JP4168135B2 - 特性を改変した蛋白質の作出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特性を改変した蛋白質の作出方法に関する。詳しくは、２種類以上の不活性な断片化蛋白質を混合し、混合状態のままリフォールディングさせることにより、特性を改変した活性型蛋白質を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、蛋白質（酵素）の特性を改変することは、非常に困難であった。一部には、遺伝子レベルで改変する手法（非特許文献１）もあるが、「蛋白質（酵素）を構成する数百のアミノ酸残基のうち、どのアミノ酸残基をどのように変換すれば、所望する改変活性を有する酵素が得られるか」、といった予測手法がほとんど見あたらないことから、遺伝子レベルでの蛋白質（酵素）改変には多大な時間と労力を要した（非特許文献２）。
一方、複数酵素を対象にその遺伝子を置換し、キメラ遺伝子を構築し、得られたキメラ遺伝子を発現することにより、両親酵素とは異なった特性を有するキメラ酵素を取得する技術も開発されている（非特許文献３）。しかし、この方法では、遺伝子置換を一つずつ実施する必要があり、容易ではない。
また、蛋白質を人為的に断片化し、得られた断片化蛋白質を混合し、共存リフォールディングにより活性型の蛋白質（酵素）を得ることは、試みられていなかった。
【０００３】
【非特許文献１】
生物化学実験法40、「蛋白質工学研究法」、井本泰治著、学会出版センター発行、「変異蛋白質の調製」p55-70、ISBN4-7622-9822-0(1996)
【非特許文献２】
ゲノム微生物学、木村 光編、シュプリンガー・フェアラーク発行、「8.蛋白質工学」、p181-196、ISBN4-431-70840-5(1999)
【非特許文献３】
K. Hayashi et al., J. Mol. Cat. B: Enzym., vol.11,p811-816(2001)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、断片化され、活性を有していない蛋白質の２種類以上を共存させ、リフォールディングすることにより活性型の蛋白質、すなわち特性の改変された蛋白質を得る方法を開発することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングすることを特徴とする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法である。
請求項２記載の本発明は、異なる生物種由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法である。
請求項３記載の本発明は、同一生物種由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法である。
請求項５記載の本発明は、同一のβ−グルコシダーゼ由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングすることによる、β−グルコシダーゼの至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変する方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明では、まず、既存技術を活用して目的蛋白質（酵素）の遺伝子を断片化して発現する系を構築する。構築した遺伝子断片を発現することにより断片化蛋白質を得る。次いで、この断片化蛋白質を２種類以上混合した後、混合状態のままリフォールディング（共存リフォールディング）することにより活性型蛋白質（酵素）を得る。
この場合、用いる断片化蛋白質の種類は、２種類が最少であり、混合する種類が多ければ多いほど、多様な活性型蛋白質（酵素）が得られる。通常は２〜１００種類の断片化蛋白質を混合する。
本発明の対象とされる蛋白質としては、酵素蛋白質が代表的なものであり、植物、動物、微生物などの各種起源のものが適用される。酵素蛋白質としては、糖質分解酵素、蛋白質分解酵素、脂質分解酵素、異性化酵素、酸化酵素、還元酵素などが挙げられる。また、糖質分解酵素としては、グルコシダーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼなどがある。
【０００７】
共存リフォールディングによって得られた活性型蛋白質（酵素）のｐＨ安定性、熱安定性、反応の至適ｐＨ、至適温度、基質特異性、蛋白質（酵素）安定剤の必要の有無等の蛋白質（酵素）の化学的性質は、遺伝子断片化に用いた両親の蛋白質（酵素）とは異なっていることから、本発明によれば、特性が改変された蛋白質（酵素）が得られる。
【０００８】
本発明におけるリフォールディングの方法としては、変性透析法、カラム吸着法、環状糖質活用法等が適用できる。これらの方法について説明する。
（１）変性透析法
２種類以上の断片化蛋白質を合計で、通常は０．０５〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌとなるように変性溶液に溶解する。変性溶液は、変性剤、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤などを含む。
変性剤としては、塩酸グアニジン、尿素等の蛋白質の構造を解きほぐす作用を有する化合物が使用できる。塩酸グアニジンを用いる場合には、その濃度は通常は１〜８Ｍ、好ましくは５〜７Ｍである。尿素を用いる場合には、その濃度は通常は１〜１０Ｍ、好ましくは６〜９Ｍである。
緩衝剤としては、溶液のｐＨを一定に保つ作用を有する化合物が使用でき、例えば酢酸、クエン酸、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの他、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝剤などがある。その濃度は通常は１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭであり、緩衝液のｐＨは通常は１〜１４、好ましくは４〜１１、より好ましくは６〜１０である。
【０００９】
還元剤としては、グルタチオン、メルカプトエタノール、ジチオオスレイトール等の蛋白質内部のジスルフィド結合を還元する作用を有する化合物が使用できる。その濃度は、特に限定されるものではないが、通常は０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。
次に、酸化剤としては、酸化型グルタチオン等の蛋白質内部のジスルフィド結合を酸化する作用を有する化合物が使用できる。その濃度は、特に限定されるものではないが、通常は０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。
【００１０】
変性溶液に溶解した状態の蛋白質断片は、その立体構造が破壊されていることから、蛋白分解酵素の作用を受けやすい。そこで、わずかに混在する蛋白分解酵素の作用を阻止するために、ベンザミジン、フェニルメチルスルフォニルフルオリド、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオリド、アンチパイン、キモスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、ホスホラミドン、アプロチニンＥＤＴＡ、ラクタスタチン、セルピン等のタンパク質分解酵素阻害剤を用いる。該阻害剤の濃度は、特に限定されるものではないが、通常は０．０００１〜１０ｍＭ、好ましくは０．０１〜１ｍＭである。
安定剤としては、断片化蛋白質並びにリフォールディングされた蛋白質の安定化を促す作用を有する化合物、すなわちグリセロール等の多価アルコールや基質類似物等が使用できる。
【００１１】
変性溶液に溶解した断片化蛋白質を透析膜内部に入れ、透析を開始する。透析温度は、通常は−２０〜９０℃、好ましくは０〜５０℃、より好ましくは４〜３０℃である。透析膜としては、断片化蛋白質は保持するが、塩類等の低分子は透過する性質を有する膜が使用できる。代表的な透析膜としては、再生セルロース膜、酢酸セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ポリメチルメタクリレート膜、エチレンビニルアルコール膜、ポリスルホン膜、ポリアミド膜、ポリエステル系ポリマーアロイ膜、ハイパフォーマンス膜等が使用できる。
透析を開始し、一定の時間が経過した際に、透析外液を下記の外液１、外液２、外液３、外液４と逐次、交換する。交換までの放置時間（透析時間）は、通常は１分〜４８時間、好ましくは１時間〜１６時間、より好ましくは３時間〜１６時間である。
【００１２】
外液１：断片化蛋白質の溶解に用いた変性溶液中の変性剤の濃度を、通常は５〜１００％、好ましくは１０〜２０％減少させた溶液。なお、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤は、先に用いた変性溶液と、好ましくは同じ濃度とするが、必要に応じて緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤の一部もしくは全部の濃度を変えることも有効である。
外液２：外液１に用いた変性溶液中の変性剤の濃度を、通常は５〜１００％、好ましくは１０〜２０％減少させた溶液。この場合も、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤は、先に用いた変性溶液と、好ましくは同じ濃度とするが、必要に応じ、これらの一部もしくは全部の濃度を変えることも有効である。
【００１３】
外液３：外液２に用いた変性溶液中の変性剤の濃度を、通常は５〜１００％、好ましくは１０〜２０％減少させた溶液。なお、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤の各濃度については、先に用いた変性溶液と、同じとすることが好ましいけれども、必要に応じて緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤の一部もしくは全部の濃度を変えることも有効である。
外液４：外液３に用いた変性溶液中の変性剤の濃度を、通常は５〜１００％、好ましくは１０〜２０％減少させた溶液。緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤の各濃度については、先に用いた変性溶液と、同じ濃度とすることが好ましい。しかし、必要に応じてこれらの一部もしくは全部の濃度を変えることも有効である。
以下、順次、変性剤の濃度が低下した一連の外液を調製する。外液の種類は、通常は１〜２０種類、好ましくは４〜１０種類である。
【００１４】
透析方法及び透析外液の具体的な例を以下に示す。
断片化蛋白質を変性溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解し、これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００１５】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５０倍とした。また、交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、２〜９割であった。酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換後、１２時間後に認められた。
得られた共存リフォールディング活性型酵素をｐＨ６．５、５０ｍＭ ＭＯＰＳ塩酸緩衝液で平衡化したMONO-Qイオン交換カラム（０〜０．５Ｍ 塩化ナトリウムグラジエント）で精製後、その特性を解析した。
【００１６】
（２）カラム吸着法
断片化蛋白質を、上記の変性溶液に溶解後、カラムに充填した樹脂（カラム樹脂）に吸着させる方法である。カラム樹脂に吸着後、順次、カラムに上記の外液１、外液２、外液３、外液４等を流す。なお、外液を順に流す代わりに、変性剤の濃度が連続的に変化するよう、グラジエントを作出して流す方法も有効である。この方法により、カラム樹脂に吸着された状態で、断片化蛋白質をリフォールディングすることが可能である。カラム樹脂としては、キレート樹脂、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、アフィニティー樹脂等が使用できる。
【００１７】
（３）環状糖質活用法
断片化蛋白質を、上記の変性溶液に溶解後、希釈溶液を加える。希釈溶液は、界面活性剤、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤を含む。
希釈溶液の添加量は、変性溶液の通常は２〜１００００倍、好ましくは５０〜５００倍である。この過程で、変性剤濃度が低下し、変性状態の断片化蛋白質は凝集沈澱するが、希釈溶液に含まれる界面活性剤等がその凝集沈澱を防止する。界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤が使用できる。その濃度は、通常は０．０００１〜１０％、好ましくは０．０１〜１％である。
緩衝剤としては、溶液のｐＨを一定に保つ作用を有する化合物が使用できる。その濃度は、通常は１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭで、緩衝液のｐＨは通常は１〜１４、好ましくは４〜１１、より好ましくは６〜１０である。還元剤としては、グルタチオン、メルカプトエタノール、ジチオオスレイトール等の蛋白質内部のジスルフィド結合を還元する作用を有する化合物を使用することができ、その濃度は、通常は０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。
酸化剤としては、酸化型グルタチオン等の蛋白質内部のジスルフィド結合を酸化する作用を有する化合物が使用できる。その濃度は、通常は０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。
【００１８】
変性溶液に溶解した状態の蛋白質断片は、その立体構造が破壊されていることから、蛋白分解酵素の作用を受けやすい。それ故、わずかに混在する蛋白分解酵素の作用を阻止するために、ベンザミジン、フェニルメチルスルフォニルフルオリド、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオリド、アンチパイン、キモスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンA 、ホスホラミドン、アプロチニンEDTA、ラクタスタチン、セルピン等のタンパク質分解酵素阻害剤を用いる。その濃度は、通常は０．０００１〜１０ｍＭ、好ましくは０．０１〜１ｍＭである。
安定剤としては、断片化蛋白質並びにリフォールディングされた蛋白質の安定化を促す作用を有する化合物、例えばグリセロール等の多価アルコールや基質類似物等が使用できる。
【００１９】
希釈溶液に、吸着剤溶液を加えることによりリフォールディングが完了する。吸着剤溶液は、蛋白質断片に吸着している界面活性剤の一部（あるいは全部）を吸着除去する作用を有する吸着剤を含む。吸着剤としては、環状糖質（例えばサイクロデキストリン、サイクロアミロース）、澱粉の部分分解物、イオン交換樹脂等の界面活性剤の吸着能（または包接能）を有する物質が使用できる。
【００２０】
【実施例】
以下に、実施例を示して本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１
Thermotoga maritima 由来のβ−グルコシダーゼ
（１）分断遺伝子と断片化蛋白質の調製
Thermotoga maritima 由来のβ−グルコシダーゼは、７２１残基のアミノ酸で構成されている。本酵素の遺伝子をほぼ中央付近で切断し、以下の４種のＮ末端断片化蛋白質と４種のＣ末端断片化蛋白質が得られるように（図１）、遺伝子を設計した。
また、遺伝子レベルで工夫し、Ｎ末端断片化蛋白質にはＮ末端に６残基のヒスチジンから構成されるHis タグを、Ｃ末端断片化蛋白質にはＣ末端に６残基のヒスチジンから構成されるHis タグを付与した。なお、上記のアミノ酸配列の順番には、天然型の酵素のアミノ酸配列の順番を用いており、His タグを構成するアミノ酸残基は数えていない。
【００２１】
４種類のＮ末端断片化蛋白質の遺伝子
１番目〜３７０番目の残基で構成されるTmＮ370 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４０３番目の残基で構成されるTmＮ403 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４１９番目の残基で構成されるTmＮ419 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４３５番目の残基で構成されるTmＮ435 断片化蛋白質の遺伝子、
【００２２】
４種類のＣ末端断片化蛋白質の遺伝子
３７１番目〜７２１番目の残基で構成されるTmＣ371 断片化蛋白質の遺伝子、
４０４番目〜７２１番目の残基で構成されるTmＣ404 断片化蛋白質の遺伝子、
４２０番目〜７２１番目の残基で構成されるTmＣ420 断片化蛋白質の遺伝子、
４３６番目〜７２１番目の残基で構成されるTmＣ436 断片化蛋白質の遺伝子、
【００２３】
なお、本酵素の活性中心アミノ酸残基は２４２番目のアスパラギン酸残基（求核／塩基残基）並びに５２４番目のグルタミン酸残基（水素供与体残基）であると推察されている。このうちのアスパラギン酸残基はＮ末端断片化蛋白質に、５２４番目のグルタミン酸残基はＣ末端断片化蛋白質に存在している。すなわち、蛋白質の断片化により、活性中心アミノ酸残基も分断されたのである。
【００２４】
断片化蛋白質の調製
得られた断片化蛋白質の遺伝子を大腸菌で発現させ、断片化蛋白質を調製した。断片化蛋白質の発現には、断片化蛋白質がなるべく封入体とならないように、蛋白合成の遅い２０℃で大腸菌を培養し、誘導に用いるIPTG濃度も通常の１ｍＭではなく、０．１ｍＭという低濃度で、発現を穏やかに誘導するよう工夫した。しかしながら、得られた断片化蛋白質は、すべて水不溶性の封入体として得られた。当然のことながら、この段階で酵素活性を示す断片化蛋白質は認められなかった。
そこで、封入体を８Ｍ 尿素に可溶化後、キレートカラムを用いて、８種の断片化蛋白質をそれぞれ精製した。精製断片化蛋白質は、ＳＤＳゲル電気泳動で、単一バンドを示し、高度に精製されていることが分かった。
【００２５】
（２）断片化蛋白質の、個別のリフォールディング
得られた８種の精製断片化蛋白質をそれぞれ、個別にリフォールディングしたが、８種類のいずれの断片化蛋白質も、酵素活性を示さなかった。リフォールディング条件は、以下の各種条件を組み合わせて検討した。
リフォールディング条件
変性剤：８Ｍ 尿素あるいは６Ｍ 塩酸グアニジン
温度は、４、１０、２０、３０、４０または５０℃とした。
ｐＨは、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０とした。
蛋白質濃度は、０．１、０．３、１または３ｍｇ／ｍｌとした。
蛋白質のジスルフィド結合の形成を促進する試薬として、１．６ｍｇ／ｍｌ酸化型グルタチオン、１．０ｍｇ／ｍｌ還元型グルタチオンまたは０．５％メルカプトエタノールの存在の有無
金属キレート試薬として１ｍＭ ＥＤＴＡの存在の有無
４日間かけて透析し、変性剤の濃度を徐々に低下させる。
透析期間中、透析内部溶液を約１２時間毎に少量取り出し、酵素活性を測定する。
【００２６】
酵素活性測定方法
基質として２．５ｍＭ パラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドを６２．５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、３０℃に保温した水溶液０．４ｍｌに、酵素溶液を０．１ｍｌ加え、３０℃で１０分間反応させた。反応後、酵素作用により遊離するパラニトロフェノールの量を、分光光度計（波長４０５ｎｍ）で測定した。
【００２７】
（３）８種の断片化蛋白質を混合し、共存リフォールディング
先に精製した８種の断片化蛋白質を混合し、それらが共存する溶液をリフォールディングしたところ、酵素活性が認められた。通常の使用では、この画分を改変酵素として使用できる。
ここでは、この段階で、どの組み合わせの断片化蛋白質が、一緒になり活性型となったか、また酵素の特性がどのように変化したかを明瞭にするため、さらに以下の実験を行った。
【００２８】
（４）断片化蛋白質をＮ末端断片化蛋白質１個とＣ末端断片化蛋白質１個を組み合わせ、共存リフォールディング
Ｎ末端断片化蛋白質は４種類、Ｃ末端断片化蛋白質は４種類存在することから、Ｎ末端断片化蛋白質１個とＣ末端断片化蛋白質１個での共存リフォールディングする組み合わせは合計で１６通りとなる。そこで、１６通りの組み合わせで、共存リフォールディングを行った。
その結果、１６通りの組み合わせのすべてにおいて活性型が得られた。
そこで、１６通りの組み合わせの内、代表的な以下の４通りの組み合わせの酵素について、さらに詳細な検討を加えた。
【００２９】
TmＮ370 断片化蛋白質とTmＣ371 断片化蛋白質との２種を共存リフォールディングして活性型となった蛋白質を、TmN370/TmC371 酵素と命名した。
TmＮ403 断片化蛋白質とTmＣ404 断片化蛋白質との２種を共存リフォールディングして活性型となった蛋白質を、TmN403/TmC404 酵素と命名した。
TmＮ419 断片化蛋白質とTmＣ420 断片化蛋白質との２種を共存リフォールディングして活性型となった蛋白質を、TmN419/TmC420 酵素と命名した。
TmＮ435 断片化蛋白質とTmＣ436 断片化蛋白質との２種を共存リフォールディングして活性型となった蛋白質を、TmN435/TmC436 酵素と命名した。
【００３０】
なお、共存リフォールディングの例としては、以下の通りである。
２種の封入体蛋白質を合計で約２ｍｇ／ｍｌとなるように６Ｍ 塩酸グアニジン（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解する。これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
【００３１】
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００３２】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５０倍とした。また、交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、２〜９割であった。酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換してから、１２時間後に認められた。
得られた共存リフォールディング活性型酵素をｐＨ６．５、５０ｍＭ ＭＯＰＳ塩酸緩衝液で平衡化したMONO-Qイオン交換カラム（０〜０．５Ｍ 塩化ナトリウムグラジエント）で精製後、その特性を解析した。
【００３３】
共存リフォールディング活性型酵素４種の構成蛋白質の確認
先に得られた共存リフォールディング活性型酵素４種を、ＳＤＳゲル電気泳動で分析した（図２）。親酵素は１本のバンドとなったが、共存リフォールディング活性型酵素は、それぞれ２本のバンドを与えた。いずれの共存リフォールディング酵素においても、２本のバンドの強度がほぼ等しいことから、２つの成分の構成比は１：１であることが推察された。
さらに、これらのバンドを膜にブロッティングし、アミノ酸配列を解析した。その結果、TmN370/TmC371 酵素は、TmＮ370 断片化蛋白質とTmＣ371 断片化蛋白質との２種から、TmN403/TmC404 酵素は、TmＮ403 断片化蛋白質とTmＣ404 断片化蛋白質との２種から、TmN419/TmC420 酵素はTmＮ419 断片化蛋白質とTmＣ420 断片化蛋白質との２種から、TmN435/TmC436 酵素はTmＮ435 断片化蛋白質とTmＣ436 断片化蛋白質との２種から構成されていることが確認された。
【００３４】
すなわち、共存リフォールディングにより活性型となった４種類の酵素は、いずれも、共存する断片化蛋白質が、ほぼ１：１の割合で再構成されていた。また、４種の共存リフォールディング活性型酵素のＣＤスペクトルを測定したところ、親酵素と類似しており、親酵素に類似の立体構造を保持していることが推察された。
【００３５】
本酵素の活性中心アミノ酸残基は２４２番目のアスパラギン酸残基（求核／塩基残基）並びに５２４番目のグルタミン酸残基（水素供与体残基）であり、酵素が活性を示すためには、この２つの活性中心アミノ酸残基の立体配置は、極めて重要である。蛋白質の断片化により、２つの断片化蛋白質に分断され、その立体配置情報は、一旦は完全に失われた。しかし、共存リフォールディングにより活性型となった酵素では、２つの活性中心アミノ酸残基は、ほぼ天然型に近い位置に回復したことが推察される。
【００３６】
次に、精製した共存リフォールディング活性型酵素４種と親酵素の特性を解析した。
反応の至適ｐＨ
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素を３０℃、１０分間、５０ｍＭの各種緩衝液で反応させた際の反応の至適ｐＨを、図３に示した。至適となる酵素反応のｐＨは、親酵素では３．５〜４．０であった。TmN403/TmC404 、TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素は、至適ｐＨが親酵素と同等であったが、TmN370/TmC371 酵素では、ｐＨ５．２で親酵素と大きく異なっていた。
TmN370/TmC371 酵素では、反応の至適温度が中性側に１．５程度シフトし、親酵素と異なっていることが明らかとなった。また、酵素を使用する際には、その条件により、望ましい反応の至適ｐＨ値は異なることから、これらのうち、どれが優れていると判定は出来ないが、ここでは、反応の至適ｐＨに多様性が導入されている点が重要である。
【００３７】
酵素のｐＨ安定性
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素を３０℃、３０分間、５０ｍＭの各種緩衝液で処理した際の残存活性をｐＨ安定性とし、図４に示した。４種の共存リフォールディング酵素はｐＨ４〜１１の非常に広範囲のｐＨで安定であり、親酵素とほぼ同等のｐＨ安定性を示した。ｐＨ安定性が大きく低下していないことは重要である。
【００３８】
反応の至適温度
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素を、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．７）で１０分間、種々の温度で反応させた場合の、反応の至適温度を図５に示した。
酵素活性が至適となる酵素反応の温度は、親酵素では８５℃であった。TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素の至適温度は、親酵素と同等の８５℃であったが、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 酵素では、それぞれ６５℃、７０℃であり、親酵素とは異なっていた。
TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 酵素では、反応の至適温度が１５〜２０℃低下しているが、通常の産業利用での酵素反応は、雑菌繁殖防止の観点から５０℃程度で行われているので、その低下は大きな障害とはならない。ここでは、反応の至適温度に多様性が導入されている点が重要である。
【００３９】
酵素の温度安定性
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素を、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．７）で３０分間、種々の温度で加熱し、その残存活性を温度安定性として図６に示した。酵素活性が５０％となる熱処理温度は、親酵素では８５℃であった。TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素は、親酵素と同等の８５℃であったが、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 酵素では、それぞれ７５℃、８０℃で、親酵素とは異なっていた。
親酵素のように温度安定性が８５℃とあまりに高いと、酵素作用が不要となった際に、加熱失活させ難いことが欠点として挙げられる。一方、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 酵素では、熱安定性が親酵素の場合よりも５〜１０℃低下しており、その熱安定性の低下が望まれる利用場面では有利である。ここでは、熱安定性に多様性が導入されている点が重要である。
【００４０】
糖転移活性
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素の糖転移活性を、２０ｍＭの各種アルコール共存下の５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で測定し、結果を図７に示した。図中、横軸の０はアルコール無添加、１はメタノール、２はエタノール、３はプロパノール、４はブタノール、５はペンタノール、６はヘキサノール、７はヘプタノール、８はオクタノールを示し、左端の黒棒はAT（親酵素）、左から２番目の棒はTmN370/TmC371 酵素、左から３番目の棒はTmN403/TmC404 酵素、左から４番目の棒はTmN419/TmC420 酵素、右端の棒はTmN435/TmC436 酵素を示す。
４種の共存リフォールディング酵素は、いずれも直鎖アルコール存在下で酵素活性が増加、とりわけヘプタノール存在下では２倍程度増加しており、親酵素とほぼ同等の糖転移活性を保持していた。この糖転移活性は、酵素に変異を導入すると失われることが多いことから、４種の共存リフォールディング酵素が糖転移活性を保持していることは、重要である。
【００４１】
塩による阻害効果
共存リフォールディングにより活性型として得られた酵素は、分子の中央で切断されている。２つの断片化蛋白質が、相互作用することにより立体構造を保持していることが推察されるが、その主要な因子としてイオン結合が想定される。そこで、イオン結合を弱くする塩化ナトリウムを添加し、その阻害効果を５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で３０℃、１０分間の酵素反応をした際の活性として図８に示した。一方、TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素は、天然型と同じ挙動であったが、TmN370/TmC371 並びにTmN403/TmC404 酵素では、１０００ｍＭ 塩化ナトリウム共存下で酵素活性は５割程度であった。
このように、共存リフォールディングで活性型となった酵素は、親酵素とは異なった挙動を示し、多様性が増していた。また、１０００ｍＭ 塩化ナトリウムは非常に高濃度であり、通常使用では、塩の存在は全く問題がないことが推察された。
【００４２】
Ｋｍ値並びにｋｃａｔ値
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素の３０℃、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）での動力学的パラメータを、グルコース誘導基質並びにキシロース誘導基質を用いて測定した。結果を第１表にまとめた。
【００４３】
【表１】
第１表 動力学的パラメータ
【００４４】
グルコースの誘導体であるパラニトロフェニルグルコシドを基質とした際には、親酵素（表ではTM酵素）は、Ｋｍ値は０．００３９ｍＭで、ｋｃａｔ値は６．４ｓ-1である。
一方、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 、TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素のＫｍ値は、それぞれ０．０１２８、０．００９８、０．００８８、０．００８６ｍＭで、ｋｃａｔ値は、それぞれ１．７５、２．１３、２．１０、２．４３ｓ-1であり、親酵素とは異なった値を示した。
【００４５】
さらに、キシロースの誘導体であるパラニトロフェニルキシロシドを基質とした際には、親酵素（表ではT. maritima ）は、Ｋｍ値は２．６４ｍＭで、ｋｃａｔ値は１８．４である。
一方、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 、TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素のＫｍ値は、それぞれ５．０７、５．７３、７．６３、５．１６ｍＭで、ｋｃａｔ値は、それぞれ９．５１、７．９０、９．５６、９．０３ｓ-1であり、親酵素とは異なった値を示した
このように、動力学的パラメータからも、４種の共存リフォールディング酵素の特性は、親酵素と異なっていることが明らかとなった。また、酵素を使用する際には、その条件により、望ましいＫｍ値、ｋｃａｔ値は異なることから、これらのうち、どれが優れていると判定は出来ないが、多様であることは重要なことである。
上記のように、これら４種の改変酵素の特性を明らかにしたところ、素材となった親酵素とは性質が異なっており、本法により、特性改変酵素を創出できることが明らかとなった。
【００４６】
実施例２
Agrobacterium tumefaciens 由来のβ−グルコシダーゼ
（１）分断遺伝子と断片化蛋白質の調製
Agrobacterium tumefaciens 由来のβ−グルコシダーゼは、８２１残基のアミノ酸で構成されている。本酵素の遺伝子をほぼ中央付近で切断し、以下の４種のＮ末端断片化蛋白質と４種のＣ末端断片化蛋白質が得られるように（図９）、遺伝子を設計した。
また、遺伝子レベルで工夫し、Ｎ末端断片化蛋白質にはＮ末端側に６残基のヒスチジンから構成されるHis タグを、Ｃ末端断片化蛋白質にはＣ末端側に６残基のヒスチジンから構成されるHis タグを付与した。なお、下記のアミノ酸配列の順番には、天然型の酵素のアミノ酸配列の順番を用いており、His タグを構成するアミノ酸残基は数えていない。
【００４７】
４種類のＮ末端断片化蛋白質の遺伝子
１番目〜３５１番目の残基で構成されるAtＮ351 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４２１番目の残基で構成されるAtＮ421 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４６６番目の残基で構成されるAtＮ466 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜５３３番目の残基で構成されるAtＮ533 断片化蛋白質の遺伝子、
【００４８】
４種類のＣ末端断片化蛋白質の遺伝子
３５２番目〜８２１番目の残基で構成されるAtＣ352 断片化蛋白質の遺伝子、
４２２番目〜８２１番目の残基で構成されるAtＣ422 断片化蛋白質の遺伝子、
４６７番目〜８２１番目の残基で構成されるAtＣ467 断片化蛋白質の遺伝子、
５３４番目〜８２１番目の残基で構成されるAtＣ534 断片化蛋白質の遺伝子、
【００４９】
なお、本酵素の活性中心アミノ酸残基は２２２番目のアスパラギン酸残基（求核／塩基残基）並びに６１６番目のグルタミン酸残基（水素供与体残基）であると推察されている。このうちの２２２番目のアスパラギン酸残基はＮ末端断片化蛋白質に、６１６番目のグルタミン酸残基はＣ末端断片化蛋白質に、存在している。すなわち、蛋白質の断片化により、活性中心アミノ酸残基も分断されたのである。
【００５０】
断片化蛋白質の調製
得られた断片化蛋白質の遺伝子を大腸菌で発現させ、断片化蛋白質を調製した。断片化蛋白質の発現には、断片化蛋白質がなるべく封入体ならないように、蛋白合成の遅い２０℃で培養し、誘導に用いるIPTG濃度も通常の１ｍＭではなく、０．１ｍＭという低濃度で、発現を穏やかに誘導するよう工夫した。
しかしながら、得られた断片化蛋白質は、すべて水不溶性の封入体として得られた。当然のことながら、この段階で酵素活性を示す断片化蛋白質は認められなかった。
そこで、封入体を８Ｍ 尿素に可溶化後、キレートカラムを用いて、８種の断片化蛋白質をそれぞれ精製した。精製断片化蛋白質は、ＳＤＳゲル電気泳動で、単一バンドを示し、高度に精製されていることが分かった。
【００５１】
（２）断片化蛋白質の、個別のリフォールディング
得られた８種の精製断片化蛋白質を、それぞれ個別にリフォールディングした。８種類のいずれの断片化蛋白質も、酵素活性を示さなかった。リフォールディング条件は、以下の各種条件を組み合わせ、検討した。
【００５２】
リフォールディング条件
変性剤：８Ｍ 尿素あるいは６Ｍ 塩酸グアニジン
温度は、４、１０、２０、３０、４０または５０℃とした。
ｐＨは、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０とした。
蛋白質濃度は、０．１、０．３、１または３ｍｇ／ｍｌとした。
蛋白のジスルフィド結合の形成を促進する試薬として、１．６ｍｇ／ｍｌ酸化型グルタチオン、１．０ｍｇ／ｍｌ還元型グルタチオン、０．５％メルカプトエタノールの存在の有無
金属キレート試薬１ｍＭ ＥＤＴＡの存在の有無
４日間かけて透析し、変性剤の濃度を徐々に低下させる。
透析期間中、透析内部溶液を約１２時間毎に少量取り出し、酵素活性を測定する。
【００５３】
酵素活性測定方法
基質として２．５ｍＭ パラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドを６２．５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、３０℃に保温した水溶液０．４ｍｌに、酵素溶液を０．１ｍｌ加え、３０℃で１０分間、反応させた。反応後、酵素作用により遊離するパラニトロフェノールの量を、分光光度計（波長４０５ｎｍ）で測定した。
【００５４】
（３）８種の断片化蛋白質を混合し、共存リフォールディング
先に精製した８種の断片化蛋白質を混合し、それらが共存する溶液をリフォールディングしたところ、酵素活性が認められた。通常の使用では、この画分を改変酵素として使用できる。
ここでは、この段階で、どの組み合わせの断片化蛋白質が、一緒になり活性型となったか、また、酵素の特性がどのように変化したかを明瞭にするため、さらに以下の実験を行った。
【００５５】
（４）断片化蛋白質をＮ末端断片化蛋白質１個とＣ末端断片化蛋白質１個を組み合わせ、共存リフォールディング
Ｎ末端断片化蛋白質は４種類、Ｃ末端断片化蛋白質は４種類存在することから、Ｎ末端断片化蛋白質１個とＣ末端断片化蛋白質１個での共存リフォールディングする組み合わせは合計で１６通りとなる。そこで、１６通りの組み合わせで、共存リフォールディングを行った。
その結果、１６通りの組み合わせの内、明瞭に活性型となったものは、２通り存在した。すなわち、Ｎ421 断片化蛋白質（１番目〜４２１番目の残基で構成される）とＣ422 断片化蛋白質（４２２番目〜８２１番目の残基で構成される）、並びにＮ466 断片化蛋白質（１番目〜４６６番目の残基で構成される）とＣ422 断片化蛋白質（４２２番目〜８２１番目の残基で構成される）の組み合わせであった。
【００５６】
Ｎ421 断片化蛋白質とＣ422 断片化蛋白質で共存リフォールディングし、活性型となった蛋白質をAtN421/AtC422 酵素、並びにＮ466 断片化蛋白質とＣ422 断片化蛋白質で共存リフォールディングし活性型となった蛋白質をAtN466/AtC422 酵素と命名した。
なお、この２通りの組み合わせ以外には、活性が極く弱い（天然型の１割以下）ものも認められた。
【００５７】
なお、共存リフォールディングの例としては、以下の通りである。
２種の封入体蛋白質を合計で約２ｍｇ／ｍｌとなるよう６Ｍ 塩酸グアニジン（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解した。これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００５８】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５０倍とした。交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、２〜９割であった。また、酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換してから、１２時間後に認められた。
得られた共存リフォールディング活性型酵素をｐＨ８．０、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液で平衡化したMONO-Qイオン交換カラム（０−１．０Ｍ 塩化ナトリウムグラジエント）で精製後、その特性を解析した。
【００５９】
共存リフォールディング活性型酵素２種の構成蛋白質の確認
先に得られた共存リフォールディング活性型酵素４種を、ＳＤＳゲル電気泳動で分析した（図１０）。親酵素は１本のバンドとなったが、共存リフォールディング活性型酵素は、それぞれ２本のバンドを与えた。いずれの共存リフォールディング酵素においても、２本のバンドの強度がほぼ等しいことから、２つの成分の構成比は１：１であることが推察された。
さらに、これらのバンドを膜にブロッティングし、アミノ酸配列を解析した。その結果、AtN421/AtC422 酵素はＮ421 断片化蛋白質とＣ422 断片化蛋白質との２種から、AtN466/AtC422 酵素はＮ466 断片化蛋白質とＣ422 断片化蛋白質との２種から構成されていることが確認された。
すなわち、共存リフォールディングにより活性型となった酵素２種は、いずれも、共存する断片化蛋白質が、ほぼ１：１の割合で再構成されていた。また、２種の共存リフォールディング活性型酵素のCDスペクトルを測定したところ、親酵素と類似しており、親酵素に類似の立体構造を保持していることが推察された。
【００６０】
本酵素の活性中心アミノ酸残基である、２２２番目のアスパラギン酸残基（求核／塩基残基）ならびに６１６番目のグルタミン酸残基（水素供与体残基）の立体配置は、酵素が活性を示すためには極めて重要である。蛋白質の断片化により、２つの断片化蛋白質に分断され、その立体配置情報は、一旦は完全に失われた。しかし、共存リフォールディングにより活性型となった酵素では、２つの活性中心アミノ酸残基は、ほぼ天然型に近い位置に回復したことが推察される。
【００６１】
（５）特性改変酵素の性質
精製した共存リフォールディング活性型酵素２種と親酵素の特性を解析した。すなわち、AtN421/AtC422 酵素、並びにAtN466/AtC422 酵素を精製し、その特性を解析した。
このＮ421 断片化蛋白質酵素とＣ422 断片化蛋白質酵素の特性を解析した。
反応の至適ｐＨ
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素を３０℃、１０分間、５０ｍＭの各種緩衝液で反応させた際の反応の至適ｐＨを図１１に示した。図から明らかなように、至適となる酵素反応のｐＨは、親酵素では６．５〜７．５であった。また、AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素は、親酵素と同等の至適ｐＨであった。
【００６２】
酵素のｐＨ安定性
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素を、３０℃、３０分間、５０ｍＭの各種緩衝液で処理した際の残存活性をｐＨ安定性とし、図１２に示した。図に示したように、２種の共存リフォールディング酵素はｐＨ４〜１０の非常に広範囲のｐＨで安定であり、親酵素とほぼ同等のｐＨ安定性を示した。ｐＨ安定性が大きく低下していないことは重要である。
【００６３】
反応の至適温度
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素を５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．４で１０分間、種々の温度で反応させた場合の反応の至適温度を図１３に示した。
酵素活性が至適となる酵素反応の温度は、親酵素では６０℃であった。一方、AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素では、ともに５０℃であり親酵素と異なっていた。
AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素では、反応の至適温度が親酵素よりも１０℃低下しているが、通常の産業利用での酵素反応は、雑菌繁殖防止の観点から５０℃程度で行われており、その低下は大きな障害とはならない。ここでは、反応の至適温度に多様性が導入されている点が重要である。
【００６４】
酵素の温度安定性
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素を５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．４で３０分間、種々の温度で加熱し、その残存活性を温度安定性として求め、結果を図１４に示した。
酵素活性が５０％となる熱処理温度は、親酵素では６５℃であった。AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素では、それぞれ４５℃、５０℃であり、親酵素とは異なっていた。
親酵素のように温度安定性が高いと、酵素作用が不要となった際に、加熱失活させ難いことが欠点として挙げられる。一方、AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素では、熱安定性が５〜１０℃低下しており、その熱安定性の低下が望まれる利用場面では有利である。ここでは、熱安定性に多様性が導入されている点が重要である。
【００６５】
糖転移活性
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素の糖転移活性を、２０ｍＭの各種アルコール共存下の５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６．５で測定した。結果を図１５に示す。図中、横軸の０はアルコール無添加、１はメタノール、２はエタノール、３はプロパノール、４はブタノール、５はペンタノール、６はヘキサノール、７はヘプタノール、８はオクタノールを示し、左端の黒棒はAT（親酵素）、中央の棒はAtN421/AtC422 酵素、右端の棒はAtN466/AtC422 酵素を示す。
２種の共存リフォールディング酵素は、いずれも直鎖アルコール存在下で酵素活性が増加、とりわけブタノール存在下で４倍程度増加しており、親酵素とほぼ同等の糖転移活性を保持していた。この糖転移活性は、酵素に変異を導入すると失われることが多いことから、２種の共存リフォールディング酵素が糖転移活性を保持していることは、重要である。
【００６６】
塩による阻害効果
共存リフォールディングにより活性型として得られた酵素は、分子の中央で切断されている。２つの断片化蛋白質が、相互作用することにより立体構造を保持していることが推察されるが、その主要な因子としてイオン結合が想定される。そこで、イオン結合を弱くする塩化ナトリウムを添加し、その阻害効果を５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６．５で３０℃、１０分間酵素反応をした際の活性として図１６に示した。
酵素活性が５０％阻害される塩化ナトリウム濃度は、親酵素では１４００ｍＭ、AtN421/AtC422 ，AtN466/AtC422 酵素ではともに８００ｍＭであった。
このように、共存リフォールディングで活性型となった酵素は、親酵素とは異なった挙動を示し、多様性が増していた。また、８００ｍＭ 塩化ナトリウムは、非常に高濃度であり、通常使用では、塩の存在は全く問題がないことが推察された。
【００６７】
Ｋｍ値並びにｋｃａｔ値
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素の３０℃、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）での動力学的パラメータを、グルコース誘導基質並びにキシロース誘導基質を用いて測定した。結果を第２表にまとめた。
【００６８】
【表２】
第２表 動力学的パラメータ
【００６９】
グルコースの誘導体であるパラニトロフェニルグルコシドを基質とした際には、親酵素（表ではAT）は、Ｋｍ値は０．０１２ｍＭであり、ｋｃａｔ値は９５．４ｓ-1である、一方、AtN421/AtC422 ，AtN466/AtC422 酵素のＫｍ値は、それぞれ０．１２９、０．０２５ｍＭで、ｋｃａｔ値は、それぞれ６．２６、４．６３ｓ-1であり、親酵素とは異なった値を示した。
【００７０】
さらに、キシロースの誘導体であるパラニトロフェニルキシロシドを基質とした際には、親酵素（表ではAT）は、Ｋｍ値は０．００５ｍＭで、ｋｃａｔ値は２８．９である。一方、AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素のＫｍ値は、それぞれ０．０２３、０．０６ｍＭで、ｋｃａｔ値は、それぞれ１．５９、３．４０ｓ-1と親酵素とは異なった値を示した
このように、動力学的パラメータからも、２種の共存リフォールディング酵素の特性は、親酵素と異なっていることが明らかとなった。また、酵素を使用する際には、その条件により、望ましいＫｍ値とｋｃａｔ値は異なることから、これらのうち、どれが優れていると判定することは出来ないが、多様であることは重要である。
【００７１】
これら２種の改変酵素の特性を明らかにしたところ、素材となった親酵素とは性質が異なっており、本法により、特性改変酵素を創出できることが明らかとなった。
【００７２】
実施例３
異種起源の断片化蛋白質による共存リフォールディング
Agrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ由来のＮ末端断片化蛋白質４種類、並びにThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ由来のＣ末端断片化蛋白質４種類での共存リフォールディング
先に調製したAgrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ由来のＮ末端断片化蛋白質４種類並びにThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ由来のＣ末端断片化蛋白質４種類を混合し、共存リフォールディングを行った。
その結果、共存リフォールディングにより酵素活性が得られた。得られた酵素活性は、素材となった両親酵素（Agrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ並びにThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ）とは、異なった特性を示した。本手法により、多様性を有する酵素が得られた。
なお、共存リフォールディングの例としては、以下の通りである。
【００７３】
２種の封入体蛋白質を合計で約２ｍｇ／ｍｌとなるように６Ｍ 塩酸グアニジン（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解した。これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００７４】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５倍とした。交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、１〜３割であった。また、酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換したのち、１２時間後に認められた。
【００７５】
実施例４
異種起源の断片化蛋白質による共存リフォールディング
Thermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ由来のＮ末端断片化蛋白質４種類、並びにAgrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ由来のＣ末端断片化蛋白質４種類での共存リフォールディング
先に調製したThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ由来のＮ末端断片化蛋白質４種類並びにAgrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ由来のＣ末端断片化蛋白質４種類を混合し、共存リフォールディングを行った。
共存リフォールディングにより酵素活性が得られた。得られた酵素活性は、素材となった両親酵素（Agrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ並びにThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ）とは異なった特性を示した。
本手法により、多様性を有する酵素が得られた。
なお、共存リフォールディングの例としては、以下の通りである。
【００７６】
２種の封入体蛋白質を合計で約２ｍｇ／ｍｌとなるよう６Ｍ 塩酸グアニジン（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解した。これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００７７】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５０倍とした。交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、１〜３割であった。また、酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換した後、１２時間後に認められた。
【００７８】
【発明の効果】
これまでは、蛋白質（酵素）の特性を改変することは非常に困難であったが、本発明の方法を活用することにより、迅速に特性の異なった蛋白質（酵素）を調製することが可能である。
本発明によれば、２種類以上の断片化蛋白質を共存させ、共存リフォールディングするという簡便な操作で、目的とする特性の改変した蛋白質を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Thermotoga maritima 由来のβ−グルコシダーゼの断片化蛋白質を示した図である。
【図２】 実施例１の共存リフォールディング活性型酵素のＳＤＳゲル電気泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍ：１０ｋＤａマーカー
１： TmN370/TmC371酵素
２： TmN403/TmC404酵素
３： TmN419/TmC420酵素
４： TmN435/TmC436酵素
【図３】 実施例１における反応の至適ｐＨを示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図４】 実施例１における酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図５】 実施例１における反応の至適温度を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図６】 実施例１における酵素の温度安定性を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図７】 実施例１における酵素の糖転移作用を示す図である。
【図８】 実施例１における塩による酵素の阻害効果を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図９】 Agrobacterium tumefaciens 由来のβ−グルコシダーゼの断片化蛋白質を示した図である。
【図１０】 実施例２の共存リフォールディング活性型酵素のＳＤＳゲル電気泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍ：１０ｋＤａマーカー
１： AtN421/AtC422酵素
２： AtN466/AtC422酵素
【図１１】 実施例２における反応の至適ｐＨを示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【図１２】 実施例２における酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【図１３】 実施例２における反応の至適温度を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【図１４】 実施例２における酵素の温度安定性を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【図１５】 実施例２における酵素の糖転移作用を示す図である。
【図１６】 実施例２における塩による酵素の阻害効果を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【発明の属する技術分野】
本発明は、特性を改変した蛋白質の作出方法に関する。詳しくは、２種類以上の不活性な断片化蛋白質を混合し、混合状態のままリフォールディングさせることにより、特性を改変した活性型蛋白質を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、蛋白質（酵素）の特性を改変することは、非常に困難であった。一部には、遺伝子レベルで改変する手法（非特許文献１）もあるが、「蛋白質（酵素）を構成する数百のアミノ酸残基のうち、どのアミノ酸残基をどのように変換すれば、所望する改変活性を有する酵素が得られるか」、といった予測手法がほとんど見あたらないことから、遺伝子レベルでの蛋白質（酵素）改変には多大な時間と労力を要した（非特許文献２）。
一方、複数酵素を対象にその遺伝子を置換し、キメラ遺伝子を構築し、得られたキメラ遺伝子を発現することにより、両親酵素とは異なった特性を有するキメラ酵素を取得する技術も開発されている（非特許文献３）。しかし、この方法では、遺伝子置換を一つずつ実施する必要があり、容易ではない。
また、蛋白質を人為的に断片化し、得られた断片化蛋白質を混合し、共存リフォールディングにより活性型の蛋白質（酵素）を得ることは、試みられていなかった。
【０００３】
【非特許文献１】
生物化学実験法40、「蛋白質工学研究法」、井本泰治著、学会出版センター発行、「変異蛋白質の調製」p55-70、ISBN4-7622-9822-0(1996)
【非特許文献２】
ゲノム微生物学、木村 光編、シュプリンガー・フェアラーク発行、「8.蛋白質工学」、p181-196、ISBN4-431-70840-5(1999)
【非特許文献３】
K. Hayashi et al., J. Mol. Cat. B: Enzym., vol.11,p811-816(2001)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、断片化され、活性を有していない蛋白質の２種類以上を共存させ、リフォールディングすることにより活性型の蛋白質、すなわち特性の改変された蛋白質を得る方法を開発することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングすることを特徴とする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法である。
請求項２記載の本発明は、異なる生物種由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法である。
請求項３記載の本発明は、同一生物種由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法である。
請求項５記載の本発明は、同一のβ−グルコシダーゼ由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングすることによる、β−グルコシダーゼの至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変する方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明では、まず、既存技術を活用して目的蛋白質（酵素）の遺伝子を断片化して発現する系を構築する。構築した遺伝子断片を発現することにより断片化蛋白質を得る。次いで、この断片化蛋白質を２種類以上混合した後、混合状態のままリフォールディング（共存リフォールディング）することにより活性型蛋白質（酵素）を得る。
この場合、用いる断片化蛋白質の種類は、２種類が最少であり、混合する種類が多ければ多いほど、多様な活性型蛋白質（酵素）が得られる。通常は２〜１００種類の断片化蛋白質を混合する。
本発明の対象とされる蛋白質としては、酵素蛋白質が代表的なものであり、植物、動物、微生物などの各種起源のものが適用される。酵素蛋白質としては、糖質分解酵素、蛋白質分解酵素、脂質分解酵素、異性化酵素、酸化酵素、還元酵素などが挙げられる。また、糖質分解酵素としては、グルコシダーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼなどがある。
【０００７】
共存リフォールディングによって得られた活性型蛋白質（酵素）のｐＨ安定性、熱安定性、反応の至適ｐＨ、至適温度、基質特異性、蛋白質（酵素）安定剤の必要の有無等の蛋白質（酵素）の化学的性質は、遺伝子断片化に用いた両親の蛋白質（酵素）とは異なっていることから、本発明によれば、特性が改変された蛋白質（酵素）が得られる。
【０００８】
本発明におけるリフォールディングの方法としては、変性透析法、カラム吸着法、環状糖質活用法等が適用できる。これらの方法について説明する。
（１）変性透析法
２種類以上の断片化蛋白質を合計で、通常は０．０５〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌとなるように変性溶液に溶解する。変性溶液は、変性剤、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤などを含む。
変性剤としては、塩酸グアニジン、尿素等の蛋白質の構造を解きほぐす作用を有する化合物が使用できる。塩酸グアニジンを用いる場合には、その濃度は通常は１〜８Ｍ、好ましくは５〜７Ｍである。尿素を用いる場合には、その濃度は通常は１〜１０Ｍ、好ましくは６〜９Ｍである。
緩衝剤としては、溶液のｐＨを一定に保つ作用を有する化合物が使用でき、例えば酢酸、クエン酸、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの他、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝剤などがある。その濃度は通常は１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭであり、緩衝液のｐＨは通常は１〜１４、好ましくは４〜１１、より好ましくは６〜１０である。
【０００９】
還元剤としては、グルタチオン、メルカプトエタノール、ジチオオスレイトール等の蛋白質内部のジスルフィド結合を還元する作用を有する化合物が使用できる。その濃度は、特に限定されるものではないが、通常は０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。
次に、酸化剤としては、酸化型グルタチオン等の蛋白質内部のジスルフィド結合を酸化する作用を有する化合物が使用できる。その濃度は、特に限定されるものではないが、通常は０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。
【００１０】
変性溶液に溶解した状態の蛋白質断片は、その立体構造が破壊されていることから、蛋白分解酵素の作用を受けやすい。そこで、わずかに混在する蛋白分解酵素の作用を阻止するために、ベンザミジン、フェニルメチルスルフォニルフルオリド、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオリド、アンチパイン、キモスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、ホスホラミドン、アプロチニンＥＤＴＡ、ラクタスタチン、セルピン等のタンパク質分解酵素阻害剤を用いる。該阻害剤の濃度は、特に限定されるものではないが、通常は０．０００１〜１０ｍＭ、好ましくは０．０１〜１ｍＭである。
安定剤としては、断片化蛋白質並びにリフォールディングされた蛋白質の安定化を促す作用を有する化合物、すなわちグリセロール等の多価アルコールや基質類似物等が使用できる。
【００１１】
変性溶液に溶解した断片化蛋白質を透析膜内部に入れ、透析を開始する。透析温度は、通常は−２０〜９０℃、好ましくは０〜５０℃、より好ましくは４〜３０℃である。透析膜としては、断片化蛋白質は保持するが、塩類等の低分子は透過する性質を有する膜が使用できる。代表的な透析膜としては、再生セルロース膜、酢酸セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ポリメチルメタクリレート膜、エチレンビニルアルコール膜、ポリスルホン膜、ポリアミド膜、ポリエステル系ポリマーアロイ膜、ハイパフォーマンス膜等が使用できる。
透析を開始し、一定の時間が経過した際に、透析外液を下記の外液１、外液２、外液３、外液４と逐次、交換する。交換までの放置時間（透析時間）は、通常は１分〜４８時間、好ましくは１時間〜１６時間、より好ましくは３時間〜１６時間である。
【００１２】
外液１：断片化蛋白質の溶解に用いた変性溶液中の変性剤の濃度を、通常は５〜１００％、好ましくは１０〜２０％減少させた溶液。なお、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤は、先に用いた変性溶液と、好ましくは同じ濃度とするが、必要に応じて緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤の一部もしくは全部の濃度を変えることも有効である。
外液２：外液１に用いた変性溶液中の変性剤の濃度を、通常は５〜１００％、好ましくは１０〜２０％減少させた溶液。この場合も、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤は、先に用いた変性溶液と、好ましくは同じ濃度とするが、必要に応じ、これらの一部もしくは全部の濃度を変えることも有効である。
【００１３】
外液３：外液２に用いた変性溶液中の変性剤の濃度を、通常は５〜１００％、好ましくは１０〜２０％減少させた溶液。なお、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤の各濃度については、先に用いた変性溶液と、同じとすることが好ましいけれども、必要に応じて緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤の一部もしくは全部の濃度を変えることも有効である。
外液４：外液３に用いた変性溶液中の変性剤の濃度を、通常は５〜１００％、好ましくは１０〜２０％減少させた溶液。緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤の各濃度については、先に用いた変性溶液と、同じ濃度とすることが好ましい。しかし、必要に応じてこれらの一部もしくは全部の濃度を変えることも有効である。
以下、順次、変性剤の濃度が低下した一連の外液を調製する。外液の種類は、通常は１〜２０種類、好ましくは４〜１０種類である。
【００１４】
透析方法及び透析外液の具体的な例を以下に示す。
断片化蛋白質を変性溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解し、これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００１５】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５０倍とした。また、交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、２〜９割であった。酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換後、１２時間後に認められた。
得られた共存リフォールディング活性型酵素をｐＨ６．５、５０ｍＭ ＭＯＰＳ塩酸緩衝液で平衡化したMONO-Qイオン交換カラム（０〜０．５Ｍ 塩化ナトリウムグラジエント）で精製後、その特性を解析した。
【００１６】
（２）カラム吸着法
断片化蛋白質を、上記の変性溶液に溶解後、カラムに充填した樹脂（カラム樹脂）に吸着させる方法である。カラム樹脂に吸着後、順次、カラムに上記の外液１、外液２、外液３、外液４等を流す。なお、外液を順に流す代わりに、変性剤の濃度が連続的に変化するよう、グラジエントを作出して流す方法も有効である。この方法により、カラム樹脂に吸着された状態で、断片化蛋白質をリフォールディングすることが可能である。カラム樹脂としては、キレート樹脂、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、アフィニティー樹脂等が使用できる。
【００１７】
（３）環状糖質活用法
断片化蛋白質を、上記の変性溶液に溶解後、希釈溶液を加える。希釈溶液は、界面活性剤、緩衝剤、還元剤、酸化剤、阻害剤、安定剤を含む。
希釈溶液の添加量は、変性溶液の通常は２〜１００００倍、好ましくは５０〜５００倍である。この過程で、変性剤濃度が低下し、変性状態の断片化蛋白質は凝集沈澱するが、希釈溶液に含まれる界面活性剤等がその凝集沈澱を防止する。界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤が使用できる。その濃度は、通常は０．０００１〜１０％、好ましくは０．０１〜１％である。
緩衝剤としては、溶液のｐＨを一定に保つ作用を有する化合物が使用できる。その濃度は、通常は１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭで、緩衝液のｐＨは通常は１〜１４、好ましくは４〜１１、より好ましくは６〜１０である。還元剤としては、グルタチオン、メルカプトエタノール、ジチオオスレイトール等の蛋白質内部のジスルフィド結合を還元する作用を有する化合物を使用することができ、その濃度は、通常は０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。
酸化剤としては、酸化型グルタチオン等の蛋白質内部のジスルフィド結合を酸化する作用を有する化合物が使用できる。その濃度は、通常は０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。
【００１８】
変性溶液に溶解した状態の蛋白質断片は、その立体構造が破壊されていることから、蛋白分解酵素の作用を受けやすい。それ故、わずかに混在する蛋白分解酵素の作用を阻止するために、ベンザミジン、フェニルメチルスルフォニルフルオリド、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオリド、アンチパイン、キモスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンA 、ホスホラミドン、アプロチニンEDTA、ラクタスタチン、セルピン等のタンパク質分解酵素阻害剤を用いる。その濃度は、通常は０．０００１〜１０ｍＭ、好ましくは０．０１〜１ｍＭである。
安定剤としては、断片化蛋白質並びにリフォールディングされた蛋白質の安定化を促す作用を有する化合物、例えばグリセロール等の多価アルコールや基質類似物等が使用できる。
【００１９】
希釈溶液に、吸着剤溶液を加えることによりリフォールディングが完了する。吸着剤溶液は、蛋白質断片に吸着している界面活性剤の一部（あるいは全部）を吸着除去する作用を有する吸着剤を含む。吸着剤としては、環状糖質（例えばサイクロデキストリン、サイクロアミロース）、澱粉の部分分解物、イオン交換樹脂等の界面活性剤の吸着能（または包接能）を有する物質が使用できる。
【００２０】
【実施例】
以下に、実施例を示して本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１
Thermotoga maritima 由来のβ−グルコシダーゼ
（１）分断遺伝子と断片化蛋白質の調製
Thermotoga maritima 由来のβ−グルコシダーゼは、７２１残基のアミノ酸で構成されている。本酵素の遺伝子をほぼ中央付近で切断し、以下の４種のＮ末端断片化蛋白質と４種のＣ末端断片化蛋白質が得られるように（図１）、遺伝子を設計した。
また、遺伝子レベルで工夫し、Ｎ末端断片化蛋白質にはＮ末端に６残基のヒスチジンから構成されるHis タグを、Ｃ末端断片化蛋白質にはＣ末端に６残基のヒスチジンから構成されるHis タグを付与した。なお、上記のアミノ酸配列の順番には、天然型の酵素のアミノ酸配列の順番を用いており、His タグを構成するアミノ酸残基は数えていない。
【００２１】
４種類のＮ末端断片化蛋白質の遺伝子
１番目〜３７０番目の残基で構成されるTmＮ370 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４０３番目の残基で構成されるTmＮ403 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４１９番目の残基で構成されるTmＮ419 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４３５番目の残基で構成されるTmＮ435 断片化蛋白質の遺伝子、
【００２２】
４種類のＣ末端断片化蛋白質の遺伝子
３７１番目〜７２１番目の残基で構成されるTmＣ371 断片化蛋白質の遺伝子、
４０４番目〜７２１番目の残基で構成されるTmＣ404 断片化蛋白質の遺伝子、
４２０番目〜７２１番目の残基で構成されるTmＣ420 断片化蛋白質の遺伝子、
４３６番目〜７２１番目の残基で構成されるTmＣ436 断片化蛋白質の遺伝子、
【００２３】
なお、本酵素の活性中心アミノ酸残基は２４２番目のアスパラギン酸残基（求核／塩基残基）並びに５２４番目のグルタミン酸残基（水素供与体残基）であると推察されている。このうちのアスパラギン酸残基はＮ末端断片化蛋白質に、５２４番目のグルタミン酸残基はＣ末端断片化蛋白質に存在している。すなわち、蛋白質の断片化により、活性中心アミノ酸残基も分断されたのである。
【００２４】
断片化蛋白質の調製
得られた断片化蛋白質の遺伝子を大腸菌で発現させ、断片化蛋白質を調製した。断片化蛋白質の発現には、断片化蛋白質がなるべく封入体とならないように、蛋白合成の遅い２０℃で大腸菌を培養し、誘導に用いるIPTG濃度も通常の１ｍＭではなく、０．１ｍＭという低濃度で、発現を穏やかに誘導するよう工夫した。しかしながら、得られた断片化蛋白質は、すべて水不溶性の封入体として得られた。当然のことながら、この段階で酵素活性を示す断片化蛋白質は認められなかった。
そこで、封入体を８Ｍ 尿素に可溶化後、キレートカラムを用いて、８種の断片化蛋白質をそれぞれ精製した。精製断片化蛋白質は、ＳＤＳゲル電気泳動で、単一バンドを示し、高度に精製されていることが分かった。
【００２５】
（２）断片化蛋白質の、個別のリフォールディング
得られた８種の精製断片化蛋白質をそれぞれ、個別にリフォールディングしたが、８種類のいずれの断片化蛋白質も、酵素活性を示さなかった。リフォールディング条件は、以下の各種条件を組み合わせて検討した。
リフォールディング条件
変性剤：８Ｍ 尿素あるいは６Ｍ 塩酸グアニジン
温度は、４、１０、２０、３０、４０または５０℃とした。
ｐＨは、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０とした。
蛋白質濃度は、０．１、０．３、１または３ｍｇ／ｍｌとした。
蛋白質のジスルフィド結合の形成を促進する試薬として、１．６ｍｇ／ｍｌ酸化型グルタチオン、１．０ｍｇ／ｍｌ還元型グルタチオンまたは０．５％メルカプトエタノールの存在の有無
金属キレート試薬として１ｍＭ ＥＤＴＡの存在の有無
４日間かけて透析し、変性剤の濃度を徐々に低下させる。
透析期間中、透析内部溶液を約１２時間毎に少量取り出し、酵素活性を測定する。
【００２６】
酵素活性測定方法
基質として２．５ｍＭ パラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドを６２．５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、３０℃に保温した水溶液０．４ｍｌに、酵素溶液を０．１ｍｌ加え、３０℃で１０分間反応させた。反応後、酵素作用により遊離するパラニトロフェノールの量を、分光光度計（波長４０５ｎｍ）で測定した。
【００２７】
（３）８種の断片化蛋白質を混合し、共存リフォールディング
先に精製した８種の断片化蛋白質を混合し、それらが共存する溶液をリフォールディングしたところ、酵素活性が認められた。通常の使用では、この画分を改変酵素として使用できる。
ここでは、この段階で、どの組み合わせの断片化蛋白質が、一緒になり活性型となったか、また酵素の特性がどのように変化したかを明瞭にするため、さらに以下の実験を行った。
【００２８】
（４）断片化蛋白質をＮ末端断片化蛋白質１個とＣ末端断片化蛋白質１個を組み合わせ、共存リフォールディング
Ｎ末端断片化蛋白質は４種類、Ｃ末端断片化蛋白質は４種類存在することから、Ｎ末端断片化蛋白質１個とＣ末端断片化蛋白質１個での共存リフォールディングする組み合わせは合計で１６通りとなる。そこで、１６通りの組み合わせで、共存リフォールディングを行った。
その結果、１６通りの組み合わせのすべてにおいて活性型が得られた。
そこで、１６通りの組み合わせの内、代表的な以下の４通りの組み合わせの酵素について、さらに詳細な検討を加えた。
【００２９】
TmＮ370 断片化蛋白質とTmＣ371 断片化蛋白質との２種を共存リフォールディングして活性型となった蛋白質を、TmN370/TmC371 酵素と命名した。
TmＮ403 断片化蛋白質とTmＣ404 断片化蛋白質との２種を共存リフォールディングして活性型となった蛋白質を、TmN403/TmC404 酵素と命名した。
TmＮ419 断片化蛋白質とTmＣ420 断片化蛋白質との２種を共存リフォールディングして活性型となった蛋白質を、TmN419/TmC420 酵素と命名した。
TmＮ435 断片化蛋白質とTmＣ436 断片化蛋白質との２種を共存リフォールディングして活性型となった蛋白質を、TmN435/TmC436 酵素と命名した。
【００３０】
なお、共存リフォールディングの例としては、以下の通りである。
２種の封入体蛋白質を合計で約２ｍｇ／ｍｌとなるように６Ｍ 塩酸グアニジン（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解する。これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
【００３１】
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００３２】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５０倍とした。また、交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、２〜９割であった。酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換してから、１２時間後に認められた。
得られた共存リフォールディング活性型酵素をｐＨ６．５、５０ｍＭ ＭＯＰＳ塩酸緩衝液で平衡化したMONO-Qイオン交換カラム（０〜０．５Ｍ 塩化ナトリウムグラジエント）で精製後、その特性を解析した。
【００３３】
共存リフォールディング活性型酵素４種の構成蛋白質の確認
先に得られた共存リフォールディング活性型酵素４種を、ＳＤＳゲル電気泳動で分析した（図２）。親酵素は１本のバンドとなったが、共存リフォールディング活性型酵素は、それぞれ２本のバンドを与えた。いずれの共存リフォールディング酵素においても、２本のバンドの強度がほぼ等しいことから、２つの成分の構成比は１：１であることが推察された。
さらに、これらのバンドを膜にブロッティングし、アミノ酸配列を解析した。その結果、TmN370/TmC371 酵素は、TmＮ370 断片化蛋白質とTmＣ371 断片化蛋白質との２種から、TmN403/TmC404 酵素は、TmＮ403 断片化蛋白質とTmＣ404 断片化蛋白質との２種から、TmN419/TmC420 酵素はTmＮ419 断片化蛋白質とTmＣ420 断片化蛋白質との２種から、TmN435/TmC436 酵素はTmＮ435 断片化蛋白質とTmＣ436 断片化蛋白質との２種から構成されていることが確認された。
【００３４】
すなわち、共存リフォールディングにより活性型となった４種類の酵素は、いずれも、共存する断片化蛋白質が、ほぼ１：１の割合で再構成されていた。また、４種の共存リフォールディング活性型酵素のＣＤスペクトルを測定したところ、親酵素と類似しており、親酵素に類似の立体構造を保持していることが推察された。
【００３５】
本酵素の活性中心アミノ酸残基は２４２番目のアスパラギン酸残基（求核／塩基残基）並びに５２４番目のグルタミン酸残基（水素供与体残基）であり、酵素が活性を示すためには、この２つの活性中心アミノ酸残基の立体配置は、極めて重要である。蛋白質の断片化により、２つの断片化蛋白質に分断され、その立体配置情報は、一旦は完全に失われた。しかし、共存リフォールディングにより活性型となった酵素では、２つの活性中心アミノ酸残基は、ほぼ天然型に近い位置に回復したことが推察される。
【００３６】
次に、精製した共存リフォールディング活性型酵素４種と親酵素の特性を解析した。
反応の至適ｐＨ
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素を３０℃、１０分間、５０ｍＭの各種緩衝液で反応させた際の反応の至適ｐＨを、図３に示した。至適となる酵素反応のｐＨは、親酵素では３．５〜４．０であった。TmN403/TmC404 、TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素は、至適ｐＨが親酵素と同等であったが、TmN370/TmC371 酵素では、ｐＨ５．２で親酵素と大きく異なっていた。
TmN370/TmC371 酵素では、反応の至適温度が中性側に１．５程度シフトし、親酵素と異なっていることが明らかとなった。また、酵素を使用する際には、その条件により、望ましい反応の至適ｐＨ値は異なることから、これらのうち、どれが優れていると判定は出来ないが、ここでは、反応の至適ｐＨに多様性が導入されている点が重要である。
【００３７】
酵素のｐＨ安定性
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素を３０℃、３０分間、５０ｍＭの各種緩衝液で処理した際の残存活性をｐＨ安定性とし、図４に示した。４種の共存リフォールディング酵素はｐＨ４〜１１の非常に広範囲のｐＨで安定であり、親酵素とほぼ同等のｐＨ安定性を示した。ｐＨ安定性が大きく低下していないことは重要である。
【００３８】
反応の至適温度
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素を、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．７）で１０分間、種々の温度で反応させた場合の、反応の至適温度を図５に示した。
酵素活性が至適となる酵素反応の温度は、親酵素では８５℃であった。TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素の至適温度は、親酵素と同等の８５℃であったが、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 酵素では、それぞれ６５℃、７０℃であり、親酵素とは異なっていた。
TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 酵素では、反応の至適温度が１５〜２０℃低下しているが、通常の産業利用での酵素反応は、雑菌繁殖防止の観点から５０℃程度で行われているので、その低下は大きな障害とはならない。ここでは、反応の至適温度に多様性が導入されている点が重要である。
【００３９】
酵素の温度安定性
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素を、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．７）で３０分間、種々の温度で加熱し、その残存活性を温度安定性として図６に示した。酵素活性が５０％となる熱処理温度は、親酵素では８５℃であった。TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素は、親酵素と同等の８５℃であったが、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 酵素では、それぞれ７５℃、８０℃で、親酵素とは異なっていた。
親酵素のように温度安定性が８５℃とあまりに高いと、酵素作用が不要となった際に、加熱失活させ難いことが欠点として挙げられる。一方、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 酵素では、熱安定性が親酵素の場合よりも５〜１０℃低下しており、その熱安定性の低下が望まれる利用場面では有利である。ここでは、熱安定性に多様性が導入されている点が重要である。
【００４０】
糖転移活性
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素の糖転移活性を、２０ｍＭの各種アルコール共存下の５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で測定し、結果を図７に示した。図中、横軸の０はアルコール無添加、１はメタノール、２はエタノール、３はプロパノール、４はブタノール、５はペンタノール、６はヘキサノール、７はヘプタノール、８はオクタノールを示し、左端の黒棒はAT（親酵素）、左から２番目の棒はTmN370/TmC371 酵素、左から３番目の棒はTmN403/TmC404 酵素、左から４番目の棒はTmN419/TmC420 酵素、右端の棒はTmN435/TmC436 酵素を示す。
４種の共存リフォールディング酵素は、いずれも直鎖アルコール存在下で酵素活性が増加、とりわけヘプタノール存在下では２倍程度増加しており、親酵素とほぼ同等の糖転移活性を保持していた。この糖転移活性は、酵素に変異を導入すると失われることが多いことから、４種の共存リフォールディング酵素が糖転移活性を保持していることは、重要である。
【００４１】
塩による阻害効果
共存リフォールディングにより活性型として得られた酵素は、分子の中央で切断されている。２つの断片化蛋白質が、相互作用することにより立体構造を保持していることが推察されるが、その主要な因子としてイオン結合が想定される。そこで、イオン結合を弱くする塩化ナトリウムを添加し、その阻害効果を５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で３０℃、１０分間の酵素反応をした際の活性として図８に示した。一方、TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素は、天然型と同じ挙動であったが、TmN370/TmC371 並びにTmN403/TmC404 酵素では、１０００ｍＭ 塩化ナトリウム共存下で酵素活性は５割程度であった。
このように、共存リフォールディングで活性型となった酵素は、親酵素とは異なった挙動を示し、多様性が増していた。また、１０００ｍＭ 塩化ナトリウムは非常に高濃度であり、通常使用では、塩の存在は全く問題がないことが推察された。
【００４２】
Ｋｍ値並びにｋｃａｔ値
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素の３０℃、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）での動力学的パラメータを、グルコース誘導基質並びにキシロース誘導基質を用いて測定した。結果を第１表にまとめた。
【００４３】
【表１】
第１表 動力学的パラメータ
グルコースの誘導体であるパラニトロフェニルグルコシドを基質とした際には、親酵素（表ではTM酵素）は、Ｋｍ値は０．００３９ｍＭで、ｋｃａｔ値は６．４ｓ-1である。
一方、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 、TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素のＫｍ値は、それぞれ０．０１２８、０．００９８、０．００８８、０．００８６ｍＭで、ｋｃａｔ値は、それぞれ１．７５、２．１３、２．１０、２．４３ｓ-1であり、親酵素とは異なった値を示した。
【００４５】
さらに、キシロースの誘導体であるパラニトロフェニルキシロシドを基質とした際には、親酵素（表ではT. maritima ）は、Ｋｍ値は２．６４ｍＭで、ｋｃａｔ値は１８．４である。
一方、TmN370/TmC371 、TmN403/TmC404 、TmN419/TmC420 、TmN435/TmC436 酵素のＫｍ値は、それぞれ５．０７、５．７３、７．６３、５．１６ｍＭで、ｋｃａｔ値は、それぞれ９．５１、７．９０、９．５６、９．０３ｓ-1であり、親酵素とは異なった値を示した
このように、動力学的パラメータからも、４種の共存リフォールディング酵素の特性は、親酵素と異なっていることが明らかとなった。また、酵素を使用する際には、その条件により、望ましいＫｍ値、ｋｃａｔ値は異なることから、これらのうち、どれが優れていると判定は出来ないが、多様であることは重要なことである。
上記のように、これら４種の改変酵素の特性を明らかにしたところ、素材となった親酵素とは性質が異なっており、本法により、特性改変酵素を創出できることが明らかとなった。
【００４６】
実施例２
Agrobacterium tumefaciens 由来のβ−グルコシダーゼ
（１）分断遺伝子と断片化蛋白質の調製
Agrobacterium tumefaciens 由来のβ−グルコシダーゼは、８２１残基のアミノ酸で構成されている。本酵素の遺伝子をほぼ中央付近で切断し、以下の４種のＮ末端断片化蛋白質と４種のＣ末端断片化蛋白質が得られるように（図９）、遺伝子を設計した。
また、遺伝子レベルで工夫し、Ｎ末端断片化蛋白質にはＮ末端側に６残基のヒスチジンから構成されるHis タグを、Ｃ末端断片化蛋白質にはＣ末端側に６残基のヒスチジンから構成されるHis タグを付与した。なお、下記のアミノ酸配列の順番には、天然型の酵素のアミノ酸配列の順番を用いており、His タグを構成するアミノ酸残基は数えていない。
【００４７】
４種類のＮ末端断片化蛋白質の遺伝子
１番目〜３５１番目の残基で構成されるAtＮ351 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４２１番目の残基で構成されるAtＮ421 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜４６６番目の残基で構成されるAtＮ466 断片化蛋白質の遺伝子、
１番目〜５３３番目の残基で構成されるAtＮ533 断片化蛋白質の遺伝子、
【００４８】
４種類のＣ末端断片化蛋白質の遺伝子
３５２番目〜８２１番目の残基で構成されるAtＣ352 断片化蛋白質の遺伝子、
４２２番目〜８２１番目の残基で構成されるAtＣ422 断片化蛋白質の遺伝子、
４６７番目〜８２１番目の残基で構成されるAtＣ467 断片化蛋白質の遺伝子、
５３４番目〜８２１番目の残基で構成されるAtＣ534 断片化蛋白質の遺伝子、
【００４９】
なお、本酵素の活性中心アミノ酸残基は２２２番目のアスパラギン酸残基（求核／塩基残基）並びに６１６番目のグルタミン酸残基（水素供与体残基）であると推察されている。このうちの２２２番目のアスパラギン酸残基はＮ末端断片化蛋白質に、６１６番目のグルタミン酸残基はＣ末端断片化蛋白質に、存在している。すなわち、蛋白質の断片化により、活性中心アミノ酸残基も分断されたのである。
【００５０】
断片化蛋白質の調製
得られた断片化蛋白質の遺伝子を大腸菌で発現させ、断片化蛋白質を調製した。断片化蛋白質の発現には、断片化蛋白質がなるべく封入体ならないように、蛋白合成の遅い２０℃で培養し、誘導に用いるIPTG濃度も通常の１ｍＭではなく、０．１ｍＭという低濃度で、発現を穏やかに誘導するよう工夫した。
しかしながら、得られた断片化蛋白質は、すべて水不溶性の封入体として得られた。当然のことながら、この段階で酵素活性を示す断片化蛋白質は認められなかった。
そこで、封入体を８Ｍ 尿素に可溶化後、キレートカラムを用いて、８種の断片化蛋白質をそれぞれ精製した。精製断片化蛋白質は、ＳＤＳゲル電気泳動で、単一バンドを示し、高度に精製されていることが分かった。
【００５１】
（２）断片化蛋白質の、個別のリフォールディング
得られた８種の精製断片化蛋白質を、それぞれ個別にリフォールディングした。８種類のいずれの断片化蛋白質も、酵素活性を示さなかった。リフォールディング条件は、以下の各種条件を組み合わせ、検討した。
【００５２】
リフォールディング条件
変性剤：８Ｍ 尿素あるいは６Ｍ 塩酸グアニジン
温度は、４、１０、２０、３０、４０または５０℃とした。
ｐＨは、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０とした。
蛋白質濃度は、０．１、０．３、１または３ｍｇ／ｍｌとした。
蛋白のジスルフィド結合の形成を促進する試薬として、１．６ｍｇ／ｍｌ酸化型グルタチオン、１．０ｍｇ／ｍｌ還元型グルタチオン、０．５％メルカプトエタノールの存在の有無
金属キレート試薬１ｍＭ ＥＤＴＡの存在の有無
４日間かけて透析し、変性剤の濃度を徐々に低下させる。
透析期間中、透析内部溶液を約１２時間毎に少量取り出し、酵素活性を測定する。
【００５３】
酵素活性測定方法
基質として２．５ｍＭ パラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドを６２．５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、３０℃に保温した水溶液０．４ｍｌに、酵素溶液を０．１ｍｌ加え、３０℃で１０分間、反応させた。反応後、酵素作用により遊離するパラニトロフェノールの量を、分光光度計（波長４０５ｎｍ）で測定した。
【００５４】
（３）８種の断片化蛋白質を混合し、共存リフォールディング
先に精製した８種の断片化蛋白質を混合し、それらが共存する溶液をリフォールディングしたところ、酵素活性が認められた。通常の使用では、この画分を改変酵素として使用できる。
ここでは、この段階で、どの組み合わせの断片化蛋白質が、一緒になり活性型となったか、また、酵素の特性がどのように変化したかを明瞭にするため、さらに以下の実験を行った。
【００５５】
（４）断片化蛋白質をＮ末端断片化蛋白質１個とＣ末端断片化蛋白質１個を組み合わせ、共存リフォールディング
Ｎ末端断片化蛋白質は４種類、Ｃ末端断片化蛋白質は４種類存在することから、Ｎ末端断片化蛋白質１個とＣ末端断片化蛋白質１個での共存リフォールディングする組み合わせは合計で１６通りとなる。そこで、１６通りの組み合わせで、共存リフォールディングを行った。
その結果、１６通りの組み合わせの内、明瞭に活性型となったものは、２通り存在した。すなわち、Ｎ421 断片化蛋白質（１番目〜４２１番目の残基で構成される）とＣ422 断片化蛋白質（４２２番目〜８２１番目の残基で構成される）、並びにＮ466 断片化蛋白質（１番目〜４６６番目の残基で構成される）とＣ422 断片化蛋白質（４２２番目〜８２１番目の残基で構成される）の組み合わせであった。
【００５６】
Ｎ421 断片化蛋白質とＣ422 断片化蛋白質で共存リフォールディングし、活性型となった蛋白質をAtN421/AtC422 酵素、並びにＮ466 断片化蛋白質とＣ422 断片化蛋白質で共存リフォールディングし活性型となった蛋白質をAtN466/AtC422 酵素と命名した。
なお、この２通りの組み合わせ以外には、活性が極く弱い（天然型の１割以下）ものも認められた。
【００５７】
なお、共存リフォールディングの例としては、以下の通りである。
２種の封入体蛋白質を合計で約２ｍｇ／ｍｌとなるよう６Ｍ 塩酸グアニジン（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解した。これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００５８】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５０倍とした。交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、２〜９割であった。また、酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換してから、１２時間後に認められた。
得られた共存リフォールディング活性型酵素をｐＨ８．０、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液で平衡化したMONO-Qイオン交換カラム（０−１．０Ｍ 塩化ナトリウムグラジエント）で精製後、その特性を解析した。
【００５９】
共存リフォールディング活性型酵素２種の構成蛋白質の確認
先に得られた共存リフォールディング活性型酵素４種を、ＳＤＳゲル電気泳動で分析した（図１０）。親酵素は１本のバンドとなったが、共存リフォールディング活性型酵素は、それぞれ２本のバンドを与えた。いずれの共存リフォールディング酵素においても、２本のバンドの強度がほぼ等しいことから、２つの成分の構成比は１：１であることが推察された。
さらに、これらのバンドを膜にブロッティングし、アミノ酸配列を解析した。その結果、AtN421/AtC422 酵素はＮ421 断片化蛋白質とＣ422 断片化蛋白質との２種から、AtN466/AtC422 酵素はＮ466 断片化蛋白質とＣ422 断片化蛋白質との２種から構成されていることが確認された。
すなわち、共存リフォールディングにより活性型となった酵素２種は、いずれも、共存する断片化蛋白質が、ほぼ１：１の割合で再構成されていた。また、２種の共存リフォールディング活性型酵素のCDスペクトルを測定したところ、親酵素と類似しており、親酵素に類似の立体構造を保持していることが推察された。
【００６０】
本酵素の活性中心アミノ酸残基である、２２２番目のアスパラギン酸残基（求核／塩基残基）ならびに６１６番目のグルタミン酸残基（水素供与体残基）の立体配置は、酵素が活性を示すためには極めて重要である。蛋白質の断片化により、２つの断片化蛋白質に分断され、その立体配置情報は、一旦は完全に失われた。しかし、共存リフォールディングにより活性型となった酵素では、２つの活性中心アミノ酸残基は、ほぼ天然型に近い位置に回復したことが推察される。
【００６１】
（５）特性改変酵素の性質
精製した共存リフォールディング活性型酵素２種と親酵素の特性を解析した。すなわち、AtN421/AtC422 酵素、並びにAtN466/AtC422 酵素を精製し、その特性を解析した。
このＮ421 断片化蛋白質酵素とＣ422 断片化蛋白質酵素の特性を解析した。
反応の至適ｐＨ
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素を３０℃、１０分間、５０ｍＭの各種緩衝液で反応させた際の反応の至適ｐＨを図１１に示した。図から明らかなように、至適となる酵素反応のｐＨは、親酵素では６．５〜７．５であった。また、AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素は、親酵素と同等の至適ｐＨであった。
【００６２】
酵素のｐＨ安定性
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素を、３０℃、３０分間、５０ｍＭの各種緩衝液で処理した際の残存活性をｐＨ安定性とし、図１２に示した。図に示したように、２種の共存リフォールディング酵素はｐＨ４〜１０の非常に広範囲のｐＨで安定であり、親酵素とほぼ同等のｐＨ安定性を示した。ｐＨ安定性が大きく低下していないことは重要である。
【００６３】
反応の至適温度
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素を５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．４で１０分間、種々の温度で反応させた場合の反応の至適温度を図１３に示した。
酵素活性が至適となる酵素反応の温度は、親酵素では６０℃であった。一方、AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素では、ともに５０℃であり親酵素と異なっていた。
AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素では、反応の至適温度が親酵素よりも１０℃低下しているが、通常の産業利用での酵素反応は、雑菌繁殖防止の観点から５０℃程度で行われており、その低下は大きな障害とはならない。ここでは、反応の至適温度に多様性が導入されている点が重要である。
【００６４】
酵素の温度安定性
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素を５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．４で３０分間、種々の温度で加熱し、その残存活性を温度安定性として求め、結果を図１４に示した。
酵素活性が５０％となる熱処理温度は、親酵素では６５℃であった。AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素では、それぞれ４５℃、５０℃であり、親酵素とは異なっていた。
親酵素のように温度安定性が高いと、酵素作用が不要となった際に、加熱失活させ難いことが欠点として挙げられる。一方、AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素では、熱安定性が５〜１０℃低下しており、その熱安定性の低下が望まれる利用場面では有利である。ここでは、熱安定性に多様性が導入されている点が重要である。
【００６５】
糖転移活性
親酵素並びに２種の共存リフォールディング酵素の糖転移活性を、２０ｍＭの各種アルコール共存下の５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６．５で測定した。結果を図１５に示す。図中、横軸の０はアルコール無添加、１はメタノール、２はエタノール、３はプロパノール、４はブタノール、５はペンタノール、６はヘキサノール、７はヘプタノール、８はオクタノールを示し、左端の黒棒はAT（親酵素）、中央の棒はAtN421/AtC422 酵素、右端の棒はAtN466/AtC422 酵素を示す。
２種の共存リフォールディング酵素は、いずれも直鎖アルコール存在下で酵素活性が増加、とりわけブタノール存在下で４倍程度増加しており、親酵素とほぼ同等の糖転移活性を保持していた。この糖転移活性は、酵素に変異を導入すると失われることが多いことから、２種の共存リフォールディング酵素が糖転移活性を保持していることは、重要である。
【００６６】
塩による阻害効果
共存リフォールディングにより活性型として得られた酵素は、分子の中央で切断されている。２つの断片化蛋白質が、相互作用することにより立体構造を保持していることが推察されるが、その主要な因子としてイオン結合が想定される。そこで、イオン結合を弱くする塩化ナトリウムを添加し、その阻害効果を５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６．５で３０℃、１０分間酵素反応をした際の活性として図１６に示した。
酵素活性が５０％阻害される塩化ナトリウム濃度は、親酵素では１４００ｍＭ、AtN421/AtC422 ，AtN466/AtC422 酵素ではともに８００ｍＭであった。
このように、共存リフォールディングで活性型となった酵素は、親酵素とは異なった挙動を示し、多様性が増していた。また、８００ｍＭ 塩化ナトリウムは、非常に高濃度であり、通常使用では、塩の存在は全く問題がないことが推察された。
【００６７】
Ｋｍ値並びにｋｃａｔ値
親酵素並びに４種の共存リフォールディング酵素の３０℃、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）での動力学的パラメータを、グルコース誘導基質並びにキシロース誘導基質を用いて測定した。結果を第２表にまとめた。
【００６８】
【表２】
第２表 動力学的パラメータ
グルコースの誘導体であるパラニトロフェニルグルコシドを基質とした際には、親酵素（表ではAT）は、Ｋｍ値は０．０１２ｍＭであり、ｋｃａｔ値は９５．４ｓ-1である、一方、AtN421/AtC422 ，AtN466/AtC422 酵素のＫｍ値は、それぞれ０．１２９、０．０２５ｍＭで、ｋｃａｔ値は、それぞれ６．２６、４．６３ｓ-1であり、親酵素とは異なった値を示した。
【００７０】
さらに、キシロースの誘導体であるパラニトロフェニルキシロシドを基質とした際には、親酵素（表ではAT）は、Ｋｍ値は０．００５ｍＭで、ｋｃａｔ値は２８．９である。一方、AtN421/AtC422 、AtN466/AtC422 酵素のＫｍ値は、それぞれ０．０２３、０．０６ｍＭで、ｋｃａｔ値は、それぞれ１．５９、３．４０ｓ-1と親酵素とは異なった値を示した
このように、動力学的パラメータからも、２種の共存リフォールディング酵素の特性は、親酵素と異なっていることが明らかとなった。また、酵素を使用する際には、その条件により、望ましいＫｍ値とｋｃａｔ値は異なることから、これらのうち、どれが優れていると判定することは出来ないが、多様であることは重要である。
【００７１】
これら２種の改変酵素の特性を明らかにしたところ、素材となった親酵素とは性質が異なっており、本法により、特性改変酵素を創出できることが明らかとなった。
【００７２】
実施例３
異種起源の断片化蛋白質による共存リフォールディング
Agrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ由来のＮ末端断片化蛋白質４種類、並びにThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ由来のＣ末端断片化蛋白質４種類での共存リフォールディング
先に調製したAgrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ由来のＮ末端断片化蛋白質４種類並びにThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ由来のＣ末端断片化蛋白質４種類を混合し、共存リフォールディングを行った。
その結果、共存リフォールディングにより酵素活性が得られた。得られた酵素活性は、素材となった両親酵素（Agrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ並びにThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ）とは、異なった特性を示した。本手法により、多様性を有する酵素が得られた。
なお、共存リフォールディングの例としては、以下の通りである。
【００７３】
２種の封入体蛋白質を合計で約２ｍｇ／ｍｌとなるように６Ｍ 塩酸グアニジン（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解した。これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００７４】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５倍とした。交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、１〜３割であった。また、酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換したのち、１２時間後に認められた。
【００７５】
実施例４
異種起源の断片化蛋白質による共存リフォールディング
Thermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ由来のＮ末端断片化蛋白質４種類、並びにAgrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ由来のＣ末端断片化蛋白質４種類での共存リフォールディング
先に調製したThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ由来のＮ末端断片化蛋白質４種類並びにAgrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ由来のＣ末端断片化蛋白質４種類を混合し、共存リフォールディングを行った。
共存リフォールディングにより酵素活性が得られた。得られた酵素活性は、素材となった両親酵素（Agrobacterium tumefaciens 起源β−グルコシダーゼ並びにThermotoga maritima 起源β−グルコシダーゼ）とは異なった特性を示した。
本手法により、多様性を有する酵素が得られた。
なお、共存リフォールディングの例としては、以下の通りである。
【００７６】
２種の封入体蛋白質を合計で約２ｍｇ／ｍｌとなるよう６Ｍ 塩酸グアニジン（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）に溶解した。これを透析膜チューブ内部に入れ、４℃で透析した。
透析外液としては、以下の６種類を用意した。
外液１：５Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液２：４Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液３：３Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液４：２Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液５：１Ｍ 塩酸グアニジン溶液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有）
外液６：５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ メルカプトエタノール、０．１６％ 酸化型グルタチオンを含有
【００７７】
約１２時間毎に、透析外液を、外液１から外液２へ、外液２から外液３へと順次交換した。透析外液の液量は、透析内液の液量の約５０倍とした。交換の都度、透析内液の一部を取り出し、酵素活性を測定した。
この条件で共存リフォールディングした際の活性レベルでの回収収率は、１〜３割であった。また、酵素活性は外液５に交換した頃より認められ、最も高い酵素活性は外液６に交換した後、１２時間後に認められた。
【００７８】
【発明の効果】
これまでは、蛋白質（酵素）の特性を改変することは非常に困難であったが、本発明の方法を活用することにより、迅速に特性の異なった蛋白質（酵素）を調製することが可能である。
本発明によれば、２種類以上の断片化蛋白質を共存させ、共存リフォールディングするという簡便な操作で、目的とする特性の改変した蛋白質を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Thermotoga maritima 由来のβ−グルコシダーゼの断片化蛋白質を示した図である。
【図２】 実施例１の共存リフォールディング活性型酵素のＳＤＳゲル電気泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍ：１０ｋＤａマーカー
１： TmN370/TmC371酵素
２： TmN403/TmC404酵素
３： TmN419/TmC420酵素
４： TmN435/TmC436酵素
【図３】 実施例１における反応の至適ｐＨを示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図４】 実施例１における酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図５】 実施例１における反応の至適温度を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図６】 実施例１における酵素の温度安定性を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図７】 実施例１における酵素の糖転移作用を示す図である。
【図８】 実施例１における塩による酵素の阻害効果を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
■： TmN370/TmC371酵素
□： TmN403/TmC404酵素
▲： TmN419/TmC420酵素
△： TmN435/TmC436酵素
【図９】 Agrobacterium tumefaciens 由来のβ−グルコシダーゼの断片化蛋白質を示した図である。
【図１０】 実施例２の共存リフォールディング活性型酵素のＳＤＳゲル電気泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍ：１０ｋＤａマーカー
１： AtN421/AtC422酵素
２： AtN466/AtC422酵素
【図１１】 実施例２における反応の至適ｐＨを示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【図１２】 実施例２における酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【図１３】 実施例２における反応の至適温度を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【図１４】 実施例２における酵素の温度安定性を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
【図１５】 実施例２における酵素の糖転移作用を示す図である。
【図１６】 実施例２における塩による酵素の阻害効果を示す図である。
【符号の説明】
●：親酵素
○： AtN421/AtC422酵素
▲： AtN466/AtC422酵素
Claims (5)
- ２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングすることを特徴とする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法。
- 異なる生物種由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法。
- 同一生物種由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングする、至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変したβ−グルコシダーゼの作出方法。
- ３〜１００種類の断片化β−グルコシダーゼを共存させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の作出方法。
- 同一のβ−グルコシダーゼ由来の２種類以上の断片化β−グルコシダーゼを共存させ、５〜７ M 塩酸グアニジンもしくは６〜９ M 尿素、１０〜５０ｍ M 緩衝剤、０．０１〜１０ｍ M 還元剤、０．０１〜１０ｍ M 酸化剤、０．０１〜１ｍ M タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液（ｐ H ６〜１０）を用いて４〜３０℃で共存リフォールディングすることによる、β−グルコシダーゼの至適ｐ H 、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Ｋｃａｔ値およびＫｍ値から選ばれた少なくとも１種の特性を改変する方法。
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2002
- 2002-10-21 JP JP2002305896A patent/JP4168135B2/ja not_active Expired - Lifetime
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