CN102628058A

CN102628058A - 制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法及复性液

Info

Publication number: CN102628058A
Application number: CN2012100802287A
Authority: CN
Inventors: 钱永常
Original assignee: HANGZHOU NEUROPEPTIDE BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: HANGZHOU NEUROPEPTIDE BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN102628058B

Abstract

本发明涉及制备重组人源神经生长因子(rhNGF)蛋白质的方法及复性液，所述方法包括通过工程大肠杆菌表达rhNGF蛋白质，破碎表达rhNGF蛋白质的工程大肠杆菌菌体，离心收集rhNGF蛋白质包涵体，利用变性体系变性溶解包涵体以形成包涵体溶解后溶液，复性液以大于1080ml/min的流速加入到包涵体溶解后溶液中进行复性，纯化rhNGF蛋白质。所述复性液包含45～55mMTris-HCl，0～10mMβ-巯基乙醇，0～1mM二价铜盐，0.95～1.05mM EDTA，pH8.5～10.0。本发明的方法通过复性液瞬间加入稀释复性提高了复性率，降低了生产成本，且操作简单。

Description

制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法及复性液

技术领域

本发明属于医药领域中的重组蛋白质药物，涉及制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法及复性液。

背景技术

神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一。NGF对正常神经细胞具有营养作用，对损伤神经修复机能具有调节作用，可以维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向，对促进大脑的发育、神经系统的生长、损伤神经的再生和功能恢复等具有决定性作用。

人源神经生长因子(hNGF)可应用于神经系统疾病，如糖尿病性周围神经病变、老年痴呆症、帕金森症、面神经炎以及包括脊髓损伤、高位截瘫、断肢再植、脑损伤、周围神经损伤等中枢及外围神经系统的损伤的神经损伤，hNGF是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。hNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人源神经生长因子(rhNGF)成为唯一的选择。

利用基因工程技术、以微生物或酵母为载体生产外源蛋白质具有广阔的应用前景。到目前为止，已经发展了多种蛋白质表达系统。

CN100357441C公开了一种新的表达人源神经生长因子的酵母表达系统：将合成的hNGF基因插入由商购的pPIC9K质粒改造的pPIC9KL质粒，构建表达hNGF的重组表达载体；用该重组表达载体转化酵母宿主，构建表达hNGF的酵母表达系统；最后培养该酵母表达系统，获得hNGF。但该专利中GS115酵母菌株生产NGF的发酵周期为160～180小时，而使用大肠杆菌生产NGF的发酵周期一般为30～35小时，远远短于酵母发酵的周期，生产成本低；同时，酵母的培养要求相比大肠杆菌要高很多，培养成本高。

大肠杆菌表达系统是研究的最清楚的一套原核表达系统，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单以及适于工业化生产的优点，其应用非常广泛。CN1219795C公开了一种用二硫键异构酶(PDI)促进变性的重组人源神经生长因子正确折叠并提高其复性率的方法。但是PDI价格昂贵，大大增加了生产成本。

常规的复性制备rhNGF蛋白质的方法使用缓慢加入复性液的复性方法，复性率较低、制备过程复杂、耗时长、操作复杂，因而生产成本较高。

发明内容

本发明针对rhNGF蛋白质在工程大肠杆菌表达系统中包涵体复性率较低、制备过程复杂、耗时长、操作复杂，生产成本较高的问题，提出了能够显著提高复性率、设备要求非常简单、耗时短、操作简单的复性方法。同时提供了一种复性液，该复性液提高了rhNGF蛋白质的复性率，同时降低了生产成本。

本发明的技术方案通过改变复性液的加入速度提高了rhNGF蛋白质的复性率。本发明涉及制备rhNGF蛋白质的方法，该方法包括步骤①通过工程大肠杆菌表达rhNGF蛋白质，②破碎表达rhNGF蛋白质的工程大肠杆菌菌体，③离心收集rhNGF蛋白质的包涵体，④利用变性体系变性溶解所述入到所述包涵体溶解后溶液rhNGF包涵体以形成包涵体溶解后溶液，⑤复性液以大于1080ml/min的流速加入进行复性，⑥纯化rhNGF蛋白质。复性液瞬间稀释复性大大提高了复性率，稀释后可以摇匀或玻璃棒搅匀，降低了对设备的要求，操作简单。

所述方法步骤①中使用的工程大肠杆菌包括各类大肠杆菌表达菌株，优选BL21(DE3)。

所述方法步骤②中可使用各种菌体破碎方法，优选超声破碎。

所述方法步骤④中的变性体系包括尿素变性溶解液和盐酸胍变性溶解液等，优选尿素变性溶解液。

步骤④中，复性液以大于1080ml/min的流速加入到所述包涵体溶解后溶液中，摇匀或玻璃棒搅匀，然后静置，优选4℃静置4小时。

步骤⑤中，使用的复性液包含45～55mM Tris-HCl，0～10mMβ-巯基乙醇，0～1mM二价铜盐，0.95～1.05mM EDTA，pH8.5～10.0。该复性液采用廉价的组分，降低了生产成本。同时使用该复性液可提高复性率。

根据本发明的一个实施方式，所述复性液的pH值为9.0～10.0。优选pH值为9.0。

根据本发明的一个实施方式，所述复性液中β-巯基乙醇的浓度为2.5～5mM，优选5mM。

上述复性液中，可使用各种二价铜盐，如CuSO₄和CuCl₂等。根据本发明的一个实施方式，使用CuSO₄。根据本发明的一个实施方式，所述二价铜盐浓度为10～20μM，优选10μM。

根据本发明的一个实施方式，步骤⑤中，使用的复性液包含：45～55mMTris-HCl，1.95～2.05mM GSSG，4.5～5.5mM GSH，0.95～1.05mM EDTA，pH8.6。

根据本发明的一个实施方式，在步骤⑤中用上述复性液对所述包涵体溶解后溶液进行5～20倍稀释复性。优选5倍稀释。

根据本发明的一个实施方式，所述复性液包含：50mM Tris-HCl，5mMβ-巯基乙醇，10μM CuSO₄，1mM EDTA，pH9.0。

根据本发明的另一个实施方式，步骤①中6组氨酸标签和rhNGF蛋白质融合表达。6组氨酸标签的使用可简化rhNGF蛋白质的纯化步骤，使其经一步镍琼脂糖凝胶层析柱纯化即可达到纯度90％以上。rhNGF融合蛋白质切除6组氨酸标签后的氨基酸序列与天然蛋白质一致，避免了额外免疫源的干扰。

本发明还涉及一种rhNGF蛋白质的复性液，该复性液包含：45～55mMTris-HCl，0～10mMβ-巯基乙醇，0～1mM二价铜盐，0.95～1.05mM EDTA，pH8.5～10.0。该复性液采用廉价的组分，降低了生产成本。同时该复性液提高了复性率。

根据本发明的另一个实施方式，上述复性液的pH值为9.0～10.0。优选9.0。在上述pH值范围内时，可大大提高复性率。

根据本发明的一个实施方式，上述复性液中β-巯基乙醇的浓度为2.5～5mM，优选5mM。

根据本发明的一个实施方式，上述复性液的二价铜盐浓度为10～20μM。优选10μM。

根据本发明的一个实施方式，上述复性液包含：50mM Tris-HCl，5mMβ-巯基乙醇，10μM CuSO₄，1mM EDTA，pH9.0。

根据本发明的另一个实施方式，上述复性液包含：45～55mM Tris-HCl，1.95～2.05mM GSSG，4.5～5.5mM GSH，0.95～1.05mM EDTA，pH8.6。

上述各种复性液中各个组分的浓度是基于复性液总体积的浓度。

上述复性液适用于蛋白质的复性，特别适用于rhNGF蛋白质的复性。

附图说明

图1为pET-28a-hNGF重组质粒的酶切检测结果；

图2为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF诱导表达检测结果；

图3为rhNGF蛋白质表达位置检测结果；

图4为尿素变性溶解液溶解rhNGF包涵体的检测结果；

图5为盐酸胍变性溶解液溶解rhNGF包涵体的检测结果；

图6为复性液1缓慢稀释复性检测结果；

图7为复性液1瞬间稀释复性检测结果；

图8为使用复性液1和复性液2的rhNGF蛋白质包涵体的复性检测结果；

图9为使用复性液3的rhNGF蛋白质包涵体的复性检测结果；

图10为复性液不同稀释倍数的瞬间稀释复性检测结果；

图11为使用不同pH值复性液的瞬间稀释复性的检测结果1；

图12为使用不同pH值复性液的瞬间稀释复性的检测结果2；

图13为使用不同浓度β-巯基乙醇的复性液的瞬间稀释复性的检测结果1；

图14为使用不同浓度β-巯基乙醇的复性液的瞬间稀释复性的检测结果2；

图15为使用不同二价铜离子浓度的复性液的瞬间稀释复性的检测结果1；

图16为使用不同二价铜离子浓度的复性液的瞬间稀释复性的检测结果2；

图17为rhNGF蛋白质包涵体的镍琼脂糖凝胶层析柱纯化的检测结果；

图18为rhNGF融合蛋白质切除6组氨酸标签的检测结果；

图19为0ng/ml rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞72小时的细胞突触生长情况；

图20为5ng/ml rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞72小时的细胞突触生长情况；

图21为10ng/ml rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞72小时的细胞突触生长情况；

图22为20ng/ml rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞72小时的细胞突触生长情况；

图23为40ng/ml rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞72小时的细胞突触生长情况；

图24为20ng/ml rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞6天的细胞突触生长情况1；

图25为20ng/ml rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞6天的细胞突触生长情况2。

具体实施方式

本发明提供了一种制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法，该方法包括步骤①通过工程大肠杆菌表达重组人源神经生长因子蛋白质，②破碎表达rhNGF蛋白质的工程大肠杆菌菌体，③离心收集rhNGF蛋白质的包涵体，④利用变性体系变性溶解所述rhNGF蛋白质的包涵体以形成包涵体溶解后溶液，⑤将复性液以大于1080ml/min的流速加入到所述包涵体溶解后溶液中进行复性，⑥纯化所述rhNGF蛋白质。

一种重组人源神经生长因子蛋白质的复性液，所述复性液包含：45～55mM Tris-HCl，0～10mMβ-巯基乙醇，0～1mM二价铜盐，0.95～1.05mMEDTA，pH8.5～10.0。

本申请中所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品，具体见表1。各种试剂和培养基的成分和配置方法可以参见常规实验手册中的描述。各种试剂中各个组分的浓度是基于各试剂总体积的浓度。

表1实验材料的生产厂商和货号

试剂等名称	厂商	货号
			Tris-HCl	Amresco	6976-37-0
GSSG	上海生工	GB0228-5g
			GSH	上海生工	70-18-8
EDTA	阿拉丁	6381-92-6
			β-巯基乙醇	Sigma	M6250-500ML
CuSO₄	阿拉丁	7758-98-7
			EDTA	阿拉丁	6381-92-6
NdeI	TAKARA	D1161A
			HindIII	TAKARA	D1060A
DNA Ligation Kit Solution	TAKARA	D6022A
			卡那霉素	阿拉丁	25389-94-0
BL21(DE3)	NEB	C2527I
			pET-28a	Invitrogen	69864-3
IPTG	阿拉丁	367-93-1
			蛋白质分子量标准I	纽龙生物	NRPA10
尿素	阿拉丁	57-13-6
			咪唑	阿拉丁	288-32-4
镍琼脂糖凝胶层析柱	北京韦氏	CS-A01-0A
			DH5α	Invitrogen	11319-019
凝血酶	阿拉丁	9002-04-4

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对发明较佳实施方式的描述，详细说明制备rhNGF蛋白质的复性方法及复性液，但是不限制本发明。

步骤①：通过工程大肠杆菌表达重组人源神经生长因子蛋白质

一、6组氨酸标签和rhNGF融合蛋白质表达载体的构建

(一)模板、引物和目的基因序列

1、hNGF基因克隆模板：

以pET-32a-NGF质粒作为hNGF基因克隆用模板。

2、hNGF基因克隆引物(南京金斯瑞合成)序列如下：

上游引物：ATACCGCATATGTCATCATCC CATCCCATCTTC 下划线为NdeI酶切位点

下游引物：ATACCGAAGCTTTCATCTCACAGCCTTCCTGCTG 下划线为HindIII酶切位点

3、hNGF目的基因序列：

TCATCCCATCCCATCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATCAAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAAGTGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGACTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGA

(二)hNGF基因的扩增

以pET-32a-NGF为模板、上游引物和下游引物直接对hNGF基因进行PCR扩增。

1、PCR反应体系(50μl)：

TaKaRa PrimeSTAR Premix，25μl；

上游引物，1μl；

下游引物，1μl；

pET-32a-NGF质粒，0.5μl；

ddH2O，22.5μl。

2、PCR扩增条件：

94℃，3min；{94℃，20s；56℃，20s；72℃，90s}，30个循环；72℃，10min；16℃保温。

(三)pET-28a-hNGF重组载体的构建

1、将上述hNGF的PCR产物和带6组氨酸标签的pET-28a载体分别用NdeI/HindIII进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收后通过如下连接体系进行连接：

连接体系(10μl)：

DNA Ligation Kit Solution I，5μl；

pET-28a酶切回收片段，1μl；

hNGF酶切回收片段，4μl；

16℃连接过夜。

2、用以上连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上于37℃培养过夜。

3、挑取单菌落用LB液体培养基培养后提取质粒进行重组质粒的酶切检测。

图1为pET-28a-hNGF重组质粒的酶切检测结果，其中M为DNA分子量标准(纽龙生物)，泳道1为pET-28a-hNGF重组质粒的NdeI/HindIII双酶切结果。图1表明质粒可被NdeI/HindIII双酶切并产生目标条带，说明hNGF的PCR产物与pET-28a载体成功连接。

二、6组氨酸标签和rhNGF融合蛋白质的表达

(一)rhNGF蛋白质的诱导表达检测

1、提取以上步骤(三)中构建正确(南京金斯瑞测序)的pET-28a-hNGF质粒并转化BL21(DE3)菌株。

2、挑取4个BL21(DE3)/pET-28a-hNGF单菌落，用5ml LB(含50μg/ml卡那霉素)于37℃培养4小时，然后添加IPTG(终浓度为1mM)于37℃诱导表达5小时。同时设BL21(DE3)/pET-28a作为阴性对照。

3、上述单菌落分别取800μl菌液于8000rpm离心2min，沉淀用80μl50mM磷酸缓冲液(PBS)重悬，加入20μl上样缓冲液混匀，取10μl进行SDS-PAGE(12％)检测。

图2为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF诱导表达检测结果，其中M为蛋白质分子量标准I，泳道1～4为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF的1～4号单菌落，泳道5为BL21(DE3)/pET-28a对照。从SDS-PAGE检测结果表明，BL21(DE3)/pET-28a-hNGF的4个单菌落在15kDa处均有明显表达。步骤②和③：破碎表达rhNGF蛋白质的菌体和离心收集rhNGF蛋白质的包涵体

1、步骤①中诱导表达rhNGF蛋白质的BL21(DE3)菌液8000rpm离心5分钟，收集诱导表达rhNGF蛋白质的BL21(DE3)菌体，用20ml的50mMTris-HCl(pH 8.0)悬浮后超声破碎：超声3s，间隔5s，超声破碎100次，超声功率为650×0.45W。

2、破碎后的菌体12000rpm离心10分钟，得到的rhNGF蛋白质的包涵体沉淀用20ml的50mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，对上清液和包涵体分别进行SDS-PAGE(12％)检测。

图3为rhNGF蛋白质表达位置检测，其中M为蛋白质分子量标准I，泳道1为BL21(DE3)空菌，泳道2为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF表达菌株于20℃诱导的全菌，泳道3为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF表达菌株于20℃诱导破碎后的沉淀，泳道4为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF表达菌株于20℃诱导破碎后的上清，泳道5为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF表达菌株于37℃诱导的全菌，泳道6为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF表达菌株于37℃诱导破碎后的沉淀，泳道7为BL21(DE3)/pET-28a-hNGF表达菌株于37℃诱导破碎后的上清。由图3可看出，rhNGF蛋白质在不同温度下诱导均有表达；且细胞破碎后经SDS-PAGE检测确定，rhNGF蛋白质均以包涵体的形式表达在沉淀中。

步骤④：rhNGF蛋白质包涵体的变性溶解

一、尿素变性溶解液对rhNGF蛋白质包涵体溶解性的评价

1、rhNGF蛋白质包涵体用100ml漂洗缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1M NaCl，2％Triton X-100，1mM DTT，pH8.0)洗涤一次，12000rpm离心10min，离心得到的沉淀用100ml的50mM Tris-HCl(pH8.0)重悬。

2、分别取1ml上述重悬的包涵体于4个EP管中，12000rpm离心10min，离心得到的沉淀分别用含有2M、4M、6M和8M尿素的1ml包涵体变性溶解液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，2mM DTT，pH8.0)重悬，室温充分溶解2小时。

3、对不同尿素浓度的包涵体溶解后溶液进行SDS-PAGE(12％)检测。

图4为尿素变性溶解液溶解rhNGF蛋白质包涵体的检测结果，其中M为蛋白质分子量标准I，泳道1为菌体破碎后包涵体用漂洗缓冲液洗涤后的上清，泳道2为rhNGF蛋白质包涵体，泳道3～6为分别用含2M、4M、6M和8M尿素的包涵体变性溶解液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，2mM DTT，pH8.0)溶解rhNGF蛋白质包涵体获得的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液。由图4可看出，包涵体变性溶解液(50mM Tris-HCl，8M尿素，2mM EDTA，2mM DTT，pH8.0)能溶解大部分的rhNGF蛋白质包涵体。

二、盐酸胍变性溶解液对rhNGF蛋白质包涵体溶解性的评价

盐酸胍变性溶解液溶解rhNGF蛋白质包涵体的方法同上，不同之处在于上述步骤2中分别用含有2M、4M和6M盐酸胍的1ml包涵体溶解液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，2mM DTT，pH 8.0)代替含有2M、4M、6M和8M尿素的1ml包涵体变性溶解液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，2mMDTT，pH8.0)重悬包涵体。

对不同盐酸胍浓度的包涵体溶解后溶液进行SDS-PAGE(12％)检测。图5为盐酸胍溶解液溶解rhNGF蛋白质包涵体的检测结果，其中M为蛋白质分子量标准I，泳道1为菌体破碎后用漂洗缓冲液洗涤包涵体后的上清液，泳道2为rhNGF蛋白质的包涵体，泳道3～5为分别用含2M、4M和6M盐酸胍的包涵体变性溶解液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，2mM DTT，pH8.0)溶解rhNGF蛋白质包涵体获得的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液。由图5可看出，盐酸胍对rhNGF蛋白质包涵体的溶解效果较差，包涵体溶解液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，6M盐酸胍，2mM DTT，pH8.0)仅能溶解约50％的hNGF蛋白质包涵体。

下面如无特别说明，使用包涵体变性溶解液(50mM Tris-HCl，8M尿素，2mM EDTA，2mM DTT，pH8.0)。

步骤⑤：rhNGF蛋白质的复性

1、取10ml步骤④中得到的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，复性液以大于1080ml/min的流速加入该rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，并混合均匀。

2、将得到的rhNGF蛋白质包涵体的复性溶液于4℃静置4小时以上。

复性率计算方法：将包涵体溶解后溶液充分复性后离心，分离上清液和蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀用50mM Tris-HCl(pH8.0)重悬并调整其体积同上清液相同。取等体积的蛋白质沉淀重悬液和上清液进行SDS-PAGE检测，用BIORAD凝胶成像系统对SDS-PAGE凝胶拍照，用附带软件对各泳道中的各蛋白质条带进行灰度值扫描，上清液中目的蛋白质的灰度值占蛋白质沉淀重悬液和上清液中目的蛋白质灰度值总和的比率即为复性率，即：

复性率＝上清液中目的蛋白质的灰度值/(蛋白质沉淀重悬液中目的蛋白质的灰度值+上清液中目的蛋白质的灰度值)×100％

以下详细介绍复性步骤中影响复性率的各因素。

一、缓慢稀释和瞬间稀释比较

缓慢稀释步骤：将90ml复性液1(50mM Tris-HCl，2mM GSSG，5mM GSH，1mM EDTA，pH 8.6)缓慢加入到10ml步骤④中得到的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液中(流速为0.3ml/min)，边加边搅拌混匀，时间共计5小时。

瞬间稀释步骤：将90ml上述复性液1在5秒内(流速大于1080ml/min)全部加入到10ml步骤④中得到的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液中，摇匀或用玻璃棒搅拌均匀，4℃静置4小时。

缓慢/瞬间稀释后的100ml溶液用透析缓冲液(20mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)透析2次后离心，离心得到的沉淀用10ml透析缓冲液(20mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)悬起。SDS-PAGE检测的复性结果见图6和图7。图6为复性液1缓慢稀释的复性检测，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，泳道2为缓慢稀释后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道3为缓慢稀释后的rhNGF蛋白质包涵体复性后溶液。图7为复性液1瞬间稀释复性的检测，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，泳道2为瞬间稀释后的rhNGF蛋白质包涵体复性后溶液，泳道3为瞬间稀释后的rhNGF蛋白质沉淀。

表2为复性液1的缓慢稀释复性和瞬间稀释复性比较。从图6和图7及表2可得出结论：两种稀释复性方法实验结果差异明显，缓慢稀释复性几乎不能复性目的蛋白质，而瞬间稀释复性能将大部分目的蛋白质复性为可溶状态。

下面如无特别说明，使用瞬间稀释复性的方法。

表2复性液1缓慢稀释复性和瞬间稀释复性比较

二、不同复性液对复性效果的影响

用上述瞬间稀释复性方法分别用复性液1(50mM Tris-HCl，2mMGSSG，5mM GSH，1mM EDTA，pH 8.6)、复性液2(50mM Tris-HCl，5mM β-巯基乙醇，10μM CuSO₄，1mM EDTA，pH9.5)和复性液3(50mMTris-HCl，1mM EDTA，pH9.0)分别对10ml步骤④中得到的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液进行瞬间稀释复性。

方法1：用复性液1进行瞬间稀释复性，10倍稀释；

方法2：用复性液2进行瞬间稀释复性，10倍稀释；

方法3：用复性液3进行瞬间稀释复性，5倍稀释。

图8为使用复性液1和复性液2的rhNGF包涵体的复性结果，其中M为蛋白质分子量标准I，泳道1为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，泳道2为复性液1稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道3为复性液1稀释复性并过滤后的rhNGF蛋白质上清液，泳道4为复性液1稀释复性并透析后的rhNGF蛋白质上清液，泳道5为复性液1稀释复性、透析并过滤后的rhNGF蛋白质上清液，泳道6为复性液2稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道7为复性液2稀释复性并过滤后的rhNGF蛋白质上清液，泳道8为复性液2稀释复性并透析后的rhNGF蛋白质上清液，泳道9为复性液2稀释复性、透析并过滤后的rhNGF蛋白质上清液。图9为使用复性液3的rhNGF包涵体的复性结果，其中M为蛋白质分子量标准I，泳道1为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，泳道2为复性液3稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道3为复性液3稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀。

表3为瞬间稀释复性方法1、方法2与方法3的对比。由表3可看出，方法3使用的复性液的配方最简单，只含有50mM Tris-HCl和1mM EDTA，其复性率高于缓慢复性，但是低于方法1和方法2。方法2的蛋白质复性率优于方法1，且方法2成本为方法1的1/3。

表3不同方法瞬间稀释复性的对比

三、稀释倍数对复性率的影响

分别取10ml步骤④中得到的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液用复性液(包含50mM Tris-HCl，5mM β-巯基乙醇，10μM CuSO₄，1mM EDTA，pH 9.5)进行5倍、10倍和20倍稀释的瞬间稀释复性。其结果见图10。图10中，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，泳道2为复性液瞬间稀释5倍复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道3为复性液瞬间稀释5倍复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道4为复性液瞬间稀释10倍复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道5为复性液瞬间稀释10倍复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道6为复性液瞬间稀释20倍复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道7为复性液瞬间稀释20倍复性后的rhNGF蛋白质沉淀。

表4显示了复性液不同稀释倍数的瞬间稀释复性的复性率。由表4可看出，rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液用复性液进行5～10倍稀释复性效果均较好，5倍稀释复性效果最好，未复性的蛋白质沉淀量最少，复性率为90％。

表4复性液不同稀释倍数的复性率

稀释倍数	复性率
		5倍	90％
10倍	80％
		20倍	70％

四、复性液的pH值对复性率的影响

分别取10ml步骤④中得到的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液用pH8.0、pH8.5、pH9.0、pH9.5和pH10.0的复性液(包含50mM Tris-HCl，5mM β-巯基乙醇，10μM CuSO₄，1mM EDTA)进行瞬间稀释复性(5倍稀释)。结果见图11和图12。图11中，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为pH 8.0的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道2为pH8.0的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道3为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液。图12中，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，泳道2为pH8.5的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道3为pH8.5的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道4为pH9.0的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道5为pH9.0的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道6为pH9.5的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道7为pH9.5的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道8为pH10.0的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道9为pH10.0的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀。

表5显示了不同pH值的复性液的瞬间稀释复性的复性率。由表5可看出，复性液的pH值在8.5～10.0时复性率较高，复性液的pH值在pH9.0～10.0时复性率最高。

表5不同pH值复性液的复性率

复性液的pH值	复性率
		8.0	40％
8.5	80％
		9.0	90％
9.5	90％
		10.0	90％

五、复性液中β-巯基乙醇浓度对复性率的影响

分别取10ml步骤④中得到的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液用含有0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、2.5mM、5mM和10mMβ-巯基乙醇的复性液(包含50mM Tris-HCl，10μM CuSO₄，1mM EDTA，pH9.0)进行瞬间稀释复性(5倍稀释)。结果见图13和图14。图13中，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为包涵体溶解后溶液，泳道2为含0mM β-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道3为含0mMβ-巯基乙醇的复性瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道4为含0.1mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道5为含0.1mM β-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道6为含0.5mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道7为含0.5mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀。图14中，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为含1mMβ-巯基乙醇的复性液稀释后的rhNGF蛋白质上清液，泳道2为含1mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道3为含2.5mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道4为含2.5mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道5为含5mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道6为含5mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道7为含10mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道8为含10mMβ-巯基乙醇的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道9为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液。

表6不同β-巯基乙醇浓度的复性液的复性率

复性液中的β-巯基乙醇浓度	复性率
		0mM	70％
0.1mM	70％
		0.5mM	70％
1mM	70％
		2.5mM	80％
5mM	90％
		10mM	70％

表6显示了不同β-巯基乙醇浓度的复性液的复性率。由表6可看出，复性液中β-巯基乙醇的浓度在2.5～5mM时，复性率较高。β-巯基乙醇浓度是5mM时，复性率最高。

六、复性液中铜离子浓度对复性率的影响

分别取10ml步骤④中得到的rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液用含有0μM、1μM、5μM、10μM、20μM、100μM和1mM CuSO₄的复性液(包含50mM Tris-HCl，5mM β-巯基乙醇，1mM EDTA，pH9.0)进行瞬间稀释复性(5倍稀释)。结果见图15和图16。图15中，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，泳道2为上述含0μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道3为上述含0μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道4为上述含1μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道5为上述含1μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道6为上述含5μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道7为上述含5μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀。图16中，M为蛋白质分子量标准I，泳道1为rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，泳道2为上述含10μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道3为上述含10μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道4为上述含20μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道5为上述含20μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道6为上述含100μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道7为上述含100μM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀，泳道8为上述含1mM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质上清液，泳道9为上述含1mM铜离子的复性液瞬间稀释复性后的rhNGF蛋白质沉淀。

表7不同铜离子浓度的复性液的复性率

复性液中的铜离子浓度	复性率
		0μM	70％
1μM	60％
		5μM	70％
10μM	90％
		20μM	80％
100μM	70％
		1mM	60％

表7显示了不同铜离子浓度的上述复性液的复性率。由表7可看出，最适宜复性的铜离子浓度为10～20μM；在此浓度范围内，复性后的rhNGF蛋白质沉淀中含有的目的蛋白质条带较浅，复性效率较高；铜离子浓度为10μM，复性率最高。

步骤⑥：rhNGF蛋白质的纯化

用镍琼脂糖凝胶层析柱纯化rhNGF蛋白质

1、rhNGF蛋白质包涵体复性上清液用透析缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)透析，然后用0.45μm膜过滤，接着滤液过5ml镍琼脂糖凝胶层析柱。

2、分别用20ml含50mM、100mM、200mM和500mM咪唑的50mMTris-HCl(pH8.0)先后过上述镍琼脂糖凝胶层析柱。

图17为rhNGF蛋白质包涵体的镍琼脂糖凝胶层析柱纯化的检测结果，其中M为蛋白质分子量标准I，泳道1和2分别为过滤前和过滤后的rhNGF蛋白质包涵体复性后上清液，泳道3为复性后rhNGF蛋白质的穿透液，泳道4为50mM咪唑洗脱液，泳道5为100mM咪唑洗脱液，泳道6为200mM咪唑洗脱液，泳道7为500mM咪唑洗脱液。

由图17可看出，可以用含50mM咪唑的50mM Tris-HCl(pH8.0)洗去杂蛋白质，用含200mM咪唑的50mM Tris-HCl(pH8.0)洗脱目的rhNGF融合蛋白质。

洗脱的rhNGF融合蛋白质切除6组氨酸标签后可进行活性检测。对rhNGF融合蛋白质切除6组氨酸标签

1、上述步骤⑥中纯化后的rhNGF融合蛋白质用透析缓冲液(20mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)透析。

2、透析后的rhNGF融合蛋白质使用凝血酶切除6组氨酸标签。

酶切体系：

0.2mg/ml rhNGF融合蛋白质

0.025U/ml 凝血酶

10mM Tris-HCl、pH8.0

20℃酶切16小时，透析去除标签。

图18为rhNGF融合蛋白质切除6组氨酸标签的检测结果，其中M为蛋白质分子量标准I；泳道1为切除标签后的rhNGF蛋白质，蛋白质大小为13.4kDa；泳道2为含有标签的rhNGF融合蛋白质，蛋白质大小为15.6kDa。图18显示了rhNGF融合蛋白质上的6组氨酸标签被切除。

rhNGF蛋白质的生物活性检测

人类SK-N-SH-SY5Y(以下简称SY5Y)细胞在神经生长因子(NGF)的诱导下产生分化，神经轴突不断生长，直至与相邻神经细胞的轴突交联成神经网。因此，可以利用SY5Y细胞检测上述步骤中切除6组氨酸标签的rhNGF蛋白质的生物活性。具体步骤如下：

1、转染了能表达EGFP荧光蛋白质的pEGFP-N3质粒的SY5Y/pEGFP-N3稳定细胞株接种24孔细胞培养板，铺板密度为2×10³个细胞/孔，在含有5％二氧化碳的培养环境中于37℃进行培养。

2、SY5Y/pEGFP-N3细胞经培养24小时后添加rhNGF蛋白质，调整rhNGF蛋白质的终浓度分别为0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml和40ng/ml，每个浓度做4孔重复，每两天换一次细胞培养液。定期用倒置荧光显微镜观察细胞突触生长情况。

3、用上述方法得到的rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞24～48小时时突触生长不明显，处理72小时时添加了rhNGF蛋白质的细胞突触与对照组(0ng/ml rhNGF)相比均有增长，5ng/ml和10ng/ml rhNGF蛋白质处理的细胞突触长度不及20ng/ml和40ng/ml rhNGF蛋白质处理的细胞突触长度，20ng/ml和40ng/ml rhNGF蛋白质处理的细胞突触长度相差不大(rhNGF蛋白质处理72小时效果分别见图19～23)。

4、rhNGF蛋白质处理SY5Y/pEGFP-N3细胞6天时，添加了rhNGF蛋白质的细胞突触与对照组(0ng/ml hNGF)相比增长明显，20ng/ml和40ng/mlrhNGF蛋白质处理的细胞突触长度可以达到500μm以上(20ng/ml rhNGF蛋白质处理的细胞见图24和图25)。

从图19～25中，可得出结论：添加了rhNGF蛋白质的SY5Y细胞突触与对照组相比增长明显。

实施例

实施例1

1、活化后的BL21(DE3)/pET-28a-hNGF表达菌株以1％的接种量用500ml LB(含50μg/ml卡那霉素)于37℃培养4小时，添加IPTG(终浓度为1mM)于37℃诱导表达5小时。

2、8000rpm离心5min收集诱导表达rhNGF蛋白质的BL21(DE3)菌体，用100ml的50mM Tris-HCl(pH 8.0)悬浮收集到的菌体后超声破碎：超声3s，间隔5s，超声破碎100次，超声功率为650×0.45W。

3、超声破碎后的菌体于12000rpm离心10min，收集rhNGF蛋白质包涵体。

4、rhNGF蛋白质包涵体用100ml漂洗缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1M NaCl，2％Triton X-100，1mM DTT，pH8.0)洗涤一次，12000rpm离心10min，沉淀用100ml包涵体变性溶解液(50mM Tris-HCl，8M尿素，2mM EDTA，2mM DTT，pH 8.0)溶解2小时，得到rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液。

5、取10ml rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，将90ml复性液(50mMTris-HCl，2mM GSSG，5mM GSH，1mM EDTA，pH 8.6)在5秒内(流速大于1080ml/min)全部加入该rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液，摇匀或用玻璃棒搅拌均匀，4℃静置4小时，得到rhNGF蛋白质复性后的上清液。

6、rhNGF蛋白质复性后上清液用透析缓冲液(20mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)透析。

7、透析后的rhNGF蛋白质复性后上清液用0.45μm膜过滤，然后滤液过5ml镍琼脂糖凝胶层析柱。

8、用20ml含50mM咪唑的50mM Tris-HCl(pH8.0)从镍琼脂糖凝胶层析柱上洗去杂蛋白质，用20ml含200mM咪唑的50mM Tris-HCl(pH8.0)从镍琼脂糖凝胶层析柱上洗脱目的rhNGF融合蛋白质。

9、对经过步骤7～8纯化后的rhNGF融合蛋白质切除6组氨酸标签。

实施例2～21的方法同上，所用的复性液配方和复性方法见表8。

对比例1的实验方法同实施例1，不同之处在于上述步骤5中，复性液缓慢加入到rhNGF蛋白质包涵体溶解后溶液中(流速为0.3ml/min)，边加边搅拌混匀，时间共计5小时。

上述步骤5中，复性率计算方法见上述步骤⑤。

结果见表8。

表8实施例1～21和对比例1的复性条件和复性率

从表8中可以看出，对比例1采用缓慢稀释的方法，其复性率小于10％；采用瞬间稀释方法的实施例1～21的复性率全部优于对比例1。复性液只包含Tris-HCl和EDTA的实施例2的复性率为50％。复性液包含Tris-HCl、EDTA、GSSG和GSH的实施例1的复性率为70％，复性液包含Tris-HCl、EDTA、CuSO4的实施例3的复性率为70％，复性液包含Tris-HCl、EDTA、β-巯基乙醇实施例4的复性率为70％，复性液包含Tris-HCl、EDTA、CuSO4及β-巯基乙醇的实施例10的复性率为90％。由此可见，含有Tris-HCl、EDTA、CuSO4和β-巯基乙醇的复性液的复性率最高。实施例5～7中，复性液稀释倍数分别是5、10和20，其它条件相同，稀释倍数越小，复性率越高。实施例5和8～11中，pH值分别是9.5、8.0、8.5、9.0和10.0，其它条件相同，pH值大于8.5时，复性率较高，尤其是pH值介于9.0和10.0时，复性率更高。实施例10和12～16中，β-巯基乙醇浓度分别是5、0.1、0.5、1、2.5和10mM，其它条件相同，复性液中β-巯基乙醇的浓度在2.5～5mM时，复性率较高；尤其是5mM时，复性率最高。实施例4、10和17～21中，铜离子的浓度分别是0μM、10μM、1μM、5μM、20μM、100μM和1000μM，其它条件相同，铜离子的浓度在10～20μM时，复性率较高。

在不脱离本发明构思的前提下，进行任何可能的变化或替换均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法，该方法包括步骤①通过工程大肠杆菌表达重组人源神经生长因子蛋白质，②破碎表达所述重组人源神经生长因子蛋白质的工程大肠杆菌菌体，③离心收集所述重组人源神经生长因子蛋白质的包涵体，④利用变性体系变性溶解所述包涵体以形成包涵体溶解后溶液，⑤将复性液加入到所述包涵体溶解后溶液中进行复性，⑥纯化所述重组人源神经生长因子蛋白质，

其中所述复性液以大于1080ml/min的流速加入到所述包涵体溶解后溶液中。

2.如权利要求1所述的制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法，其特征在于所述复性液包含45～55mM Tris-HCl，0～10mMβ-巯基乙醇，0～1mM二价铜盐，0.95～1.05mM EDTA，pH8.5～10.0。

3.如权利要求2所述的制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法，其特征在于所述复性液的pH值为9.0～10.0。

4.如权利要求1所述的制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法，其特征在于所述复性液包含：45～55mM Tris-HCl，1.95～2.05mM GSSG，4.5～5.5mMGSH，0.95～1.05mM EDTA，pH 8.6。

5.如权利要求1～4中任一项所述的制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法，其特征在于步骤⑤中用所述复性液对所述包涵体溶解后溶液进行5～20倍稀释。

6.如权利要求1所述的制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法，其特征在于步骤①中所述重组人源神经生长因子蛋白质和6组氨酸标签融合表达。

7.如权利要求2所述的制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法，其特征在于复性液包含：50mM Tris-HCl，5mM β-巯基乙醇，10μM CuSO₄，1mMEDTA，pH9.0。

8.一种重组人源神经生长因子蛋白质的复性液，其特征在于所述复性液包含：45～55mM Tris-HCl，0～10mMβ-巯基乙醇，0～1mM二价铜盐，0.95～1.05mMEDTA，pH8.5～10.0。

9.如权利要求8所述的重组人源神经生长因子蛋白质的复性液，其特征在于所述复性液的pH值为9.0～10.0。

10.如权利要求8所述的重组人源神经生长因子蛋白质的复性液，其特征在于所述复性液包含：50mM Tris-HCl，5mM β-巯基乙醇，10μM CuSO₄，1mMEDTA，pH9.0。