CN104593399A - 一种转基因胰岛素的合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因胰岛素的合成工艺，其工艺步骤为：(1)提取目的基因；(2)培养工程菌；(3)提取质粒；35℃培养平板中挑取一个单菌落(直径2～3mm)，接种到10ml LB培养液35℃剧烈振摇培养16h，取4ml菌液到5ml离心管，8000rpm室温离心3min，去上清，放于面巾纸上吸干痕液，加350ul RNaseA的溶液，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次，将上清倒入柱状收集管中，将柱状管放到一个消过毒的1.5ml离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min洗提质粒；(4)基因重组；(5)感受态细胞的制备；(6)导入载体；(7)分离纯化；(8)基因表达，本发明的胰岛素能够在短时间内大量生产，产品为基因产物，纯度高，药效好，发酵化生产，易于控制，稳定性好，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种转基因胰岛素的合成工艺。
背景技术
胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛素是由胰岛B细胞分泌的。在人体十二指肠旁边，有一条长形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布着许许多多的细胞群，叫做胰岛，胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成，所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗，但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗，专利申请号为CN201110064735.7公开了一种复方胰岛素制剂，所说的制剂为河豚毒素与胰岛素经组合后，充分溶于医用或食用油而制成的口服油剂，其中：胰岛素含量为0.5-10U/ml，河豚毒素含量为0.01-10μg/ml，本发明针对胰岛素易产生副作用和给药方式的弊端，用微量的河豚毒素与胰岛素组成复方口服油相制剂，不但避免了每天注射胰岛素的麻烦和皮肉之苦，而且能降低或消除胰岛素的副作用，但是该胰岛素不能够在短时间内被大量生产，纯度低，药效较差，不易于控制，稳定性不好。
发明内容
为克服现有技术上的不足，本发明目的是提供一种转基因胰岛素的合成工艺。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
一种转基因胰岛素的合成工艺，其工艺步骤如下：
(1)提取目的基因：向牛肉膏蛋白胨培养基中加入适量血清，接种培养人体胰岛B细胞，控制培养温度为35℃，PH为7.0，用限制性内切酶获取胰岛B细胞内的产胰岛素的核苷酸序列，提取目的基因，备用；
(2)培养工程菌：选用大肠杆菌作为工程菌，用肉汁培养基培养，接种与摇瓶培养基中，于35℃下振摇培养24h，调pH至5.0，而后放入恒温箱中培养，培养温度为35℃；
(3)提取质粒：35℃培养平板中挑取一个直径2～3mm的单菌落，接种到10ml LB培养液35℃剧烈振摇培养16h，取4ml菌液到5ml离心管，8000rpm室温离心3min，去上清，放于面巾纸上吸干痕液，加350ul RNaseA的溶液，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次，将上清倒入柱状收集管中，将柱状管放到一个消过毒的1.5ml离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min洗提质粒；
(4)基因重组：运用同种限制性内切酶切割步骤(3)提取的质粒的基因序列，再经过DNA聚合酶将步骤(1)提取的目的基因导入质粒基因中；
(5)感受态细胞的制备：将步骤(2)某一菌落置于－70℃温度下培养，而后用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于35℃培养过夜，第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，35℃振荡培养过夜，次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，350C剧烈震荡培养约2-3小时，当菌落600nm OD值达到0.4-0.5时，将烧瓶取出放置冰水上10-15分钟，在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中，4℃，8000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟，4℃，8000g离心10 分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液，加2ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体，每管0.1ml分装，至4℃保存备用；
(6)导入载体：将步骤(4)载有重组基因的质粒导入步骤(5)制得的感受态细胞中，在大肠杆菌细胞施加高压，以使导入顺利进行；
(7)分离纯化：在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(6)得到的大肠杆菌，提取标记基因表达的菌落，将其接种到另一培养基中纯化培养；
(8)基因表达：经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养，控制温度为35℃，从发酵罐流出液中即可提取，得到胰岛素。
在一个优选实例中，所述步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中加入胰岛A细胞的分泌液。
在一个优选实例中，所述步骤(4)中，所述基因重组控制温度为35-40℃。
有益效果：本发明通过提取目的基因、培养工程菌、提取质粒、基因重组、感受态细胞的制备、导入载体、分离纯化、基因表达八大步骤完成转基因胰岛素的合成工艺，能够在短时间内大量生产，产品为基因产物，纯度高，药效好，发酵化生产，易于控制，稳定性好，整个制取过程严格控制pH和温度，并且通过发酵化生产，致使生产的胰岛素稳定性好，循环有效批量生产，在提取质粒的步骤中，反复离心，使质粒的提取更为纯净，为以后的高纯度胰岛素生产打下基础，感受态细胞的制备耗时长，工艺操作复杂保证了感受态细胞制取的效率，使平板内的细胞转化率达到90％以上，选用的牛肉膏蛋白胨培养基价廉易得，大大降低了生产成本，载体导入中采用电化法，效率高，本工艺使胰岛素在短时间内大量生产，极大满足人们的需求，适于推广使用。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1：
本实施例的一种转基因胰岛素的合成工艺，其工艺步骤如下：
(1)提取目的基因：向牛肉膏蛋白胨培养基中加入适量血清，接种培养人体胰岛B细胞，控制培养温度为35℃，PH为中性，用限制性内切酶获取胰岛B细胞内的产胰岛素的核苷酸序列，提取目的基因，备用；
(2)培养工程菌：选用大肠杆菌作为工程菌，用普通肉汁培养基培养，接种与摇瓶培养基中，于35℃下振摇培养24h，调pH至5.0，而后放入恒温箱中培养，培养温度为35℃；
(3)提取质粒：35℃培养平板中挑取一个单菌落(直径2～3mm)，接种到10ml LB培养液35℃剧烈振摇培养16h，取4ml菌液到5ml离心管，8000rpm室温离心3min，去上清，放于面巾纸上吸干痕液，加350ulRNaseA的溶液，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次，将上清倒入柱状收集管中，将柱状管放到一个消过毒的1.5ml离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min洗提质粒；
(4)基因重组：运用同种限制性内切酶切割步骤(3)提取的质粒的基因序列，再经过DNA聚合酶将步骤(1)提取的目的基因导入质粒基因中；
(5)感受态细胞的制备：将步骤(2)某一菌落置于－70℃温度下培养，而后用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于35℃培养过夜，第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，35℃振荡培养过夜，次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，350C剧烈震荡培养约2-3小时，当菌落600nm OD值达到0.5时，将烧瓶取出放置冰水上10-15分钟，在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中，4℃，8000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟，4℃，8000g离心10分钟， 弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液，加2ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体，每管0.1ml分装，至4℃保存备用；
(6)导入载体：将步骤(4)载有重组基因的质粒导入步骤(5)制得的感受态细胞中，在大肠杆菌细胞施加高压，以使导入顺利进行；
(7)分离纯化：在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(6)得到的大肠杆菌，提取标记基因表达的菌落，将其接种到另一培养基中纯化培养；
(8)基因表达：经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养，控制温度为35℃，从发酵罐流出液中即可提取，得到胰岛素。
在一个优选实例中，所述步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中加入胰岛A细胞的分泌液。
在一个优选实例中，所述步骤(4)中，所述基因重组控制温度为40℃。
实施例2：其余与所述实施例1相同，不同之处在于，步骤(3)中减少离心次数，本实施例中，耗时短，但是制取的产品纯度低。
实施例3：其余与所述实施例1相同，不同之处在于，步骤(5)中改过夜为置于黑暗条件下培养8小时，本实施例中，耗时短，操作灵活。
经实际应用中可知，通过提取目的基因、培养工程菌、提取质粒、基因重组、感受态细胞的制备、导入载体、分离纯化、基因表达八大步骤完成转基因胰岛素的合成工艺，能够在短时间内大量生产，产品为基因产物，纯度高，药效好，发酵化生产，易于控制，稳定性好，整个制取过程严格控制pH和温度，并且通过发酵化生产，致使生产的胰岛素稳定性好，循环有效批量生产，在提取质粒的步骤中，反复离心，使质粒的提取更为纯净，为以后的高纯度胰岛素生产打下基础，感受态细胞的制备耗时长，工艺操作复杂保证了感受态细胞制取的效率，使平板内的细胞转化率达到90％以上，选用的牛肉膏蛋白胨培养基价廉易得，大大降低了生产成本，载体导入中采用电化法，效率高，本工艺使胰 岛素在短时间内大量生产，极大满足人们的需求，适于推广使用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.一种转基因胰岛素的合成工艺，其特征在于，其工艺步骤如下：
(1)提取目的基因：向牛肉膏蛋白胨培养基中加入适量血清，接种培养人体胰岛B细胞，控制培养温度为35℃，PH为7.0，用限制性内切酶获取胰岛B细胞内的产胰岛素的核苷酸序列，提取目的基因，备用；
(2)培养工程菌：选用大肠杆菌作为工程菌，用肉汁培养基培养，接种与摇瓶培养基中，于35℃下振摇培养24h，调pH至5.0，而后放入恒温箱中培养，培养温度为35℃；
(3)提取质粒：35℃培养平板中挑取一个直径2～3mm的单菌落，接种到10ml LB培养液35℃剧烈振摇培养16h，取4ml菌液到5ml离心管，8000rpm室温离心3min，去上清，放于面巾纸上吸干痕液，加350ul RNaseA的溶液，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次，将上清倒入柱状收集管中，将柱状管放到一个消过毒的1.5ml离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min洗提质粒；
(4)基因重组：运用同种限制性内切酶切割步骤(3)提取的质粒的基因序列，再经过DNA聚合酶将步骤(1)提取的目的基因导入质粒基因中；
(5)感受态细胞的制备：将步骤(2)某一菌落置于－70℃温度下培养，而后用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于35℃培养过夜，第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，35℃振荡培养过夜，次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，350C剧烈震荡培养约2-3小时，当菌落600nm OD值达到0.4-0.5时，将烧瓶取出放置冰水上10-15分钟，在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中，4℃，8000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟，4℃，8000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液，加2ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体，每管0.1ml分装，至4℃保存备用；
(6)导入载体：将步骤(4)载有重组基因的质粒导入步骤(5)制得的感受态细胞中，在大肠杆菌细胞施加高压，以使导入顺利进行；
(7)分离纯化：在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(6)得到的大肠杆菌，提取标记基因表达的菌落，将其接种到另一培养基中纯化培养；
(8)基因表达：经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养，控制温度为35℃，从发酵罐流出液中即可提取，得到胰岛素。
2.根据权利要求1所述的转基因胰岛素的合成工艺，其特征在于，所述步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中加入胰岛A细胞的分泌液。
3.根据权利要求1所述的转基因胰岛素的合成工艺，其特征在于，所述步骤(4)中，所述基因重组控制温度为35-40℃。
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| EP0381433B1 (en) * | 1989-02-01 | 1996-10-23 | SHIONOGI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA trading under the name of SHIONOGI & CO. LTD. | A method for the production of glucagon |
| CN1819838A (zh) * | 2002-05-28 | 2006-08-16 | 贝克顿·迪金森公司 | 人类胰腺腺泡细胞体外扩增并转分化为胰岛素产生细胞的方法 |
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Patent Citations (2)
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