PT1740698E - Plasmina modificada por recombinação - Google Patents

Plasmina modificada por recombinação Download PDF

Info

Publication number
PT1740698E
PT1740698E PT05737862T PT05737862T PT1740698E PT 1740698 E PT1740698 E PT 1740698E PT 05737862 T PT05737862 T PT 05737862T PT 05737862 T PT05737862 T PT 05737862T PT 1740698 E PT1740698 E PT 1740698E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
polypeptide
plasminogen
delta
pro
gly
Prior art date
Application number
PT05737862T
Other languages
English (en)
Inventor
Valery Novokhatny
Jennifer Audrey Hunt
Original Assignee
Talecris Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34982338&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT1740698(E) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Talecris Biotherapeutics Inc filed Critical Talecris Biotherapeutics Inc
Publication of PT1740698E publication Critical patent/PT1740698E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

-1- DESCRIÇÃO "PLASMINA MODIFICADA POR RECOMBINAÇÂO"
Descrição
Antecedentes da invenção 0 plasminogénio humano é uma proteína de cadeia simples que contém 791 resíduos de aminoácidos. A activação de plasminogénio para plasmina resulta de uma clivagem da ligação peptídica Arg561-Val562 no zimogénio. A molécula de plasmina resultante é uma cadeia dupla de serina protease com ligações dissulfito com especificidade similar a tripsina (cliva após Lys e Arg). A cadeia pesada amino-terminal de plasmina (resíduos 1-561, ~60 kDa) é composta por cinco domínios kringle, contendo cada um aproximadamente 80 resíduos de aminoácidos. Os domínios kringle são responsáveis pelas propriedades reguladoras de plasminogénio, tais como interacção com inibidores de activação, por ex., iões Cl-1; com simuladores de activação, por ex., ácido ε-aminocapróico; com células de mamíferos e células bacterianas; e com outras proteínas, tais como uma fibrina de substrato fisiológico de plasmina e um inibidor de plasmina, a2-antiplasmina. De todos os cinco kringles, o kringle 1 é um dos mais multifuncionais: a sua actividade de ligação a lisina tem sido mostrada ser a responsável pela interacção de plasmina com a2-antiplasmina e fibrina. Ver Wiman, B., et al., Biochim. Biophys. Acta 579:142-154 -2- (1979); e Lucas, M.A., et al., J. Biol. Chem. 258:4249-4256 (1983). A cadeia leve C-terminal de plasmina (resíduos 562-791, ~251Da) é uma serina protease típica, homóloga a tripsina e que contém a tríade catalítica de serina protease clássica: His603, Asp646 e Ser741. 0 plasminogénio contém 24 pontes de dissulfito e 2 locais de glicosilação, em Asn289 e Thr346.
Estudos mostraram que a proteólise limitada de plasminogénio por elastase resulta em três fragmentos (Sottrup-Jensen, L., et al., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3:191-209 (1978)). O primeiro fragmento, Kl-3, inclui os três primeiros kringles e pode ser isolado em duas versões, Tyr79-Val338 e Tyr79-Val354. O segundo fragmento, K4, corresponde ao quarto kringle e inclui resíduos Val355-Ala440. O último, o fragmento C-terminal (o denominado mini-plasminogénio) inclui resíduos Val443-Asn791 e é composto pelo quinto kringle e pelo domínio de serina protease. O mini-plasminogénio pode ser activado da mesma forma que o plasminogénio, formando mini-plasmina.
Devido à estrutura complexa da molécula completa de plasminogénio, os sistemas de expressão bacteriana não têm provado ser úteis para a produção de plasminogénio recombinante. O plasminogénio é produzido sob a forma de corpos de inclusão insolúveis e não se consegue que se volte a enrolar a partir desse estado. Além disso, a expressão de plasminogénio em células de mamíferos é complicada por activação intracelular de plasminogénio em plasmina e a resultante citotoxicidade. A produção de plasminogénio completamente activo utilizando células de insectos é possível, no entanto, este sistema não é adequado para produção em grande escala devido ao baixo rendimento. uma proteína recombinante caracteristicas desejáveis de não possuindo determinadas e sendo capaz de efectuar a bacterianas em quantidades
Correspondentemente, modificada, contendo as plasmina/plasminogénio e caracteristicas negativas produção em células substanciais, é desejável.
Resumo da Invenção A presente invenção apresenta polinucleótidos que incluem uma sequência nucleotídica que codifica um polipéptido como definido na reivindicação 1 ou 2.
Em algumas formas de realização, 0 polipéptido codificado é pelo menos 90%, 95%, ou 98% idêntico à sequência apresentada em SEQ ID : 2. Além disso, o polipéptido codificado pode ser a sequência mostrada em SEQ ID NO:2. A sequência nucleotídica do polinucleótido pode ser a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 ou variações disto degeneradas.
Num outro aspecto, a invenção apresenta polipétidos codificados pelo polinucleótido como definido acima.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos podem apresentar uma actividade fibrinolítica que é inibida por a2-antiplasmina a uma taxa que é pelo menos 5 vezes mais rápida que a taxa de inibição da actividade fibrinolítica de mini-plasmina por a2-antiplasmina. A taxa de inibição por a2-antiplasmina também pode ser pelo menos cerca de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, ou 40 vezes mais -4- rápida do que a taxa de inibição de mini-plasmina.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos podem ligar lisina imobilizada. A lisina imobilizada pode ser lisina ligada a uma matriz de suporte sólida seleccionada de um grupo que consiste em lisina-agarose, lysine-BIOGEL (BioRad, Hercules, CA), lysine-HYPERD (Pall Life Sciences, East Hills, NY, uma lisina-hidrogel), lysine-SEPHAROSE (SEPHAROSE é agarose reticulada). A lisina imobilizada pode ser lisina-SEPHAROSE.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos podem apresentar uma afinidade de ligação mais baixa para fibrinogénio do que a afinidade de ligação para fibrinogénio de mini-plasmina.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos podem apresentar afinidade de ligação mais alta para fibrina parcialmente clivada do que a afinidade de ligação para fibrina parcialmente clivada de mini-plasmina.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos podem ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ id NO:2, e substituições conservadoras disto. Os polipéptidos podem ter um resíduo numa posição relativa análoga à da posição 76 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:2 que é arginina.
Num outro aspecto, a invenção inclui vectores que incluem os polinucleótidos da invenção, e células hospedeiras cultivadas que incluem os vectores.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é uma representação esquemática de plasmina nativa após activação por clivagem proteolítica. -5- Κ1-Κ5 são regiões kringle 1-5; e SP é o domínio da serina protease. "a2-AP" é o local de ligação de a2-antiplasmina em kringle 1. A Figure 2 é uma representação esquemática de um mutante de delecção de plasminogénio da invenção que usa a mesma nomenclatura que na Figura 1, e que mostra a delecção de K2-5. A Figura 3 mostra a sequência de aminoácidos de plasminogénio humano, mostrando a sequência líder do resíduo 19 numerada como -19 a -1, e a sequência de plasminogénio mostrada como resíduos 1- 791 (ver SEQ ID NO:3 (sequência de cADN para plasminogénio humano; e SEQ ID NO: 4, a sequência de aminoácidos codificada, como mostrado na Figura 3) . Um número de características é mostrado, incluindo o seguinte: a sequência de delta-plasminogénio (sombreada); domínios kringle 1-5 (sublinhado duplo); locais de glicosilações Asn289 e Thr346 (a negrito); local de activação da activação de plasminogénio Arg-Val (a negrito); e locais de ligação a lisina em kringle 1 (sublinhado e com numeração de posição específica). A Figura 4 mostra comparações de sequência polipetídica entre os cinco domínios kringle (1-5) de plasminogénio humano nativo. Resíduos de aminoácidos que são idênticos aos da mesma posição relativa em kringle 1 são mostrados a sublinhado. A Figura 5 mostra um gradiente de 8-25% SDS-PAGE de uma preparação de delta-plasminogénio não redutora (pista 1) e redutora (pista 2). A activação de delta-plasminogénio para delta-plasmina com estreptoquinase (pista 3), Activador do Plasminogénio tecidual (tPA) (pista 4), e uroquinase (pista 5) resulta na formação da molécula de -6- duas cadeias que consiste em kringle 1 (Kl) e no domínio de serina protease (SP) ligados por duas pontes de dissulfito. A Figura 6 é uma representação gráfica de activação de delta-plasminogénio por uroquinase. Uroquinase (5,8 nM) foi adicionada a uma solução de delta-plasminogénio de 5 μΜ em PBS contendo 1,0 mM S-2251 a 37°C. Os aumentos na absorvência foram monitorizados a 405 nm. A Figura 7 é um cromatograma que mostra a ligação de delta-plasminogénio a lisina-SEPHAROSE 4B: 0,5 mg de Delta-plasminogénio purificado foi aplicado na coluna de lisina-SEPHAROSE 4B (1x3 cm) equilibrado com tampão salino de Tris (TBS) , pH 7,4. A proteína ligada foi eluída a partir da coluna por um gradiente de 0-20 mM de ácido s-aminocapróico (ε-ACA) como um pico único. A absorvência em 280 nm e a concentração de ε-ACA, como uma função do volume efluente são apresentadas no gráfico. A Figura 8 mostra a ligação de delta-plasminogénio a fibrina. Concentrações variadas de delta-plasminogénio foram incubadas com coágulos de fibrina numa placa de microtitulação durante 1 hora a 37°C. Após a incubação os coágulos foram lavados extensivamente com PBS e uma solução de 0,lmg/ml de tPA foi adicionada a cada poço. Após 2 horas de incubação a 37°C o líquido foi removido e os coágulos sólidos restantes foram reconstituídos com 100 μΐ de 1M NaOH. A quantidade de fibrina restante foi quantificada pela medição de absorvência de 280 nm destes coágulos reconstituídos. O grau de fibrinólise, que é o resultado da ligação de delta-plasminogénio a fibrina, foi traçado no gráfico como uma função de concentração de delta-plasminogénio (linha contínua). A linha tracejada representa o melhor ajuste de dados experimentais a uma -7- equação de ligação. A Figura 9 mostra um gradiente de 8-25% SDS-PAGE de delta-plasminogénio inicial sob condições não redutoras (pista 1) e redutoras (pista 2) e a preparação de delta-plasmina final, também sob condições não redutoras (pista 3) e redutoras (pista 4) . A Figura 10 mostra diagramas esquemáticos de plasmina, mini-plasmina, micro-plasmina, e delta-plasmina, juntamente com a caracterização correspondente de actividade enzimática (kcat e KM em relação ao substrato S-2251 (D-Val-Leu-Lysp-nitroanilide, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH)). A Figura 11 é uma representação gráfica de lise induzida por delta-plasmina de coágulos de sangue total retraídos. Cada coágulo (0,8x7cm) foi injectado com um volume de 1 ml de veículo (solução salina acidificada, pH 3,6), plasmina (1,0 mg/ml), ou delta-plasmina (0,44 mg/ml), e deixou-se a dissolução do coágulo continuar a 37 °C durante 1 hora.
Descrição da Invenção
Para fornecer uma molécula simples não glicosilada tendo as propriedades de ligação de anti-plasmina e fibrina de plasmina completa, a presente invenção apresenta um mutante de delecção de plasminogénio. Neste mutante, aqui referido como delta-plasminogénio, pelo menos uma parte da sequência de aminoácidos nativa entre um domínio homólogo para kringle 1 e o local de activação é eliminada. Num aspecto, o domínio homólogo ao domínio kringle 1 nativo de plasminogénio humano pode ser directamente ligado à parte -8- de serina protease de plasminogénio, ou a um homólogo, análogo funcional disto, com apenas substancialmente a sequência nativa interveniente contendo o local de activação de plasminogénio restante entre os domínios.
Delta-plasminogénio de acordo com a presente invenção pode ser caracterizado por: peso molecular mais baixo (37,198 Da) de delta-plasmina pode resultar em actividade específica aumentada (por mg de proteína); a falta de pelo menos dois locais de glicosilação em locais encontrados na proteína nativa (ver Figura 3), combinado com o peso molecular relativamente baixo, pode facilitar a produção recombinante desta proteína utilizando sistemas de expressão bacterianos e de levedura relativamente não dispendiosos; delta-plasminogénio pode ser activado por activadores de plasminogénio tPA, uroquinase, e estreptoquinase; a presença do domínio homólogo ao kringle 1 nativo preserva as propriedades de ligação a fibrina de plasmina as quais podem ser importantes para a eficácia de trombolíticos; presença de locais de ligação a2-antiplasmina no domínio homólogo a kringle 1 pode permitir que delta-plasmina seja inibida rapidamente por este inibidor fisiológico de plasmina (uma característica que pode evitar hemorragias); uma dimensão mais pequena de delta-plasmina pode facilitar esta inibição por a2-macroglobulina, reduzindo ainda mais as hipóteses de complicações de hemorragias relacionadas com plasmina nativa. Em formas de realização particulares, a ausência de kringle 5, que retém o local de ligação primário para fibrinogénio indigesto, intacto, pode permitir a utilização de delta-plasmina com depleção redutora de fibrinogénio circulante. -9-
Em geral, a invenção fornece moléculas de plasminogénio recombinantes que têm uma região kringle N-terminal única para o local de activação e dominio serina protease, tendo algumas vantagens em relação ao mini-plasminogénio. Embora os polipéptidos de delta-plasminogénio da invenção apenas tenham uma região kringle, tal como, N-terminal para o local de activação, algumas formas de realização incluem sequências de N-terminal adicionais para o local de activação. As sequências de N-terminal adicionais podem ser derivadas das regiões kringle nativas de plasminogénio.
Os dominios kringle de N-terminal da presente invenção incluem sequências kringle de kringle 1 de plasminogénio nativo e equivalentes funcionais disto. Em particular, veja a discussão abaixo que fornece orientação em relação à preservação de função em variantes de polipéptidos, incluindo a preservação de resíduos que participam ou têm influência na ligação de lisina.
Definições
Os termos "domínio" e "região" de um polipéptido são geralmente sinónimos conforme aqui usados, a não ser que seja doutro modo indicado. Quando citados juntos com designações funcionais ou estruturais bem reconhecidas tais como "kringle" ou "serina protease," etc., tais termos introduzirão uma característica de um polipéptido relacionada com pelo menos alguma(s) característica (s) normalmente reconhecida (s) e compreendida(s) estar(em) associada(s) às estruturas de polipéptidos que correspondem a tais designações. -10-
Uma "célula hospedeira cultivada," conforme aqui usado, refere-se a uma célula procariótica ou eucariótica que contém ADN heterólogo que foi introduzido na célula através de qualquer meio, por ex., electroporação, precipitação de fosfato de cálcio, microinjecção, transformação, infecção virai, e outros semelhantes. "Heterólogo" como aqui usado significa "de origem natural diferente" ou representando um estado não natural. Por exemplo, se uma célula hospedeira cultivada for transformada com um ADN ou gene derivado de um outro organismo, especialmente de uma outra espécie, esse gene é heterólogo em relação à célula hospedeira cultivada e também em relação aos descendentes da célula hospedeira cultivada que transporta esse gene. Do mesmo modo, "heterólogo" refere-se a uma sequência de nucleótidos derivada de e introduzida no mesmo tipo de célula original, natural, mas que está presente num estado não natural, por ex., um número de cópia diferente ou sob o controlo de elementos reguladores diferentes.
Uma molécula "vector" é uma molécula de ácido nucleico na qual pode ser introduzido ácido nucleico heterólogo a qual pode então ser introduzida numa célula hospedeira cultivada apropriada. Os vectores têm preferivelmente uma ou mais origens de replicação, e um ou mais locais para os quais o ADN recombinante pode ser introduzido. Os vectores têm frequentemente meios convenientes pelos quais células com vectores podem ser seleccionadas destes sem, por ex., codificarem genes de resistência a medicamento. Os vectores comuns incluem plasmideos, genomas virais, e (principalmente em levedura e bactérias) "cromossomas artificiais". -11-
Como aqui usado, o termo "sequência de controlo transcricional" refere-se a sequências de ácido nucleico, tais como sequências iniciadoras, sequências enhancer e sequências promotoras, que induzem, reprimem, ou que doutro modo controlam a transcrição das sequências de ácido nucleico que codificam a proteína às quais estão ligadas de forma funcional. O termo "polipéptido" é aqui usado alternadamente com os termos "péptido" e "proteína."
Os termos "polinucleótido" e "ácido nucleico" são aqui usados alternadamente, e podem referir-se a qualquer ácido nucleico que contenha a informação necessária para o fim indicado pelo contexto. Isto é, o ácido nucleico pode ser ADN ou ARN, cadeia simples ou cadeia dupla, ou outro ácido nucleico, enquanto o polímero for capaz de representar a informação apropriada, por ex., em relação a um péptido codificado, e pode incluir sequências complementares, por ex., cadeias sense e cadeias anti-sense de polímeros ácidos nucleicos. 0 termo "variante" de um polipéptido refere-se a uma sequência de aminoácidos que é alterada por um ou mais aminoácidos. A variante pode ter alterações "conservadoras", em que o aminoácido substituído tem propriedades químicas ou estruturais similares, por ex., substituição de leucina por isoleucina. Como alternativa, uma variante pode ter alterações "não-conservadoras", por ex., substituição de uma glicina por um triptófano. Variação menor análoga também pode incluir delecção ou inserção de aminoácido, ou ambos. Uma forma particular de um polipéptido "variante" é um polipéptido "equivalente funcionalmente", isto é, um polipéptido que apresenta -12- actividade in vivo ou in vitro substancialmente semelhante como os exemplos do polipéptido da invenção, como descrito abaixo mais detalhadamente. A orientação na determinação de quais os residuos de aminoácidos que podem ser substituídos, inseridos, ou eliminados sem eliminar actividade imunológica ou biológica pode ser encontrada utilizando programas de computador bem conhecidos na área, por exemplo, software DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Além disso, são fornecidas orientações especificas abaixo, incluindo as que são disponibilizadas dentro das referências citadas.
Os termos "N-terminal" e "C-terminal" são aqui usados para designar a posição relativa de qualquer sequência de aminoácidos ou domínio polipeptídico ou estrutura a que são aplicados. 0 posicionamento relativo será evidente a partir do contexto. Isto é, uma característica "N-terminal" será localizada pelo menos mais próxima da extremididade N-terminal da molécula polipeptídica do que uma outra característica discutida no mesmo contexto (a outra possível característica referida como "C-terminal" em relação à primeira característica). Igualmente, os termos "5'-" e "3'-" podem ser aqui usados para designar posições relativas de características de polinucleótidos.
Os polipéptidos delta-plasminogénio/plasmina aqui referidos como tendo um domínio N-terminal "homólogo para um domínio kringle de plasminogénio humano nativo" apresenta características funcionais e estruturais semelhantes às dos domínios kringle nativos de plasminogénio. Além disso, os polipéptidos de delta-plasminogénio/plasmina aqui referidos como tendo um domínio -13- N-terminal "homólogo a kringle 1" apresenta características semelhantes a kringle 1 nativo, pelo menos na medida em que os polipéptidos podem ter uma afinidade mais elevada para ácidos ω-aminocarboxílicos (e homólogos funcionais tais como ácido trans-4-aminometil-ciclohexano-l-carboxilíco, um ácido ciclico) que kringle 5. Ver, por ex., Chang, Y., et al., Biochemistry 37:3258-3271 (1998), para condições e protocolos para comparação de ligação de polipéptidos de domínio kringle isolado para ácido 5-aminopentanóico (5-APnA); ácido 6-aminohexanóico (6-AHxA), também conhecido como ε-aminocapróico (sACA); ácido 7-aminoheptanóico (7-AHpA); e ácido trans-4-aminometilciclohexano-l-carboxilíco (t-AMCHA).
Referências para domínios kringle "homólogos para kringle 4" são definidas de forma semelhante, conforme referido acima em relação à expressão "homólogo para kringle 1." Isto é, eles apresentam características funcionais semelhantes para kringle 1 de plasminogénio humano nativo como discutido acima. Estes polipéptidos também se ligam a lisina imobilizada como descrito acima.
Os polipéptidos da invenção ligam-se a lisina imobilizada. Como aqui utilizado, a expressão "ligar-se a lisina imobilizada" significa que os polipéptidos assim caracterizados são retardados no seu progresso em relação a mini-plasminogénio quando sujeitos a cromatografia em coluna usando lisina-SEPHAROSE como o meio cromatográfico. Tipicamente, os polipéptidos da invenção podem ser eluídos de tal meio cromatográfico (resinas com afinidade de lisina) utilizando soluções contendo o ligante específico, por ex., εΑΟΑ, como eluentes.
Além disso, adicionalmente a Chang et al., supra, -14- podem ser consultadas outras referências pelos especialistas na técnica para determinar quais os resíduos que podem ser variados por substituição conservadora ou não-conservadora, delecção ou adição para produzir um mutante de delecção dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, as sequintes referências fornecem informação relacionada com resíduos particulares de domínios kringle nativos que podem ser importantes para ligação de ácidos (0 aminocarboxílicos: Pat U.S. N.°. 6538103 to Ji, et al.; Pat. U.S. N.° 6218517 to Suzuki; Douglas, J.T., et al., Biochemistry 41(10):3302-10 (2002); Zajicek, J., et al., J. Mol. Biol., 301 (2):333-47 (2000); Lee, H., et al., Arch Biochem Biophys., 375(2):359-63 (2000); Castellino, F. e S. McCance, Ciba Found Symp. 212:46-60 (1997); McCance, S., et al., J. Biol. Chem., 269: 32405-32410 (1994); Rejante, M.R. e M. Llinas, Eur. J. Biochem., 221(3):939-49 (1994); Wu, T.P., et al., Blood Coagul. Fibrinolysis, 5(2):157-66 (1994); Hoover, C.J., et al., Biochemistry, 32 (41):10936-43 (1993); Menhart, N., et al., Biochemistry, 32:8799-8806 (1993); Thewes, T., et al., J. Biol. Chem., 265 (7):3906-3915 (1990); Novokhatny, V., et al., Thromb Res., 53(3):243-52 (1989); Motta, A., et al., Biochemistry, 26(13):3827-36 (1987); Novokhatny, V., et al., J. Mol. Biol., 179:215-232 (1984); Lerch, P.G., et al., Eur. J. Biochem., 107(1):7-13 (1980); Sottrup-Jensen, L., et al., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3:191-209 (1978); e Wiman, B. e D. Collen, Nature 272, 549-545 (1978).
Porque os presentes inventores reconheceram que uma molécula de plasminogénio simplificada e importante pode ser preparada tendo um domínio kringle N-terminal que tem características funcionais vantajosas (que podem ser -15- avaliadas, em parte, ao testar a ligação de lisina imobilizada como aqui descrito), a aplicação descreve outros domínios de ligação a fibrina ou regiões N-terminal para um local de activação. Por exemplo, a aplicação descreve polipéptidos em que o domínio de serina protease de plasmina é ligado a um kringle de ligação a fibrina seleccionado a partir de um grupo incluindo, mas não limitado a, kringle 4 de plasminogénio humano, kringle 2 de tPA, ou um kringle de apolipoproteína (a) . Além disso, a aplicação descreve polipéptidos em que um domínio de serina protease de plasmina é ligado a quaisquer outros módulos de ligação a fibrina conhecidos, tais como o domínio "finger" de tPA ou fibronectina, ou o fragmento FAB de IgG específico de fibrina.
Em formas de realização especiais, os resíduos em certas posições do domínio kringle N-terminal de delta-plasminogénio são conservados em relação a kringle 1 de plasminogénio humano nativo. Estes podem ser resíduos em posições associadas com a ligação de lisina, e incluem Prol36-Prol40, Prol43-Tyrl46, e Argl53-Tyrl56 (posições numeradas como mostrado na Figura 3) . Algumas formas de realização do delta-plasminogénio da invenção podem ter Arg na posição 153. Noutras formas de realização, as posições específicas dos resíduos denominados podem ter alguma variação enquanto continuam presentes no polipéptido em posições estrutural e funcionalmente análogas (isto é, em relação à estrutura kringle do domínio N-terminal; ver Chang, Y., et al. como discutido acima).
Adicionalmente, formas de realização especiais da invenção podem ser caracterizadas funcionalmente por contraste para miniplasminogénio que tem uma composição de -16- domínio semelhante, isto é, kringle-serine protease (K-SP) (ver Sottrup-Jensen, L., et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, (Eds: J. F. Davidson, et al.) Raven Press, New York (1978)). Em formas de realização preferidas, o delta-plasmina da invenção apresenta uma taxa de inibição aumentada por a2-antiplasmina, por ex., até cerca de uma ou duas ordens de magnitude mais rápida do que a taxa de inibição de mini-plasmina. Além disso, em formas de realização especiais, o delta-plasmina liga lisina imobilizada (por ex., lisina-SEPHAROSE). A caracterização do domínio kringle de delta-plasminogénio como "N-terminal" apenas significa que o domínio N-terminal está presente para o local de activação e não significa que resíduos de aminoácidos adicionais de N-terminal para o próprio domínio não estão presentes. Além disso, o número e a identidade de resíduos interpostos entre o domínio homólogo para kringle 1 e o local de activação de plasminogénio podem ser variados sem partir do âmbito da presente invenção. Os especialistas na técnica serão capazes de determinar estas variações que alcançam os benefícios da invenção (ligação similar a kringle 1 de ácidos ω aminocarboxílicos, sem aumento substancial em tamanho do mutante de delecção ou introdução de locais de glicolisação potencialmente problemáticos) sem a experimentação necessária baseados na informação aqui apresentada e nas referências aqui citadas para orientação em relação à função e estrutura de kringle 1.
Correspondentemente, a invenção está relacionada com polinucleótidos, polipéptidos, métodos recombinantes para produzir os polipéptidos, vectores contendo os -17- polinucleótidos, sistemas de expressão para produzir os polipéptidos, e células hospedeiras cultivadas incluindo tais sistemas de expressão.
Como referido, num aspecto, a invenção está relacionada com um polinucleótido que codifica o polipéptido aqui apresentado ou um polipéptido que tem substituições de aminoácidos conservadoras daí resultantes. A orientação em relação à selecção de substituições de aminoácidos "conservadoras" é fornecida abaixo mais detalhadamente. Numa forma de realização, o polinucleótido é ADN.
Num outro aspecto, a invenção está relacionada com um método de construir um vector que inclui a inserção do polinucleótido da invenção num vector. Num outro aspecto, a invenção está relacionada com um vector produzido pelo método da invenção.
Num outro aspecto, a invenção está relacionada com um método de fazer uma célula hospedeira cultivada consistindo na introdução do vector da invenção numa célula hospedeira cultivada. Num outro aspecto, a invenção está relacionada com uma célula hospedeira cultivada produzida pelo método da invenção.
Num outro aspecto, a invenção está relacionada com um polipéptido da invenção, produzido por um método que consiste: (a) na introdução de um vector que contém um polinucleótido que codifica o polipéptido numa célula hospedeira cultivada; (b) o cultivo da célula hospedeira; e (c) a recuperação do polipéptido. Num outro aspecto, a invenção está relacionada com um método de produção de um polipéptido que consiste: (a) no cultivo da célula hospedeira da invenção sob condições em que o vector é -18- expresso; e (b) na recuperação do polipéptido.
Num outro aspecto, a invenção está relacionada com células que contêm pelo menos um polinucleótido da invenção.
Em algumas formas de realização, o polinucleótido contém a sequência nucleotidica conforme apresentado na SEQ ID N0:1. Numa outra forma de realização, o polipéptido contém a sequência de aminoácidos como apresentado em SEQ ID NO:2.
Polinucleótidos
Os polinucleótidos da invenção contêm variantes que têm substituições, delecções, e/ou adições que podem envolver um ou mais nucleótidos. As variantes podem ser alteradas em regiões codificantes, regiões não-codificantes, ou ambas. As alterações nas regiões codificantes podem produzir substituições de aminoácidos conservadoras ou não-conservadoras, delecções ou adições. Especialmente preferido entre estas estão substituições silenciosas, adições e delecções, que não alteram as propriedades e actividades da proteína de delta-plasminogénio ou partes disto. Também especialmente preferido a este respeito são as substituições conservadoras (ver abaixo).
Outras formas de realização da invenção incluem moléculas de ácido nucleico que contêm um polinucleótido que tem uma sequência nucleotidica pelo menos 90% idêntica, e mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a (a) uma sequência nucleotidica que codifica o polipéptido de delta-plasminogénio que tem a sequência de -19- aminoácidos completa em SEQ ID NO:2; (b) uma sequência nucleotídica que codifica o polipéptido de delta-plasminogénio que tem uma sequência de aminoácidos em SEQ ID NO:2; e (c) uma sequência nucleotídica complementar a qualquer das sequências nucleotídicas em (a) ou (b) acima.
Através de um polinucleótido que tem pelo menos uma sequência nucleotídica, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência nucleotídica de referência que codifica um polipéptido de delta-plasminogénio pretende-se que a sequência nucleotídica do polinucleótido seja idêntica à sequência de referência excepto a sequência polinucleotídica que pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência nucleotídica de referência que codifica o polipéptido de delta-plasminogénio. Por outras palavras, para obter um polinucleótido que tenha uma sequência nucleotídica de pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica de referência, até 5% dos nucleótidos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos por um outro nucleótido, ou um número de nucleótidos até 5% do total de nucleótidos na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições de terminal 5' ou 3' da sequência nucleotídica de referência ou em qualquer local entre essas posições de terminal, intercaladas tanto individualmente entre nucleótidos na sequência de referência como num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
Como referido acima, duas ou mais sequências polinucleotídicas podem ser comparadas ao determinar a sua identidade percentual. Duas ou mais sequências de -20- aminoácidos podem do mesmo modo ser comparadas ao determinar a sua identidade percentual. A identidade percentual de duas sequências, quer sequências de ácido nucleico quer sequências peptidicas, é geralmente descrita como o número de correspondências exactas entre duas sequências alinhadas divididas pelo comprimento da sequência mais curta e multiplicado por 100. Um alinhamento aproximado para sequências de ácido nucleico é fornecido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo pode ser aumentado para usar com sequências peptidicas utilizando a matriz de pontuação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. 0. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, e normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14 (6):6745-6763 (1986). Uma implementação deste algoritmo para sequências de ácido nucleico e peptidicas é fornecida pelo Genetics Computer Group (Madison, Wis.) na sua aplicação utilitária BESTFIT. Os parâmetros predefinidos para este método são descritos em Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (disponível a partir de Genetics Computer Group, Madison, Wis.)
Certamente, devido à degeneração do código genético, qualquer especialista na técnica reconhecerá imediatamente que um grande número de moléculas de ácido nucleico que tem uma sequência de pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID NO:l codificará um polipéptido de delta-plasminogénio. De facto, devido às variantes degeneradas destas sequências -21- nucleotídicas todas codificam o mesmo polipéptido, isto será claro para o especialista na técnica mesmo sem efectuar quaisquer ensaios ou medições funcionais aqui descritos. Será ainda reconhecido na área que, para tais moléculas de ácido nucleico que não são variantes degeneradas, um número razoável também codificará um polipéptido que tem uma actividade polipeptidica de delta-plasminogénio. Isto acontece porque o especialista na técnica sabe quais as substituições de aminoácidos que têm maior ou menor probabilidade de afectar a função da proteína (por ex., substituir um aminoácido alifático por um segundo aminoácido alifático).
Recentemente, avanços na produção sintética de sequências polinucleótidas mais longas têm permitido a produção sintética de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos significativamente mais longos sem utilizar as técnicas de clonagem tradicionais. Fornecedores comerciais de tais serviços incluem Blue Heron, Inc., Bothell, WA (http://www.blueheronbio.com). A tecnologia utilizada por Blue Heron, Inc. é descrita na Patente U.S. N.os 6 664 112; 6 623 928; 6 613 508; 6 444 422; 6 312 893; 4 652 639; Aplicação de Patente Publicada U.S. N.os 20020119456A1; 20020077471A1; e Aplicações de Patente Internacional Publicadas (Publicações N.os) WO03054232A3; WO0194366A1; W09727331A2; e WO9905322A1.
Evidentemente, as técnicas tradicionais de biologia molecular, microbiologia, e ácido nucleico recombinantes também podem ser usadas para produzir os polinucleótidos da invenção. Estas técnicas são bem conhecidas e são explicadas em, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausebel, ed., Vols. I, II and III (1997); -22-
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); DNA Cloning: A Practical Approach, D. N. Glover, ed., Vols. I e II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. L. Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, eds. (1985); Transcription and Translation, Hames and Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; as séries, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller and Μ. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); e Methods in Enzymology, Wu and Grossman and Wu, eds., respectivamente, Vols. 154 e 155.
Vectores e Células Hospedeiras Cultivadas A presente invenção também está relacionada com vectores que incluem as moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção, células hospedeiras cultivadas que são geneticamente produzidas com os vectores recombinantes, e a produção de polipéptidos de delta-plasminogénio através de técnicas recombinantes.
Construções recombinantes podem ser introduzidas em células hospedeiras cultivadas utilizando técnicas bem conhecidas tais como infecção, transdução, transfecção, transvecção, electroporação e transformação. 0 vector pode ser, por exemplo, um vector fago, plasmideo, virai ou retroviral. Os vectores retrovirais podem ser replicação competente ou replicação defectiva. No último caso, a -23- propagação virai geralmente apenas ocorrerá em complemento com as células hospedeiras cultivadas.
Os polinucleótidos podem ser juntos a um vector que contém um marcador seleccionável para propagação num hospedeiro cultivado. Em geral, um vector plasmideo é introduzido num precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio, ou num complexo com um lipido carregado. Se o vector for um vírus, este pode ser embalado in vitro utilizando uma linha de célula de embalamento apropriada e depois transduzido para células hospedeiras cultivadas. 0 preferido são vectores que incluem regiões de controlo cis-acting para o polinucleótido de interesse. Factores trans-acting apropriados podem ser fornecidos pelo hospedeiro cultivado, fornecido por um vector complementar ou fornecido pelo próprio vector sob introdução num hospedeiro cultivado.
Em certas formas de realização a este respeito, os vectores cuidam da expressão específica, os quais podem ser induzíveis e/ou específicos do tipo de célula. Particularmente preferido entre tais vectores estão aqueles que são induzíveis por factores ambientais que são fáceis de manipular, tais como temperatura e aditivos nutrientes.
Os vectores de expressão úteis na presente invenção incluem vectores derivados cromossómicos, epissómicos e vírus, por ex., vectores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófago, epissomas de levedura, elementos cromossómicos de levedura, vírus tais como baculovírus, vírus papova, vírus vaccinia, adenovírus, vírus fowl pox, vírus pseudorabies e retrovírus, e vectores derivados de combinações destes, tais como cósmidos e fagemídeos.
As inserções de ADN deverão estar operativamente -24- ligadas a um promotor apropriado, tal como o promotor de fago lambda PL, os promotores de E. coli lac, trp e tac, os promotores de expressão precoce e tardia SV40 e promotores de retrovírus LTRs, para mencionar alguns. Outros promotores adequados serão do conhecimento dos especialistas na técnica. As construções de expressão conterão mais locais para iniciação de transcrição, terminação e, na região transcrita, um local de ligação de ribossomas para tradução. A parte condificante de transcritos maturos expressos pelas construções incluirá preferivelmente um codão de iniciação da tradução colocado no inicio e um codão de terminação (UAA, UGA ou UAG) posicionado apropriadamente no fim do polipéptido a ser traduzido.
Como indicado, os vectores de expressão incluirão preferivelmente pelo menos um marcador seleccionável. Tais marcadores incluem resistência a dihidrofolato redutase ou neomicina para a cultura de células eucarióticas e genes de resistência a tetraciclina ou ampicilina para cultivo em E. coli e outras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiros cultivados incluem, mas não estão limitados a, células bacterianas, tais como células de E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células de fungos, tais como células de levedura; células de insectos tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células animais tais como CHO, COS e células de melanoma de Bowes; e células vegetais. Meios e condições de cultura apropriados para as células hospedeiras cultivadas descritas acima são conhecidos na área.
Entre os vectores preferidos para usar em bactérias estão incluídos pQE70, pQE60 e pQE-9, disponibilizados por -25-
Qiagen Inc., Valência, CA; vectores pBS, vectores PHAGESCRIPT, vectores BLUESCRIPT, pNH8A, pNH16a, pNHl8A, pNH4 6A, disponibilizados por Stratagene, LaJolla, CA; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponbilizados por Pharmacia (now Pfizer, Inc., New York, NY). Entre os vectores eucarióticos preferidos estão pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG disponibilizados por Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponibilizados por Pharmacia. Outros vectores adequados estarão prontamente disponíveis para os especialistas na técnica.
Promotores bacterianos adequados para usar na presente invenção incluem os promotores de E. coli lacl e lacZ, os promotores de T3 e T7, o promotor de gpt, os promotores de lambda PR e PL, e o promotor de trp. Os promotores eucarióticos adequados incluem o promotor de expressão precoce imediata CMV, o promotor de HSV timidina quinase, os promotores de expressão precoce e tardia SV40, os promotores de LTRs retrovirais, tais como os do Rous sarcoma vírus (RSV), e promotores de metalotionéinas, tal como o promotor de metalotionéina-I em ratos. A introdução da construção de um vector numa célula hospedeira cultivada pode ser feita através da transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran, transfecção mediada por lípidos catiónicos, electroporação, transdução, infecção ou outros métodos. Tais métodos são descritos em muitos manuais laboratoriais padrão, como em Davis et ai., Basic Methods In Molecular Biology, 2nd Edition (1995). A transcrição do ADN que codifica os polipéptidos da presente invenção através de eucariotas superiores pode ser aumentada introduzindo uma sequência enhancer no -26- vector. Os enhancers são elementos cis-acting de ADN, normalmente cerca de 10 a 300 bp que actuam para aumentar a actividade transcricional de um promotor num determinado tipo de célula hospedeira cultivada. Exemplos de enhancers incluem o enhancer SV40, o qual está localizado no lado tardio da origem de replicação em bp 100 para 270, o enhancer promotor precoce de citomegalovirus, o enhancer de polioma no lado tardio da origem de replicação, e enhancers de adenovirus.
Para a secreção da proteína traduzida para o lúmen do retículo endoplásmico, para o espaço periplásmico ou para um ambiente extracelular, sinais de secreção apropriados podem ser incorporados no polipéptido expresso. Os sinais podem ser endógenos para o polipéptido ou eles podem ser sinais heterólogos. O polipéptido pode ser expresso numa forma modificada, tal como uma proteína de fusão, e pode incluir não apenas sinais de secreção, mas também regiões funcionais heterólogas. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionada ao N-terminal do polipéptido para melhorar a estabilidade e a persistência na célula hospedeira cultivada, durante a purificação, ou durante o manuseamento e armazenamento subsequentes. Também podem ser adicionadas fracções de péptidos ao polipéptido para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser removidas antes da preparação final do polipéptido. A adição de fracções de péptidos a polipétidos para efectuar a secreção ou excreção, para melhorar a estabilidade e para facilitar a purificação, entre outros, são técnicas familiares e de rotina na área. Uma proteína de fusão -27- preferida inclui uma região heteróloga de imunoglobulina que é útil para solubilizar proteínas. Por exemplo, EP 0 464 533 Al (homólogo canadiano, 2 045 869) apresenta proteínas de fusão que incluem várias partes de região constante de moléculas de imunoglobulina juntamente com uma outra proteína humana ou parte dela. Em muitos casos, a parte Fc na proteína de fusão é muito vantajosa para usar em terapêutica e diagnóstico e assim resulta, por exemplo, em propriedades farmacocinéticas melhoradas. Por outro lado, para algumas utilizações seria desejável ser capaz de eliminar a parte de Fc após a proteína de fusão ter sido expressa, detectada e purificada na forma vantajosa descrita. Isto acontece quando parte de Fc prova ser um obstáculo à utilização em terapêutica e diagnóstico, por exemplo quando a proteína de fusão é para ser usada como antigénio para imunizações. Na descoberta de fármacos por exemplo, as proteínas humanas têm sido fundidas com partes de Fc com a finalidade de ensaios de "High Throughput Screening" (HTS) (tais como receptor ML5, para identificar antagonistas de hIL-5) . Ver, Bennett, D., et al., J. Molecular Recognition, 8:52-58(1995) e Johanson, K. et al., J. Biol.Chem., 270(16):9459-9471 (1995). A proteína de delta-plasminogénio pode ser recuperada e purificada a partir de culturas de células recombinantes através de métodos bem conhecidos incluindo os especificamente descritos nos exemplos aqui apresentados. Os polipéptidos da presente invenção incluem produtos purificados naturalmente, produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro cultivado procariótico ou eucariótico, incluindo, por -28- exemplo, células bacterianas, de levedura, de planta superior, de insectos e mamíferos. Além disso, os polipéptidos da invenção também podem incluir um resíduo inicial de metionina modificada, em alguns casos como um resultado de processos mediados por hospedeiro.
Polipéptidos
Os polinucleótidos da invenção incluem os que codificam variações e exemplos particulares dos polipéptidos da invenção. Por exemplo, a orientação de como fazer substituições de aminoácidos silenciosas fenotipicamente é fornecido em Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to
Amino Acid Substitutions,"Science 247 :1306-1310 (1990), em que os autores indicam que as proteínas são surpreendentemente tolerantes a substituições de aminoácidos.
Os polinucleótidos da invenção incluem os que codificam variações e exemplos particulares dos polipéptidos da invenção. Por exemplo, a orientação de como fazer substituições de aminoácidos silenciosas fenotipicamente é fornecido em Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to
Amino Acid Substitutions, "Science 247 :1306-1310 (1990), em que os autores indicam que as proteínas são surpreendentemente tolerantes a substituições de aminoácidos. Embora qualquer número de substituições dentro do âmbito da invenção possa ser obtido através da aplicação de tais princípios gerais, para orientação específica -29- relacionada com substituições, as referências aqui citadas relacionadas com a estrutura e função de domínios kringle 1 podem ser consultadas por um dos especialistas na técnica.
Será ainda apreciado que, dependendo do critério usado, a "posição" exacta do kringle 1, local de activação, e domínios de serina protease do polipéptido de delta-plasminogénio possam diferir ligeiramente em variações particulares dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, o local exacto do domínio kringle 1 em relação ao local de activação pode variar ligeiramente e/ou a sequência de N-terminal para o domínio kringle 1 pode variar em comprimento. Deste modo, a invenção inclui tais variações do polipéptido de delta-plasminogénio que mostra a actividade do polipéptido de delta-plasminogénio como aqui apresentado. Tais variantes incluem delecções, inserções, inversões, repetições, e substituições. Como indicado acima, a orientação relacionada com quais as alterações de aminoácidos que são prováveis de serem silenciosas fenotipicamente pode ser encontrada em Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990).
Assim, fragmentos, derivados ou análogos do polipéptido de SEQ ID NO:2 podem ser os (i) em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos (por ex., 3, 5, 8, 10, 15 ou 20) são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não-conservado (preferivelmente um resíduo de amonoácido conservado). Tais resíduos de aminoácido substituídos podem ou não podem ser codificados pelo código genético, ou os (ii) em que um ou mais dos resíduos de aminoácido inclui um grupo substituinte (por ex., 3, 5, 8, -30- 10, 15 ou 20), ou os (iii) em que o polipéptido maduro é fundido com um outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipéptido (por exemplo, polietilenoglicol), os (iv) em que os aminoácidos adicionais são fundidos para o polipéptido maduro, tal como um péptido da região de fusão IgG Fc ou líder ou sequência secretória ou uma sequência que seja utilizada para purificação do polipéptido maduro ou uma sequência proproteíca. Tais fragmentos, derivados e análogos são considerados estarem dentro do âmbito dos especialistas na técnica a partir das orientações aqui dadas.
Como indicado, as alterações são preferivelmente de uma natureza menor, tais como substituições de aminoácidos conservadoras que não afectam significativamente o enrolamento ou a actividade da proteína. É evidente que o número de substituições de aminoácidos que um especialista na técnica faria depende de muitos factores, incluindo os descritos acima. Geralmente falando, o número de substituições para qualquer polipéptido de delta-plasminogénio não será mais de 30, 25, 20, 15, 10, 5 ou 3.
Os aminoácidos no polipéptido de delta-plasminogénio da presente invenção que são essenciais para a função podem ser identificados por métodos conhecidos na área, tal como mutagénese dirigida ou alanine-scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). O último procedimento introduz mutações de alanina simples em cada resíduo na molécula. As células mutantes resultantes são então testadas para actividade biológica, por ex., como mostrado nos exemplos aqui fornecidos. Os locais que são críticos para ligações de ligantes também podem ser determinados por análise estrutural tais como -31- cristalização, ressonância magnética nuclear ou marcação por fotoafinidade (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:399-904 (1992) e de Vos, et al. Science 255:306-312 (1992)). Mesmo que a delecção de um ou mais aminoácidos do N-terminal de uma proteina resulte na modificação ou perda de uma ou mais funções biológicas da proteina, outras actividades biológicas podem continuar a ser mantidas.
Também é considerado que os polipéptidos úteis na produção dos "polipéptidos isolados" da invenção podem ser produzidos por métodos sintéticos da fase sólida. Ver Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5131-5135 (1985) ; e Pat. U.S. N.° 4 631 211 para Houghten et al. (1986) .
Os polipéptidos da presente invenção podem ser fornecidos numa forma isolada. Por "polipéptido isolado" entende-se que um polipéptido foi removido do seu ambiente nativo. Assim, um polipéptido produzido e/ou contido dentro duma célula hospedeira cultivada recombinante é considerado isolado para fins da presente invenção. Também concebido como um "polipéptido isolado" são polipétidos que foram purificados, parcialmente ou substancialmente, de um hospedeiro cultivado recombinante. na técnica
Os polipéptidos que têm uma sequência de aminoácidos duma identidade percentual indicada para uma sequência de aminoácidos de referência de um polipéptido de delta-plasminogénio podem ser determinados utilizando os métodos, incluindo métodos assistidos por computador, indicados acima relacionados com os polinucleótidos. As sequências de aminoácidos polipeptidicas são examinadas e comparadas da mesma forma que as sequências nucleotidicas na discussão anterior. O especialista -32- reconhecerá que tais conceitos como os pontos terminais moleculares discutidos para polinucleótidos terão análogos directos quando considerar a correspondente utilização de tais métodos e programas para análise de polipéptidos. Por exemplo, as correcções manuais discutidas relacionadas com polinucleótidos referem-se a pontos terminais 5' e 3' de ácidos nucleicos, mas a mesma discussão será reconhecida como aplicável a N-terminal e C-terminal de polipéptidos. A invenção abrange polipéptidos de delta-plasminogénio que são diferencialmente modificados durante ou após a tradução, por ex., por glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos conhecidos de protecção/bloqueios, clivagem proteolitica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outros ligantes celulares, etc. Quaisquer de numerosas modificações químicas podem ser efectuadas por técnicas conhecidas, incluindo mas não limitado, a clivagem química por brometo de cianogénio, tripsina, quimotripsina, papaína, protease V8 de S. aureus, NaBH4; acetilação, formilação, oxidação, redução; síntese metabólica na presença de tunicamicina, etc.
Modificações pós-traducionais adicionais abrangidas pela invenção incluem, por exemplo, cadeias de hidratos de carbono N-línked ou O-linked, processando terminais de N-terminal ou C-terminal, ligação de fracções químicas à cadeia principal de aminoácidos, modificações químicas de cadeias de hidratos de carbono N-linked ou O-linked, e a adição de um resíduo de metionina N-terminal como um resultado de vectores e construções adaptadas para expressão de polipéptidos de delta-plasminogénio em células hospedeiras procarióticas cultivadas. Os polipéptidos também podem ser modificados com um marcador detectável, -33- tal como um marcador de afinidade ou isotópico, fluorescente, enzimático para permitir a detecção e isolamento da proteína.
Composições Farmacêuticas e Métodos de Tratamento 0 delta-plasminogénio pode ser formulado para uso terapêutico de acordo com os métodos e composições descritos em US 2003/0012778 Al; e Novokhatny, V., et al., J. Thromb. Haemost. 1(5):1034-41 (2003). Por exemplo, um pH baixo (de cerca de 2.5 a cerca de 4), tampão com baixa capacidade de tampão pode ser usado para formulação de delta-plasmina. Adicionalmente, outros métodos e formulações conhecidos pelos especialistas na técnica, como praticado com plasmina, mini-plasmina, e/ou micro-plasmina, podem ser usados para formular o delta-plasmina da invenção para administração terapêutica. O delta-plasminogénio pode ser usado para tratar uma variedade de doenças ou condições trombóticas, por exemplo, de acordo com os métodos como descrito na Patente U.S. N.° 6 355 243; e Aplicações de Patente U.S. publicadas N.os US 2003/0026798 Al; US 2003/0175264 Al. De novo, como com as formulações farmacêuticas possíveis aplicáveis a deltaplasmina, delta-plasmina também pode ser administrada terapeuticamente por métodos conhecidos na área, por exemplo, os que podem ser actualmente praticados com plasmina, mini-plasmina, e/ou micro-plasmina.
EXEMPLOS
Design de vector de Expressão -34- A sequência de aminoácidos para delta-plasminogénio é mostrada em SEQ ID NO: 2. Uma sequência putativa que codifica o delta-plasminogénio foi optimizada por codão para a expressão de E. coli e estabilidade de mARN para produzir a sequência de ADN como mostrado em SEQ ID N0:1.
Este ADN foi quimicamente sintetizado (Blue Heron, Inc,) e inserido nos locais Ndel e BamHl do vector de expressão de E. coli pET22b(+) (Novagen; Madison, WI) para produzir a proteína citosólica. Esta construção produz delta-plasminogénio com uma metionina N-terminal não nativa. (pET-22b(+) = pET Expression System 22b (Cat. No. 70765), EMD Biosciences, Inc., Novagen Brand, Madison, WI; ver http://www.emdbiosciences.com para a secção de informação do produto relacionado com pET-22b para detalhes relacionados com o vector) .
Purificação e Expressão de Delta-Plasmlnogénlo 0 ADN que codifica a sequência de delta-plasminogénio foi transformado numa variedade de células, e expressão génica de proteínas após indução por lmM IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo) foi analisado por SDS-PAGE. Célula tipo BL21(DE3) células RIL (Stratagene, La Jolla, CA), concebidas para expressar tARNs raros de E. coli que codificam Arg, Ile, e Leu, foram usadas para a produção de delta-plasminogénio.
A produção de delta-plasminogénio foi confirmada em expressão de maior escala em que as células foram lisadas e tanto a proteína solúvel como os corpos de inclusão purificados foram examinados por SDS-PAGE. As células RIL -35- BL21 (DE 3) produziram proteínas de delta-plasminogénio significativas na forma de corpos de inclusão. Os cálculos da expressão foram 50-80 mg/L de cultura de célula. O seguinte protocolo típico foi usado para a expressão de delta-plasminogénio: Uma única colónia de células RIL BL21(DE3) que contém o vector de delta-plasminogénio foi usada para inocular 5 ml de LB/ampicilina (100 Pg/ml) /cloramfenicol (50 Pg/ml) e foi incubada durante 8 horas a 37°C num agitador. Depois disso, foi tirada uma aliquota PI 50 de suspensão bacteriana cultivada para crescimento em meio fresco. O procedimento foi repetido após 16 horas com 6 ml de cultura bacteriana e 250 ml do meio. As culturas estiveram a crescer a 37°C com agitação para um OD600 nm de ~ 1,0, e IPTG foi adicionado à concentração final del mM. As culturas estiveram a crescer durante 5 horas adicionais. As células foram colhidas por centrifugação a 5.000 x g e os pellets de células foram dissolvidos em 20 mM de Tris pH 8,0 contendo 20 mM de EDTA e congelados a -80 °C.
Para purificar o delta-plasminogénio, os pellets de células foram descongelados e foi adicionado tampão até o volume da solução ser aproximadamente 1/20° do volume de cultura da célula original. A seguir, foi adicionada lisozima à concentração final de 0,5 mg/ml e as células foram rapidamente misturadas a 4°C durante 10 - 15 minutos. Depois, Triton X-100 foi adicionado a 1% da concentração final e a mistura continuou durante mais 10 min. ADNse I (0,05 mg/ml) e MgC12 (2,5 mM) foram adicionados e a mistura continuou a 4°C durante 30 minutos ou até a solução deixar de estar viscosa. A solução final foi centrifugada a 4°C durante 30 min a 15.000 x g e o sobrenadante foi -36- descartado. 0 pellet de células foi lavado três vezes com uma solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7,4 contendo 10 mM de EDTA, 1 % Triton-X-100, e 0,5 M ureia), e o pellet final foi dissolvido em 40 ml de tampão de extracção (PBS, pH 7,4 contendo 10 mM de EDTA, 20 mM de DTT, e 6 M de guanidina-HC1) e armazenado a 4 °C durante a noite. Após 16 horas, a solução foi centrifugada durante 30 minutos a 15.000 x g para remover sólidos e o sobrenadante foi lentamente adicionado à solução de reenrolamento (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3,5 M guanidina HC1, 0,5 M arginina HC1, 10 mM de EDTA, 3 mM de GSH, 0,3 mM de GSSG) enquanto é misturado a 4°C. O procedimento de reenrolamento foi efectuado na concentração de proteína de 0,03 mg/ml ou menos. A solução de reenrolamento foi mantida durante 2 dias a 4°C em repouso e depois dialisada contra a um volume de 8 vezes 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 contendo 10 mM de EDTA, 0,15 M de NaCl, 0,15 M de arginina-HCl, durante um período de 8 a 10 horas com mudanças frequentes da solução tampão. A solução de proteína foi então removida de diálise e concentrada utilizando filtros AMICON com a membrana de corte de 10 kDa a aproximadamente 10 -20 ml e dialisada durante a noite versus um volume de 100 vezes de 0,1 M Tris pH 8,0 contendo 10 mM de EDTA, 0,15 M NaCl. Este material foi centrifugado para remover partículas, e depois foi passado por resina de afinidade com lisina (Lysine-SEPHAROSE 4B; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . O delta-plasminogénio foi eluído de uma resina utilizando o tampão salino de Tris, pH 8,0 contendo 0,2 M de ácido épsilon-aminocapróico (sACA).
Tipicamente, 80 mg de corpos de inclusão poderiam -37- ser isolados de 1 litro de cultura de células e 40 mg poderiam ser eluidos no passo de cromatografia de lisina-SEPHAROSE.
Propriedades de Delta-Plasminogénio O delta-plasminogénio purificado apareceu como uma banda única na região 35-40 kDa através de análise de SDS-PAGE de proteínas redutoras (tratado com ditiotreitol) e não-redutoras (Ver Fig. 5) . O seu peso molecular exacto, determinado pela espectrometria de massa maldi, foi 37.089 Da, muito próximo do valor esperado de 37.198 Da.
Para testar se o delta-plasminogénio (APg) poderia ser activado para delta-plasmina, o delta plasminogénio foi incubado com uroquinase (razão molar 1:1000), e o aumento na actividade de serina protease foi monitorizada pela medição do aumento na taxa de hidrólise S-2251 (S-2251= D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH) . Como visto na Fig. 6, um aumento parabólico na actividade típica para a reacção acoplada de activação (zimogénio é convertido em enzima activa (1); e é observado que a enzima cliva o substrato cromogénico (2)). A activação de delta-plasminogénio foi concluída dentro de 3 minutos sob estas condições. Foram obtidos resultados muito semelhantes com tPA e estreptoquinase. A cinética para a activação de uroquinase de delta-plasminogénio foi comparada à do plasminogénio completo utilizando o método de Wohl et al. (Wohl, R.C., Summaria, L., Arzadon, L., e Robbins, K.C.; J. Biol. Chem. 253: 1402-1407 (1978), completamente incorporado por referência). Para este fim, 5,8 nM de uroquinase foi adicionado às -38- soluções contendo várias concentrações de espécies de plasmina na presença de 1 mM S-2251 de substrato a 37°C, pH 7,5. 0 aumento na absorvência a 405nm foi monitorizada e a taxa de aceleração de formação de produto S-2251 foi calculada utilizando uma equação parabólica onde a taxa = k*t2. Os dados foram adaptados a um modelo cinético de Michaelis-Menten utilizando a análise Lineweaver-Burk, resultando nos valores abaixo:
Quadro 1. Cinética para a activaçao de uroquinase de delta-plasminoqénio._
Espécies: Km (μΜ) ) kcat (min-1) kcat/Km (μΜ-lmin-1) Delta- plasminogénio 30 + /- 5 80+/-10 2, 67 Plasminogénio 1,2 +/-0,1 2,3+/-0,3 1, 92 0 plasminogénio completo foi bem activado por uroquinase, com valores Km similares aos dos que foram encontrados na literatura (1,7 μΜ; Wohl, R.C., Summaria, L., and Robbins, K.C.; J. Biol. Chem 255(5): 2005-2013 (1980)) e valores kcat equivalentes.
Os valores Km para activação de uroquinase de delta-plasminogénio foram aproximadamente 30 vezes mais elevados do que para plasminogénio, possivelmente indicando uma afinidade de uroquinase mais baixa para este mutante de plasminogénio. Ao mesmo tempo, o valor kcat para activação de delta-plasminogénio foi muito mais elevado do que para plasminogénio: Apesar das diferenças acima mencionadas em kCat e Km, a sua razão, ou eficiência catalítica, é aproximadamente a mesma para activação das espécies de plasminogénio natural e modificado recombinantemente por uroquinase. Assim, estes dados indicam que a presença de um kringle 1 "exógeno" não afecta consideravelmente as propriedades de activação do domínio de serina protease em -39- delta-plasminogénio.
Ainda numa outra experiência de activação, o delta-plasminogénio foi incubado com estreptoquinase, tPA, e uroquinase e analisado em SDS-PAGE reduzido para observar a conversão da molécula de delta-plasminogénio de uma cadeia em delta-plasmina de duas cadeias (Ver Fig. 5, pistas 3 a 5). Em todos os três casos, duas cadeias (-12 kDa kringle 1 e a cadeia - 25 kDa serina protease) de delta-plasmina podem ser vistas, sugerindo que de facto o delta- plasminogénio pode ser activado por todos os três activadores de plasminogénio.
Como esperado, o delta-plasminogénio ligado a lisina-SEPHAROSE através de kringle 1 poderia ser eluido a partir da coluna através do gradiente de saca como um pico único (Ver Figura 7) . A capacidade de ligação de delta-plasminogénio reenrolado a lisina-SEPHAROSE indica que o domínio kringle da molécula é correctamente enrolado e o local de ligação a lisina está completamente activo.
Para confirmação adicional da funcionalidade de kringle 1, a ligação de eACA a delta-plasminogénio foi medida atavés da monitorização de alterações associadas à fluorescência da proteína como descrito por Matsuka et al. (Matsuka, Y.V., Novokhatny, V.V., e Kudinov, S.A., Eur. J. Biochem. 190:93-97 (1990)) e Douglas et al. (Douglas, J.T., von Haller, P.D., Gehrmann, M., Llinas, M., e Schaller. J., Biochemistry 41:3302-3310(2002)). A ligação de sACA a kringle 1 de delta-plasminogénio resulta numa diminuição na fluorescência, provavelmente devido à atenuação de resíduos de triptofano que fazem parte do local de ligação a lisina.
Para monitorizar este processo, aliquotas de 4 PI a -40- 16 PI de uma solução concentrada de sACA foram adicionadas a 2 ml de 5 μΜ de delta-plasminogénio em tampão Tris de 50 mM contendo 20 mM de NaCl, pH 8,0, 25°C. A fluorescência foi monitorizada numa excitação de comprimento de onda de 298nm e numa emissão de comprimento de onda de 340nm num espectrofotómetro de fluorescência FLUOROMAX (Jobin Yvon, Inc., Edison, NJ); após cada adição de sACA, foi permitido à solução equilibrar até não serem observadas mais alterações na fluorescência.
Os valores de fluorescência resultantes foram corrigidos para diluição e projectados versus a concentração de sACA num limite de 0 - 50 μΜ sACA. Os dados foram ajustados por regressão não-linear para obter um Kd of 11,1 +/- 2,3 μΜ, em boa concordância com os valores da literatura para a afinidade de kringle 1 para sACA de 3,2 μΜ (Matsuka, et al.) e 13 PM (Douglas, et al.).
Uma propriedade de plasmina é a sua capacidade para ligar fibrina. Para determinar se o delta-plasminogénio retém a capacidade de interagir com fibrina, as suas propriedades de ligação a fibrina foram testadas num ensaio numa placa de microtitulação em que a ligação de deltaplasminogénio a fibrina foi avaliada pela sua activação subsequente por tPA e resultando em lise do coágulo. Para este fim, 100 PI de 5mg/ml de fibrinogénio foi polimerizado com trombina em cada poço de uma placa de microtitulação. Várias concentrações de delta-plasminogénio foram adicionadas no topo dos coágulos de fibrina e incubadas durante 1 hora a 37°C. A placa foi extensivamente lavada com PBS enquanto os coágulos de fibrina continuaram intactos e presos aos poços. Após a lavagem, uma solução de 0,1-mg/ml de tPA foi adicionada a cada poço e a placa foi -41 - incubada durante 2 horas a 37°C. Como resultado, alguns dos coágulos foram completamente dissolvidos e alguns foram parcialmente dissolvidos, enquanto os poços com quantidades muito pequenas de delta-plasminogénio e poços de controlo permaneceram praticamente intactos. 0 grau de fibrinólise foi monitorizado através da medição de absorvência de 280nm de restos dos coágulos iniciais reconstituídos em 1M NaOH. Os valores de absorvência foram traçados como uma função de concentração de delta-plasminogénio.
Como visto na Fig. 8, a ligação de delta-plasminogénio a fibrina segue uma curva de ligação sigmoidal, clássica. Utilizando este ensaio, descobriu-se que o delta-plasminogénio liga fibrina com afinidade comparável à do paslminogénio completo e o C50 desta interacção (—0,2 μΜ) é comparável a Kd de ligação de fibrina de plasminogénio completo (Lucas, M.A., Fretto, L.J., and McKee, P.A.; J. Biol. Chem. 258(7): 4249-4256 (1983) ) . Estas experiências indicam que o delta plasminogénio pode ligar fibrina.
Assim, a interação de delta-plasminogénio com lisina-SEPHAROSE, a sua capacidade para ligar sACA com o Kd esperado, a sua capacidade para se ligar à fibrina, a sua capacidade para ser activado por todos os principais activadores de plasminogénio, e a potência de delta-plasmina em relação a substrato de plasmina cromogénico S-2251 tudo indicou que esta molécula foi produzida no sistema E. coli numa forma completamente funcional.
Purificação e Formulação de Delta-Plasmina
Delta-plasminogénio, dialisado contra 0,1M de -42- tampão Tris, pH 8,0 contendo 10 mM de EDTA e 0,15 M de NaCl, foi activado para delta-plasmina usando uroquinase imobilizada em SEPHAROSE 4B essencialmente como descrito anteriormente para plasmina (Marder, V.J., et al., Thromb Haemost., 86(3):739-45 (2001)). A activação ocorreu à temperatura ambiente e foi monitorizada em tempo real pelo aumento na actividade S-2251. Dependendo da quantidade de delta-plasminogénio, a qual varia de lote para lote (tipicamente 1-2 mg/ml), o tempo de incubação foi de 30 a 60 min. Após a conclusão da activação, quando a actividade S-2251 alcançou o platô, uroquinase-SEPHAROSE foi filtrado e delta-plasmina activa foi capturada em benzamidina-SEPHAROSE (Pharmacia). O delta-plasminogénio foi eluido de uma resina utilizando o tampão de baixo pH (0,2 M glicina, pH 3,0, 0,3 M NaCl, 0,2m sACA).
As concentrações de proteina e actividade S-2251 em fracções de eluição foram medidas. Fracções de actividade especifica alta foram agrupadas e dialisadas contra múltiplas alterações de 0,15 M NaCl, pH 3,6 a 4°C. A análise SDS-PAGE de amostras de delta-plasmina não redutora ( ver Fig. 9, pista 3) mostra que a pureza deste material é habitualmente superior a 95%. Sob condições redutoras (Fig. 9, pista 4), além das cadeias de serina protease e kringle, existem duas bandas desmaiadas acima e abaixo da banda kringle. Estas bandas representam produtos de auto-degradação do dominio de serina protease que resulta de clivagens internas da sua cadeia polipeptídica; elas são normalmente mantidas juntas por ligações dissulfito mas tornam-se visíveis com PAGE sob condições redutoras. A quantidade de produtos de auto-degradação, que tipicamente não excedeu 10%, foi bastante reduzida conduzindo o passo -43- de purificação de benzamidina-SEPHAROSE no modo de lote em vez do formato de coluna.
Porque delta-plasmina, similar a plasmina completa, tem tendência a auto-degradação em pH fisiológico, o pH 3.6 foi escolhido para a formulação final (acidificado com ácido acético-salino). Como anteriormente mostrado para plasmina (Novokhatny, V. et al., J Thromb Haemost., 1(5):1034-41 (2003), incorporado por referência) e confirmado em experiências com deltaplasmina, esta baixa capacidade de tampão, a baixa formulação de pH não apenas permite um armazenamento seguro de plasminas activas durante períodos de tempo prolongados, mas também é compatível com a administração parenteral destes trombolíticos. Quando misturado com plasma ou tampões de pH neutro, delta-plasmina é rapidamente re-activada.
Propriedades Enzimáticas de Delta-Plasmina A actividade amidolítica de delta-plasmina foi examinada utilizando o substrato de plasmina D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide (S—2251) (DiaPharma, West Chester, OH) . Em pH 7,4, 25 °C em tampão PBS, a constante Michaelis-Menten (Km) para S-2251 foi encontrada ser 138 PM (Quadro 2). A kcat para a preparação foi encontrada ser 510 min-1. Usando 4-nitrofenil 4-guanidinobenzoato hidrocloreto (pNPGB) titulação (Chase, T. and E. Shaw, Methods Enzymol. 197:20-27(1970)), a percentagem de locais activos funcionais foi encontrada ser 67%. Corrigindo a kcat para locais activos percentuais, uma kcat de 755 +/-45 min-1 foi determinada. Este valor esteve muito próximo do valor determinado no mesmo ensaio para plasmina completa, 760 +/- 23 min-1 e -44- para micro-plasmina (sem todos os cinco kringle), 795 +/-24 min'1 (Ver Figura 9). Estes dados indicam que a presença ou ausência de kringles não afecta a actividade catalítica do domínio de serina protease. A taxa de inibição de delta-plasmina por a2-macroglobulina foi medida utilizando o método de Anonick et al. (Anonick, P., et al., Thrombosis Res. 59:449-462 (1990)). A taxa de inibição foi encontrada ser 7,6 +/- 0,6 xlO5 M_1s_1 a 22 °C em tampão PBS. A taxa de inibição de delta-plasmina por a2-antiplasmina foi determinada ser 1,1 x 107 M_1S_1 usando o método de Wiman e Collen (Wiman, B. and D. Collen, Eur. J. Biochem. 84:573-578 (1978)) em que a plasmina e a2-antiplasmina são misturadas e depois ensaiadas para a actividade S-2251 em pontos de tempo específicos (Quadro 3). Este valor é comparável aos valores reportados para plasmina de 2,5 x 107 M_1s_1 (de Anonick, et al., Thrombosis Res. 59:449 (1990)).
As mesmas experiências conduzidas com micro-plasmina revelaram taxas de inibição de a2-antiplasmina de 1,8 x 105 M_1s_1 e 3,1 x 105 M_1s_1 em duas experiências separadas. A taxa de inibição de a2-antiplasmina de mini-plasmina (composição do domínio de mini-plasmina, K5-SP) foi determinada ser 2,4 x 105 M_1s_1. Estes dados estão em concordância razoável com valores de literatura para micro e mini-plasmina e mostram que a inibição de delta-plasmina por a2-antiplasmina é 40 vezes mais rápida do que a inibição de micro-plasmina ou mini-plasmina. Deste modo, estes resultados indicam que delta-plasmina deverá ser rapidamente inibida por a2-antiplasmina devido à presença de kringle 1 na sua estrutura. -45-
Em geral, os dados apresentados nesta secção mostram que as propriedades inibidoras e enzimáticas de delta-plasmina são semelhantes às de plasmina completa.
Quadro 2. Parâmetros cinéticos de estado estacionário para várias espécies de plasmina com substrato S-2251, em tampão PBS, pH 7,4. 25 °C. __
Km kCat Plasmina 193 + /- 7 μΜ 760 + /- 23 min-1 mini-plasmina 160 + /- 30 μΜ 770 + /- 70 min-1 micro-plasmina 145 + /- 13 μΜ 795 + /- 24 min-1 delta-plasmina 138 + /- 5 μΜ 755 + /- 45 min-1
Quadro 3. Taxas de inibição para várias espécies de plasmina e inibidores foram determinados a 22°C em tampão PBS, pH 7,4.__ a2-macroglobulina cg-antiplasmina plasmina 6,5 +/- 0,5xl0b M_1s_1 2,5 +/- 0,5x107 M^s"1 (lit.) mini- plasmina 7,5 +/- 0,3xlOb M_1s_1 2,4 +/- 0,5xlOb M_1s_1 micro- plasmina 7,8 +/- 0,6xlOb M_1s_1 1,8 +/- 0,2xlOb M_1s_1 delta- plasmina 7,6 +/- 0, βχΙΟ'Μ'ν1 1,0 +/- 0,1x107 M_1s_1
Os valores da literatura foram tirados de Anonick, et al., Thrombosis Res. 59:449(1990). Todos os valores foram medidos de acordo com os métodos publicados em Anonick, et al.
Eficiência Trombolítica In Vitro A eficácia de delta-plasmina foi testada num modelo in vitro de trombólise assistida por cateter (Novokhatny, V. et al., J Thromb Haemost., 1(5):1034-41 (2003)) usando o seguinte protocolo experimental.
Sangue humano completamente fresco foi recolhido em tubos de vidro de 20 x 0, 95 cm e foi deixado coagular -46- espontaneamente sem aditivos. Os tubos foram incubados durante 20 h a 37°C para permitir a retracção total. Os coágulos retraídos foram separados do serum utilizando peneiras de teste USA Standard D16 com 14 malhas, e os seus pesos foram determinados. Coágulos de sangue foram transferidos para tubos de vidro com um diâmetro mais pequeno em que os coágulos retraídos ficam bem ajustados (0,8 x 7 cm). O peso médio dos coágulos foi ~3,6 g.
Doses únicas de 1-ml de solução salina acidificada, plasmina, ou delta-plasmina foram injectados no coágulo utilizando uma seringa. Os coágulos foram incubados durante 1 hora a 37°C num forno laboratorial THELCO (Jouan, Inc., Winchester, VA). Após a incubação, os coágulos foram novamente colocados na peneira para remover o material liquefeito e o peso dos coágulos digeridos foi medido. A extensão da lise do coágulo foi determinada a partir da diferença entre o peso de coágulo inicial e o peso do coágulo residual e foi expresso como uma percentagem de redução de peso do coágulo. A Figura 10 mostra os resultados das experiências de lise com delta-plasmina neste modelo. A infusão de 0,44 mg de dose única (equivalente a 1 mg/ml de plasmina numa base molar) de delta-plasmina resultou numa redução em 36% do peso do coágulo dentro de 60 min. Ao mesmo tempo, o peso dos coágulos infundidos com solução salina diminuiu apenas 4%. Plasmina (1,0 mg) resultou na redução em 50% do peso do coágulo no mesmo período. Assim, estes dados mostram que delta-plasmina apresenta potência trombolítica e que pode ser usada como um agente trombolítico directo. -47-
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Talecris Biotherapeutics, Inc. Hunt, Jennifer A. Novokhatny, Valery <120> Plasmina Modificada por Recombinação <130> B185 1240-PCT(8017) <150> US 60/564 472 <151> 2004-04-22 <160> 9
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1008 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> polinucleótido incluindo uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido tendo um domínio kringle N-terminal homólogo a um domínio kringle de plasminogénio humano nativo < 4 0 0 > 1 aaagtctatt tatctgaatg taaaacaggc aatggtaaaa actatcgcgg taccatgtcc 60 aaaacaaaaa acggtatcac ttgtcaaaaa tggtctagca cttcacccca tcgtcctcgt 120 ttctcccctg cgacccatcc ctctgaaggc ctcgaagaaa actactgccg caaccccgat 180 aatgatcctc aaggcccatg gtgttatact accgatcctg aaaaacgtta tgactattgc 240 gatatcttag aatgcgcagc cccttctttt gattgcggca aaccacaagt tgaacccaag 300 aaatgtccag gtcgtgttgt cggcggttgt gttgcgcatc cccacagttg gccgtggcag 360 gtctcattac gtacccggtt tggaatgcac ttttgtggcg gcactctcat ctcgcccgaa 420 tgggttctta cagctgcaca ctgtttggaa aaaagccccc gtccttcttc ttataaagtt 480 atcctcggcg cacatcaaga agtcaattta gaacctcatg tacaagaaat cgaagtatct 540 cgtttattcc tggaaccgac tcgcaaagac atcgcattac ttaaactgtc ctcccccgct 600 gtgatcaccg ataaagtaat tcccgcgtgt ttaccttctc ctaattatgt tgttgcagat 660 cgtacagaat gctttattac cggctggggt gaaactcaag gtacttttgg tgcgggactc 720 ctgaaagaag cacagttacc agtcatcgaa aacaaagtat gtaatcgcta cgaattctta 780 aacggtcgtg ttcaatccac agaattgtgc gcaggtcatt tagcaggtgg cactgatagc 840 tgtcaaggtg attcaggtgg tcctctcgta tgtttcgaaa aagataaata tattctgcaa 900 ggcgtcacct cttggggttt aggttgtgct cgtcccaata aacctggtgt atatgtacgt 960 gtaagtcgtt ttgttacctg gattgaaggt gttatgcgga acaactaa 1008
<210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> um polipéptido tendo um domínio kringle N-terminal único homólogo a um domínio kringle de plasminogénio humano nativo <400> 2 -48-
Lys Vai Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg 1 5 10 15 Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gin Lys Trp Ser 20 25 30 Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser 35 40 45 Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp As"n Asp Pro Gin 50 55 60 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 65 70 75 80 Asp Ile Leu Glu Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gin 85 90 95 Vai Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Vai Vai Gly Gly Cys Vai Ala 100 105 110 His Pro His Ser Trp Pro Trp Gin Vai Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly 115 120 125 Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Vai Leu Thr 130 135 140 Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Vai 145 150 155 160 Ile Leu Gly Ala His Gin Glu Vai Asn Leu Glu Pro His Vai Gin Glu 165 170 175 Ile Glu Vai Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala 180 185 190 Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Vai Ile Thr Asp Lys Vai Ile Pro 195 200 205 Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Vai Vai Ala Asp Arg Thr Glu Cys 210 215 220 Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gin Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Lys Glu Ala Gin Leu Pro Vai Ile Glu Asn Lys Vai Cys Asn Arg 245 250 255 Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Vai Gin Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly 260 265 270 His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro 275 280 285 Leu Vai Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gin Gly Vai Thr Ser 290 295 300 Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Vai Tyr Vai Arg 305 310 315 320 Vai Ser Arg Phe Vai Thr Trp Ile Glu Gly Vai Met Arg Asn Asn 325 330 335
<210> 3 <211> 2432 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (0) ... (0) <223> Plasminogénio humano <400> 3 atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagag 60 cctctggatg actatgtgaa tacccagggg gcttcactgt tcagtgtcac taagaagcag 120 ctgggagcag gaagtataga agaatgtgca gcaaaatgtg aggaggacga agaattcacc 180 -49- -49- caacaatgtg tgataatggc tgaaaacagg 240 gtagttttat ttgaaaagaa agtgtatctc 300 tacagaggga cgatgtccaa aacaaaaaat 360 tctccccaca gacctagatt ctcacctgct 420 tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480 aagagatatg actactgcga cattcttgag 540 gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600 tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660 aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720 aacaagcgct gggaactttg cgacatcccc 780 cccacctacc agtgtctgaa gggaacaggt 840 gtttccgggc acacctgtca gcactggagt 900 ccagaaaact tcccctgcaa aaatttggat 960 agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020 tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080 acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140 accaccacca caggaaagaa gtgtcagtct 1200 aagaccccag aaaactaccc aaatgctggc 1260 gccgataaag gcccctggtg ttttaccaca 1320 ctgaaaaaat gctcaggaac agaagcgagt 1380 ccagatgtag agactccttc cgaagaagac 1440 ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 1500 catagacaca gcattttcac tccagagaca 1560 tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 1620 ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 1680 caagtggagc cgaagaaatg tcctggaagg 1740 tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 1800 ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 1860 tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920 gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980 ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040 tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100 tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160 cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220 ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280 aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340 ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400 ta 2432 tgcagggcat tccaatatca cagtaaagag aagtcctcca taatcattag gatgagagat tcagagtgca agactgggaa tggaaagaac ggcatcacct gtcaaaaatg gagttccact acacacccct cagagggact ggaggagaac gggccctggt gctatactac tgatccagaa tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag ctgcggcctt ggtgtttcac caccgacccc cgctgcacaa cacctccacc atcttctggt gaaaactatc gcgggaatgt ggctgttacc gcacagaccc ctcacacaca taacaggaca gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa caagtgcggt gggagtactg taagataccg caattggctc ccacagcacc acctgagcta gatggacaga gctaccgagg cacatcctcc tggtcatcta tgacaccaca ccggcaccag ctgacaatga actactgcag gaatccagat gaccccagcg tcaggtggga gtactgcaac gttgtagcac ctccgcctgt tgtcctgctt tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa gcggcccctt catttgattg tgggaagcct gttgtggggg ggtgtgtggc ccacccacat aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag gtaatcccag cttgtctgoc atccccaaat atcactggct ggggagaaac ccaaggtact ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggao ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct acttggattg agggagtgat gagaaataat
<210> 4 <211> 810 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PÉPTIDO <222> (0) ... (0) <223> Plasminogénio humano <400> 4
Met Glu His Lys 1
Gly Gin Gly Glu 20
Leu Phe Ser Vai 35
Cys Ala Ala Lys 50
Gin Tyr His Ser
Glu Vai Vai Leu 5
Pro Leu Asp Asp
Thr Lys Lys Gin 40
Cys Glu Glu Asp 55
Lys Glu Gin Gin
Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser 10 15 Tyr Vai Asn Thr Gin Gly Ala Ser 25 30 Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu 45 Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe 60 Cys Vai lie Met Ala Glu Asn Arg 50- 65 70 75 80 Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Vai Vai Leu Phe Glu Lys 85 90 95 Lys Vai Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg 100 105 110 Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gin Lys Trp Ser 115 120 125 Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser 130 135 140 Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gin 145 150 155 160 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 165 170 175 Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn 180 185 190 Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gin Ala 195 200 205 Trp Asp Ser Gin Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe 210 215 220 Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu 225 230 235 240 Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu 245 250 255 Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr 260 265 270 Tyr Gin Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Vai Ala 275 280 285 Vai Thr Vai Ser Gly His Thr Cys Gin His Trp Ser Ala Gin Thr Pro 290 295 300 His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp 305 310 315 320 Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His 325 330 335 Thr Thr Asn Ser Gin Vai Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys 340 345 350 Asp Ser Ser Pro Vai Ser Thr Glu Gin Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro 355 360 365 Glu Leu Thr Pro Vai Vai Gin Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gin Ser 370 375 380 Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gin Ser 385 390 395 400 Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gin Lys Thr Pro Glu Asn Tyr 405 410 415 Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp 420 425 430 Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Vai Arg Trp Glu Tyr 435 440 445 Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Vai Vai Ala Pro 450 455 460 Pro Pro Vai Vai Leu Leu Pro Asp Vai Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp 465 470 475 480 Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr 485 490 495 Vai Thr Gly Thr Pro Cys Gin Asp Trp Ala Ala Gin Glu Pro His Arg 500 505 510 His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys 515 520 525 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Vai Gly Gly Pro Trp Cys Tyr 530 535 540 -51-
Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Vai Pro Gin Cys 545 550 555 560 Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gin Vai Glu Pro Lys Lys 565 570 575 Cys Pro Gly Arg Vai Vai Gly Gly Cys Vai Ala Hls Pro His Ser Trp 580 585 590 Pro Trp Gin Vai Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly 595 600 605 Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Leu 610 615 620 Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Vai Ile Leu Gly Ala His 625 630 635 640 Gin Glu Vai Asn Leu Glu Pro His Vai Gin Glu Ile Glu Vai Ser Arg 645 650 655 Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser 660 665 670 Ser Pro Ala Vai Ile Thr Asp Lys Vai Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser 675 680 685 Pro Asn Tyr Vai Vai Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp 690 695 700 Gly Glu Thr Gin Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gin 705 710 715 720 Leu Pro Vai Ile Glu Asn Lys Vai Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn 725 730 735 Gly Arg Vai Gin Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly 740 745 750 Thr Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Phe Glu 755 760 765 Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gin Gly Vai Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys 770 775 780 Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Vai Tyr Vai Arg Vai Ser Arg Phe Vai 785 790 795 800 Thr Trp Ile Glu Gly Vai Met Arg Asn Asn 805 810
<210> 5 <211> 79 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> domínio kringle 1 de plasminogénio humano nativo <400> 5
Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr 1 5 10 15 Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gin Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg 20 25 30 Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gin Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 50 55 60 Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys 65 70 75
<210> 6 <211> 78 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> domínio kringle 2 de plasminogénio humano nativo <400> 6 -52-
Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Glu Cys Gin Ala Trp Asp Ser Gin Ser Pro His Ala 20 25 30 His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr 50 55 60 Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys 65 70 75
<210> 7 <211> 78 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> domínio kringle 3 de plasminogénio humano nativo <400> 7
Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Vai Ala Vai Thr 1 5 10 15 Vai Ser Gly His Thr Cys Gin His Trp Ser Ala Gin Thr Pro His Thr 20 25 30 His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr 50 55 60 Asn Ser Gin Vai Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys 65 70 75
<210> 8 <211> 78 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> domínio kringle 4 de plasminogénio humano nativo < 4 0 0 > 8
Cys Tyr His Gly Asp Gly Gin Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gin Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg 20 25 30 His Gin Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr 50 55 60 Asp Pro Ser Vai Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys 65 70 75
<210> 9 <211> 80 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> domínio kringle 5 de plasminogénio humano nativo <400> 9 -53-
Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr 1 5 10 15 Vai Thr Gly Thr Pro Cys Gin Asp Trp Ala Ala Gin Glu Pro His Arg 20 25 30 His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys 35 40 45 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Vai Gly Gly Pro Trp Cys Tyr 50 55 60 Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Vai Pro Gin Cys 65 70 75 80 -54-
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.
Documentos de Patente citados na descrição us 6538103 B, Ji [0034] us 6218517 B, Suzuki [0034] us 6664112 B [0051] us 6623928 B [0051] us 6613508 B [0051] us 6444422 B [0051] us 6312893 B [0051] us 4652639 B [0051] us 20020119456 Al [0051] us 20020077471 Al [0051] wo 03054232 A3 [0051] wo 0194366 Al [0051] wo 9727331 A2 [0051] wo 9905322 Al [0051] EP 0464533 Al [0066] CA 2045869 [0066] us 4631211 A, Houghten [0073] us 20030012778 Al [0078] us 6355243 B [0079] us 20030026798 Al [0079] us 20030175264 Al [0079] us 60564472 B [0116] -55-
Literatura citada na descrição não relacionada com patentes • Wiman, B. et al. Biochim. Biophys. Acta, 1979, vol. 579, 142-154 [0002] • Lucas, M.A. et al. J. Biol. Chem., 1983, vol. 258, 4249-4256 [0002] • Sottrup-Jensen, L. et al. Prog. Chem. Fibrinol.
Thrombol., 1978, vol. 3, 191-209 [0004] • Chang, Y. et al. Biochemistry, 1998, vol. 37, 3258-3271 [0031] • Douglas, J.T. et al. Biochemistry, 2002, vol. 41 (10), 3302-10 [0034] • Zajicek, J. et al. J. Mol. Biol., 2000, vol. 301 (2), 333-47 [0034] • Lee, H. et al. Arch Biochem Biophys., 2000, vol. 375 (2), 359-63 [0034] • Castellino, F. ; S. McCance. Ciba Found Symp., 1997, vol. 212, 46-60 [0034] • McCance, S. et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, 32405-32410 [0034] • Rejante, M.R. ; M. Llinas. Eur. J. Biochem., 1994, vol. 221 (3), 939-49 [0034] • Wu, T.P. et al. Blood Coagul. Fibrinolysis, 1994, vol. 5 (2), 157-66 [0034] • Hoover, C.J. et al. Biochemistry, 1993, vol. 32 (41), 10936-43 [0034] • Menhart, N. et al. Biochemistry, 1993, vol. 32, 8799- 8806 [0034] • Thewes, T. et al. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265 (7), 3906-3915 [0034] • Novokhatny, V. et al. Thromb Res., 1989, vol. 53 (3), 243-52 [0034] • Motta, A. et al. Biochemistry, 1987, vol. 26 (13), 3827-36 [0034] -56- • Novokhatny, V. et al. J. Mol. Biol., 1984, vol. 179, 215-232 [0034] • Davis et al. Basic Methods In Molecular Biology. 1995 [0063] • Bennett, D. et al. J. Molecular Recognition, 1995, vol. 8, 52-58 [0066] • Johanson, K. et al. J. Biol.Chem., 1995, vol. 270 (16), 9459-9471 [0066] • Bowie, J. U. et al. Deciphering the Message in Protein
Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions.
Science, 1990, vol. 247, 1306-1310 [0068] [0069] • Cunningham ; Wells. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0072] • Smith et al. J. Mol. Biol., 1992, vol. 224, 399-904 [0072] • de Vos et al. Science, 1992, vol. 255, 306-312 [0072] • Houghten, R. A. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985, vol. 82, 5131-5135 [0073] • Novokhatny, V. et al. J. Thromb. Haemost., 2003, vol. 1 (5), 1034-41 [0078] • Wohl, R.C. ; Summaria, L. ; Arzadon, L. ; Robbins, K.C. J. Biol. Chem., 1978, vol. 253, 1402-1407 [0092] • Lerch, P.G. et al. Eur. J. Biochem., 1980, vol. 107 (1), 7-13 [0034] • Sottrup-Jensen, L. et al. Prog. Chem. Fibrinol.
Thrombol., 1978, vol. 3, 191-209 [0034] • Wiman, B. ; D. Collen. Nature, 1978, vol. 272, 549-545 [0034] • Sottrup-Jensen, L. et al. Progress in Chemical
Fibrinolysis and Thrombolysis. Raven Press, 1978, vol. 3 [0037] • Smith ; Waterman. Advances in Applied Mathematics, 1981, vol. 2, 482-489 [0049] • Dayhoff. Atlas of Protein Sequences and Structure. vol. 3, 353-358 [0049] -57- • Gribskov. Nucl. Acids Res., 1986, vol. 14 (6), 6745- 6763 [0049] • Current Protocols in Molecular Biology. 1997, vol. I, II, I [0052] • Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0052] • DNA Cloning: A Practical Approach. 1985, vol. I, II [0052] • Oligonucleotide Synthesis. 1984 [0052] • Nucleic Acid Hybridization. 1985 [0052] • Transcription and Translation. 1984 [0052] • Animal Cell Culture. 1986 [0052] • Immobilized Cells and Enzymes. IRL Press, 1986 [0052] • A Practical Guide to Molecular Cloning. Perbal. Methods in Enzymology. Academic Press, Inc, 1984 [0052] • Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells. Cold Spring Harbor Laboratory, 1987 [0052] • Methods in Enzymology. vol. 154, 155 [0052] • Wohl, R.C. ; Summaria, L. ; Robbins, K.C. J. Biol. Chem, 1980, vol. 255 (5), 2005-2013 [0093] • Matsuka, Y.V. ; Novokhatny, V.V. ; Kudinov, S.A. Eur. J. Biochem., 1990 , vol. 190, 93-97 [0097] • Douglas, J.T. ; von Haller, P.D. ; Gehrmann, M. ; Llinas, M. ; Schaller. J. Biochemistry, vol. 41, 3302- 3310 [0097] • Lucas, M.A. ; Fretto, L.J. ; McKee, P.A. J. Biol . Chem., 1983, vol. 258 (7), 4249-4256 [0101] • Marder, V.J. et al. Thromb Haemost., 2001, vol. 86 (3), 739-45 [0103] • Novokhatny, V. et al. J Thromb Haemost., 2003, vol. 1 (5), 1034-41 [0105] [0112] • Chase, T. ; E. Shaw. Methods Enzymol., 1970, vol. 197, 20-27 [0106] • Anonick, P. et al. Thrombosis Res., 1990, vol. 59, 449-462 [0107] 84, -58- • Wiman, B. ; D. Collen. Eur. J. Biochem., 1978, vol. 573-578 [0108] 449 • Anonick et al. Thrombosis Res., 1990, vol. 59, [0108] [0111]
Lisboa, 25/10/2010

Claims (11)

  1. -1 - REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleótido que inclui uma sequência nucleotídica que codifica um polipéptido que tem um único dominio Kringle N-terminal que é pelo menos 90% idêntico ao domínio kringle 1 de plasminogénio humano nativo; e um domínio C-terminal que é pelo menos 90% idêntico ao local de activação e domínio de serina protease de plasminogénio humano, em que o polipéptido se liga a lisina imobilizada e pode ser activado por um activador de plasminogénio.
  2. 2. O polinucleótido da reivindicação 1, em que o polipéptido codificado corresponde à SEQ ID NO:2 com um máximo de 30 substituições de aminoácidos.
  3. 3. O polinucleótido da reivindicação 1 ou 2, em que o polipéptido codificado é pelo menos 90% idêntico à sequência apresentada na SEQ ID NO:2.
  4. 4. O polinucleótido de qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que o polipéptido codificado é pelo menos 95% idêntico à sequência apresentada na SEQ ID NO: 2.
  5. 5. O polinucleótido de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o polipéptido codificado é pelo menos 98% idêntico à sequência apresentada na SEQ ID NO: 2. -2- 6. 0 polinucleótido de qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que o polipéptido codificado corresponde à sequência apresentada na SEQ ID NO:2. 7. 0 polinucleótido de qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a sequência nucleotídica do polinucleótido corresponde à sequência apresentada na SEQ ID N0:1 ou uma sua variante degenerada.
  6. 8. Um polipéptido codificado por um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7. 9. 0 polipéptido da reivindicação 8, em que o polipéptido apresenta uma actividade fibrinolitica que é inibida pela a2-antiplasmina a uma taxa de inibição que é pelo menos 5 vezes mais rápida do que a taxa de inibição da actividade fibrinolitica da miniplasmina pela a2-antiplasmina. 10.0 polipéptido da reivindicação 9, em que a taxa de inibição é pelo menos cerca de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, ou 40 vezes mais rápida do que a taxa de inibição de mini-plasmina. 11.0 polipéptido de qualquer uma das reivindicações de 8 a 10, em que a lisina imobilizada é lisina ligada a uma matriz de suporte sólido seleccionada do grupo que consiste em lisina-agarose, lisina-hidrogel, lisina-agarose reticulada. -3- 12.0 polipéptido de qualquer uma das reivindicações de 8 a 11, em que a lisina imobilizada é lisina-agarose reticulada.
  7. 13. Os polipéptidos de qualquer uma das reivindicações de 8 a 12, em que o polipéptido apresenta uma afinidade de ligação mais baixa para o fibrinogénio do que a afinidade de ligação para o fibrinogénio apresentada pela mini-plasmina.
  8. 14. Os polipéptidos de qualquer uma das reivindicações de 8 a 13, em que o polipéptido apresenta uma afinidade de ligação mais alta para fibrina parcialmente clivada do que a afinidade de ligação para fibrina parcialmente clivada apresentada pela mini-plasmina . 15.0 polipéptido de qualquer uma das reivindicações de 8 a 14, em que o polipéptido tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO: 2, e suas substituições conservadoras.
  9. 16.Os polipéptidos da reivindicação 15, em que o polipéptido tem um residuo de arginina numa posição relativa análoga à da posição 76 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N0:2.
  10. 17. Um vector de expressão que inclui um polinucleótido de qualquer uma das reivindicações de 1 a 7. -4-
  11. 18.Uma célula cultivada contendo o vector de expressão da reivindicação 17. Lisboa 25/10/2010
PT05737862T 2004-04-22 2005-04-21 Plasmina modificada por recombinação PT1740698E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56447204P 2004-04-22 2004-04-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1740698E true PT1740698E (pt) 2010-11-02

Family

ID=34982338

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT05737862T PT1740698E (pt) 2004-04-22 2005-04-21 Plasmina modificada por recombinação
PT101661346T PT2246417E (pt) 2004-04-22 2005-04-21 Plasmina modificada por recombinação

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT101661346T PT2246417E (pt) 2004-04-22 2005-04-21 Plasmina modificada por recombinação

Country Status (28)

Country Link
US (2) US8034913B2 (pt)
EP (2) EP1740698B1 (pt)
JP (1) JP5026254B2 (pt)
KR (1) KR101161819B1 (pt)
CN (2) CN102660564B (pt)
AT (1) ATE476502T1 (pt)
AU (1) AU2005238464B2 (pt)
BR (1) BRPI0510063B8 (pt)
CA (1) CA2563675C (pt)
CY (1) CY1111650T1 (pt)
DE (1) DE602005022692D1 (pt)
DK (1) DK1740698T3 (pt)
EA (1) EA010784B1 (pt)
ES (2) ES2534744T3 (pt)
HK (3) HK1099341A1 (pt)
HR (1) HRP20100568T1 (pt)
IL (1) IL178343A (pt)
MA (1) MA28590B1 (pt)
MX (1) MXPA06012236A (pt)
NO (1) NO338542B1 (pt)
NZ (1) NZ550250A (pt)
PL (2) PL2246417T3 (pt)
PT (2) PT1740698E (pt)
RS (1) RS51623B (pt)
SI (1) SI1740698T1 (pt)
TN (1) TNSN06332A1 (pt)
WO (1) WO2005105990A2 (pt)
ZA (1) ZA200608498B (pt)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2555609A1 (en) 2004-02-11 2005-08-25 Biolex, Inc. Expression of plasminogen and microplasminogen in duckweed
KR101161819B1 (ko) 2004-04-22 2012-07-03 테일크리스 바이오쎄러퓨틱스 아이엔씨. 재조합적으로 변형된 플라스민
US8231869B2 (en) * 2005-10-20 2012-07-31 Grifols Therapeutics Inc. Recombinant plasmin for opthalmic indications
KR100888022B1 (ko) * 2006-12-21 2009-03-09 재단법인 목암생명공학연구소 면역글로불린 Ｆｃ와 인간 아포리포단백질（ａ）크링글절편의 융합단백질 ＬＫ8­Ｆｃ
EP2220221B1 (en) * 2007-11-29 2014-12-31 Grifols Therapeutics Inc. Recombinantly modified plasmin
BRPI0913397B8 (pt) 2008-06-04 2021-05-25 Grifols Therapeutics Inc método para preparar plasmina
JP5789521B2 (ja) 2009-03-03 2015-10-07 グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツドＧｒｉｆｏｌｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット；ならびにそれから製造されるプラスミン
MX2012000475A (es) 2009-07-10 2012-03-26 Thrombogenics Nv Variantes de plasminogeno y plasmina.
EP2480249B1 (en) 2009-08-28 2015-01-28 ThromboGenics N.V. Plasmin for the treatment of filtration failure after trabeculectomy
EP2661493B1 (en) 2011-01-05 2016-03-30 ThromboGenics N.V. Plasminogen and plasmin variants
CN103764163A (zh) 2011-08-12 2014-04-30 斯路姆基因公司 纤溶酶原和纤溶酶变体
US10709771B2 (en) * 2015-12-18 2020-07-14 Talengen International Limited Method for preventing or treating diabetic retinopathy
WO2018107686A1 (zh) 2016-12-15 2018-06-21 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 一种治疗动脉粥样硬化及其并发症的方法
JP7168990B2 (ja) 2016-12-15 2022-11-10 タレンゲン インターナショナル リミテッド 肥満症を予防および治療するための方法および薬物
CN108210904A (zh) * 2016-12-15 2018-06-29 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 治疗动脉粥样硬化及其并发症的药物及其用途
WO2018107705A1 (zh) 2016-12-15 2018-06-21 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 一种促进胰岛素分泌的方法
CN115427704A (zh) 2020-04-13 2022-12-02 株式会社F.C.C. 动力传递装置
CN115697385A (zh) * 2020-05-11 2023-02-03 泰伦基国际有限公司 一种治疗脊髓性肌萎缩症的方法和药物
US20240299506A1 (en) 2020-11-25 2024-09-12 Grifols Worldwide Operations Limited Wound healing
US11964004B2 (en) * 2021-03-31 2024-04-23 Shenzhen Bay Laboratory Short in vivo half-life and in vivo unstable recombinant microplasmin, pharmaceutical composition comprising thereof and method of treating thromboembolism related diseases including administration thereof
WO2024018051A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Grifols Worldwide Operations Limited Stable plasmin compositions for organ preservation and reconditioning

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4652639A (en) 1982-05-06 1987-03-24 Amgen Manufacture and expression of structural genes
US4631211A (en) 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
US5149533A (en) * 1987-06-04 1992-09-22 Zymogenetics, Inc. Modified t-PA with kringle-/replaced by another kringle
US4774087A (en) 1987-08-14 1988-09-27 Northwestern University Micro-size fibrinolytic plasmin
ES2120949T4 (es) 1990-06-28 2011-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh 50% Proteinas de fusión con porciones de inmunoglobulinas, su preparación y empleo.
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US6613508B1 (en) 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
DE69701671T3 (de) 1996-01-23 2006-08-17 Qiagen Genomics, Inc., Bothell Verfahren und zusammenstellungen zur sequenzbestimmung von nukleinsäuremolekülen
JPH10158300A (ja) 1996-11-28 1998-06-16 Suzuki Motor Corp 血管新生抑制効果を有するタンパク質とその製造方法及びアンギオスタチンの製造方法
EP1000176A1 (en) 1997-07-22 2000-05-17 Rapigene, Inc. Computer method and system for correlating sequencing data by ms
US6538103B1 (en) 1998-07-14 2003-03-25 Bristol--Myers Squibb Company Lysine binding fragments of angiostatin
DK1117437T3 (da) 1998-09-29 2007-04-10 Leuven Res & Dev Vzw Anvendelse af forbindelser, der reducerer alfa2-antiplasmin in vivo, til fremstilling af en sammensætning til behandling af iskæmiske slagtilfælde
US6969515B2 (en) 1999-11-13 2005-11-29 Talecris Biotherapeutics, Inc. Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin
US6355243B1 (en) 1999-11-13 2002-03-12 Bayer Corporation Method of thrombolysis by local delivery of active plasmin
US6964764B2 (en) 1999-11-13 2005-11-15 Talecris Biotherapeutics, Inc. Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin
JP2004509609A (ja) 2000-06-02 2004-04-02 ブルー　ヘロン　バイオテクノロジー　インコーポレイテッド 合成二本鎖オリゴヌクレオチドの配列忠実度を改善するための方法
AU2002218890A1 (en) 2000-12-21 2002-07-01 Thromb-X N.V. A yeast expression vector and a method of making a recombinant protein by expression in a yeast cell
AU2002357249A1 (en) 2001-12-13 2003-07-09 Blue Heron Biotechnology, Inc. Methods for removal of double-stranded oligonucleotides containing sequence errors using mismatch recognition proteins
US7776026B2 (en) 2002-02-06 2010-08-17 Nuvue Technologies, Inc. Method for vitreous liquefaction
US20050124036A1 (en) 2002-02-06 2005-06-09 Rudy Susilo Method for producing recombinant proteins in micro-organisms
GB0228409D0 (en) 2002-12-06 2003-01-08 Thromb X Nv Pharmacological vitreolysis
KR101161819B1 (ko) 2004-04-22 2012-07-03 테일크리스 바이오쎄러퓨틱스 아이엔씨. 재조합적으로 변형된 플라스민
US8231869B2 (en) 2005-10-20 2012-07-31 Grifols Therapeutics Inc. Recombinant plasmin for opthalmic indications
EP2220221B1 (en) * 2007-11-29 2014-12-31 Grifols Therapeutics Inc. Recombinantly modified plasmin

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200608498B (en) 2008-07-30
DK1740698T3 (da) 2010-10-25
IL178343A (en) 2010-11-30
EP2246417A1 (en) 2010-11-03
EP1740698A2 (en) 2007-01-10
EA010784B1 (ru) 2008-10-30
HK1150242A1 (en) 2011-11-11
US8034913B2 (en) 2011-10-11
EP1740698B1 (en) 2010-08-04
US20110318812A1 (en) 2011-12-29
EP2246417B1 (en) 2015-01-21
HRP20100568T1 (hr) 2010-11-30
WO2005105990A3 (en) 2006-01-12
CA2563675C (en) 2012-08-28
BRPI0510063B8 (pt) 2021-05-25
ATE476502T1 (de) 2010-08-15
TNSN06332A1 (en) 2008-02-22
BRPI0510063A (pt) 2008-03-11
EA200601950A1 (ru) 2007-02-27
ES2534744T3 (es) 2015-04-28
PL2246417T3 (pl) 2015-06-30
CN1961070A (zh) 2007-05-09
CY1111650T1 (el) 2015-10-07
IL178343A0 (en) 2007-02-11
JP2007533327A (ja) 2007-11-22
KR101161819B1 (ko) 2012-07-03
PL1740698T3 (pl) 2011-01-31
HK1099341A1 (en) 2007-08-10
MXPA06012236A (es) 2007-01-31
US8420079B2 (en) 2013-04-16
CA2563675A1 (en) 2005-11-10
BRPI0510063B1 (pt) 2020-03-17
DE602005022692D1 (de) 2010-09-16
SI1740698T1 (sl) 2010-11-30
US20100304465A1 (en) 2010-12-02
NZ550250A (en) 2009-05-31
NO20065050L (no) 2006-11-03
AU2005238464B2 (en) 2011-01-27
CN102660564B (zh) 2013-05-08
JP5026254B2 (ja) 2012-09-12
KR20070006918A (ko) 2007-01-11
PT2246417E (pt) 2015-05-05
HK1175812A1 (en) 2013-07-12
WO2005105990A2 (en) 2005-11-10
ES2349555T3 (es) 2011-01-05
MA28590B1 (fr) 2007-05-02
CN102660564A (zh) 2012-09-12
AU2005238464A1 (en) 2005-11-10
RS51623B (en) 2011-08-31
NO338542B1 (no) 2016-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT1740698E (pt) Plasmina modificada por recombinação
KR101529743B1 (ko) 재조합적으로 변형된 플라스민
US8231869B2 (en) Recombinant plasmin for opthalmic indications
JP3087746B2 (ja) キメラセリンプロテアーゼ
HUE025670T2 (en) A method for producing plasminogen