CN1334271A - 用新的复性方法制备重组人神经生长因子 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用二硫键异构酶PDI促进变性的重组人神经生长因子(rhNGF)正确折叠并提高其复性率的新型方法。在rhNGF的复性体系中加入一定比例的PDI,可以使rhNGF中错误配对的二硫键打开并形成正确的二硫键,从而提高复性率,降低异构体比例,简化后续纯化工艺,提高rhNGF产率。
Description
本发明属医药领域中的重组蛋白质药物。
重组人神经生长因子(human nerve growth factor，简称rhNGF)是一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向。对促进大脑的发育，神经系统的生长，损伤神经的再生和功能恢复具有重要作用。
rhNGF可应用于糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤，周围神经损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病，是目前可应用于临床的神经系统蛋白质因子。人神经生长因子在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能，以前人们试图从小鼠中提取鼠源NGF，但存在种属差异及致病微生物污染的问题。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子是唯一的选择。
因为rhNGF不含糖基化位点，可以用大肠杆菌来表达。我们构建了高效表达rhNGF的工程菌以表达rhNGF。由于rhNGF含有三对二硫键，用细菌表达的rhNGF形成包含体形式，溶解变性后用常规方法复性很难正确折叠和复性成活性形式，产率很低。这是由于组成三对二硫键的六个半胱氨酸在复性时错误配对造成的。为了提高变性rhNGF的复性率，我们发明了用二硫键异构酶(PDI)促进复性的生产工艺，我们在rhNGF的复性体系中加入重组人二硫键异构酶(rhPDI)，使错配的二硫键打开重新形成正确的二硫键，从而提高复性率，最终提高rhNGF的产率，降低成本，并可应用于工业化生产。
本发明的原理：二硫键异构酶PDI可以特异性地作用于蛋白分子中错配的二硫键，打开该错配二硫键，并促进其形成正确配对的二硫键，完成分子结构重排，形成正确活性形式，达到复性目的。
本发明的目的：使用二硫键异构酶催化变性的rhNGF形成正确配对的二硫键，从而复性成正确的有活性的分子构型。这样可提高rhNGF的复性率，降低异构体比例，简化后续纯化步骤，由此提高rhNGF的产率，降低生产成本。
技术方案：用工程菌表达rhNGF→菌体破碎→包含体分离→尿素变性溶解→在复性体系中按一定比例加入重组人PDI以催化rhNGF的复性→脱盐→阳离子交换层析。经上述步骤，即可制备得到纯度大于95％，具天然生物学活性的rhNGF。
最佳实施例：
rhNGF的复性体系如下：25mM Tris，pH7～10，1mM EDTA，rhNGF蛋白浓度0.1～1mg/ml。在此复性体系中加入重组人二硫键异构酶PDI，使rhNGF与PDI的摩尔比为100∶1～10∶1。在加入PDI的复性体系中进行复性，rhNGF的复性率比不加PDI时有显著提高，二硫键错配造成的异构体比例大大降低，rhNGF的终产率也相应提高。
rhNGF制备方法如下：将表达后的rhNGF工程菌菌体离心收集，悬浮于25mM Tris，pH8.0，超声破碎并10000×g，30分钟离心后制得rhNGF包含体。包含体用8M尿素，25mM Tris，1mM EDTA充分溶解后，10000×g，30分钟离心，取上清，即为变性的rhNGF。
将变性的rhNGF逐滴滴入己加PDI的复性体系中，使得rhNGF终浓度达到0.5mg/ml，室温下放置过夜。将上述复性液用脱盐柱脱盐后，再经过CM-Sepharose柱层析纯化(平衡缓冲：20mM PB，pH6.0，0～1MNaCl线性梯度洗脱)，得到纯度＞95％，具天然生物学活性的rhNGF。
本发明的优点：本发明提供了一种用PDI促进变性的rhNGF折叠复性以制备rhNGF的新型工艺方法。它与传统的rhNGF生产工艺相比具有以下特点：①变性rhNGF的复性率提高。②复性体系中rhNGF蛋白浓度可以提高，复性体积减少，操作方便，节省试剂。③异构体比例低，简化了后续纯化步骤。④提高rhNGF产率，降低生产成本。上述优势使本发明具有明显的技术创新性与工艺先进性，成本降低，更适合于工业化生产rhNGF。
Claims (5)
1、用一种新的复性方法制备重组人神经生长因子(简称rhNGF)。其特征在于在变性rhNGF的复性体系中加入二硫键异构酶，以提高rhNGF的复性率。
2、重组人神经生长因子(rhNGF)的制备工艺，其特征在于经过工程菌表达→菌体破碎→包含体分离→变性→PDI催化复性→脱盐→阳离子交换层析等步骤完成。
3、如权利要求2所述的重组人神经生长因子(rhNGF)的变性，其特征在于用尿素作为变性剂，变性体系含1～10M尿素，5～50mM Tris，0.5～5mM EDTA，pH7～10。
4、如权利要求2所述的PDI催化的重组人神经生长因子(rhNGF)的复性，其特征在于PDI为重组人PDI或其它来源的PDI，rhNGF与PDI的摩尔比为100∶1～10∶1。
5、如权利要求2所述的阳离子交换层析，其特征在于采用CM-Sepharose阳离子交换柱，洗脱条件是0～1M NaCl，pH4～8，最佳洗脱浓度是0.3～0.4M NaCl。
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