HUT54410A

HUT54410A - Process for producing glycagon

Info

Publication number: HUT54410A
Application number: HU90614A
Authority: HU
Inventors: Jun Ishizaki; Mikio Tamaki; Masaru Shin; Hiroshi Teraoka; Nobuo Yoshida; Hiroshige Tsuzuki
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1989-02-01
Filing date: 1990-01-31
Publication date: 1991-02-28
Also published as: AU634999B2; NO900410L; FI900497A0; NO900410D0; DK0381433T3; GR3021965T3; DE69028935T2; EP0381433A1; JPH0748999B2; IL93173A0; CA2008824A1; NZ232255A; AU4898990A; CN1063795C; DE69028935D1; CA2008824C; JPH03254692A; KR900013077A; ZA90533B; ES2095236T3

Description

A /2/ fragmentumot a ptacl2-ből|_Amman és munkatársai : Gene

25, 167 /1983/3 prototípusként a 2a. ábrában bemutatott módon megalkotott pGAl klónozó vektor restrikciós enzimes hasításával ·· • V

Pontosabban a pGAl-et a ptacl2-ből az alábbi eljárás szerint al··*· • * ckZ» kus kapcsolót beiktatjuk a ptacl2-ben levő PvuII hasítási helybe.

5’- CTGAAGCTIGGATCC

-3’

3’- gacttcgaJacctagg -5’.

HindlII /V/

Az igy kapott plazmidot /vagyis a ptacl2/.SLl-et, amely juk. Ezután, amint a 2c, ábrában bemutatjuk, az ezen a r.iódcn kapott pGAl plazmidot Hind±II-nal hasítjuk, a végeket KIeno’.v-fragmentummal végzett kezeléssel tompává tess:

D1TS fragmentumot azután KpnI-gyel hasítjuk, úgy kapunk egy 90 bp-s KpnI/HindIII/ICLeno'.v fragmentumot.

A Trp pAT hum.y/Kallilcrein vektort /3/ a következőképpen kapjuk meg. Először, amint a 2b. ábrában bemutatjuk, a humán

T-interíeronnal fuzionált PSTI-hez PTra oAT huIHWPSTI, J. Βίοchem. 102, 607-612 /1987/J tartozó kifejező plazmidot Sáli-gyei <gy obbi kát, és BAP-vsl kezeljük, és az igy létrejövő két fragmentumból ε ιιέΎ /va ~yis a Sáli-Sáli fragmentumot/ kinyerjük, külön emésztjük a

Tro

TTbal-gyel, ezáltal kapunk

Sall-Xbal fragmentumot. Ezután az alábbi /VI/ oligoúukleotid (Phe-Arg)kódoló D'TS-t tartalmazzaj szintetizáljuk ♦ I ···· ν· ···· «· • · · · · * • · · · · · • ·· · ·· /VI/ ···

Sáli	Asp	Pro	Phe
i i TC i		OCG	TIT
	i n i vx	jrlrv	AAA

£ ν· ít	Ps	ti	Xbal
cr	TGC	AjGT 1
nn h! lxv >jr	ACG~	TCA	G1TC

alI-Xbal lumán τ-interfer orrnak

V szegmensét kódoló szel·

J 'N ' zrrotoin lefelé / downstream / területnél

A fentebb említett Trn uAT

Xbal-gyel, KI enow-fragnentummal kanott fragmentumok közül a nagyob tett /1/ és rmros igy kapva meg a Irp /2c. ábra/ saival szómő vektorban

Có bán mutatjuk be egái kot ása mint a ébrában bemutatjuk, a jelen találmány szerinti alkotjuk meg /1/ terminális aminosav-szekvenciái át /elzz so fél / kódoló z

so /2/ huIFK^C-terminális aminosav szekvenciáját /hátj fél/ kódoló bázisszekvenciát és egy glükagont kódoló szekvenciát tartalmazó fragmentum ; és ···· ·· ··· ·· • · · · · • · · « ·« · ·· •· ···

Amint a

4b. ábrában bemutatjuk, az /1/

DNS fragmentumot a

Tr ρ pAT n Cy s huIFNy-nevü, hunán?*-interferont /lásd 4a. ábra/ kapjuk meg, ahol cl ototituskánt az alábbi irodai li so to Rinsho,

Ci ból e szerint töriel, alábbi /Vil/ oligonukleotidot szinLletGln/Asp/

5’-CGATACTATGCAG

3’A vall /VII/ .uIRNvels szintetikus oligonukleotid adapter /VII/ a aC.vs amely a^Cys hullik· aminoféerminálisánál leZ* Z z , o részét, v? glutamin /Glu/' dőlj a.

meg, hogy szintetizáljuh a két jelölt egy szálú oligonukleotidot

Ke bázi s clZ>

oligonukleotidot összeforraszt j uk.

A Trp pAT Cys hulliig plazmid vektort ezután úgy alkotjuk meg, hogy a fentebb említett Clal-Sphl fragmentumot, AvalI-SuhI fragmentumot és /VII/ szintetikus adaptert T4 ligázzal ligáijuk.

hzután ezt a Trn pAT x_Cys huIFN^. vektort Clal és .

emésztjük, igy kapunk egy 275 bp—s fragmentumot.

Asuli restrikciós enzimekkel

L'z a Clal-Asun ct fragmentum a humán /^interferon egy részét kóz a 4. helynél leve' glutaningycknél kezdődik és

Ov* a bázisszekvenciában levő AsuII hasitó helynek megfelelő pontig amely a hun ón ihV_: r>

jót kódoló bázisszekvenciát is

A /3/ DNS fragmentum a fentebb említett és 4b.

ábrában bemutatott Trp pAT huIFU^/glucagon kifejező plazmid Clal és Sphl hasításából eredő fragmentumok nagyobbika. Ez a Clal-Sphl fragnentum tartalmazza a triptofán promotor bázisszekvenciáját

A Trp don kapjuk ρΑΤ ZiCys huIFN^/glucagon kifejező veim őrt olyan mónieg, hogy a fentebb említett /1/ Clal-AsuII fragmeng> cl

AsuII-Sphl fragmentumot és /3/ Clal-Sphl fragmentua Ab. ábrát/ egy olyan szekvenciával bir, amely a humán pintér fér ónnak a 4« helyén levő Glu gyöké tői a 135. helyen levő Ser gyökéig terjedő szegmensét kódolja a 4b ábra alsó részében bemutatott szekvencia, a lefelé levő területnél bázisszekvenciák ebben a kifejező vektorban ugyanazok, mint a

Trp pAr hu j.TTW/glucag ónban levők, ábrában mutattünk be /c/

Amint az

9.

ábrában bemutatjuk, a jelen találm _r ό bar eg k a p o 11 T r p pA T a álötjük mer. /4b ábra/ ront osabban a Trp áb bi ..ur menettel cáron vektort Ásu-Ll és

Klenow fragmentummal tompa végűvé tesszük. Az igy kapott f-Pstn/Klehow ma χ- c

G.

ron 4. helyén levő nin a trintofán promotor szabályozó sa alatt doló szekvenciával, és a lefelé ódoló övétően egy olyan bázisszekvenciát tartalmaz, amely a glükagon aminoeavszekvenciáj át kódolja. A glükagont kódoló DNS 5*-termi nálisával szomszédos bázisszekvenciát ebben a vektorban az p.áb ra jobboldali alsó részében mutatjuk be • · · • · ·

/d/ A Trp pATc/huIFN 80A2/glucagon megalkotása.

Amint a 6. ábrában bemutatjuk, a jelen találkán szerinti Trp pAT huII'Nvk80A2/glucagont az alábbi három alkotórészt alkalmazva alkotjuk meg :

/1/ a huIFN 80A2-t kódoló bázisszekvenciát tartalmazó fragmentum;

/2/ a glükagont kódoló bázisszekvenciát tartalmazó fragmentum ; és /3/ Trp pAT vektor.

Amint a 7a. ábrában bemutatjuk, az /1/ DNS fragmentumot a polimeráz láncreakció /POR/ eljárásával £Saiki és munkatársai: Science 239,487 /1988/J kapjuk meg, Trp pBR huΙΞΠΚ80Α2-vel /6156199 számú japán szabadalmi, közrebocsátási irat/, mint templáttal. Erre a célra először két egyszálú oligonukleotidot szintetizálunk kémiai úton, vagyis a 20 nukleotidos értelmes” /sense/ prímért /VIII/ és a 25 nukleotidos ”nem értelmes” /anti-sense/ prímért /TL/, amelyek képlete az alábbi :

Sense primer :

*-AGTTAACTAGTACGCAAGTT-3 ’

Antisense primer :

5’-CAACCCTGCAGGCACAAGGCTGTA-3’ /VIII/ /IX/

Amint a 7ε.ábrában bemutatjuk, a /VIII/ képletű sense primer megfelel a triptofán promotor hátsó részének, mig az anti.sense primer /TL/ a huIFNo<80A2 hátsó részének fele meg. Ezeket a primereket alkalmazva Taq polimerázzal megnyujtva a frag* «

mentumot olyan DNS fragmentumot kapunk, amely huIIS7k<8OA2-t kói ιε doló szekvenciát tartalmaz. Ezt a DNS szekvenciát Clal-gyel és fragmentumot.

/2/ DNS fragmentumok ül, amelye /2c 'brm/ <_k

I OUTI

Esti-gyei

C?

~--el zett hasításakor keletkeznek, a '^zy_ te zj e Írve ne iával a fragmentumok közül,

Ovi.

olazmid /2c.

bra /

s.-yjyet a

Clal-gyel és ti ha SÍ t

ü.

't ralmazva /6. ábra/. Ez a térj ed, szabályozása alatt kódoló szekvenciával, ahol ez a szekvencia a lefelé levő /downstream/ oldalon qssze van kapcsolva azzal a ábra ···· ·· ···· • · · ·

- 19 jobb alsó részében ábrázolunk. A huIFN c<80A2 teljes szekvenciáját a 8. ábrában mutatjuk be.

/e/ A Trp pATACysII huIFN^/glucagon megalkotása

A τη ; nt a 7c. ábrában bemutatjuk, a jelen találmány szerinti

Trp pATΔCysII huIFNy/glucagon kifejező vektort a megelőző /b/ fejezetben leirt Trp pATΔCys huIFN^/glucagon kifejező vektorból képezzük. Az említett vektort úgy kapjuk meg, hogy a CTGCAG bázisszekvenciát, amely az egyedüli PstI hasítási hely ebben a plazmidban, CTCGAG-vé alakítjuk át a PCR eljárással /lásd fentebb/ egy hibás illesztésű oligonukleotidot alkalmazva.

Pontosabban ismertetve a glükagont és csatlakozó szekvenciákat kódoló /1/ DNS fragmentumot és a Trp pAT ACys huIFN y vektor nagyobbik fragmentumát,/2/ /mindkettőt leírjuk a későbbiekben./ T4 DNS ligázzal ligáljuk, hogy megkapjuk a Trp pAT ΔCysII huIFNy/ glucagont.

Először két egyszálú oligonukleotidot szintetizálunk kémiai úton, a 21 nukleotidos értelmes” /sense/ prímért /X/ és a 21 nukleotidos “néffi értelmes /antisense/ prímért /XI/, amelyek képletét az alábbiakban mutatjuk be :

Sense primer :

5’-CCGTTTCGCTCGAGCGAACAC-S’ /X/

Antisense primer :

5’-AGCTCTAGAGCTTTTATTAGG-3’ /XI/

Amint a 7b. ábrában bemutatjuk, a /X/ sense primer olyan

- 20 felel dal f es trszekvenciának zásánál van, ^-cg,

: felel meg,	amely a hu	~7i:^és a
míg a /XI/	antisense	őri mer oly
iely a glüka	gon karboni	-terűin éli

lűkagon

Cl' 1Ύ3 kódolja, .1 ancm a alit ett t pnrcci lkaim t és & csatla

DNS

1' r -L. C..

PCR eljáró ssal megnyujtjuk Tr tartam egy m sas

Qt vektor b <r-.

“éntunó£ ze.cvcnci - j iyy i-Sul ón csatlakozó területét, kódoló ^v>nT JkXAÍJ -L itásjhellyé /CTCGAG/ alakul t a. negnyujtott DNS szekvencia amely szerin gyököt kódől. A megnyujtott

Xhol lílenov fragmentummal tomόóvá tessz ül

Máj d ezt Xbal tor ^Cys peerg

Xbal-gyei hasítjuk és a létrejőve fragmentumok közül a nagyobbik ··· ·· • · • · • · • ·· í‘ra.gner.tunot/2/ T4 DNS ligázzal tűnőt/1/ és

Ξζ rendelkezik, anely a ol ez

Jiii::

te

Cc.

/d/ emu szarjon ϊ e z i s z t e ne i ár a litett /a/, /b/, /_c/ rótt transzfomáf:o nán '•lüka'Orü f 5 ^z e s 1ίμϊι^γϊΜ.

ont

L· stb nek

Cv ·· • · • · · · í ·· * · · • · • · er ς eror: e-y ε ki.fejez5dós választjuk ki ernensát,

Trn

A transzfc z da εz érve z e t e k a C600, -JLI1O3, • · ·

Azt a transz formálist, : ···:

termelését.

kapunk E.coli KI2

CoOO törzsbe. Tru oAT huIFK^r fused ~lucagon/C6CO-nak nevezzük, * és ezt a Fermentation Research Institute Agency fór Industrial

ÍJ

Szerződés szerint deponáltuk zis /SDS-PAGE/ és anti glükagon poliklonális antitesteket cl kalmazó 7.^festern-folt elemzés igazolja, hogy a humán glükagon valóban kifejeződik a gazdasejtekben fúziós fehérje formájában

Az SDS-PAGE egy mintegy 21 kilódéitonos és mintegy 14 kilodaltonos csikót tiír járást alkalmazva 1 liter tenyészet-keverék, amelyben a transz2,43 g;

és tisztítása

Abból a célból, ho θ' q Ili le ci gcnt kinyerjük a fentebb emli tett fúziós fehérjékből /X-Glu-Glükagon/, mivel a fúziós fehérje ' ·♦ ·· ···· «· • · · · · • · · · · ·· · ·· cl zárvány fehérje formájában gyü23 lemlik fel, εζοlubillzálni kell

J-IííjxOZ hogy ezt a célt elérj ük,

a. teny eszet keverék ö ezaz üledéket denaturálós re vU.

/védett ra, és ezt általában 0,05'í ^v > -kalmazzuk

Figyelembe véve az nufferoldat

Lozc’.e tömeg ó közti koncentrációban altét, a pufferőidat pH-ját előnyösen az említett folyamatban alkai mazandó er.zirn optimális oH-j ának közelébe kell beállítanunk.

így pi. amikor Staphylococcus aureusból származó V8 proteázt / Sí

Chemical Co enzimként, akkor a υΕ ,T.T alkalmaznunk ilyen esetekben. Ha enzimes akkor enzim-gátlókat, pl. HDTA-t pufféróldathoz, hogy gátoljuk az Vitását.

is kell hozzáadni az említet

J.· X

L· ··· ί· · ··· * · • ♦ · · · • ·« · «»

Az ilyen módon kapott szolubilizált rtalmaz denaturólószert vám' felületaktív anyagot t évékény s/~ét

Ilyen esetekben cl felelő higitószerrel, nl. a fentebb emukat felül ets ktiv anyas^~nem tartalni :i t ·’ ább leirt ií± lubilizált anyagot tartalmazó keverékben 1-5 sen 2 ng/nl-nek kell lemüe

Σ fehérjétől enzimes kezeléssel elvi íivel enzim tartalmaz glutaminsav-gyököt, a glüka segít gégével, amely fajlagosan hasítja a peptidkötést a

I • · · így Pl· előnyösen a Staphylococcus aureus ATCC 12600-ból szár>ν ra vonatköztatv / Γ7 ^z os 7 óra közti

- 25 40°C érsékleten, 30 nerc át a no2 z-'adott enzi

1-Χ így

1/500 (t öneg/1 ömeg ar ánybán. a dj u k, óra kívánatos.

Az sósav, ecetsav, hozzáad

IjJ el ökok hasadásából erednek. Szék a köztes termékek akkor is olda keverékben levő denatúrálószereket és letaktív anyagokat nüleg közrejátszana k ezeknek a z

revén kifejezett csökkenést eredményez az enzimaktivitásban tolhatják az Σ fehérjén beiul által termelt kis molekulátömegű bomlástermékek.

···· ·<

·· · 4 · ·· ·4· /iii/ A cél-hasi tóhely a cél-glutaninsav--vöknél a fehérjében kevésbé fogékonnyá válik az enzimes tevékenységre a fehérje nagasabbrondü szerkezetében levő összehajtogatás glükagon kitermelését növelni lehet ezeknek a köztes terekeknek a további kezelésével és hasításéval hatékor sz zök köz/hogy ezt megkönnyítsük, aioszer ve lamin

-r . /· az a lenerje re ’volitesat az enzimes reakcioKeverevoen, .hasításával képződött/ i belüli rl u t ami n-írvö kölnid, s molekulát eme ^'ki.e molekul

Z f elszeres

A vélsz!

ást el ónveken ovág:

a kis molekulatömegü berniástérmékel elaz tartalmazó, gélszüréssel kapott nH-t enzimet denaturál j ;.k és hatni hagyjuk a szolubilizált köztes termékekre. A glüka· <>«

Az ilyen módon gyománycs teciiniká k megfelelő kombinálásóval tisztítjuk, kromatográfia különböző formáival, ’i ával, af fi ni t ás kr ómat ogr áfi ával, hídrofób gélkrómatográf iával, vage c ént r i fűn ál i s el kül öni t é s.

élj ár ásó kkal, ε t b

- 27 Λ Al ntebb leirt eljárás glükagon felszabadítására viszonysara, ennélfogva gazdaságos

A jelen találmány eljárását alkalmazva egy liter tenyésztő

160 m.g (f, azdaszervezet transzformálására. Azo:.os módon kapunk tisztitcss glükagont abból alkalmazzuk .kagon tisztaságfokát, ar.iinosav-összetételét és bioés az eredmények azt igazolják, hogy ez sz tátalans'gokat és teljesen azonos a természetes glükagonnal az sino sav összetételt, valamint a biológiai aktiéit ást illetően.

A fente:': leirt eljárással kapott glükagont ennek megfelelően az elése, előkezelés caS pott transzformánsokkal glükagon nyer is dóinál· zetes pl re N-Glu-Giüon ké egyszerű, hat é kon pos e¹ xl, cca ’v e:

οητ rekombináns DIT végezhetünk alacsony költsé<7 er. kivíil, mivel a jelen tori •F esen azonos a természetes humán véneiae '_:,rn -i - ·. , ocázat óval,

Ö Γ7 d u-i alkal mázott pl

Példa

Az alább leirt

Clonin·

1982/ bemutatott élj ái alkalmazott enzimet a Takara Shuzo és kémiai kódoló ciat általában

ZUK,

Az ig' tervezett DNS szekvenciát, amely a kiindulási hi szti di öktől a 29. treonin-gyökig terjedő aminosavszekver.ciát ábrában mutatjuk be.

Az 1. ábrában bemutatott lp rövidláncú fragmentumot kódolja, autornaEzeket a fragmentumokat'-azután összeforrasztjuk, ezáltal raegkap29 juk az 1. ábrában bemutatott DNS szekvenciát a kétszálú szerkezettel. Ennek a DNS szekvenciának van egy metionint, valamint egy

Alul hasítási helyet tartalmazó ATG kodonja az 5’-terminálisnál, és két TAA terminációs kodonja és egy HindlII hasítási helye terminálisnál /BZ képe·:? glükagont kifejezni k.coliban, ezek az /&/ Trn n.4T ?_uiü-kV 0 /glucagcn, /b/ Trp pAT zxCys huINf^/glucagon, /c/ Trp pAT zx C-ys

Trp eAT ACysII huIFN^/glucagon plazmidok /a/

Trp pAT huIEN^/glucagon megalkotása /3/ bekezdésekben kapott három DNS fragmentumot ligáijuk. innék a kifejező vektornak a megalkotását vázlatosan bemutatjuk a 2a-2c.

ábrabban /1/

C7> 9

GAA módónt adunk amely a hiszti din, szerin, glutamin, glicin kodonokat és a treonin kodon egy részét tartalmazza, -5’terminálisához, és Iípnl helyet .□vszolgáltatunk a 3'terminálisnál. A bázisszekvenciát a korábbi szövegben a /IV/ képletben matattuk be. Ezután abból a célból, hogy ezt a bázisszekvenciát kialakítsuk, két 19-mer oligonukleotidot szintetizálunk és forrasztunk össze, igy kapunk egy olyan ···♦ ·· ···· ·· • · · · · i

vénei áj , valamint tortál• · · · ·· · ··

- 30 egy KpnI hasítási levő oldalon.

Apnl-Hind-LlI/IZleno· fragmentumát εζ ai

-.búi a

5. Amint a 2a

El alkotv hellyel

11áb bi munkame n e izor zó voka korábban '/V/ karc sóiét beikta bír a PvuII hasi zűr ·αη, .int a. 2 c

2k

CL

L· J U.

beket

L omoá z

ΤΓ 'Λ te énletben be oe

ΟΊ / va.gyi £ máj d a ha sí ⁺t alázni t 0 bt

Knnlgyei emésztjük, anott vagyis eg; 90 bp-s Kpnl-Hinőlii/ nyerjük.

mint az 1.

gliikagon aminosavszekvenciájónak hátsó felét kódolja, kiindulva.

Xbal-PstI fragmentumát az alábbi módon állítjuk elő

Amint a 2b. ábrában bemutatjuk, a humán ^-interferonnal és PSTIgyei lói fej e £Trn

-AT huIZ'Tzy/ ESTI ;

102 ;vel 'V eme ez át , e zut án

V',

37°C jiőziérsékleten rán tűnőt /Sall-Sall fra éntun/ “0 -p .idot Sáli korábbi szövegben helyét

ImazzaJ li

-•'1 iuej·----- T4 DNS ligázzal.

kapott plazmid vektort Trp likrein-nek nevezzük z* promotor szabályozása alatt-, és ezt a szeszenciát a lefelé oldalon olyan szekvenc követi,

-J Z Z alsó r-o ezben

Zbal-gyel, amint ezt a j- r r ε u — el z és οgyóbbikat huIMT/f/Kallikrein vektor hasitásr ut

2c. ábrán bemutatjuk, a hasított vé létrejöv?

/Xbal-PstI fragmentum,

A fentek említett /1/-/3/ helyen leirt eljárás szerint eke t után ezt

DNS fragmentunol· az alábbi irodalmi

Nucleic Acids Rés . , 8, 253-204 ábrában • · • * • · • · • · igy olyan kifejező vektort kapunk, amelyet Trp pAT • · · • « • · • · · · hulru^_/glucagonnak nevezünk. Ezután fragmentumnak a báziszekvenciái át, ;

amelyet ebbe a ?ri.fejező nlazerősítjük me- azt, hogy az c '.lót korrektül kódolja a hűmé' /b/ A /1/-/3/ s 4b. ábrákban mutatjuk be.

/1/ A hu ki fejező plazmidot Trp pAT huIKT^-val /lásd fentebb/, mint prototípussal alakítjuk ki, amint ezt a 4&· ábrában bemutatjuk

Trn uAT huIKT γ-t Clal-gyel juk, igy kapunk egy Clal-Sphl a fentebb említett /VII/ színtumot,

Trp uAT ábra jobb oldalán bemutatjuk, est pAT A^ys hu 151’^ plazmidot Clal-gyel és AsuII-vel emésztjük e Trp °C • · · hőmérsékleten 1 órán át, és egy 275 bp-s fragmentumot /ClalAsull fragmentum/ izolálunk a termékből /2/ A fenti /a/ fejezetben kapott Trp pAT huIJIy/glucagon kifejező plazmád Asuli-Sphl fragmentumát állítjuk elő olyan mc· pAT huIPl’^/glucagon kifejező plazmád Clal-SphT fragmentumát lyan módon, hogy a Trp pAT huIH’^/glucagon-t Clal-gyel és Sph gyei emésztjük 37°C hőmérsékleten 1 órán át, majd a nagyobbik

Ο— fragmentumot izoláljuk fentebb említett /1/-/3/ fragmentumokat amelyek mindehelyen /1980/ leírt eljárás szerint: Nucleio Ácids Rés., 8, 253-26-4

T4 ligázzal ligáijuk, amint ezt a 4b. ábrában bemutatjuk, tumnak a bázi sszekvenciáj át, amelyet ebbe a Trn nATACys huIJVW tel ^J glucagon kifejező plazmádba bevezettünk, a vizsgálati szerint az eljárás szerint végezve, amelyet a Proc. Natl. Acad. Sói. USA

74, 5464-5457 /1977/ irodalmi hely ismertet, ilyen módon erősítjük meg azt, hogy az említett DNS fragmentum valóban korrektül kódolja a humán glükagon teljes, 29 amínosavas szekvenciáját.

/c/A Trp pAT Z^Cys short huIKI /gluca.gon megalkotása.

Kifejező vektort alkotunk meg az alábbi módon. Ennek a kifejező vektornak a megalkotását vázlatosan az 5. ábrában mutatjuk be.

Klenow fragmentummal végzett kezeléssel. Az igy létrejövő fragmentumok közül a nagyobbikat/AsuII/Klenow-Pstl/Klenow fragmentum./ ezután újra ligáljuk T4 DNS ligázzal, igy kapjuk meg azt a kifejező vektort, amelyet Trp pATzxCys short huIFN^/glucagonnak nevezünk. Ezután megvizsgáljuk annak a DNS fragmentumnak a bázisszekvenciáját, amelyet ebbe a Trp pAT/\Cys short huIFN^/glucagon kifejező plázni dba bevezettünk, a vizsgálatot a szerint az eljárás szerint végezzük, amelyet a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5464-5467 /1977/ irodalmi hely ismertet, ilyen módon erősítjük meg azt, hogy az említett DNS fragmentum valóban korrektül kódolja a humán glükagon teljes, 29 aminosavas szekvenciáját.

/ d/ A Trp pAT huIFN<Á80A2/glucagon megalkotása

Ezt a kifejező vektort úgy alkotjuk meg, hogy az alábbi /1/-/3/ bekezdésekben leírtak szerint kapott három DNS fragmentumot ligáljuk. Ennek a kifejező vektornak a megalkotását vázlatosan bemutatjuk a 6. ábrában.

/1/ A huIFNo<80A2J-t kódoló bázisszekvenciát tartalmazó

Clal-PstI fragmentumot az alábbiak szerint állítjuk elő. Először két egyszálú oligonukleotidot szintetizálunk, azaz egy 20 nuk-

Trp pBR'huIFNci80A2 kifejező plazmid, amely egy humán IFN«<80A2 plazmid, Trp promotora hátsó részének felel meg, és egy 25 nukleotidos antisense prímért £lásd a korábbi /IX/ képletj, amely a huIFN<80A2 hátsó részét kódolja. Ezeket a primereket és ···· ·♦ ···«

- 35 Taq polimerázt alkalmazva huIFNc48OA2-t kódoló bázisszekvenciát tartalmazó DNS fragmentumot kapunk a fragmentum iaegnyúj tásával a fentebb már említett POR eljárás szerint. Ezt a megnyújtott fragmentumot Clal-gyel és Pstl-gyel emésztjük 37°C hőmérsékleten 1 lírán át, és az igy létrejövő Clal-PstI fragmentumot izoláljuk.

/2/ Glükagont kódoló bázisszekvenciát tartalmazó PstlBamHI fragmentumot állítunk elő olyan módon, hogy a fenti /?,/ fejezetben kapott Trp pAT huIFi'Wglucagon kifejező plazmidot PstTgyei és BamHI-gyel emésztjük 37°C hőmérsékleten 1 órán át, és a kisebbik fragmentumot izoláljuk. /6. ábra/ /3/ Hasonlóképpen állítjuk elő a Trp pAT huIFN^/glucagon plazmid vektor Clal-BamHI fragmentumát , a fenti /a·⁷ fejezetben kapott Trp pAT huIFN/j/glucagon kifejező plazmidot Clal-gyel és BamHI-gyel emésztve 37°C hőmérsékleten 1 órán át, majd a nagyobbik fragmentumot izolálva /6. ábra/

A fentebb említett /1/-/3/ DNS fragmentumokat [[amelyek mindegyikét agaróz géléiektroforézissel izoláljuk az alábbi irodalmi helyen leirt eljárás szerint: Nucleic Acids Rés., 8, 253264 /1980/j T4 DNS ligázzal ligáljuk, amint ezt a 6. ábrában bemutatjuk, igy olyan kifejező vektort kapunk, amelyet Trp pAT huIFN<80A2/glucagónnak nevezünk. Ezután megvizsgáljuk annak a DNS fragmentumnak a bázisszekvenciáját, amelyet ebbe a Trp pAT huIFN </80A2/glucagon plazmidba bevezettünk, a vizsgálatokat a szerint az eljárás szerint végezve, amelyet a Proc. Natl. Acad. Sói. USA 74. 5464-546? /1977/ irodalmi hely ismertet, ilyen módon erősítjük meg azt, hogy az említett fragmentum valóban korrektül kódolja a humán glükagon teljes, 29 aminosavas szekvenciáját.

·· /e/ A Trp pAT óCys huIFNy/glucagon megalkotása

Ez a kifejező plazmid a fenti /b/ fejezetben kapott Trp pAT áCys huIKty/glucagon plazmidból származik. Az említett kifejező plazmid megalkotását vázlatosan a 7c. ábrában ismertetjük.

Először egy 21 nukleotidos sense prímért lásd a fenti /X/ képletet] és egy 21 nukleotidos antisense prímért [lásd a fenti /1JL/ képletetj szintetizálunk. Ezeket a primereket és Taq polimerázt alkalmazva, templátként Trp pAT óCys huIFNy/glükagont alkalmazva, egy mintegy 130 bázispáros DNS fragmentumot alakítunk l-i megnyújtással a POR eljárás szerint. Ezt a megnyújtott DNS fragmentumot Xhol-gyel emésztjük 37°C hőmérsékleten 1 órán át, Klenow fragmentummal kezeljük, majd Xbal-gyel emésztjük 37°C hőmérsékleten 1 órán át, ezáltal egy mintegy 100 bázispáros DNS fragmentumot /1/ kapunk.

Ezután a /2/ DNS fragmentumot állítjuk elő a Trp pAT ACys huIK'//glucagónból olyan módon, hogy az említett Trp pAT ΔCys huIFN>/glucagon vektort Pstl-gyel emésztjük 37°C hőmérsékleten 1 órán át, majd KIenow-fragmentummal kezeljük, ezután pedig Xbalgyel emésztjük 1 órán át, és a nagyobbik fragmentumot /2/ kin;)érjük.

A Trp pATACys II huIFN^/glucagon kifejező plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a fentebb kapott DNS fragmentumokat ligáljuk. Ezu* tán megvizsgáljuk ennek a DNS fragmentumnak a bázisszekvenciáját, amelyet ebte a kifejező plazmidba bevezettünk, a vizsgálatot aszerint az eljárás szerint végezve, amelyet a Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74» 5464-5467 /1977/ irodalmi hely ismertet, ilyen módon erősítjük meg azt, hogy az említett DNS fragmentum valóban korrektül hódolja a humán glükagon 29 aminosavas szekvenciáját.

/0/ A gazdasejtek transzformálása és a génkifejeződés

Gazdasejtként E.coli K12 0600 /F~, thi“\ thr”\ leuB6, lacYl tonA21, supE44 / törzset alkalmazva transzformálást végzünk

- 37 a fentebb leirt módon előállított kifejező plazmidok mindegyikével, tehát /a/ Trp pAT huIFN^/glucagon, /b/ Trp pATACys huIFN^/ glucagon, /c/ Tro pATZxCys short huIFNof/glucagon, /d/ Trp pAT íibat. y huIFNö(80A2/glucagon, és /e/ TrpACysII huIFN^/glucagon plazmidokkal. Mivel azok a transzformánsok, amelyekbe ezeket a plazmidókat bevezetjük, mind tetraciklin rezisztenciával bírnak, a sejteket egy éj szakán át

37°C hőmérsékleten olyan tápközegen tenyésztjük, amely tetraciklint is tartalmaz /153tg/ml tetraciklint is tartalmazó LB tápközeg/, majd a telepeket képező sejteket kiválasztjuk. Ezután a telepeket tovább tenyésztjük módosított Ι.Ϊ9 tápközegben

C hőmérsékleten 2 4 órán át, amely után a sejteket centrifugá lással összegyűjtjük és az SDS gél elemzéshez alkalmas pufferoldatban / 0,1 mól/1 trisz.HCl, 1%< SDS, 20 % szacharóz és 1 %^-mer kapto-etaniol, pH 6,8 / szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót SDSPAGE-nek vetjük alá, és a glükagont tartalmazó fúziós fehérje termelését vizsgáljuk olyan módon, hogy a gélt Coomassie brilliant Blue R festékkel megfestjük, valamint Western foltképzési elemzéssel vizsgáljuk, anti-glükagon poliklonális antitesteket alkalmazva. Az eredmények feltárják, hogy egy mintegy 21 kilodaltonos szemcsés zárvány—fehérje termelődik a fentebb említett /a/ /b/, /d/, és /e/ kifejező plazmidokkal transzformált gazdaszervezetekben, mig a fentebb említett /c/ kifejező plazmiddal transz formált gazdaszervezetek egy mintegy 14 kilodaltonos szemcsés zárványfehérjét termelnek, ezen kívül az említett fehérjék, amelyek további módosítás nélkül keletkeznek, reagálnak az anti-glükagon antitestekkel. így az eredmények igazolják, hogy az összes transzformáns olyan fúziós fehérjét termel, amely tartalmazza a kívánt glükagont.

- 38 /D/ A fúziós fehérje szolubilizálása, hidrolízis V8 proteázzal; a glükagon izolálása és tisztítása

Miután a fentebb említett /a/, /b/, /c/, /d/, és /e/ kifejező vektorokkal transzformált gazdasejteket módosított M9 tápközeg ben tenyésztettük 37 C hőmérsékleten 24 órán át, a sejteket centrifugálissal összegyűjtjük és ”A” pufferőidatbán /8g/l nátriumklorid, 0,2 g/1 kálium-kiőrid, 2,9 g/1 dinátrium-hidrogénfoszfát

H^O, 0,2 g/1 kálium-dihidrogén-főszfát, 5mmól / 1 EDTA, 10 mnól/1 /o-merkapto-etanol és 10 mmól/1 benzamidín, pH 6,65 / a szuszpenziót centrifugálszuszpendálj uk.

Alapos kevert été Ezután juk és az'igy kapott sejteket mossuk. A sejteket azután újra szuszpendáljuk a fen·’ említett A pufferban. Ezután lizozimot adunk hozzá úgy, hogy 2 mg/ gramm sejt /nedves tömeg/ végső koncentrációt érjünk el, és a keveréket 35°C hőmérsékleten reagál tatjuk 1 órán át. Ezután a reakciókeveréket ultrahanggal kezeljük

és centrifugáljuk, és a zárványszemese-frakció üledéket egylépéses vagy kétlépéses enzimes reakcióval izoláljuk. A külön böző enzimes reakciókat az alábbi /D-l/ és /D-2/ fejezetekben

Írjuk le.

/D-l/ Izolálás egylépéses enzimes reakcióval.

A fentebb említett /a/ kifejező vektorral transzformált gazdasejtekből kapott zárványszemcse-frakció üledéket A pufferoldatban /amely 6 mol/liter guanidint is tartalmaz / szuszpendáljuk ahol az említett pufferoldat mennyisége 1/6 része az alkalmazott kiindulási sejttenyészet térfogatának. Alapos kevertetés és ultra hangos kezelés után a keveréket szobahőmérsékleten állni hagyjuk 2 órán át, hogy a szolubilizálás végbemenjen.

Ezután azt a frakciót, amely ezzel a művelettel nem szolubilizálódott, centrifugálássál eltávolítjuk, majd, a felülúszót egy éjszakán át dializáljuk B pufferoldattal szemben / 50 mmól/1 ammónium-bikarbonát, 5 mmól/1 EDTA, pH 7,8 /, amely 2 mól/1 guanidin-hidrokloridot is tartalmaz, A dializátumot azután összekeverjük azonos térfogatú Bⁿ pufferoldattal úgy, hogy 1 mól/1 guanidin-hidroklorid koncentrációt érjünk el, az igy kapott mintát /a/ mintának nevezzük. Az /a/ minta SDS-PAGE elemzése feltárja, hogy 1 g/mintegy 50_t>imól/ humán áj¹—interferon keletkezik 1 liter tenyészfolyadékban. Staphylococcus aureusból származó és a glutaminsav-gyökök peptidkötéseit fajlagosan hasitó V8 proteázt /Sigma Chemical Co., P-8400 / adunk az /a/ mintához 1/10 (tömeg/ tömeg’; arányban, ahol ez az arány a keverékben jelen levő fehérje összes mennyiségére vonatkozik, és a keveréket 37°O hőmérsékleten 1 órán át reagáltatjuk. Mivel a kívánt glükagon a feronnal egy glutaminsav-gyökön keresztül van fuzionálva, és mivel glutaminsav-gyök nincs jelen a glükagon molekulán belül, ez a V8 proteázos kezelés lehetővé teszi a teljes glükagon molekula elkülönítését komplett és módosítatlan formában. Az ezen a módon kapott /b/ minta azonban különböző hosszúságú peptidek keverékét is tartalmazza, amelyek a glükagon és a humán pintér férőn el bomlásából erednek. Abból a célból, hogy eltüntessük ezeket a különböző méretű peptid-tisztátalanságokat, a /b/ mintát centrifugáljuk, a csapadékot eltávolítjuk, és a felülúszótfordított fázisú HPLCnek vetjük alá, Ο^θ oszlopot / 4,6 mm belső átmérő x 250 mm / alkalmazva. Az alkalmazott indító eluálószer 32 % acetonitril- 0,1 % trifluor-ecetsav kevert oldat, és az eluálást úgy végezzük, hogy az acetonitril koncentrációját az elució rajtjától számított

5 perc után percenként 0,5 %-kal növeljük, amig elérjük a 42 % koncentrációt.

A kapott eredményeket a 9a,, ábrában mutatjuk be. Glükagon standardot is vizsgálunk azonos körülmények között, és ezt a 19,7 perc retenciós időnek megfelelő helynél határozzuk meg. Ennek megfelelően a 9a. ábrában a mintegy 20 percnek megfelelő helynél eluált frakciót összegyűjtjük, ezután pedig ezt a frakciót ioncserélő HPLC-vel tisztítjuk. A glükagont tartalmazó frakciót olyan oszlopra /7,5 mm belső átmérő x 75 mm / vezetjük, amely 20 % acetonitrilt tartalmazó 10 mmól / 1 trisz.HCl-lel /pH 6,5 / / C” pufferoldat / pufférőit DEAE-5PW ioncserélő gyantával van töltve. Miután 5 percig mostuk C” pufferoldattál, az anyagot C pufferoldatbán levő 0-0,1 mól/1 nátrium-klorid koncentráció-gradienssel eluáljuk ( a nátrium-klorid koncentráció O-ról 0,1 mól/literre 30 perc alatt emelkedik, és az áramlási sebesség 1,0 ml/perc) . Az eredményeket a 9b. ábrában mutatjuk be. A glükagon standard eluálási helye alapján a vizsgált anyag fő komponensét ^retenciós idő 19,3 perc, /b/ minta /] glükagonnak igazoljuk. A /b/ mintát azután aminosav -összetételére és aminosav-szekvenciájára elemezzük az alább leirt eljárásokkal. Ezeknek az elemzéseknek az eredményét az 1. illetve 2. táblázai tokban mutatjuk be. I

Az aminosav-osszététel vizsgálata.

Az elemzésre váró anyagot HPLC-vel / Aquapore RP-300 oszlop, Brovmlee / sómentesitjük, és 4 mól/literes raetánszulfonsawal j^amely 0,2 % 3-/2-amino-etil/-indolt is tartalmazJ hidrolizáljuk 110°C hőmérsékleten 24 órán át.

f I

A hidrolizátum aminosavösszetételét azután Hitachi Model 835 aminosav elemző berendezés segítségével határozzuk meg.

Aminosav-szekvencia elemzés.

,után A HPLC-vel végzett sóment esit és'* '/Aquapore RP-3OO oszlop, Brownlee / az elemzésre váró anyag aminosavszekvenciáját Applied Biosystews 477A Protein Sequencer berendezés alkalmazásával határozzuk meg.

A fentebb említett tisztítási munkamenetben mintegy 33 mg / mintegy lO^tmól / tisztított glükagont kapunk lg/ mintegy 50 mól/ fúziós fehérjéből, vagyis 1 liter tenyészléből mintegy 33 mg tisztított glükagont kapunk. A tisztításnak ez az eljárása azonban r.agy mennyiségű enzimet igényel a glutaminsav-gyök peptidkötésének hasításához.

1. TÁBLÁZAT : Aminosav-összetétel

Aminosav	Az aminosavak Talált	száma Számított
Asp	4,0	4
Thr	2,7	3
Ser	3,6	4
Glu	3,0	3
Giy	1,2	1
Alá	1,1	1
Val	1,0	1
Met	1,0	1
Leu	.2,2	2
Tyr	2,0	2
Phe	2,0	2
Lys	1,2	1
His	1,0	1
Arg	1,9	2
Trp	1,1	1

Összesen :

• *

2. TÁBLÁZAT : Aminosav-szekvencia elemzés

Lebontási lépés Aminosav-gyök Kinyerés /%/

1	His	9,6
2	Ser	77,9
3	Gin	27,5
4	Gly	29,6
5	Thr	• 52,2
6	Phe	28,2
7	Thr	47,4
8	Ser	58,6
9	Asp	19,6
10	Tyr	16,1
11	Ser	42,5
12	Lys	8,7
13	Tyr	14,0
¹⁴	Leu	12,0
15	Asp	11,3
16	Ser	25,4
17	Arg	9,9
18	Arg	7,8
19	Alá	7,7
20	Gin	7,9
21	Asp	6,3
22	Phe	3,2
23	Val	2,9
24	Gin	6 ,6
25	Trp	1,0
26	Leu	1,8
27	Met	1,0
28	Asn	2,9
29	Thr	0,8

·· · ♦ /D-2/. Izolálás kétlépéses enzimes reakcióval.

A fentebb említett /a/,/b/,/c/,/d/, illetve /e/ kifejező vektorokkal transzformált E.coliból kapott zárvány—szemcse frak-

ször 1 g zárványszemese frakció üledéket feloldunk 35 ml 1. pufféról dat bán /8 mól/1 guanidin-hidroklorid, 50 mmól/1 ammónium-bikarbónát , 5 mmól/1 EDTA és 10 mmól/1 DTT, pH 7,8/. Ezután 105 ml

2. pufferoldatot, amely nem tartalmaz guanidin-hidrokloridot /50 mmól/1 ammónium-bikarbonát, 5nmól/l EDTA ée 10smól/l DTT, pH 7,8/ adunk hozzá, ezzel az oldat guanidin-hidroklorid koncentrációját 2 mól/l-re, és fehérje-koncentrációját 2-3 mg/l-re állítjuk be a Proteinassay Kit-tel /BioRad Co.,/ mérve. Staphylococcus aureus- adunk ehhez az oldathoz 1/500 ]tömeg/tömegj mennyiségben a keverékben jelen levő fehérjéhez viszonyítva, és a reakciót 25°C hőmérsékleten · hajtjuk végre, miközben a keveréket gyengéden kevertetjük. 4 óra múlva a reakciót sósav hozzáadásával leállítjuk, az oldat pH-ját 3,0-ra állítva be. A reakciókeveréket megvizsgáljuk olyan módon, hogy a keverékből mintát veszünk mind az enzimes reakció során, mind annak végén, és a mintásat fordított fázisú HPLC-nek vetjük alá Vydac Protein oszlopot /0,46 mm belső átmérő x 15.0 cm/ alkalmazva. Az alkalmazott kiindulási eluálószer 25 & acetonitril0,1 % trifluor-ecet savoldat keverék, és az eluálást úgy hajtjuk végre, hogy az acetonitril koncentrációját lineárisan 35 %-ra növeljük 25 perces időtartam alatt az eluálás kiindulásától számítva Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei azt mutatják, hogy a fúziós fehérje részleges lebomlásából eredő köztes termékek, valamint a glükagon kis mennyiségei progressziven alakulnak ki, ahogy a reakció előre halad.

- 45 Következésképpen az enzimes reakció után a reakciókeverékben levő oldhatatlan anyagot centrifugálássál eltávolítjuk és a felülúszót sómenteeitjük gélszüréses krómatográfiával, Sephadex G-15 oszlopot alkalmazva / 5 cm belső átmérő x 30 cm, kapacitás 590 ml /. Az alkalmazott eluálószer 50 mmól/1 ecetsav pufferoldat / pH 3,0 /, amely 5 mmól/1 EDTA-t tartalmaz, és ez a köztes terméket és a V8 proteázt tartalmazó nagy molekulatömegü frakciót eltávolítja. Ezt a frakciót pH 7,8-ra állítjuk be ammónium-hido roxiddal, és ismét reakciót végeztetünk 25 C hőmérsékleten, miközben a keveréket gyengéden kevertetjük. így a V8 proteáz a reakciókeverékben renaturálódik, és hat a köztes termékekre, és mintegy 5 órán belül a glükagon teljesen felszabadul az említett köztes termékekből. Ezután karbamidot adunk ehhez a reakciókeverékhez úgy, hogy 6 mól/1 végső karbamid-koncentrációt érjünk el, és a keverék pH-ját azután ecetsavval 5,0-ra állítjuk be, a végső térfogatot mintegy 200 ml-re egészítve ki. Ezt a keveréket azután ioncserélő krómatográfiának vetjük alá, Sephadex oszlopot alkalmazva /2,0 cm belső átmérő x 20,0 cm, kapacitás 63 ni, gyors áranlású típus/, amelyet előzőleg 3. pufferoldattál / 6 mól/1 karbamid-oldat, pH 5,0-ra beállítva ecetsavval / egyensúlyoztunk ki. A nem adszorbeált frakciót az oszlop ismételt mosásával távolitjuk el, először 120 ml 3. pufferoldattal, majd 120 ml 0,05 mól/ liter nátrium-kloridot is tartalmazó pufferoldattal. Ezután eluálunk lineáris nátrium-klorid koncentrációgradienst alkalmazva, a nátrium-klorid koncentrációt a 3. pufferban 0,05-ről 0,15 mól/1 -re növelve / az oszlop kapacitására számított 15-szörös térfogatú eluálÓ8zert alkalmazva /, és a glükagont a mintegy 0,1 mól/ liter nátrium-kloridot tartalmazó pufferral eluáljuk.

···» ··

A glükagon frakciót /mintegy 70 ml/ azonnal sómentesitjük gélszüréses krómatográfiával 50 mmól/1 ecetsawal kiegyensúlyozott Sephadex G-15 oszlopot alkalmazva / 5 cm belső átmérő x 30 cm, kapacitás 590 ml /. Ebben a lépésben a glükagon tisztasága mintegy 97-96 %, ezért a terméket tovább tisztítjuk HPLC-vel végzett frakci ónálás sál.

A glükagont tartalmazó frakciót, amelyet gélszüréssel kaptunk a fentebb leírtak szerint, bevezetjük 25,0 % acetonitril0,1 % trifluorecetsawal kiegyensúlyozott Vydac Protein oszlopba / 2,2 cm belső átmérő 25 cm, 10-15/1^m csomagolás, póo rusméret 300 A /, ahol elvégezzük a glükagon elkülönítését és tisztítását lineáris koncentrációgradiens segítségével, az acetönitril koncentrációját 25-ről 30 %-ra növelve 120 perces időtartam mellett 4 ml/ perc átáramlási sebességnél . A. glükagont ilyen módon mintegy 90 perc alatt eluáljuk a folyamat elindításától számítva. Az ilyen módon kapott tisztított glükagon kitermelése az üledékbe vitt zárványszemcse frakció 1 grammjára viszonyítva mintegy 16,3 mg, mintegy 21,9 mg és mintegy 23,1 mg az /a/, /b/ illetve /e/ kifejező vektorokkal transzformált E.colinál, mig a megfelelő kitermelések 1 gramm fúziós fehérjére számítva 49,0 mg, 65,8 mg, illetve 69,4 mg. Tisztított glükagont kapunk hasonló módon akkor is, amikor a transzformáláshoz /c/ és /d/ kifejező vektorokat alkalmazunk.

Az /a/ kifejező vektorral transzformált E.coliból kapott tisztított glükagont elemezzük /i/ tisztaságra, /ii/ aminosavösszetételre, /iii/ aminosav-szekvenciára, és /iv/ biológiai aktivitásra az alábbi munkameneteket alkalmazva.

- 47 /1/ Tisztaság

A tisztítást fordított fázisú krómatográfiával vizsgáljuk, Vydac Protein oszlopot / 0,46 belső átmérő x 15,0 cm*A Az alkalmazott kiindulási eluálószer 25 % acetonitril- 0,1 % trifluor-ecetsav keverék oldat, és az eluálást úgy hajtjuk végre, hogy az acetonitril koncentrációját 35 %-ra növeljük 25 percen belül az eluálás beindulásától számítva. Az igy kapott HPLC görbét a 10a. ábrában mutatjuk be, míg a 10c. ábra a kereskedelmi forgalomban kapható természetes glükagon /» Sigma Chemical 00/ megfelelő görbéje. Amint a 10a. ábrából látható, a tisztított glükagon jelen változatának eluciós görbéje csak egyetlen csúcsot mutat, ennek megfelelően ez a glükagon nem tartalmaz tisztát alanságokat / azaz a tisztaság 100 % /. Ezen kívül a retenciós idő /23,016 perc/ a tisztított glükagon jelen változatának az eluálásánál csaknem azonos a természetes glükagonhoz tartozó idővel, amint ezt a 10c. ábrában bemutatjuk, vagyis 23,088 perc, azt demonstrálva, hogy a glükagon jelen változata azonos a természetes típussal. A glükagon egy másik típusának, amelyet a fentebb említett eljárás szerint kapunk, HPLC görbéjét a 10b. ábrában mutatjuk be. A tisztított glükagon jelen változatának eluciójánál a retenciós idő 20,404 perc. Ennek a glükagonnak a tisztasága 99,3 %. A /b/-/e/ kifejező vektorokkal alkotott transzformánsokból kapott tisztított glükagon készítmények elemzése lényegében azonos eredményeket mutat.

/ii/ Aminosav-összetétel

Az aminosav-összetétel elemzése előtt az elemzésre váró mintát 4 mól / 1 metánszulfonsawal [amely 0,2 % 3-/2-amino-etil/-indolt is tartalmaz^ 110°C hőmérsékleten 24 órán át hidrolizáljuk. Ennek a mintának az aminosav-összetételét azután

Hitachi Model 835 aminosav-elemző berendezés segítségével határozzuk meg. Ennek az elemzésnek az eredményei, amelyeket a 3. táblázatban mutatunk be, azt demonstrálják, hogy az /a/ kifejező vektorral transzformált E.coliból kapott tisztított glükagon megfelelő aminosav -arányai azonosak az elméleti értékekkel. A /b//e/ kifejező vektorokkal alkotott transzformánsokból kapott, tisztított glükagon készítmények lényegében azonos eredményeket mutatnak.

/iii/ Aminosav-szekvenciaelemzés.

Az /a/ kifejező vektorral transzformált gazdasejtekből kapott tisztított glükagon aminosav-szekvenciáját Applied Biosystems 477A Protein Sequencer berendezést alkalmazva határozzuk meg. Ennek az elemzésnek az eredményei, amelyeket a 4. ábrában mutatunk be, azt demonstrálják, hogy az /a/ kifejező vektorral transzformált E.coliból kapott tisztított glükagon aminosav-szekvenciája azonos a természetes glükagon aminosav-szekvenciájával. A /b/-/e/ kifejező vektorokkal alkotott transzformánéokból kapott tisztított glükagon készítmények elemzése lényegében azonos eredményt mutat.

3. TÁBLÁZAT : Aminosav-összetétel :_0?ú

Aminosav

Amino savak száma

	Talált	Számított
Asp	4,0	4
Thr	2,8	3
Ser	3,7	4
Glu	3,1	3
Pro	0,0	0
Gly	1,0	1
Alá	1,0	1
Cys/2	0,0	0
Val	0,9	1
Met	1,0	1
11 e	0,0	0
Leu	2,1	2
Tyr	2,0	2
Phe	2,0	2
Lys	1,1	1
His	1,0	1
Trp	1,1	1
Arg	2,0	2

Összesen :

4. TÁBLÁZAT : Aminosav-szekvencia elemzése

Lebontási lépés Aminosavgyök A kimutatott aminosav mennyisége /pmól/

1	His	1333
2	Ser	885
3	Gin	1412
4	Gly	1597
5	Thr	1146
6	Phe	. 2473
7	Thr	550
8	Ser	333
9	Asp	975
10	Tyr	1162
11	Ser	357
12	Lys	658
13	Tyr	804
14	Leu	1023
15	Asp	701
16	Ser	213
17	Arg	529
18	Arg	551
19	Alá	779
20	Gin	639
21	Asp	523
22	Phe	464
23	Val	537
24	Gin	178
25	Trp	109
26	Leu	356
27	Met	277
28	Asn	278
29	Thr	31

Terhelés = 3856 pmól

- 51 /iv/ Biológiai aktivitás

A biológiai aktivitás mérőszámaiként a patkánymáj membrán frakciót alkalmazó receptoros meghatározást, a szabad patkánymáj sejteket alkalmazó cAMP válasz meghatározást, és a perfúzió alatt álló májminták által végzett glükóz-kibocsájtást vizsgáljuk. Az eredmények azt mutatják, hogy az /a/-/e/ kifejező vektorokkal transzformált Ξ.coliból kapott tisztított glükagon azonos aktivitást mutat az összes ilyen vizsgálatban, mint a természetes glükagon, ismételten azt igazolva,' hogy ezek a termékek azonosak a természetes glükagonnal.

Tudomásul kell venni, hogy azok számára, akik a szakterületen jártasak, különböző más módosítások nyilvánvalók és könynyen elvégezhetők a nélkül, hogy ki vili kerülnének a jelen találmány szellemén és oltalmi körén. Következésképpen nem szándékunk, hogy a mellékelt igénypontok oltalmi köre csak az itt leirt kiviteli példákra korlátozódna, ennek megfelelően az igénypontokat úgy fogalmaztuk meg, hogy körülöleljék a jelen találmányban található szabadalmazható újdonság összes vonását, beleértve mindazokat a vonásokat, amelyeket azok, akik a jelen témakörhöz tartozó szakterületen jártasak, egyenértékűnek tekintenek.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás glükagon előállítására azzal jellemezve, hogy

-előállítjuk az

X-Glu-Glükagon /1/, ahol X jelentése 70-170 aminosavas vezető szekvencia, Glu jelentése glutaminsav-gyök és a Glükagon a glükagon aminosavszekvenciáját jelenti, képletű fúziós fehérjét, és

-az említett fúziós fehérjét olyan enzimmel kezeljük, amely fajlagosai^-, hidrolizálja a glutaminsav-gyök karboxi-terminálisánál levő peptielkötéseket, ilyen módon az említett fúziós fehérje hasítását idézve elő.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett X szekvencia a /^—interferon, Δ.Cys-^-interferőn vagy az oí, 80A2 interferon amino-terminálisának egy részét tartalmazza.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a glükagon említett aminosav-szekvenciája az alábbi /11/ képletű.

His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr

Ser Lys Tyr Leu Asp Bér Arg Arg Alá Gin

Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr fLT/
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett fúziós fehérjét olyan módon állítjuk elő, hogy az /1/ képlettel bemutatott fúziós fehérje kifejezésére szolgáló kifejező vektor E.coliba való bevezetésével kapott transzformánsokat tenyésztjük.

V ·· • • ··« • • • ·· ···· « • • » • · · 9 ··* * • ·
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett glükagont az alábbi eljárással nyerjük ki:

/a/ az említett fúziós fehérjét megfelelő denaturálószerrel vagy felületaktív anyaggal szolubilizáljuk, /b/ az említett denaturálószer vagy felületaktív anyag koncentrációját csökkentjük, /c/ a /b/ lépésben kapott keverékhez hozzáadjuk az enzimet, ezáltal olyan reakciókeveréket kapunk, amely az említett fúziós fehérje részleges lebomlásából eredő ol'dható köztes termékeket tartalmaz, /d/ az említett reakciókeveréket sómentesitjük,hogy olyan frakciót kapjunk, amely tartalmazza az említett köztes termékeket, és az említett enzimeket, de nem tartalmaz sem az említett denaturálószérből, sem az említett felületaktív anyagból, / e/ a reakciót hagyjuk tovább folyni az említett frakcióban levő enzim segítségével, hogy felszabaduljon a glükagon, és /f/ a felszabadult glükagont izoláljuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett enzim Staphylococcus aureusból származó V8 proteáz.
7. DNS szekvencia azzal jellemezve, hogy glükagont kódol és az alábbi /111/ szekvenciával bir :

5*-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAA

TACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAG

TGGCTGATGAACACC-3’ /111/

54
8. Kifejező vektor azzal jellemezve, hogy egy fúziós fehérjét, amely

X-Glu-Glükagon képlettel bír, ahol X jelentése 70-170 aminosavas vezető szekvencia, Glu jelentése glutaminsav-gyök és a Glükagon a glükagon aminosav szekvenciáját jelenti, kódoló DNS szekvenciát tartalmaz
9. A 8. igénypont szerinti kifejező vektor azzal jellemezve, hogy

Trp pAT ^Cyell huIFN^/glucagon vektorok valamelyike.
10. Transzformáns azzal jellemezve, hogy a 8. vagy 9. igénypont szerinti kifejező vektor Escherichia coli sejtbe való bevezetésével kapjuk meg.
11. Tisztított glükagon azzal jellemezve, hogy 99 %-os , vagy nagyobb tisztaságú, ahol az említett tisztaság nagy teljesítményű folyadékkrómatográfiával van meghatározva.