CN1441056A - 组织型纤溶酶原激活剂的组合突变体 - Google Patents
组织型纤溶酶原激活剂的组合突变体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1441056A CN1441056A CN 03112037 CN03112037A CN1441056A CN 1441056 A CN1441056 A CN 1441056A CN 03112037 CN03112037 CN 03112037 CN 03112037 A CN03112037 A CN 03112037A CN 1441056 A CN1441056 A CN 1441056A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rpa
- area
- yeast
- kringle
- mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明从改造组织型纤溶酶原激活剂(简称t－PA)的天然分子结构入手，通过蛋白质工程改造，得到了t－PA的重组衍生物－组合突变体(简称rPA)。将t－PA分子中的EGF区、Finger区和Kringle I区删除，保留了具有溶栓作用的Kringle II和蛋白酶二个功能区(176－527位氨基酸)，同时将t－PA分子中的126－128位氨基酸HRR突变为AAA，构建成新的t－PA组合突变体rPA。将rPA的cDNA插入酵母表达质粒中，转化毕赤酵母后经筛选得到高表达酵母工程菌，再经过表达和一系列纯化步骤，可以制备得到高纯度、高比活性的rPA。rPA在具有天然t－PA的优点，如血栓特异性的同时，还表现出显著增强的血纤蛋白刺激性，延长的半衰期，增加的酶原性以及提高的对PAI－1抑制的耐受性。因而可能成为具有诸多临床优势的新一代溶栓药物。
Description
本发明属医药领域中的重组蛋白质药物。
组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是目前应用广泛的溶栓药物。但天然型t-PA存在着半衰期短，有出血副作用，使用剂量高，成本价格高，临床使用条件苛刻等缺陷，因此科学界一直对其进行蛋白质结构改造。为提高t-PA的溶栓活性，并克服上述缺陷，我们从改造天然型t-PA的分子结构入手，通过蛋白质工程改造，得到了t-PA的重组衍生物-组合突变体(简称rPA)。
根据t-PA的结构分析和分子设计，我们在将t-PA分子中的EGF区、Finger区和Kringle I区删除的基础上，保留了具有溶栓作用的Kringle II和蛋白酶二个功能区(176-527氨基酸)，同时将t-PA分子中的PAI-1结合位点的氨基酸进行定点突变，构建了能够显著延长t-PA半衰期、提高特异活性，且其活性不被PAI-1抑制的，诸多优势特征组合的新型t-PA突变体。该新型t-PA溶栓剂，其多种特性均有显著改善。经检索我们的这种t-PA突变体氨基酸序列是首创性工作，国际上没有类似的突变体发表。
技术方案：
首先扩增出天然t-PA的176-527位氨基酸的cDNA。将该cDNA中的PAI-1结合位点核苷酸序列376-384的CAC AGG AGG改变为GCCGCG GCG，使相应的氨基酸HRR突变为AAA，构建了新的t-PA突变体，并克隆于大肠杆菌表达载体pET22b。在大肠杆菌中得到高效表达。表达蛋白占总菌体蛋白的40％，以包涵体形式存在。经蛋白质变性、复性，得到了有天然活性的t-PA突变体。为了获得更高的t-PA突变体的表达，保证其生物活性，我们将新的t-PA突变体，克隆于毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9k，用毕赤酵母进行表达，在培养上清中经分离纯化，得到高活性的t-PA突变体。对用大肠杆菌和毕赤酵母表达的新的t-PA突变体进行性质研究表明，新的t-PA突变体在具有天然t-PA的优点，如血栓特异性的同时，在药理药代上优于t-PA。突变体的半衰期为18至25分钟，而t-PA只有3.5分钟。新的t-PA突变体还表现出显著增强的血纤蛋白刺激性，并实质性地增加酶原性；与PAI-1反应后t-PA活性无抑制。说明我们的分子改构提高了纤溶酶原水解活性，大幅度增加了血纤蛋白辅因子的差别，核苷酸序列376-384相对应的氨基酸序列影响PAI-1结合活性，而不影响其纤溶酶原水解活性，这样的氨基酸突变显著提高了对PAI-1抑制的耐受性。上述突变特征的组合增加了该t-PA突变体的临床治疗应用的优势。该工作使其成为治疗活性好、用量少、临床使用方便的治疗心肌梗塞和脑血栓、肺栓塞等血栓性疾病的新型生物工程药物。
当然，亦可依不同方法来制备rPA，如可在细菌或昆虫细胞及动物细胞等较高等真核细胞中表达，但最好是在酵母系统中表达。由于rPA分子包含9对二硫键，若用大肠杆菌进行表达必需经过变性和复性步骤，复性率很低，纯化困难，其产量和应用受到限制。为了提高rPA的表达产率，我们用甲醇营养型的毕赤酵母来分泌表达rPA。由酵母细胞中表达的优点不仅因为可以分泌rPA，而且还因为它在实际上是呈准确折迭形式的并具有高度活性的。
优选采用的酵母载体是所谓的穿梭载体，其具有的细菌质粒和酵母质粒的复制原点，以及在两种宿主系统中分泌的基因。此外，该类型载体还含有表达外来基因所必需的启动子顺序，以及最好有可改善产率的终止顺序，从而即可使利于同分泌信号融合的异源基因定位于启动子和终止密码子之间。
具体工艺简述如下：
rPA表达质粒构建→转化毕赤酵母→高密度发酵表达→上清液分离→超滤浓缩→阳离子交换层析纯化→脱盐→除菌过滤→制剂分装→成品冻干。经上述步骤，即可制备得到纯度大于99％，生物比活性高于500，000IU/mg蛋白的rPA。
实施例1：
首先用PCR扩增和定点突变的方法获得rPA的全长cDNA。经DNA序列测定证实其序列正确后，插入我们已改建过的酵母表达质粒pPIC9K-Y。所构建成的表达质粒经DNA序列测定分析正确后，用Sal I酶切成线性质粒，用电穿孔的方法转化入毕赤酵母，经过筛选即得到rPA的高表达酵母工程菌。该工程菌在酵母培养基中生长、诱导、分泌，再将发酵液离心后，取上清液，超滤至十分之一体积，经脱盐后，过CM-Sepharose阳离子交换层析柱纯化，即得到纯度＞99％，比活性高于500，000IU/mg的rPA纯品。
本发明的优点：本发明提供了一种t-PA的新型重组衍生物-组合突变体rPA以及用酵母分泌表达具天然蛋白结构和生物活性的rPA的新型工艺方法。rPA在具有天然t-PA的优点，如血栓特异性的同时，还具有以下优点：显著增强的血纤蛋白刺激性，延长的半衰期，增加的酶原性以及提高的对PAI-1抑制的耐受性。因而可能成为具有诸多临床优势的新一代溶栓药物。
Claims (3)
1.组织型纤溶酶原激活剂(简称t-PA)的组合突变体(简称rPA)。其特征在于将t-PA分子中的EGF区、Finger区和Kringle I区删除，保留了具有溶栓作用的Kringle II和蛋白酶二个功能区(176-527位氨基酸)，同时将t-PA分子中的126-128位氨基酸HRR突变为AAA。
2.如权利要求1所述的rPA用酵母工程菌进行表达。其特征在于rPA表达质粒转化毕赤酵母构建成rPA表达工程酵母，可表达rPA并有效地分泌至培养基中。
3.rPA的分离和纯化。其特征在于经过酵母发酵、培养液分离、超滤浓缩、阳离子交换层析等步骤，获得高纯度、高比活的rPA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03112037 CN1441056A (zh) | 2003-03-26 | 2003-03-26 | 组织型纤溶酶原激活剂的组合突变体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03112037 CN1441056A (zh) | 2003-03-26 | 2003-03-26 | 组织型纤溶酶原激活剂的组合突变体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1441056A true CN1441056A (zh) | 2003-09-10 |
Family
ID=27770323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 03112037 Pending CN1441056A (zh) | 2003-03-26 | 2003-03-26 | 组织型纤溶酶原激活剂的组合突变体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1441056A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103509772A (zh) * | 2012-06-18 | 2014-01-15 | 王革 | 组织型纤溶酶原激活剂的新型组合突变体 |
| CN107779467A (zh) * | 2016-08-26 | 2018-03-09 | 叶建明 | 一种溶血栓药物rPA新的生产方法 |
-
2003
- 2003-03-26 CN CN 03112037 patent/CN1441056A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103509772A (zh) * | 2012-06-18 | 2014-01-15 | 王革 | 组织型纤溶酶原激活剂的新型组合突变体 |
| CN107779467A (zh) * | 2016-08-26 | 2018-03-09 | 叶建明 | 一种溶血栓药物rPA新的生产方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU217103B (hu) | Fúziós fehérje, eljárás fúziós fehérjék IgA-proteázok alkalmazásával történő enzimes hasítására | |
| JPH0829086B2 (ja) | ポリクリングルプラスミノ−ゲン活性化因子 | |
| EP0302456B1 (en) | New tissue plasminogen activator | |
| DE68918279T2 (de) | Plasminogenaktivator-varianten und verfahren zu ihrer herstellung. | |
| US5728571A (en) | Expression and secretion of mature human beta interleukin-1 in Bacillus subtilis and means and methods for its achievement | |
| CN111320702A (zh) | 一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法 | |
| CN1441056A (zh) | 组织型纤溶酶原激活剂的组合突变体 | |
| HU214243B (hu) | Eljárás plazminogén-aktivátor kifejezésére alkalmas plazmidok előállítására | |
| CN101509012B (zh) | 重组羧肽酶g2表达载体及制备重组羧肽酶g2的方法 | |
| CN103509772A (zh) | 组织型纤溶酶原激活剂的新型组合突变体 | |
| CN1142278C (zh) | 一类能被尿激酶或自身激活的尿激酶原变体及其编码基因、制备方法和用途 | |
| CA2058872C (en) | Recombinant iga protease | |
| Gupta et al. | Microbial clot busters: an overview of source, production, properties and fibrinolytic activity | |
| EP0352387B1 (en) | Method for preparing a hirudin | |
| CN1414094A (zh) | 用酵母分泌表达瑞替普酶 | |
| CN100525834C (zh) | 人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法 | |
| CN103789291A (zh) | 一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺 | |
| EP1326995B8 (de) | Verfahren zur synthese von peptiden, peptidmimetika und proteinen | |
| US5166318A (en) | Polypeptide having thrombin inhibiting activity | |
| RU2108386C1 (ru) | Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (g - csf) без дополнительного остатка метионина на n-конце | |
| Min et al. | Microbial Production of Fibrinolytic Enzymes | |
| US5965424A (en) | Methods for making neisseria or hemophilus IgA protease and DNA encoding the proteases | |
| CN1128222C (zh) | 新型分泌表达载体及其在重组水蛭素表达技术中的应用 | |
| CN102337282A (zh) | 一种溶栓蛋白酶基因nks1及用途 | |
| CN1371994A (zh) | 用酵母分泌表达重组水蛭素 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |