são idênticas às da glucagona natural. A análise das preparações de glucagona purificada obtidas a partir de transformantes criados com os vecto-res de expressão (b) - (e) forneceram essencialmente os mesmos resultados. - 44 -

* I

Composição de Aminoácidos

Aminoácido Número de Determinado aminoácidos Calculado Asp 4,0 4 Thr 2,8 3 Ser 3,7 4 Glu 3,1 3 Pro o o 0 Gly 1,0 1 Ala 1,0 1 Cys/2 0,0 0 Vai 0,9 1 Met 1,0 1 Ile 0,0 0 Leu 2,1 2 Tyr 2,0 2 Phe 2,0 2 Lys 1,1 1 His 1,0 1 Trp 1,1 1 Arg 2,0 2 Total 29 45

TABELA 4

Análise de Sequência de Aminoácidos

Operação de degradação Resíduo do aminoáoido Quantidade de aminoácido dtectado (pmol) 1 His 1333 2 Ser 885 3 Gin 1412 4 Gly 1597 5 Thr 1146 6 Phe 2473 7 Thr 550 8 Ser 333 9 Asp 975 10 Tyr 1162 11 Ser 357 12 Lys 658 13 Tyr 804 14 Leu 1023 15 Asp 701 16 Ser 213 17 Arg 529 18 Arg 551 19 Ala 779 20 Gin 639 21 Asp 523 22 Phe 464 23 Vai 537 24 Gin 178 25 Trp 109 26 Leu 356 27 Met 277 28 Asn 278 29 Thr 31

Carga = 3856 picomoles - 46 -

Claims (1)

1. iv) Actividade Biológica Como índice da actividade biológica, realizaram-se os ensaios de receptor utilizando uma fracção de membrana de fígado de ratazana, o ensaio de resposta cAMP usando células de fígado de ratazana livres e a libertação de glucose por amostras de fígado perfusionado. Os resultados mostraram que a glucagona purificada obtida a partir de Ej_ coli transformado com os vectores de expressão (a) - (e) manifestaram a mesma actividade que os de glucagona natural em todos os ensaios, confirmando assim de novo que estes produtos são idênticos à glucagona natural. Compreende-se que várias outras modificações sejam evidentes e possam ser facilmente feitas por peritos no assunto afastamento do âmbito e do espírito da presente invenção. Por consequência, não se pretende que o âmbito das reivindicações anexas se limitem à descrição realizada anteri-ormente, mas que, de preferência, as reivindicações se considerem como abarcando todas as características específicas de carácter de novidade patenteável que residem na presente invenção incluindo todas as características que possam ser tratadas como equivalentes pelos peritos na técnica a que a presente invenção pertence. REIVINDICAÇÕES - ia - Processo para a preparação de glucagona, ca-racterizado por se preparar uma proteína de fusão com a seguinte fórmula X-Glu-glucagona (I) na qual X é uma sequência de sinal de 70 - 170 aminoácidos, - 47 - * Λ

   Glu ê uma unidade de ácido glutâmico, e Glucagona representa a sequência de aminoácidos da glucagona, e se tratar a referida proteína de fusão com um enzima que hidrólise especificamente as ligações peptídicas nos terminais car-boxilo das unidades de ácido glutâmico, conduzindo à cisão da referida proteína de fusão. - 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se obter uma glucagona em que a sequência X contém uma fracção da sequência amino terminal do interferão-^fj do ^Cys interferão-^1, ou do interferão- σ(80Α2. - 3* - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se obter uma glucagona cuja sequência de aminoácidos seja a expressa pela fórmula seguintes His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp Phe Vai Gin Trp Leu Met Asn Thr (II) -4a - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se preparar uma proteína de fusão pelo processo de cultura dos transformantes obtidos pela introdução de um vector de expressão para a expressão da proteína de fusão de fórmula I em células de Escherichia coli; - 5a - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se recuperar a glucagona através do seguinte processo sequêncial: - 48 - * i

   (a) solubilização da referida proteína de fusão com um desnatu-rante ou tensioactivo apropriado, (b) diminuição da concentração do referido desnaturante ou tensioactivo, (c) adição do enzima à mistura obtida no passo (b) , obtendo-se assim uma mistura reaccional contendo intermediários solúveis resultantes da decomposição parcial da referida proteína de fusão, (d) dessolinização da referida mistura reaccional de modo a obter uma fracção contendo os referidos intermediários e o referido enzima e não contendo nem o referido desnaturante nem o referido tensioactivo, (e) continuação da reacção por acção do enzima contido na referida fracção de modo a libertar a glucagona, e (f) isolamento da glucagona libertada. - 6 ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se obter glucagona utilizando como enzima a protease V8 derivada de Staphyloooccus aureus. - 7ã - Processo para a preparação de glucagona, ca-racterizado por se utilizar uma sequência de DNA que a codifique, sequência essa correspondente à fórmula seguinte: 5’-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAA TACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAG TGGCTGATGAACACC-3’ (III) - 8â - Processo para a preparação de glucagona, ca-| racterizado por se utilizar um vector de expressão que compre- - 49 -

   enda uma sequência de DNit'que coHifique uma proteína de fusão com a seguinte fórmula: X-Glu-Glucagona (I) na qual X é uma sequência de sinal de 70-170 aminoácidos, Glu é uma unidade de ácido glutâmico, e Glucagona representa a sequência de aminoácidos da glucagona. - 91 - Processo para a preparação de glucagona, ea-racterizado por se utilizar um vector de expressão de acordo com a reivindicação 8, que seja escolhido de entre o grupo constituído por: Trp pAT huIFN^/glucagona, Trp pAT AkCys huIFN^glucagona, Trp pAT ACys "short huIFN^glucagona, Trp pAT huIFN©C80A2 /glucagona, e Trp pAT ACysII huIFN^glucagona. - 10^ - Processo para a preparação de glucagona, ca-racterizado por se utilizar um transformante obtido por introdução de um vector de expressão de acordo com as reivindicações 8 ou 9 numa célula de Escherichia coli. - m - Processo para a preparação de glucagona, ca-racterizado por se obter uma glucagona purificada com uma pureza de 99 por cento ou mais, tal como determinada por cromato-grafia líquida de alta pressão. A requerente reivindica a prioridade do pedi do no Japão apresentado em 1 de Fevereiro de 1989 sob 0 Número de Série 1-24158. 50 I Lisboa, 1 de Fevereiro de 1990 C ijl1 - j.j j J.J :‘U:JII : )'?I I, I ‘Λι'ΐJ! A líi

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