CN1299822A - 用新的复性方法制备组织型纤溶酶原激活剂重组异构体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用二硫键异构酶PDI促进变性的组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体(r－PA)正确折叠并提高其复性率的新型方法。在r－PA的复性体系中加入一定比例的PDI,可以使r－PA中错误配对的二硫键打开并形成正确的二硫键,从而提高复性率,降低异构体比例,简化后续纯化工艺,提高r－PA产率。
Description
本发明属医药领域中的重组蛋白质药物。
组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的39KD重组异构体(简称r-PA)是t-PA的一种分子改造衍生物。它包含有野生型t-PA的Kringle 2结构域和蛋白酶结构域，不含糖基化位点。r-PA具有t-PA的溶血栓活性，但半衰期延长，并且出血副作用小，比t-PA具有使用方便、安全、经济的优势，是取代t-PA的理想溶血栓药物。
因为r-PA不含糖基化位点，可以用大肠杆菌来表达。我们构建了高效表达r-PA的工程菌以表达r-PA。由于r-PA含有十对二硫键，用细菌表达的r-PA形成包含体形式，溶解变性后用常规方法复性很难正确折叠和复性成活性形式。这是由于组成十对二硫键的20个半胱氨酸在复性时错误配对造成的。为了提高变性r-PA的复性率，我们发明了用二硫键异构酶(PDI)促进复性的生产工艺，我们在r-PA的复性体系中加入重组人二硫键异构酶(rhPDI)，使错配的二硫键打开重新形成正确的二硫键，从而提高复性率，最终提高r-PA的产率，降低成本，并可应用于工业化生产。
本发明原理是：二硫键异构酶PDI可以特异性地作用于蛋白分子中错配的二硫键，打开该错配二硫键，并促进其形成正确配对的二硫键，完成分子结构重排，形成正确活性形式，达到复性目的。
本发明的目的：使用二硫键异构酶催化变性的r-PA形成正确配对的二硫键，从而复性成正确的有活性的分子构型。这样可提高r-PA的复性率，降低异构体比例，简化后续纯化步骤，由此提高r-PA的产率，降低生产成本。
技术方案：用工程菌表达r-PA→菌体破碎→包含体分离→盐酸胍变性溶解→在复性体系中按一定比例加入重组人PDI以催化r-PA的复性→脱盐→亲和层析→阳离子交换层析，经上述步骤，即可制备得到纯度大于95％，比活性达到6×105IU/mg的r-PA。
最佳实施例：
r-PA复性体系如下：50mMTris,pH7～10，氧化型谷胱甘肽10～1mM，还原型谷胱甘肽1～0.1mM,r-PA蛋白浓度0.01～1mg/ml。在此复性体系中加入重组人二硫键异构酶PDI，使r-PA与PDI的摩尔比为100∶1～10∶1。在加入PDI的复性体系中进行复性，r-PA的复性率比不加PDI时有显著提高，二硫键错配造成的异构体比例大大降低，r-PA的终产率也相应提高。
r-PA制备方法如下：将表达后的r-PA工程菌菌体离心收集，悬浮于50mM Tris,pH8.0，超声破碎并10000×g，30分钟离心后制得r-PA包含体。包含体用6M盐酸胍，50mM Tris,100mMDTT充分溶解后，10000×g，30分钟离心，取上清，即为变性的r-PA。
将变性的r-PA逐滴滴入加入PDI的复性体系中，使得r-PA终浓度达到0.1mg/ml，室温下放置过夜。将上述复性液超滤脱盐后，用亲和层析柱纯化，再经过CM-Sepharose柱层析(平衡缓冲：20mM PB,pH6.0,0～1MNaCl线性梯度洗脱)，得到纯度＞95％，比活性＞6×105IU/mg的r-PA。
本发明的优点：本发明提供了一种用PDI促进变性r-PA折叠复性以制备r-PA的新型工艺方法。它与国外传统的r-PA生产工艺相比具有以下特点：①变性r-PA复性率高。②复性体系中r-PA蛋白浓度提高，复性体积减少，操作方便，节省试剂。③异构体比例低，简化了后续纯化步骤。④提高r-PA产率，降低生产成本。上述优势使本发明具有明显的技术创新性与工艺先进性，成本降低，更适合于工业化生产r-PA。
Claims (5)
1、用一种新的复性方法制备组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体(r-PA)。其特征在于在变性r-PA的复性体系中加入二硫键异构酶，以提高r-PA的复性率。
2、组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体(r-PA)的制备工艺，其特征在于经过工程菌表达→菌体破碎→包含体分离→变性→PDI催化复性→脱盐→亲和层析→阳离子交换层析等步骤完成。
3、如权利要求2所述的组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体(r-PA)的变性，其特征在于用盐酸胍作为变性剂，变性体系含6M盐酸胍，20～100mM Tris,10～100mM DTT,pH7～10。
4、如权利要求2所述的PDI催化的组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体(r-PA)的复性，其特征在于PDI为重组人PDI或其它来源的PDI,r-PA与PDI的摩尔比为100∶1～10∶1。
5、如权利要求2所述的阳离子交换层析，其特征在于采用CM-Sepharose阳离子交换柱，洗脱条件是0～1M NaCl,pH7～10，最佳洗脱浓度是0.2～0.3M NaCl。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 99120415 CN1299822A (zh) | 1999-12-13 | 1999-12-13 | 用新的复性方法制备组织型纤溶酶原激活剂重组异构体 |
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| CN 99120415 CN1299822A (zh) | 1999-12-13 | 1999-12-13 | 用新的复性方法制备组织型纤溶酶原激活剂重组异构体 |
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| CN 99120415 Pending CN1299822A (zh) | 1999-12-13 | 1999-12-13 | 用新的复性方法制备组织型纤溶酶原激活剂重组异构体 |
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| CN (1) | CN1299822A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100336824C (zh) * | 2005-12-19 | 2007-09-12 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 一种重组蛋白的高效变复性的方法 |
| CN110387365A (zh) * | 2018-04-19 | 2019-10-29 | 山东博创生物科技有限公司 | 基因工程组织型纤溶酶原激活剂重组异构体（nt-PA）包涵体的复性方法 |
-
1999
- 1999-12-13 CN CN 99120415 patent/CN1299822A/zh active Pending
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| CN100336824C (zh) * | 2005-12-19 | 2007-09-12 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 一种重组蛋白的高效变复性的方法 |
| CN110387365A (zh) * | 2018-04-19 | 2019-10-29 | 山东博创生物科技有限公司 | 基因工程组织型纤溶酶原激活剂重组异构体（nt-PA）包涵体的复性方法 |
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