CN102660564A - 重组修饰的纤溶酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与重组修饰的纤溶酶(原)分子相关的多核苷酸和多肽。所述纤溶酶(原)分子具有位于存在于天然人纤溶酶原分子中的激活位点的N-末端的单一的三环域，并且表现出赖氨酸-结合和与天然酶相关的显著的酶特征。

Description

重组修饰的纤溶酶
发明背景
人纤溶酶原是包含791个氨基酸残基的单链蛋白。通过对酶原中Arg561-Val562肽键的单一的裂解，导致纤溶酶原激活成为纤溶酶。所得到的纤溶酶分子是双链的二硫键连接的丝氨酸蛋白酶，具有胰蛋白酶样特异性(在Lys和Arg之后裂解)。
纤溶酶的氨基-末端重链(残基1-561，大约60kDa)由五个三环域(kringle)组成，各自包含大约80个氨基酸残基。所述三环域负责纤溶酶原的调控特性，如与激活抑制剂例如Cl-1离子的相互作用；与激活刺激剂例如ε-氨基己酸的相互作用；与哺乳动物和细菌细胞的相互作用；和与其他蛋白的相互作用，如纤溶酶生理学底物血纤蛋白和纤溶酶抑制剂α2-抗纤溶酶。在所有五个三环域中，三环域1是最多功能的一种；业已证实了它的赖氨酸-结合活性负责引起纤溶酶与α2-抗纤溶酶和血纤蛋白的相互作用。参见Wiman，B.，et al.，Biochim.Biophys.Acta579：142-154(1979)；和Lucas，M.A.，et al.，J.Biol.Chem.258：4249-4256(1983)。
纤溶酶的C-末端轻链(残基562-791，大约25kDa)是典型的丝氨酸蛋白酶，与胰蛋白酶同源，并且包含典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体：His603，Asp646和Ser741。纤溶酶原包含24个二硫键和在Asn289和Thr346上的2个糖基化位点。
业已证实弹性蛋白酶对纤溶酶原的有限的蛋白水解产生三个片段(Sottrup-Jensen，L.，et al.，Prog.Chem.Fibrinol.Thrombol.，3：191-209(1978))。第一个片段，K1-3，包括前三个三环域，并且能够以两种形式分离，Tyr79-Val338和Tyr79-Val354。第二个片段K4相当于第四个三环域，并且包括残基Val355-Ala440。最后一个是C-末端片段(所谓的小-纤溶酶原)，包括残基Val443-Asn791，并且由第五个三环域和丝氨酸蛋白酶结构域组成。小-纤溶酶原能够以与纤溶酶原相同的方式被激活，形成小-纤溶酶。
由于全长纤溶酶原分子的复杂结构，细菌表达系统未证实可用于纤溶酶原的重组生产。纤溶酶原是以不溶性的内含体形式生产的，并且不能够从那种状态再折叠。另外，纤溶酶原在哺乳动物细胞中的表达由于纤溶酶原在细胞内激活形成纤溶酶和所致的细胞毒性而复杂化。用昆虫细胞生产具有完全活性的纤溶酶原是可能的，不过，由于产量低该系统不适合大规模生产。
因此，需要修饰过的重组蛋白，它具备纤溶酶/纤溶酶原的理想特征，同时缺乏某些负面特征，并且能够以较大数量在细菌细胞中生产。
发明概述
本发明提供了包含编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽具有与天然人纤溶酶原的三环域同源的单一的N-末端三环域；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；其中，所述多肽能结合固定化的赖氨酸。所述N-末端三环域可与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4同源。
在某些实施方案中，所述编码的多肽与SEQ ID NO：2所示出的序列的同一性为至少90％，95％，或98％。另外，所述编码的多肽可以是SEQ ID NO：2所示出的序列。
所述多核苷酸的核苷酸序列可以是SEQ ID NO：1所示出的序列或其简并变体。所述核苷酸序列可以编码一种多肽，其具有与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4结构域同源的N-末端三环域；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域。所述核苷酸序列还可以编码这样的多肽，其具有单一的N-末端三环域，它与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4结构域至少90％相同；和与人纤溶酶原的激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域的同一性为至少90％的C-末端结构域。所述编码的多肽能够结合固定化的赖氨酸。
另一方面，本发明提供了多肽，其具有N-末端三环域，与天然人纤溶酶原的三环域同源；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域。
在某些实施方案中，所述多肽可具有与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4同源的N-末端三环域。
在某些实施方案中，所述多肽可以表现出纤维蛋白溶解活性，该活性可以被α2-抗纤溶酶抑制，抑制速度比α2-抗纤溶酶对小-纤溶酶的纤维蛋白溶解活性的抑制速度快至少大约5倍。被α2-抗纤溶酶抑制的速度还可以比对小-纤溶酶的抑制速度快至少大约10倍，20倍，30倍，或40倍。
在某些实施方案中，所述多肽能够结合固定化的赖氨酸。所述固定化的赖氨酸可以是结合在固体支持基质上的选自下列一组的赖氨酸：赖氨酸-琼脂糖，赖氨酸-BIOGEL(BioRad，Hercules，CA)，赖氨酸-HYPERD(Pall Life Sciences，East Hills，NY，一种赖氨酸-水凝胶)，赖氨酸-SEPHAROSE(SEPHAROSE是一种交联的琼脂糖)。所述固定化的赖氨酸可以是赖氨酸-SEPHAROSE。
在某些实施方案中，所述多肽可表现出对血纤蛋白原的结合亲和力比小-纤溶酶对血纤蛋白原的结合亲和力低。
在某些实施方案中，所述多肽可表现出对部分裂解的血纤蛋白的结合亲和力比小-纤溶酶对部分裂解的血纤蛋白的结合亲和力高。
在某些实施方案中，所述多肽可以具有位于纤溶酶原激活位点和纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域的N-末端的单一的三环域，其中，所述三环域与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4的氨基酸序列同一性，比与天然人纤溶酶原的三环域5的序列同一性多至少一个残基。对于这些实施方案来说，可以理解的是，本发明多肽的三环域区相对于人纤溶酶原的三环域1和三环域4的天然序列的保守性置换就与三环域5作同一性比较目的而言不被认为与所述天然序列不同。
在某些实施方案中，所述多肽可以具有SEQ ID NO：2所示出的氨基酸序列，及其保守性置换。所述多肽可以在相对位置具有与SEQ IDNO：2所示出的氨基酸序列的76位上的残基(其为精氨酸)类似的残基。
另一方面，本发明包括含有本发明的多核苷酸的载体，以及含有所述载体的培养的宿主细胞。
附图的简要说明
图1是在通过蛋白酶剪切激活之后天然纤溶酶的示意图。K1-K5是三环域区1-5；而SP是丝氨酸蛋白酶结构域。“α2-AP”是三环域1上的α2-抗纤溶酶结合部位。
图2是本发明的纤溶酶原缺失变体的示意图，使用图1所示的相同的命名，并且显示K2-5的缺失。
图3显示人纤溶酶原的氨基酸序列，显示19个残基的前导序列，编号为-19至-1，并且纤溶酶原序列显示为1-791号残基(参见SEQ IDNO：3(人纤溶酶原的cDNA序列；和SEQ ID NO：4，所编码的氨基酸序列，如图3所示)。示出了多种特征，包括以下特征：Δ-纤溶酶原序列(加阴影的)；三环域1-5(双下划线)；糖基化位点Asn289和Thr346(粗体)；纤溶酶原激活Arg-Val激活位点(粗体)；和三环域1中的赖氨酸-结合部位(加下划线并且具有特定的位置编号)。
图4显示天然人纤溶酶(原)的五个三环域(1-5)之间的多肽序列比较。与三环域1中相同的相对位置上的氨基酸残基相同的氨基酸残基用下划线表示。
图5显示非还原的(泳道1)和还原的(泳道2)Δ-纤溶酶原制剂的8-25％梯度的SDS-PAGE。通过链激酶(泳道3)，组织纤溶酶原激活物(tPA)(泳道4)，和尿激酶(泳道5)将Δ-纤溶酶原激活成Δ-纤溶酶，导致了由通过两个二硫键连接的三环域1(K1)和丝氨酸蛋白酶结构域(SP)组成的双链分子的形成。
图6是通过尿激酶激活Δ-纤溶酶原的示意图。将尿激酶(5.8nM)添加到温度为37℃的在含有1.0mM S-2251的PBS中的5μM Δ-纤溶酶原溶液中。在405nm波长下监测吸光度的增加。
图7是显示Δ-纤溶酶原与赖氨酸-SEPHAROSE 4B结合的色谱图：将0.5mg纯化的Δ-纤溶酶原加样到赖氨酸-SEPHAROSE 4B柱(1x3cm)上，该柱用Tris-缓冲的盐水，pH 7.4平衡。结合的蛋白由0-20mM梯度的ε-氨基己酸(ε-ACA)作为单一的峰从所述柱上洗脱。在280nm处的吸光度和ε-ACA浓度作为洗脱液体积的函数表现在所述曲线图上。
图8显示Δ-纤溶酶原与血纤蛋白的结合。将不同浓度的Δ-纤溶酶原与血纤蛋白凝块一起在微量滴定板中在37℃下温育1小时。在温育之后，用PBS充分洗涤所述凝块，并且向每一个孔中添加0.1mg/mltPA的溶液。在37℃下温育2小时之后，除去液体，并且用100μl的1M NaOH重配残留的固体凝块。通过测定这些重配凝块的280nm的吸光度来定量残留血纤蛋白的数量。由Δ-纤溶酶原结合血纤蛋白导致的纤维蛋白溶解的程度在所述曲线图上以Δ-纤溶酶原浓度的函数形式作图(实线)。虚线表示试验数据与结合方程的最佳拟合。
图9显示在非还原的(泳道1)和还原的条件(泳道2)下的起始Δ-纤溶酶原的8-25％梯度的SDS-PAGE，以及同样是在非还原的(泳道3)和还原的(泳道4)条件下的最终的Δ-纤溶酶制剂的8-25％梯度的SDS-PAGE。
图10显示纤溶酶，小-纤溶酶，微-纤溶酶，和Δ-纤溶酶的示意图，以及酶活性的相应表征(针对底物S-2251(D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(p-nitroanilide)，DiaPharma Group有限公司，West Chester，OH)的kcat和KM)。
图11是Δ-纤溶酶诱导的收缩全血凝块溶解的示意图。向每一个凝块(0.8×7cm)注入1ml体积的载体(酸化盐水，pH 3.6)，纤溶酶(1.0mg/ml)，或Δ-纤溶酶(0.44mg/ml)，并且在37℃下让凝块溶解进行1小时。
本发明的说明
为了提供具有全长纤溶酶的血纤蛋白-和抗纤溶酶-结合特性的简单的非糖基化分子，本发明提供了纤溶酶原的缺失突变体。在该突变体(在本文中被称为Δ-纤溶酶原)中，位于与三环域1同源的结构域和激活位点之间的天然氨基酸序列的至少一部分缺失了。一方面，与人纤溶酶原的天然三环域1结构域同源的结构域可以直接连到纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶部分，或它的同源性功能类似物，基本上只有包含纤溶酶原激活位点的间插天然序列保留在这两个结构域之间。
本发明的Δ-纤溶酶(原)可表征为：Δ-纤溶酶的较低分子量(37，198Da)可以产生增加的比活性(每毫克蛋白)；缺少天然蛋白中见到的至少两个糖基化位点(参见图3)，结合相对低的分子量，有利于利用相对廉价的细菌和酵母表达系统重组生产这种蛋白；Δ-纤溶酶原可以通过纤溶酶原激活物tPA，尿激酶，和链激酶激活；与天然三环域1同源的结构域的存在，保持了纤溶酶的血纤蛋白-结合特性，这对于溶解血栓的效力来说是重要的；α2-抗纤溶酶-结合部位在与三环域1同源的结构域上的存在使得Δ-纤溶酶能够被纤溶酶的这种生理学抑制剂迅速抑制(一种能够阻止出血的特征)；Δ-纤溶酶的大小较小有利于其被α2-巨球蛋白抑制，相对天然纤溶酶来说进一步减小了出血并发症的机会。在特定实施方案中，三环域5(它保留了对完整的未消化过的血纤蛋白(原)的原始结合部位)的缺乏，使得可以使用Δ-纤溶酶而减少对循环血纤蛋白原的消耗。
一般来说，本发明提供了重组纤溶酶(原)分子，它具有单一的三环域区，位于激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域的N-末端，相对小-纤溶酶(原)来说具有某些优点。尽管本发明的Δ-纤溶酶原多肽只具有一个三环域区，并就这样位于激活位点的N-末端，某些实施方案包括位于所述激活位点的N-末端的额外序列。额外的N-末端序列可来自纤溶酶原的天然三环域区的序列。
本发明的N-末端三环域包括天然纤溶酶(原)的三环域1和4的三环域序列，及其功能性等同物。具体地讲，参见下面的讨论，其中提供了有关保留多肽变体的功能的指南，包括保留参与或影响赖氨酸结合的残基。
定义
如在本文中使用的，术语多肽的“结构域”和“区”一般是同义的，除非作出了相反的说明。在与诸如“三环域”或“丝氨酸蛋白酶”等的公认的结构或功能命名一起引用时，所述术语会引入与至少某些特征相关的多肽特征，这些特征被普遍认可并且理解为与对应所述命名的多肽结构相关。
在本文中使用的″培养的宿主细胞″表示包含业已通过任何方法导入细胞的异源DNA的原核或真核细胞，所述方法例如电穿孔，磷酸钙沉淀，显微注射，转化和病毒感染等。
在本文中使用的″异源的″表示″具有不同的天然来源″或表示非天然状态。例如，如果培养的宿主细胞是用来自其他生物，特别是来自其他物种的DNA或基因转化的，所述基因相对于该培养的宿主细胞来说是异源的，并且相对于携带所述基因的培养的宿主细胞的后代来说也是异源的。类似地，“异源的”表示来自并且插入相同的天然原始细胞类型的核苷酸序列，不过它是以非天然状态存在的，例如，不同的拷贝数或处于不同的调控元件的控制下。
″载体″分子是可以插入异源核酸的核酸分子，随后可以将它导入合适的培养的宿主细胞。载体优选具有一个或多个复制起点，以及一个或多个可以插入重组DNA的位点。载体通常具有便利手段，通过它可以从没有载体的细胞中选择具有载体的细胞，例如，它们编码耐药性基因。常见的载体包括质粒，病毒基因组，和(主要是在酵母和细菌中)″人工染色体″。
在本文中使用的术语″转录控制序列″表示核酸序列，如起始序列，增强子序列和启动子序列，其诱导，抑制，或以其他方式控制可操作地与它连接的蛋白编码核酸序列的转录。
术语″多肽″在本文中可以与术语″肽″和″蛋白″交换使用。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可以交换使用，并且可以表示包含对本文所述目的必要的信息的任何核酸。就是说，所述核酸可以是DNA或RNA，是单链的或双链的，或其他核酸，只要所述多聚物能够体现合适的信息就行，例如就所编码的肽而言，并且可以包括互补序列，例如，核酸聚合体的正义链和反义链。
术语多肽的″变体″表示改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有″保守性″改变，其中，置换的氨基酸具有类似的结构或化学特性，例如，用异亮氨酸置换亮氨酸。另外，变体可以具有″非保守性″变化，例如，用色氨酸置换甘氨酸。类似的次要变化还可以包括氨基酸缺失或插入或这两者。一种具体形式的″变体″多肽是″功能性等同的″多肽，即，表现出与本发明的多肽实例大体上类似的体内或体外活性的多肽，正如下面更详细地披露的。可以使用本领域众所周知的计算机程序寻找决定哪一个氨基酸残基可以被置换，插入或缺失，而又不消除生物学或免疫学活性的指南，例如，DNASTAR软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)。另外，下面提供了具体的指南，包括在被以全文形式收作本文参考的引用的参考文献中提供的指南。
在本文中使用的术语“N-末端”和“C-末端”表示它们所应用的任何氨基酸序列或多肽结构域或结构的相对位置。根据本说明书可以了解相对定位。就是说，“N-末端”特征位于比在相同上下文中讨论的另一特征至少更靠近多肽分子的N-末端(所述另一个特征可能称为处于第一种特征的“C-末端”)。类似地，在本文中术语“5’-”和“3’-”可用于表示多核苷酸中的特征的相对位置。
在这里所指的Δ-纤溶酶原/纤溶酶多肽表示具有“与天然人纤溶酶原的三环域同源”的N-末端结构域，表现出与纤溶酶原的天然三环域类似的结构和功能特征。另外，在本文中所指的Δ-纤溶酶原/纤溶酶多肽具有“与三环域1同源”的N-末端结构域，表现出类似于天然三环域1的特征，至少达到所述多肽对ω-氨基羧酸类(和功能性同系物，如反-4-氨甲基环己烷-1-羧酸，一种环酸)的亲和力比三环域5高的程度。例如，参见Chang，Y.，et al.，Biochemistry 37：3258-3271(1998)，被收作本文参考，有关用于比较分离的三环域多肽与以下化合物的结合的条件和方案：5-氨基戊酸(5-APnA)；6-氨基己酸(6-AHxA)，又被称作ε-氨基己酸(εACA)；7-氨基庚酸(7-AHpA)；和反-4-氨甲基环己烷-1-羧酸(t-AMCHA)。
所提到的“与三环域4同源”的三环域是以与上文所提到的术语“与三环域1同源”类似的方式定义的。就是说，如上文所讨论的，它们表现出与天然人纤溶酶原的三环域1类似的功能特征。这些多肽还如上所述能结合固定化的赖氨酸。
本发明的多肽结合固定化的赖氨酸。在本文中使用的短语“结合固定化的赖氨酸”表示如此表征的多肽与小-纤溶酶原相比，在使用赖氨酸-SEPHAROSE作为层析介质进行柱层析时，其前进延迟。通常，本发明的多肽可以使用含有特异性配体例如εACA的溶液作为洗脱剂从所述层析介质(赖氨酸亲和树脂)中洗脱。
另外，除了上面提到的Chang等的文献之外，本领域技术人员可以查阅其他参考文献，以确定哪些残基可以通过保守性或非-保守性置换，缺失或添加加以改变，以便得到本发明范围内的缺失突变体。例如，以下参考文献提供了有关可能对ω氨基羧酸的结合起着重要作用的天然三环域中的特定残基的信息：授予Ji等的美国专利号6,538,103；授予Suzuk i的美国专利号6,218,517；Douglas，J.T.，et al.，Biochemistry41(10)：3302-10(2002)；Zajicek，J.，et al.，J.Mol.Biol.，301(2)：333-47(2000)；Lee，H.，et al.，Arch BiochemBiophys.，375(2)：359-63(2000)；Castellino，F.和S.McCance，Ciba Found Symp.212：46-60(1997)；McCance，S.，et al.，J.Biol.Chem.，269：32405-32410(1994)；Rejante，M.R.和M.Llinas，Eur.J.Biochem.，221(3)：939-49(1994)；Wu，T.P.，et al.，Blood Coagul.Fibrinolysis，5(2)：157-66(1994)；Hoover，C.J.，et al.，Biochemistry，32(41)：10936-43(1993)；Menhart，N.，et al.，Biochemistry，32：8799-8806(1993)；Thewes，T.，et al.，J.Biol.Chem.，265(7)：3906-3915(1990)；Novokhatny，V.，et al.，ThrombRes.，53(3)：243-52(1989)；Motta，A.，et al.，Biochemistry，26(13)：3827-36(1987)；Novokhatny，V.，et al.，J.Mol.Biol.，179：215-232(1984)；Lerch，P.G.，et al.，Eur.J.Biochem.，107(1)：7-13(1980)；Sottrup-Jensen，L.，et al.，Prog.Chem.Fibrinol.Thrombol.，3：191-209(1978)；和Wiman，B.和D.Collen，Nature 272，549-545(1978)，所有文献都以全文形式收作本文参考。
由于本发明人业已认识到可以制备有价值的简化的纤溶酶(原)分子，它具有N-末端三环域，具有有利的功能性特征(可以通过检测本文所述的对固定化的赖氨酸的结合而部分地进行评价)，本发明可以包括位于激活位点N-末端的其他血纤蛋白-结合结构域或区。例如，本发明可以包括这样的多肽，其中，纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域连到选自下列一组的血纤蛋白-结合三环域：包括但不局限于人纤溶酶原的三环域4，tPA的三环域2，或载脂蛋白(a)的三环域。另外，本发明可以包括这样的多肽，其中，纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域连接到任何其他已知的血纤蛋白-结合分子上，例如，tPA或纤连蛋白的“指状”结构域，或血纤蛋白-特异性IgG的FAB片段。
在特定实施方案中，位于Δ-纤溶酶原的N-末端三环域的某些位置上的残基相对天然人纤溶酶原的三环域1来说是保守的。这些可以是处在与赖氨酸结合相关的位置上的残基，并且包括Pro136-Pro140，Pro143-Tyr 146，以及Arg153-Tyr156(位置编号如图3所示)。本发明的Δ-纤溶酶原的某些实施方案在153位上可以具有Ar g。在其他实施方案中，所述残基的具体位置可以略有改变，而仍然出现在所述多肽的结构和功能类似的位置上(即相对N-末端结构域的三环域结构；参见Chang，Y.，et al.正如上文所讨论的)。在某些实施方案中，Δ-纤溶酶(原)多肽的N-末端三环域区与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4的百分同一性，比与天然人纤溶酶原的三环域5的百分同一性大至少一个残基。
另外，本发明的具体实施方案可以通过与具有类似结构域组成(即，三环域-丝氨酸蛋白酶(K-SP))的小-纤溶酶(原)相比进行功能性表征(参见Sottrup-Jensen，L.，et al.，Progress in ChemicalFibrinolysis and Thrombolysis，Vol.3，(Eds：J.F.Davidson，et al.)Raven Press，New York(1978))。在优选实施方案中，本发明的Δ-纤溶酶表现出被α2-抗纤溶酶抑制的速度增加，例如，比对小-纤溶酶的抑制速度快大约一或两个数量级那么多。另外，在特定实施方案中，Δ-纤溶酶能结合固定化的赖氨酸(例如，赖氨酸-SEPHAROSE)。
Δ-纤溶酶原的三环域被表征为“N-末端”仅表示该结构域存在于激活位点的N-末端，而不表示不存在位于所述结构域本身的N-末端的额外氨基酸残基。另外，介于与三环域1同源的结构域和纤溶酶原的激活位点之间的残基的数量和身份可以改变，而又不超出本发明的范围。本领域技术人员能够确定能获得本发明的优点(ω氨基羧酸的三环域1-样结合，而又不会显著增加缺失突变体的大小或导入潜在有问题的糖基化位点)的这些变体，在本文公开内容和本文引用的文献有关三环域1功能和结构的指南的基础上无需进行过多实验。
因此，本发明涉及多核苷酸，多肽，生产所述多肽的重组方法，包含所述多核苷酸的载体，用于生产所述多肽的表达系统，以及包含所述表达系统的培养的宿主细胞。
正如所指出的，一方面本发明涉及编码本文所披露的多肽或具有其保守性氨基酸置换的多肽的多核苷酸。下面将更详细地提供有关选择“保守性”氨基酸置换的指南。在一种实施方案中，所述多核苷酸是DNA。
另一方面，本发明涉及制备载体的方法，包括将本发明的多核苷酸插入载体。另一方面，本发明涉及通过本发明方法生产的载体。
另一方面，本发明涉及制备培养的宿主细胞的方法，包括将本发明的载体导入培养的宿主细胞。另一方面，本发明涉及通过本发明方法生产的培养的宿主细胞。
另一方面，本发明涉及通过包括以下步骤的方法生产的本发明的分离的多肽：(a)将包含编码所述多肽的多核苷酸的载体导入培养的宿主细胞；(b)培养所述宿主细胞；和(c)回收所述多肽。另一方面，本发明涉及用于生产多肽的方法，包括：(a)在表达所述载体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收多肽。
另一方面，本发明涉及包含至少一种本发明的多核苷酸的细胞。
在一种实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1所示出的核苷酸序列。在另一种实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：2所示出的氨基酸序列。
多核苷酸
本发明的多核苷酸包括具有可能涉及一个或多个核苷酸的置换，缺失和/或添加的变体。所述变体可以在编码区，非编码区，或这两个区改变。编码区的改变可以产生保守性或非保守性氨基酸置换，缺失或添加。其中特别优选的是沉默置换，添加和缺失，这种变化不会改变Δ-纤溶酶(原)蛋白或其部分的特性和活性。在这一方面同样特别优选的是保守性置换(参见下文)。
本发明的其他实施方案包括核酸分子，包含具有与以下序列至少90％，更优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：2所示出的完整氨基酸序列的Δ-纤溶酶原多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：2所示出的氨基酸序列的Δ-纤溶酶原多肽的核苷酸序列；和(c)与上面的(a)或(b)中的任意核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在说到多核苷酸的核苷酸序列与编码Δ-纤溶酶原多肽的参考核苷酸序列至少例如95％“相同”时，表示所述多核苷酸的核苷酸序列与所述参考序列相同，所不同的是，所述多核苷酸序列在编码Δ-纤溶酶原多肽的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中可包括多至5个点突变。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多至5％的核苷酸可以缺失或用其他核苷酸置换，或可以将数目高至参考序列总核苷酸5％的核苷酸插入所述参考序列。所述参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或位于两个末端位置之间的任何位置，单独分散在参考序列的核苷酸之中或者在参考序列内的一个或多个连续的组中。
正如上文所指出的，可以通过确定它们的百分同一性比较两个或多个多核苷酸序列。同样可以通过确定它们的百分同一性比较两个或多个氨基酸序列。无论是核酸或肽序列，两个序列的百分同一性一般被描述为两个比对序列之间的完全匹配的数目除以较短序列的长度并且乘以100。核酸序列的近似比对是通过Smith和Waterman的局部同源性算法提供的，见Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)。该算法可以扩展到用于肽序列，采用由Dayhoff开发的评分矩阵，见Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff ed.，5suppl.3：353-358，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.，USA，并且由Gribskov统一化，见Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)。这种算法对于核酸和肽序列的一种实施是由Genetics Computer Group(Madison，Wis.)在他们的BESTFIT应用程序中提供的。该方法的预设参数披露于以下文献中：Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual，Version 8(1995)(可以从Genetics Computer Group，Madison，Wis.获得)。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员很容易意识到与SEQ ID NO：1所示出的核酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的大量的核酸分子都能够编码Δ-纤溶酶原多肽。实际上，由于所述核苷酸序列的简并变体都编码相同的多肽，这对本领域技术人员来说是显而易见的，甚至不需要进行本文所披露的任何功能分析或测定。本领域还可以理解的是，对于不是简并变体的这类核酸分子来说，也会有合理数量的核酸分子编码具有Δ-纤溶酶原多肽活性的多肽。这是因为技术人员完全了解不太可能或不可能显著影响蛋白功能的氨基酸置换(例如，将一种脂肪族氨基酸置换为另一种脂肪族氨基酸)。
最近，在较长的多核苷酸序列的合成生产方面的进展业已能够合成生产编码显著更长的多肽的核酸，而不使用传统克隆技术。这些服务的商业提供者包括Blue Heron有限公司，Bothe11，WA(http://www.blueheronbio.com)。由Blue Heron有限公司所采用的技术披露于美国专利6,664,112；6,623,928；6,613,508；6,444,422；6,312,893；4,652,639；美国公开专利申请号20020119456A1；20020077471A1；和公开的国际专利申请(公开号)WO 03054232A3；WO 0194366A1；WO9727331A2；和WO9905322A1中，所有文献都被收作本文参考。
当然，分子生物学，微生物学和重组核酸的传统技术也可用于生产本发明的多核苷酸。这些技术是众所周知的，并且披露于以下文献中，例如，Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausebel，ed.，Vols.I，II and III(1997)；Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring HarborLabora tory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；DNA Cloning：A Practical Approach，D.N.Glover，ed.，Vols.I and II(1985)；Ol igonucleotide Synthesis，M.L.Gait，ed.(1984)；Nucleic AcidHybridization，Hames和Higgins，eds.(1985)；Transcription andTranslation，Hames和Higgins，eds.(1984)；Animal Cell Culture，R.I.Freshney，ed.(1986)；Immobilized Cells and Enzymes，IRLPress(1986)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″；the series，Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.(1984)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，J.H.Miller和M.P.Calos，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；和Methodsin Enzymology，Wu和Grossman和Wu，eds.，分别见Vols.154和155，以上文献都被收作本文参考。
载体和培养的宿主细胞
本发明还涉及包括本发明的分离的核酸分子的载体，用所述重组载体进行遗传工程改造的培养的宿主细胞，以及通过重组技术生产Δ-纤溶酶(原)多肽。
可以使用公知技术将重组构建体导入培养的宿主细胞，如感染，转导，转染，转位，电穿孔和转化。例如，所述载体可以是噬菌体，质粒，病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是能复制的或复制缺陷型的。在后一种情况下，病毒繁殖通常只能在补偿性培养宿主细胞中发生。
所述多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接，以便在培养的宿主中繁殖。一般，将质粒载体导入沉淀物，如磷酸钙沉淀，或导入与带电荷的脂质的复合物。如果所述载体是病毒的话，可以用合适的包装细胞系进行体外包装，然后转导进入培养的宿主细胞。
优选的是包含对感兴趣的多核苷酸的顺式作用控制区的载体。合适的反式作用因子可以通过培养的宿主提供，通过互补载体提供或通过载体本身在导入培养的宿主后提供。
在这一方面的某些实施方案中，所述载体提供了特异性表达，它可以是诱导型和/或细胞类型特异性的。在这种载体中特别优选的是可以通过便于操纵的环境因素如温度和营养添加剂诱导的载体。
可用于本发明的表达载体包括染色体-，附加体-和病毒-衍生的载体，例如，来自细菌质粒，噬菌体，酵母附加体，酵母染色体元件，病毒如杆状病毒，乳多泡病毒，痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，伪狂犬病毒和逆转录病毒的载体，以及来自它们的组合的载体，如粘粒和噬菌粒。
DNA插入片段应当可操作地连接到合适启动子上，如噬菌体λPL启动子，E.colil ac，trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTR的启动子(仅举几个例子)。其他合适的启动子为本领域技术人员所公知。表达构建体还包含转录起始位点，终止位点，并且在转录区中还包含用于翻译的核糖体结合部位。由所述构建体表达的成熟转录物的编码部分优选包括位于开始部分的翻译起始和适当地位于要翻译的多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。
正如所指出的，表达载体优选包括至少一种可选择的标记，这类标记包括二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，用于真核细胞培养物；以及四环素或氨苄青霉素抗性基因，用于在大肠杆菌(E.coli)和其他细菌中培养。合适的培养的宿主的典型例子包括但不局限于细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)S2和草地夜蛾Sf 9细胞；动物细胞，如CHO，COS和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。用于上述培养的宿主细胞的合适的培养基和条件为本领域所公知。
优选用于细菌的载体包括pQE70，pQE60和pQE-9，可以从QiagenInc.，Valencia，CA购买；pBS载体，PHAGESCRIPT载体，BLUESCRIPT载体，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A，可从Stratagene，LaJolla，CA购买；和ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5，可以从Pharmacia(现在是辉瑞有限公司，New York，NY)购买。优选的真核载体有pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG，可以从Stratagene公司购买；以及pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL，可以从Pharmacia公司购买。其他合适的载体对本领域技术人员来说是显而易见的。
适用于本发明的细菌启动子包括E.coli lacI和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，λPR和PL启动子，和trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期SV40启动子，逆转录病毒LTR的启动子，如劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子，和金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
将载体构建体导入培养的宿主细胞可以通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子型脂类介导的转染，电穿孔，转导，感染或其他方法实现。所述方法披露于很多标准实验室手册中，如Davis etal.，Basic Methods In Molecular Biology，2nd Edition(1995)。
由高等真核生物转录编码本发明多肽的DNA可以通过将增强子序列插入所述载体而增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，它能在给定类型的培养的宿主细胞中提高启动子的转录活性。增强子的例子包括SV40增强子，它位于复制起点后侧(late side)100-270 bp的位置；巨细胞病毒早期启动子增强子；多瘤病毒增强子，位于复制起点的后侧；以及腺病毒增强子。
为了使翻译的蛋白分泌到内质网腔，进入壁膜间隙或进入细胞外环境，可以将合适的分泌信号掺入到所表达的多肽中。所述信号对所述多肽来说可以是内源的，或者它们可以是外源信号。
所述多肽能够以修饰过的形式表达，如融合蛋白，并且能够不仅包括分泌信号，而且还包括其他异源功能区。例如，一段额外的氨基酸，特别是带电荷的氨基酸，可以添加在所述多肽的N-末端，以便在纯化期间或者在随后的处理和保存期间改善在培养的宿主细胞中的稳定性和持久性。另外，还可以将肽部分添加到所述多肽上，以便有利于纯化。所述区段可以在最终制备所述多肽之前去掉。向多肽上添加肽部分以引起分泌或外泌，以便提高稳定性并且有利于纯化等等，这些是本领域熟知的和常用的技术。优选的融合蛋白包含来自免疫球蛋白的异源区，它可用于溶解蛋白。例如，EP 0464533A1(加拿大的对应申请为2,045,869)披露了包含免疫球蛋白分子的恒定区的多个不同部分与另一种人蛋白或其部分的融合蛋白。在很多场合下，融合蛋白中的Fc部分非常有利于用于治疗和诊断，并因此导致例如改善了的药物动力学特性。另一方面，对某些用途来说，希望在融合蛋白以所述有利方式表达、检测和纯化之后能够删除所述Fc部分。当Fc部分被证实妨碍了在治疗和诊断上的应用时这尤其如此，例如，当所述融合蛋白有待用作免疫的抗原时。例如，在药物发现方面，业已将人类蛋白与Fc部分融合，以便进行高处理量筛选试验(如hIL5-受体，以便鉴定hIL-5的拮抗剂)。参见Bennett，D.，et al.，J.MolecularRecognition，8：52-58(1995)和Johanson，K.et al.，J.Biol.Chem.，270(16)：9459-9471(1995)。
Δ-纤溶酶原蛋白可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，包括在本文的实施例中所具体披露的。本发明的多肽包括天然纯化的产物，化学合成方法的产物，以及通过重组技术从原核或真核培养宿主生产的产物，所述宿主包括例如细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞。另外，本发明的多肽还可以包括原始修饰过的甲硫氨酸残基，在某些场合下是宿主介导的过程的结果。
多肽
本发明的多核苷酸包括编码本发明多肽的变化形式和具体例子的那些。例如，有关如何制备表型沉默氨基酸置换的指南披露于以下文献中：Bowie，J.U.et al.，“Deciphering the Message in ProteinSequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions，”Science 247：1306-1310(1990)，其中，所述作者指出，蛋白令人吃惊地耐受氨基酸置换。尽管本发明范围内的任何数量的置换都可以通过应用这种一般原则获得，对于有关置换的具体指南，本文所引用的关于三环域1结构域的结构和功能的文献可供本领域技术人员参考。
还可以理解的是，根据所采用的标准，Δ-纤溶酶原多肽的三环域1，激活位点，和丝氨酸蛋白酶结构域的确切“位置”在本发明范围内的具体变化中可略有不同。例如，相对于激活位点，三环域1结构域的确切位置可略微变化和/或三环域1结构域的N-末端的序列的长度可以改变。因此，本发明包括Δ-纤溶酶原多肽的这样的变化形式，其表现出本文所披露的Δ-纤溶酶原多肽活性。这种变体包括缺失，插入，倒位，重复，和置换。正如上面所指出的，有关哪些氨基酸变化可能是表型沉默的指南可以参见以下文献：Bowie，J.U.，et al.，“Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance toAmino Acid Substitutions”，Science 247：1306-1310(1990)。
因此，SEQ ID NO：2所示的多肽的片段，衍生物或类似物可以是(i)这样的物质，其中，一个或多个氨基酸残基(例如，3，5，8，10，15或20)被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)所置换，这种置换的氨基酸残基可以是或者不是由遗传密码编码的，或(ii)这样的物质，其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团(例如，3，5，8，10，15或20)，或(iii)这样的物质，其中，成熟的多肽与另一种化合物融合，如能延长所述多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)这样一种物质，其中额外的氨基酸与成熟的多肽融合，如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化成熟的多肽或前蛋白序列的序列。这样的片段，衍生物和类似物被视为本领域技术人员通过阅读本说明书可以了解的范围。
正如所指出的，改变优选是微小性质的，如不会显著影响蛋白折叠或活性的保守性氨基酸置换。当然，技术人员可以进行的氨基酸置换的数目取决于很多因素，包括上面所披露的因素。一般来说，对任何给定Δ-纤溶酶原多肽的置换数将不超过50，40，30，25，20，15，10，5或3。
对功能来说必需的本发明Δ-纤溶酶原多肽中的氨基酸可以通过本领域公知的方法确定，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一种方法在有关分子的每个残基上导入单一的丙氨酸突变。然后测试所得到的突变型分子的生物学活性，例如，正如在本文所披露的实施例中所示的。对配体结合来说关键的位点还可以通过结构分析确定，如结晶，核磁共振或光亲和标记(Smith，et al.，J.Mol.Biol.224：399-904(1992)和de Vos，et al.Science 255：306-312(1992))。即使从蛋白的N-末端去掉一个或多个氨基酸导致了所述蛋白的一种或多种生物学功能的改变或丧失，其他生物学活性可仍然得以保留。
还可以预期的是，可用于生产本发明的“分离的多肽”的多肽能够通过固相合成方法生产。可以参见Houghten，R.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135(1985)；和授予Houghten等的美国专利号4,631,211(1986)。
本发明的多肽能够以分离的形式提供。所说的“分离的多肽”表示从它的天然环境中取出的多肽。因此，对于本发明的目的而言，在重组培养宿主细胞中生产和/或包含的多肽被认为是分离的。还表示为“分离的多肽”的是从重组培养宿主中部分或大体纯化的多肽。
具有与Δ-纤溶酶原多肽的参考氨基酸序列具有所标明的百分同一性的氨基酸序列的多肽可以用所述方法确定，包括计算机辅助的方法，如上面结合多核苷酸时指出的。正如在前面讨论核苷酸序列时所述，对多肽氨基酸序列进行检查和比较。本领域技术人员可以理解的是，这样的概念，如对多核苷酸所讨论的分子端点，在考虑所述方法和程序用于多肽分析的相应用途时具有直接的类似物。例如，有关多核苷酸讨论的人工校正指核酸的5’和3’端点，不过，相同的讨论被认为可适用于多肽的N-末端和C-末端。
本发明包含Δ-纤溶酶原多肽，它在翻译期间或之后以不同的方式修饰，例如，糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白酶剪切，连接在抗体分子或其他细胞配体上等。多种化学修饰中的任何修饰都可以通过已知技术完成，包括但不局限于通过溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，S.aureus V8蛋白酶，NaBH4进行的特异性化学裂解；乙酰化，甲酰化，氧化，还原；在存在衣霉素的条件下进行代谢合成等。
本发明包含的其他翻译后修饰包括，例如，N-连接的或O-连接的糖链，N-末端或C-末端的加工)，将化学部分连接在氨基酸主链上，N-连接的或O-连接的糖链的化学修饰，以及为在原核培养宿主细胞中表达Δ-纤溶酶原多肽而改造载体和构建体所致的添加N-末端甲硫氨酸残基。所述多肽还可以通过可检测的标记修饰，如酶，荧光，同位素或亲和标记，以便可以检测和分离所述蛋白。
药用组合物和治疗方法
Δ-纤溶酶(原)可以按照在以下文献中披露的方法和组成配制用于治疗用途：US 2003/0012778A1；和Novokhatny，V.，et al.，J.Thromb.Haemost.1(5)：1034-41(2003)，这两份文献都被收作本文参考。例如，可以将低-pH(大约2.5-大约4)，低缓冲力缓冲液用于制备Δ-纤溶酶。另外，本领域技术人员所公知的其他方法和配方，如对纤溶酶，小-纤溶酶，和/或微-纤溶酶的实践，可用于配制本发明的Δ-纤溶酶，用于治疗性施用。
Δ-纤溶酶(原)可用于治疗多种血栓形成性疾病或病况，例如，按照披露于以下文献中的方法进行：美国专利号6,355,243；和公开的美国专利申请号US 2003/0026798A1；US 2003/0175264A1，所有文献都被收作本文参考。同样，正如可能的药用制剂可应用于Δ-纤溶酶，Δ-纤溶酶也可以通过本领域公知的方法治疗性施用，例如，目前可对纤溶酶，小-纤溶酶，和/或微-纤溶酶实施的方法。
实施例
表达载体设计
Δ-纤溶酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码Δ-纤溶酶原的推定的序列针对大肠杆菌表达和mRNA稳定性进行密码子优化，以便产生如SEQ ID NO：1所示出的DNA序列。
化学合成该DNA(Blue Heron，Inc，)并且插入大肠杆菌表达载体pET22b(+)(Novagen；Madison，WI)的NdeI和BamH1位点，以便生产细胞质蛋白。这种构建体能生产具有额外的，非天然N-末端甲硫氨酸的Δ-纤溶酶原(pET-22b(+)＝pET表达系统22b(Cat.No.70765)，EMDBiosciennces，Inc.，Novagen Brand，Madison，WI；参见http://www.emdbiosciennces.com，了解有关载体的细节可参见与pET-22b相关的产品信息部分)。
Δ-纤溶酶原表达和纯化
将编码Δ-纤溶酶原序列的DNA转化入多种细胞，并且通过SDS-PAGE分析在用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导之后蛋白的过表达。细胞类型BL21(DE3)RIL(Stratagene，La Jolla，CA)细胞，通过工程改造成能够表达编码Arg，Ile，和Leu的罕见的大肠杆菌tRNA，将它用于生产Δ-纤溶酶原。
通过大规模表达证实Δ-纤溶酶原的生产，其中，裂解细胞，并且通过SDS-PAGE检查可溶性蛋白和纯化的内含体。BL21(DE3)RIL细胞产生了内含体形式的大量的Δ-纤溶酶原蛋白。表达估计为50-80mg/L细胞培养物。
可以将以下典型方案用于表达Δ-纤溶酶原：
将包含Δ-纤溶酶原载体的BL21(DE3)RIL细胞的单一的菌落用于接种5ml的LB/氨苄青霉素(100×μg/ml)/氯霉素(50μg/ml)，并且在37℃下在摇床上培养8小时。此后，从培养的细菌悬浮液中取出50μl的等分样品，用于在新鲜培养基中进一步生长。16小时之后重复以上操作，使用6ml的细菌培养物和250ml的培养基。培养物在37℃下摇动生长，达到OD600nm为大约1.0，并且加入IPTG至1mM的最终浓度。让培养物再生长5小时。通过以5,000xg的速度离心收获细胞，并且将细胞沉淀物溶解在含有20mM EDTA的20mM Tris pH 8.0中，并且在-80℃下冷冻。
为了纯化Δ-纤溶酶原，将细胞沉淀物解冻，并且添加缓冲液，直到溶液体积约为原始细胞培养物体积的1/20。此后，添加溶菌酶，使最终浓度为0.5mg/ml，并且在4℃下快速搅拌细胞10-15分钟。然后，添加Triton X-100到1％的最终浓度，并且再继续搅拌10分钟。添加DNAse I(0.05mg/ml)和MgCl2(2.5mM)，并且在4℃下继续搅拌30分钟，或直到溶液不再黏稠。最终的溶液在4℃以15,000x g的速度离心30分钟，并且丢弃上清液。
用洗涤液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，含有10mM EDTA，1％Triton-X-100，和0.5M尿素)洗涤细胞沉淀物3次，并且将最终的沉淀物溶解在40ml的提取缓冲液(PBS，pH 7.4，含有10mM EDTA，20mM DTT，和6M盐酸胍)中，并且在4℃下保存过夜。16小时之后，以15,000x g的速度对该溶液进行离心30分钟，以便除去固体，并且将上清液缓慢添加到再折叠溶液(50mM Tris-HCl，pH 8.3，3.5M盐酸胍，0.5M精氨酸HCl，10mM EDTA，3mM GSH，0.3mM GSSG)中，同时在4℃下搅拌。再折叠过程是在0.03mg/ml或以下的蛋白浓度下进行的。
将再折叠溶液在4℃下保持2天不受干扰，然后用8倍体积的含有10mM EDTA，0.15M NaCl，0.15M精氨酸-HCl的0.1M Tris-HClpH 8.0透析8-10小时，经常更换缓冲溶液。
然后从透析中取出蛋白溶液，并且使用AMI CON滤膜进行浓缩，滤膜的膜截断分子量为10kDa，将蛋白溶液浓缩到大约10-20ml，并且用100倍体积的含有10mM EDTA，0.15M NaCl的0.1M Tris pH 8.0透析过夜。离心该材料以便除去颗粒物，然后过赖氨酸亲和树脂(赖氨酸-SEPHAROSE 4B；Amer sham Biosciences，Piscataway，NJ)。使用含有0.2Mε氨基己酸(εACA)的Tris-缓冲的盐水，pH 8.0从所述树脂上洗脱Δ-纤溶酶原。
通常，从1升细胞培养物中可以分离出80mg的内含体，并且在赖氨酸-SEPHAROSE层析步骤中可以洗脱40mg。
Δ-纤溶酶原的特性
通过对还原的(二硫苏糖醇-处理的)和非还原的蛋白进行SDS-PAGE分析发现，纯化的Δ-纤溶酶原表现为在35-40kDa区域单一的条带(参见图5)。通过MALDI质谱法测定的它的确切的分子量为37，089Da，非常接近预期值37，198Da。
为了检验Δ-纤溶酶原(ΔPg)是否可以激活成Δ-纤溶酶，将Δ-纤溶酶原与尿激酶一起温育(摩尔比为1∶1000)，并且通过测定S-2251(S-2251＝D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺，DiaPharma Group，Inc.，West Chester，OH)水解速度的增加监测丝氨酸蛋白酶活性的增加。如由图6可见，观察到了激活偶联反应(酶原被转化成活性酶(1)；和酶裂解生色的底物(2))典型的活性的抛物线性增加。在上述条件下，Δ-纤溶酶原激活成Δ-纤溶酶是在3分钟内完成的。用tPA和链激酶获得了非常类似的结果。
Δ-纤溶酶原的尿激酶激活的动力学利用Wohl等方法与全长的纤溶酶原的动力学进行比较(Wohl，R.C.，Summaria，L.，Arzadon，L.，and Robbins，K.C.；J.Biol.Chem.253：1402-1407(1978)，被完整地收作本文参考)。为此，将5.8nM尿激酶添加到含有不同浓度的纤溶酶种类的溶液中，存在1mM S-2251底物，温度为37℃，pH 7.5。监测在405nm波长下的吸光度的增加，并且使用抛物线方程计算S-2251产物形成的加速度，其中，速度＝k·t2。采用Lineweaver-Burk分析，将数据代入Michaelis-Menten动力学模型，得到了以下值：
表1.Δ-纤溶酶原的尿激酶激活的动力学。
 种类：   Km(μM)   kcat(min-1)  kcat/Km(μM-1min-1)
 Δ-纤溶酶原   30+/-5   80+/-10  2.67
  纤溶酶原   1.2+/-0.1   2.3+/-0.3  1.92
全长的纤溶酶原很好地被尿激酶激活，其Km值类似于在文献中出现的值(1.7μM；Woh1，R.C.，Summaria，L.，和Robbins，K.C.；J.Biol.Chem 255(5)：2005-2013(1980))和等同的kcat值。
尿激酶激活Δ-纤溶酶原的Km值大约比对纤溶酶原高30倍，可能表明了尿激酶对纤溶酶原的这种突变体具有较低的亲和力。与此同时，激活Δ-纤溶酶原的kcat值比对纤溶酶原高得多。尽管在kcat和Km方面存在上述差别，它们的比例或催化效力对于尿激酶激活天然的和重组修饰的纤溶酶原大体上是相同的。因此，以上数据表明，“外源”三环域1的存在不会明显影响Δ-纤溶酶原中丝氨酸蛋白酶结构域的激活特性。
在另一个激活实验中，将Δ-纤溶酶原与链激酶，tPA，和尿激酶一起温育，并且在还原性SDS-PAGE上分析，以便观察单链Δ-纤溶酶原分子在双链Δ-纤溶酶中的转化(参见图5，泳道3-5)。在所有三种情况下，都可以看到Δ-纤溶酶的两条链(大约12kDa的三环域1和大约25kDa的丝氨酸蛋白酶链)，表明了Δ-纤溶酶原确实可以被所有三种纤溶酶原激活物激活。
正如所预期的，Δ-纤溶酶原通过三环域1与赖氨酸-SEPHAROSE结合，并且可以通过εACA梯度从所述柱上以单一的峰的形式洗脱(参见图7)。重新折叠的Δ-纤溶酶原与赖氨酸-SEPHAROSE结合的能力，表明了所述分子的三环域是正确折叠的，并且赖氨酸-结合部位具有完全的活性。
为了进一步证实三环域1的功能，通过监测蛋白荧光的相关的变化测定εACA与Δ-纤溶酶原的结合，如Matsuka等(Matsuka，Y.V.，Novokhatny，V.V.，和Kudinov，S.A.，Eur.J.Biochem.190：93-97(1990))和Douglas等(Douglas，J.T.，von Haller，P.D.，Gehrmann，M.，Llinas，M.，和Schaller.J.，Biochemistry 41：3302-3310(2002)，所有文献都被收作本文参考)所述。εACA与Δ-纤溶酶原的三环域1的结合导致了荧光的减弱，这可能是由于色氨酸残基的淬火，所述残基是赖氨酸-结合部位的一部分。
为了监测这一过程，将4μl-16μl的εACA浓缩溶液添加到2ml的溶解在含有20mM NaCl的50mM Tris缓冲液中的5μMΔ-纤溶酶原中，pH 8.0，25℃。在298nm的激发波长和340nm的发射波长下在FLUOROMAX荧光分光光度计(Jobin Yvon，Inc.，Edison，NJ)中监测荧光；在每次添加εACA之后，让所述溶液平衡，直到再也观察不到荧光的进一步变化。
将所得到的荧光值对稀释度进行校正，并且相对εACA的浓度进行作图，浓度范围为0-50μMεACA。通过非线性回归拟合数据，获得11.1+/-2.3μM的Kd，与文献中三环域1对εACA的亲和力的值(3.2μM(Matsuka等)和13μM(Douglas等))非常吻合。
纤溶酶的一种特性是它结合血纤蛋白的能力。为了确定Δ-纤溶酶原是否保留了与血纤蛋白相互作用的能力，通过微量滴定板测定测定了它的血纤蛋白结合特性，其中，Δ-纤溶酶原与血纤蛋白的结合是通过tPA随后对它的激活和所造成的凝块溶解评估的。为此，在微量滴定板的每一个孔中用凝血酶对100μl的5mg/ml血纤蛋白原进行聚合化。将各种浓度的Δ-纤溶酶原添加到血纤蛋白凝块的顶部，并且在37℃下温育1小时。用PBS充分洗涤所述平板，同时血纤蛋白凝块仍然保持完整并且附着于所述孔。在洗涤之后，将0.1-mg/ml tPA溶液添加到每一个孔中，并且在37℃下温育平板2小时。结果，某些凝块被完全溶解，并且某些被部分溶解，同时具有极少量Δ-纤溶酶原的孔和对照孔几乎保持完整。通过在280nm波长测量在1M NaOH中重配的原始凝块残余物的吸光度来监测纤维蛋白溶解的程度。以Δ-纤溶酶原浓度的函数形式对所述吸光度值进行作图。
参见图8，Δ-纤溶酶原与血纤蛋白的结合遵循典型的S形结合曲线。通过这种分析，发现Δ-纤溶酶原能结合血纤蛋白，其亲和力与全长的纤溶酶原的亲和力相当，并且该相互作用的C50(大约0.2μM)与全长的纤溶酶原的血纤蛋白-结合Kd(Lucas，M.A.，Fretto，L.J.，和McKee，P.A.；J.Biol.Chem.258(7)：4249-4256(1983))相当。以上实验表明，Δ-纤溶酶原能结合血纤蛋白。
因此，Δ-纤溶酶原与赖氨酸-SEPHAROSE的相互作用，它的以预期的Kd与εACA结合的能力，它的结合血纤蛋白的能力，它的能被所有主要纤溶酶原激活物激活的能力，以及Δ-纤溶酶针对生色的纤溶酶底物S-2251的效力均表明该分子是在大肠杆菌系统中以完全功能性的形式生产的。
Δ-纤溶酶纯化和配制
用含有10mM EDTA和0.15M NaCl的0.1M Tris缓冲液，pH 8.0，透析的Δ-纤溶酶原利用固定在SEPHAROSE 4B上的尿激酶激活形成Δ-纤溶酶，大体上如先前结合纤溶酶所披露的(Marder，V.J.，et al.，Thromb Haemost.，86(3)：739-45(2001)，被收作本文参考)。激活在室温下发生并通过S-2251活性的增强实时监测。根据Δ-纤溶酶原的数量，在每一批之间的数量不同(通常为1-2mg/ml)，温育时间为30-60分钟。在激活完成时，此时S-2251活性达到平台期，将尿激酶-SEPHAROSE过滤出来，并且将活性Δ-纤溶酶捕获在苯甲脒-SEPHAROSE(Pharmacia)上。使用低-pH缓冲液(0.2M甘氨酸，pH 3.0，0.3M NaCl，0.2M εACA)将Δ-纤溶酶从树脂上洗脱下来。
测定洗脱级分中的蛋白浓度和S-2251活性，收集合并高比活性级分并且在4℃下用多次更换的0.15M NaCl，pH 3.6透析。对非还原的Δ-纤溶酶样品进行的SDS-PAGE分析(参见图9，泳道3)表明，该材料的纯度通常超过95％。在还原的条件下(图9，泳道4)，除了丝氨酸蛋白酶和三环域链，存在高于和低于三环域条带的两条微弱的条带。这些条带表示丝氨酸蛋白酶结构域的自动降解产物，它们是由其多肽链的内部裂解产生的；在正常情况下它们是通过二硫键保持在一起的，不过在还原条件下用PAGE可以看见。自动降解产物的数量通常不超过10％，通过以批量方式进行苯甲脒-SEPHAROSE纯化步骤而不是进行柱层析可以大大减少这种产物。
由于Δ-纤溶酶与全长的纤溶酶类似在生理学pH下容易发生自动降解，选择pH 3.6作为最终制剂的pH(用乙酸-盐水酸化)。正如以前结合纤溶酶所披露的(Novokhatny，V.et al.，J Thromb Haemost.，1(5)：1034-41(2003)，被收作本文参考)，并且在使用Δ-纤溶酶进行的实验中得到了证实，这种低缓冲能力，低pH制剂不仅可以长时间安全地储存活性纤溶酶，而且还适应这些直接溶栓剂的肠胃外施用。在与血浆或中性pH缓冲液混合时，Δ-纤溶酶迅速地被再激活。
Δ-纤溶酶的酶特性
利用纤溶酶底物D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(S-2251)(DiaPharma，West Chester，OH)检验了Δ-纤溶酶的酰胺裂解活性。在pH 7.4，25℃的条件下，在PBS缓冲液中发现S-2251的Mi chaelis-Menten常数(Km)为138μM(表2)。发现该制剂的kcat为510min-1。通过4-硝基苯基4-胍基苯甲酸酯盐酸盐(pNPGB)滴定(Chase，T.和E.Shaw，Methods Enzymol.197：20-27(1970))，发现功能性活性位点的百分比为67％。相对百分比活性位点校正kcat，测定kcat为755+/-45min-1。该值非常接近用相同方法测定的全长的纤溶酶的值，760+/-23min-1，和微-纤溶酶(缺少所有五个三环域)的值，795+/-24min-1(参见图9)。以上数据表明，三环域的存在或缺乏不会影响丝氨酸蛋白酶结构域的催化活性。
使用Anonick等的方法测定α2-巨球蛋白对Δ-纤溶酶的抑制速度(Anonick，P.，et al.，Thrombosis Res.59：449-462(1990))。在22℃下，在PBS缓冲液中，发现所述抑制速度为7.6+/-0.6x 105M-1s-1。
使用Wiman和Collen的方法测定α2-抗纤溶酶对Δ-纤溶酶的抑制速度为1.1x 107M-1s-1(Wiman，B.和D.Collen，Eur.J.Biochem.84：573-578(1978))，其中将纤溶酶和α2-抗纤溶酶混合，然后在特定时间点分析S-2251活性(表3)。该值与所报导的纤溶酶的值2.5x107M-1s-1(来自Anonick等，Thrombosis Res.59：449(1990))相当。
用微-纤溶酶进行的相同的实验发现，α2-抗纤溶酶的抑制速度在两个独立的实验中分别为1.8x 105M-1s-1和3.1x 105M-1s-1。小-纤溶酶(小-纤溶酶结构域组成，K5-SP)的α2-抗纤溶酶抑制速度被测定为2.4x 105M-1s-1。以上数据与微型-和小-纤溶酶的文献报导值相当吻合，并且表明了α2-抗纤溶酶对Δ-纤溶酶的抑制速度比对微-纤溶酶或小-纤溶酶的抑制速度快40倍。因此，以上结果表明，Δ-纤溶酶由于在其结构中存在三环域1应当能够被α2-抗纤溶酶迅速抑制。
总体上讲，在这一部分所提供的数据表明了Δ-纤溶酶的酶特性和抑制特性与全长的纤溶酶类似。
表2.在25℃下，在pH 7.4的PBS缓冲液中，各种纤溶酶种类 与底物S-2251的稳态动力学参数。
  KM   kcat
  纤溶酶   193+/-7μM   760+/-23min-1
  小-纤溶酶   160+/-30μM   770+/-70min-1
  微-纤溶酶   145+/-13μM   795+/-24min-1
  Δ-纤溶酶   138+/-5μM   755+/-45min-1
表3.在22℃下，在pH 7.4的PBS缓冲液中测定各种纤溶酶种 类和抑制剂的抑制速度。
  α2-巨球蛋白   α2-抗纤溶酶
  纤溶酶   6.5+/-0.5X 105M-1S-1   2.5+/-0.5X 107M-1S-1(文献值)
  小-纤溶酶   7.5+/-0.3X 105M-1S-1   2.4+/-0.5X 105M-1S-1
  微-纤溶酶   7.8+/-0.6X 105M-1S-1   1.8+/-0.2X 105M-1S-1
  Δ-纤溶酶   7.6+/-0.6X 105M-1S-1   1.0+/-0.1X 107M-1S-1
文献值引自Anonick等，ThrombosisRes.59：449(1990)。所有速度都是按照在Anonick等的文献中所披露的方法测定的。
体外溶栓效力
在导管协助的血栓溶解的体外模型(Novokhatny，V.et al.，JThromb Haemost.，1(5)：1034-41(2003)，被收作本文参考)中测定Δ-纤溶酶的溶栓效力，采用以下实验方案。
将新鲜的人全血采集到20x 0.95cm的玻璃试管中，并且在没有添加剂的条件下让血液自发凝固。在37℃下温育试管20小时，以便完全收缩。使用美国标准实验用筛D16(用14号网孔)将收缩的凝块从血清中分离出来，并且测定其重量。将血液凝块转移到较小直径的玻璃试管中，在其中收缩的凝块紧密配合(0.8x 7cm)。凝块的平均重量为大约3.6g。
用注射器将单一的1-ml剂量的酸化盐水，纤溶酶，或Δ-纤溶酶注入所述凝块。在37℃下，在THELCO实验室烘箱(Jouan，Inc.，Winchester，VA)中温育所述凝块1小时。在温育之后，将所述凝块再次放置在所述筛子上，以便除去液化材料，并且测定消化过的凝块的重量。根据原始凝块重量和残余凝块重量之间的差别，确定凝块溶解程度，并且表达为凝块重量减轻的百分比。
图10显示在该模型中用Δ-纤溶酶进行溶解实验的结果。单一的0.44mg(以摩尔为基础相当于1mg/ml的纤溶酶)剂量的Δ-纤溶酶的输注在60分钟之内导致凝块重量减轻36％。与此同时，输注盐水的凝块的重量仅减轻了4％。纤溶酶(1.0mg)在相同时间内导致凝块重量减轻50％。因此，以上数据表明，Δ-纤溶酶表现出溶栓效力，并且可用作直接的溶栓剂。
本申请还公开了如下编号的内容：
1.多核苷酸，包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与天然人纤溶酶原的三环域同源的单一的N-末端三环域；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；其中，所述多肽能结合固定化的赖氨酸。
2.如项目1的多核苷酸，其中，所述N-末端三环域与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4同源。
3.如项目1的多核苷酸，其中，所述编码的多肽与SEQ ID NO：2所示出的序列的同一性为至少90％或95％，或98％。
4.如项目1的多核苷酸，其中，所述编码的多肽与SEQ ID NO：2所示出的序列的同一性为至少98％。
5.如项目1的多核苷酸，其中，所述编码的多肽是SEQ ID NO：2所示出的序列。
6.如项目1的多核苷酸，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示出的序列或其简并变体。
7.如项目1的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列编码的多肽具有N-末端三环域，其与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4结构域同源；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域。
8.如项目1的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列编码多肽，其具有单一的N-末端三环域，该三环域与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4结构域至少90％相同；和C-末端结构域，它与人纤溶酶原的激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域的同一性为至少90％。
9.多肽，其包含与天然人纤溶酶原的三环域同源的单一的N-末端三环域；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域，其中，所述多肽能结合固定化的赖氨酸。
10.如项目9的多肽，其中，所述N-末端三环域与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4同源。
11.如项目9的多肽，其中，所述多肽表现出纤维蛋白溶解活性，该活性被α2-抗纤溶酶抑制，抑制速度比α2-抗纤溶酶对小-纤溶酶的纤维蛋白溶解活性的抑制速度快至少大约5倍。
12.如项目11的多肽，其中，所述抑制速度比对小-纤溶酶的抑制速度快至少大约10倍，20倍，30倍，或40倍。
13.如项目1的多肽，其中，所述固定化的赖氨酸是选自下列一组的结合在固体支持基质上的赖氨酸：赖氨酸-琼脂糖，赖氨酸-水凝胶，赖氨酸-交联的琼脂糖。
14.如项目13的多肽，其中，所述固定化的赖氨酸是赖氨酸-交联的琼脂糖。
15.如项目1的多肽，其中，所述多肽对血纤蛋白原的结合亲和力比小-纤溶酶对血纤蛋白原的结合亲和力低。
16.如项目1的多肽，其中，所述多肽对部分裂解的血纤蛋白的结合亲和力比小-纤溶酶对部分裂解的血纤蛋白的结合亲和力高。
17.多肽，包含位于纤溶酶原激活位点和纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域的N-末端的单一的三环域，其中，所述三环域与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4的氨基酸序列同一性，比与天然人纤溶酶原的三环域5的同一性大至少一个残基，并且，其中，相对于人纤溶酶原的三环域1和三环域4的天然序列，所述单一的三环域区的保守性置换就与三环域5进行同一性比较目的而言不被认为有别于天然序列。
18.如项目17的多肽，其中，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示出的氨基酸序列，及其保守性置换。
19.如项目17的多肽，其中，所述多肽在类似于SEQ ID NO：2所示出的氨基酸序列的76位的相对位置上具有精氨酸残基。
20.表达载体，包含项目1的多核苷酸。
21.培养的细胞，包含项目20的表达载体。
Figure IDA0000154489210000021
Figure IDA0000154489210000031
Figure IDA0000154489210000041
Figure IDA0000154489210000051
Figure IDA0000154489210000061
Figure IDA0000154489210000071

Claims (5)

1.多核苷酸，由编码多肽的核苷酸序列组成，所述多肽具有与天然人纤溶酶原的三环域1同源的单一的N-末端三环域、和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；
其中，所述多肽能结合固定化的赖氨酸，且所述多肽具有溶解血栓的效力，且
其中，所述编码的多肽是SEQ ID NO：2所示出的序列。
2.如权利要求1的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列是SEQ IDNO：1所示出的序列或其简并变体。
3.多肽，其包含与天然人纤溶酶原的三环域1同源的单一的N-末端三环域、和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域，
其中，所述多肽能结合固定化的赖氨酸，且所述多肽具有溶解血栓的效力，且
其中，所述多肽是SEQ ID NO：2所示出的序列。
4.表达载体，包含权利要求1-2中任何一项的多核苷酸。
5.培养的细胞，包含权利要求4的表达载体。
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