KR101161819B1 - 재조합적으로 변형된 플라스민 - Google Patents

재조합적으로 변형된 플라스민 Download PDF

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Abstract

재조합적으로 변형된 플라스민(노겐) 분자에 관한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 제공된다. 상기 플라스민(노겐) 분자는 천연 인간 플라스미노겐 분자에 존재하는 활성화 부위의 N-말단에 단일 크린글 도메인을 가지며, 상기 천연 효소와 관련된 라이신-결합 및 현저한 효소학적 특성을 나타낸다.

Description

재조합적으로 변형된 플라스민{Recombinantly modified plasmin}
인간 플라스미노겐은 791개 아미노산 잔기를 포함하는 단일쇄 단백질이다. 플라스미노겐에서 플라스민으로의 활성화는 자이모겐에서 Arg561-Val562 펩티드 결합의 단일 절단으로부터 초래된다. 생성된 플라스민 분자는 트립신 유사 특이성 (Lys 및 Arg 다음에 절단)을 갖는 2개의 사슬의 이황화 연결된 세린 프로테아제이다.
플라스민의 아미노-말단 중쇄(잔기 1-561, ~60 kDa)는 각각이 대략 80개의 아미노산 잔기를 포함하는 5개의 크린글(kringle) 도메인으로 이루어진다. 상기 크린글 도메인은 플라스미노겐의 조절 특성, 예를 들면, 활성화 저해제, 예를 들면, Cl-1 이온; 활성화 촉진제, 예를 들면, ε-아미노카프로산; 포유류 및 박테리아 세포; 및 기타 단백질, 예를 들면, 플라스민 생리학적 기질 피브린 및 플라스민 저해제 α2-항플라스민과의 상호작용에 관련된다. 모든 5개의 크린글 중에서, 크린글 1은 가장 다기능적인 것 중의 하나이며; 이의 라이신-결합 활성은 α2-항플라스민 및 피브린과 플라스민 상호작용에 관련된 것으로 밝혀졌다. Wiman, B., et al., Biochim . Biophys . Acta 579:142-154 (1979); 및 Lucas, M.A., et al., J. Biol . Chem . 258:4249-4256 (1983) 참고.
플라스민의 C-말단 경쇄(잔기 562-791, ~25kDa)는 트립신과 유사한 전형적인 세린 프로테아제이며, 고전적인 세린 프로테아제 세작용기 촉매(catalytic triad)인 His603, Asp646 및 Ser741를 포함한다. 플라스미노겐은 24개의 이황화 다리 및 Asn289 및 Thr346에 2개의 글리코실화 자리를 포함한다.
엘라스타아제에 의한 플라스미노겐의 제한된 단백질분해는 3개의 단편을 초래하는 것으로 밝혀졌다 (Sottrup-Jensen, L., et al., Prog . Chem . Fibrinol . Thrombol., 3:191-209 (1978)). 제1 단편인 K1-3은 첫번째 3개의 크린글을 포함하며, 2개의 버전인 Tyr79-Val338 및 Tyr79-Val354로 분리될 수 있다. 제2 단편인 K4는 네번째 크린글에 해당하며, 잔기 Val355-Ala440를 포함한다. 마지막 C-말단 단편 (소위 미니-플라스미노겐)은 잔기 Val443-Asn791를 포함하며, 다섯번째 크린글 및 세린 프로테아제 도메인으로 이루어진다. 미니-플라스미노겐은 미니-플라스민을 형성하면서, 플라스미노겐과 동일한 방식으로 활성화될 수 있다.
전장 플라스미노겐 분자의 복잡합 구조 때문에, 박테리아 발현 시스템은 재조합 플라스미노겐 생산에 유용하지 않은 것으로 증명되었다. 플라스미노겐은 불용성 봉입체의 형태로 생산되며, 상기 상태로부터 재폴딩되지 않는다. 또한, 포유류 세포에서 플라스미노겐의 발현은 플라스미노겐의 플라스민으로의 세포내 활성화 및 생성된 세포독성에 의해 복잡해진다. 곤충 세포를 이용한 충분히 활성인 플라스미노겐의 생산이 가능하나, 상기 시스템은 낮은 수율로 인해 대규모 생산에 적합하지 않다.
따라서, 특정 부특성(negative characteristics)이 결여되면서 플라스민/플 라스미노겐의 바람직한 특성을 보유하며, 실질적인 양으로 박테리아 세포에서 생산할 수 있는 변형된 재조합 단백질이 바람직하다.
발명의 요약
본 발명은 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 도메인과 상동성인 단일 N-말단 크린글 도메인; 및 인간 플라스미노겐 중의 해당하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데; 상기 폴리펩티드는 고정화된 라이신에 결합한다. 상기 N-말단 크린글 도메인은 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 1 또는 크린글 4에 상동성이다.
특정 구현예에서, 코딩된 폴리펩티드는 서열번호 2에 기재된 서열과 적어도 90%, 95%, 또는 98% 동일하다. 또한, 상기 코딩된 폴리펩티드는 서열번호 2에 기재된 서열일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 기재된 서열 또는 이의 축퇴 변이일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 1 또는 크린글 4 도메인과 상동성인 N-말단 크린글 도메인; 및 인간 플라스미노겐 중의 해당하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 또한 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 1 또는 크린글 4 도메인과 90% 이상 동일한 단일 N-말단 크린글 도메인; 및 인간 플라스미노겐의 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인과 90% 이상 동일한 C-말단 도메인을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 코딩된 폴리펩티드는 고정화된 라이신에 결합할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 도메인과 상동성인 N-말단 크린글 도메인; 및 인간 플라스미노겐 중의 해당하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 1 또는 크린글 4와 상동성인 N-말단 크린글 도메인을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 α2-항플라스민에 의한 미니-플라스민의 섬유소용해 활성의 저해 속도보다 적어도 약 5배 더 빠른 속도로 α2-항플라스민에 의해 저해되는 섬유소용해 활성을 나타낼 수 있다. α2-항플라스민에 의한 저해 속도는 또한 미니-플라스민의 저해 속도보다 적어도 약 10배, 20배, 30배 또는 40배 더 빠를 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 고정화된 라이신에 결합할 수 있다. 상기 고정화된 라이신은 라이신-아가로스, 라이신-BIOGEL (BioRad, Hercules, CA), 라이신-HYPERD (Pall Life Sciences, East Hills, NY, 라이신-히드로겔), 라이신-SEPHAROSE (SEPHAROSE는 가교 아가로스임)로 이루어진 군으로부터 선택된 고체 지지체 매트릭스에 결합된 라이신일 수 있다. 상기 고정화된 라이신은 라이신-SEPHAROSE일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 미니-플라스민의 피브리노겐에 대한 결합 친화성보다 피브리노겐에 대한 더 낮은 결합 친화성을 나타낼 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 미니-플라스민의 부분적으로 절단된 피브린에 대한 결합 친화성보다 부분적으로 절단된 피브린에 대한 더 높은 결합 친화성을 나타낼 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 플라스미노겐 활성화 부위 및 플라스미노겐 세린 프로테아제 도메인에 대한 N-말단에 위치한 단일 크린글 도메인을 가질 수 있으며, 상기 크린글 도메인은 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 5보다 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 1 또는 크린글 4와 1개 이상의 잔기가 더 큰 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 상기 구현예에 대해, 인간 플라스미노겐의 크린글 1 및 4의 천연 서열에 대해, 본 발명의 폴리펩티드의 크린글 영역의 보존 치환은 크린글 5와 동일성 비교 목적을 위해 천연 서열과 상이한 것으로 고려되지 않을 것이라는 것을 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열, 및 이의 보존 치환을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아르기닌인 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열의 76번 위치의 아르기닌과 유사한 상대적인 위치에 하나의 잔기를 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 배양된 숙주 세포를 포함한다.
발명의 상세한 설명
전장 플라스민의 피브린- 및 항플라스민-결합 특성을 갖는 간단한 비-글리코실화된 분자를 제공하기 위해, 본 발명은 플라스미노겐의 결손형 돌연변이체를 제공한다. 본원에서 델타-플라스미노겐으로서 언급된 상기 돌연변이체에서, 크린글 1과 상동성인 도메인 및 활성화 부위 사이의 천연 아미노산 서열의 적어도 일부가 결손된다. 하나의 양태에서, 인간 플라스미노겐의 천연 크린글 1 도메인과 상동성인 도메인이 도메인 사이에 존재하는 플라스미노겐 활성화 부위를 포함하는 실질적으로 단지 개재 천연 서열을 가지고, 플라스미노겐의 세린 프로테아제 부분, 또는 이의 상동성, 기능적 유사체에 직접 부착될 수 있다.
본 발명에 따른 델타-플라스민(노겐)은 하기의 특징이 있을 수 있다: 델타-플라스민의 저분자량(37,198 Da)은 증가된 비활성(단백질 mg 당)을 초래할 수 있으며; 비교적 저분자량과 조합된 천연 단백질에서 발견되는 적어도 2개의 글리코실화 자리의 결핍은(도 3 참고) 비교적 값싼 박테리아 및 효모 발현 시스템을 이용하여 상기 단백질의 재조합 생산을 촉진시킬 수 있으며; 델타-플라스미노겐은 플라스미노겐 활성화제 tPA, 유로키나아제, 및 스트렙토키나아제에 의해 활성화될 수 있으며; 천연 크린글 1과 상동성인 도메인의 존재는 혈전용해 효능에 중요할 수 있는 플라스민의 피브린-결합 특성을 보존하며; 크린글 1과 상동성인 도메인에 α2-항플라스민-결합 자리의 존재는 델타-플라스민이 플라스민의 생리학적 저해제에 의해 급속하게 저해되도록 할 수 있으며(출혈을 막을 수 있는 특징); 델타-플라스민의 더 작은 크기는 α2-마크로글로불린에 의한 저해를 촉진시켜, 천연 플라스민에 대한 출혈 합병증의 기회를 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 원래의 절단되지 않은 피브린(노겐)에 대한 주요 결합 자리를 보유하는 크린글 5의 부재는 순환하는 피브로노겐의 감소된 고갈을 갖는 델타-플라스민의 이용을 허용할 수 있다.
일반적으로, 본 발명은 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인에 대한 N-말단에 단일 크린글 영역을 가지며, 미니-플라스민(노겐)에 대해 특정 이점을 갖는 재조합 플라스민(노겐) 분자를 제공한다. 본 발명의 상기 델타-플라스미노겐 폴리펩티드가 예를 들면, 활성화 부위에 대한 N-말단에서 단지 하나의 크린글 영역을 가질 수 있지만, 특정 구현예는 상기 활성화 부위에 대한 N-말단에서 부가적인 서열을 포함한다. 부가적인 N-말단 서열은 플라스미노겐의 천연 크린글 영역의 것으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 N-말단 크린글 도메인은 천연 플라스민(노겐)의 크린글 1 및 4의 크린글 서열 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. 특히, 라이신-결합에 참여하거나 영향을 주는 잔기의 보존을 포함하는, 폴리펩티드 변이체에서 기능의 보존에 관한 안내를 제공하는 하기 논의를 참고한다.
정의
폴리펩티드의 용어 "도메인" 및 "영역"은 일반적으로 본원에 이용된 바와 같이 반대로 표시되지 않는다면 동의어이다. "크린글" 또는 "세린 프로테아제" 등과 같은 잘 인식된 구조적 또는 기능적 표시와 함께 인용될 때, 상기 용어는 상기 표시에 해당하는 폴리펩티드 구조와 연관되는 것으로 통상적으로 인식되고 이해되는 적어도 일부 특성(들)에 관한 폴리펩티드 특징을 도입할 것이다.
본원에 이용된 "배양된 숙주 세포"는 임의의 수단, 예를 들면, 전기천공법, 인산칼슘 침전법, 미세주사법, 형질전환법, 바이러스 감염법 등에 의해 세포 내로 도입된 이종 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다.
본원에 이용된 "이종"은 "상이한 천연 유래"를 의미하거나 비천연 상태를 나타낸다. 예를 들면, 배양된 숙주 세포가 또 다른 생물체, 특히 또 다른 종으로부터 유래된 DNA 또는 유전자로 형질전환된다면, 상기 유전자는 상기 배양된 숙주 세포 및 또한 상기 유전자를 보유하는 배양된 숙주 세포의 자손에 대해 이종이다. 유사하게, "이종"은 동일한 천연 세포 유형으로부터 유래되며, 동일한 천연 세포 유형 내로 삽입되나, 비천연 상태, 예를 들면, 상이한 카피 수 또는 상이한 조절 성분의 제어하에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 말한다.
"벡터" 분자는 이종 핵산이 삽입된 후, 적당한 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 복제 원점, 및 재조합 DNA가 삽입될 수 있는 하나 이상의 자리를 가진다. 벡터는 종종 벡터를 갖는 세포가 예를 들면 약물 내성 유전자를 코딩하는 것이 없는 것으로부터 선발될 수 있는 편리한 수단을 가진다. 통상적인 벡터는 플라스미드, 바이러스 게놈, 및 (주로 효모 및 박테리아에서) "인공 염색체"를 포함한다.
본원에 이용된, 용어 "전사 조절 서열"은 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 코딩하는 단백질의 전사를 유도, 억제, 또는 조절하는 개시자 서열, 인핸서 서열 및 프로모터 서열과 같은 핵산 서열을 말한다.
용어 "폴리펩티드"는 용어 "펩티드" 및 "단백질"와 상호교환하여 이용된다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 본원에 상호교환하여 이용되며, 내용상 표시된 목적에 필요한 정보를 포함하는 임의의 핵산을 말할 수 있다. 즉, 상기 핵산은 상기 중합체가 예를 들면, 코딩된 펩티드에 대해 적당한 정보를 나타낼 수 있다면, DNA 또는 RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 또는 기타 핵산일 수 있으며, 상보적 서열, 예를 들면, 핵산 중합체의 센스 가닥 및 안티-센스 가닥을 포함할 수 있다.
용어 폴리펩티드의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 아미노산 서열을 말한다. 상기 변이체는 "보존" 변화를 가질 수 있으며, 여기에서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성, 예를 들면, 류신의 이소류신으로의 치환을 가질 수 있다. 대안적으로 변이체는 "비보존" 변화를 가질 수 있는데, 예를 들면, 글리신의 트립토판으로의 치환이다. 유사한 사소한 변이는 또한 아미노산 결손 또는 삽입, 또는 양자를 포함할 수 있다. "변이체" 폴리펩티드의 특정 형태는 "기능적으로 동등한" 폴리펩티드, 즉, 하기에 더욱 상세히 기재되는 본 발명의 폴리펩티드의 예와 실질적으로 유사한 생체 내 또는 시험관 내 활성을 나타내는 폴리펩티드이다. 아미노산 잔기가 생물학적 또는 면역학적 활성의 제거 없이 치환, 삽입, 또는 결손될 수 있는 것을 정의하는 지침은 당업계에 주지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, DNASTAR 소프트웨어 (DNASTAR, Inc., Madison, WI)를 이용하여 발견될 수 있다. 또한, 전적으로 원용에 의해 본원에 포함된 인용 문헌 내에 제공된 것을 포함하는 특정 지침이 하기에 제공된다.
용어 "N-말단" 및 "C-말단"은 이들이 적용된 임의의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드 도메인 또는 구조의 상대적인 위치를 표시하기 위해 본원에 이용된다. 상대적인 위치화는 본 명세서로부터 명백할 것이다. 즉, "N-말단" 특징은 동일한 명세서에 논의된 또 다른 특징(제1 특징에 대한 "C-말단"으로서 언급된 가능한 기타 특징)보다 폴리펩티드 분자의 N-말단에 적어도 더 가까이 위치할 것이다. 유사하게, 용어 "5'-" 및 "3'-"은 폴리뉴클레오티드의 상대적 위치를 표시하기 위해 본원에 이용될 수 있다.
"천연 인간 플라스미노겐의 크린글 도메인과 상동성인" N-말단 도메인을 갖는 것으로서 본원에 언급된 델타-플라스미노겐/플라스민 폴리펩티드는 플라스미노겐의 천연 크린글 도메인과 유사한 구조적 및 기능적 특징을 나타낸다. 또한, "크린글 1과 상동성인" N-말단 도메인을 갖는 것으로서 본원에 언급된 델타-플라스미노겐/플라스민 폴리펩티드는 적어도 상기 폴리펩티드가 크린글 5보다 ω-아미노카르복실산(및 고리 산인 트랜스-4-아미놈틸시클로헥산-1-카르복실산과 같은 기능적 동족체)에 대해 더 높은 친화성을 가질 수 있을 정도로, 천연 크린글 1과 유사한 특징을 나타낸다. 예를 들면, 분리된 크린글 도메인 폴리펩티드의 5-아미노펜탄산 (5-APnA); 6-아미노헥산산 (6-AHxA), 또한 ε-아미노카프리산(εACA)로서 알려짐; 7-아미노헵탄산 (7-AHpA); 및 트랜스-4-아미노메틸시클로헥산-1-카르복실산(t-AMCHA)에 대한 결합의 비교를 위한 조건 및 프로토콜을 위해 본원에 원용에 의해 포함된 Chang, Y., et al., Biochemistry 37:3258-3271 (1998)을 참고한다.
"크린글 4와 상동성인" 크린글 도메인에 대한 참고는 "크린글 1과 상동성인" 구문에 관하여 상기 언급된 바와 같이 유사하게 정의된다. 즉, 이는 상기 논의된 바와 같이 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 1과 유사한 기능적 특성을 나타낸다. 상기 폴리펩티드는 또한 전술한 바와 같이 고정화된 라이신에 결합한다.
본 발명의 폴리펩티드는 고정화된 라이신에 결합한다. 본원에 이용된, 구문 "고정화된 라이신에 결합"은 상기 규명된 폴리펩티드가 크로마토그래피 매질로서 라이신-SEPHAROSE를 이용한 칼럼 크로마토그래피를 할 경우에 미니-플라스미노겐에 대한 이의 진전에서 지연되는 것을 의미한다. 전형적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 용출제로서 특정 리간드, 예를 들면, εACA를 포함하는 용액을 이용하여 상기 크로마토그래피 매질(라이신 친화성 수지)로부터 용출될 수 있다.
또한, Chang 등(이하 동일)외에, 기타 참고문헌이 어느 잔기가 본 발명의 범위 내의 결손형 돌연변이체를 생산하기 위해 보존 또는 비보존 치환, 결손 또는 삽입에 의해 변할 것인지를 결정하기 위해 당업자에 의해 참고될 수 있다. 예를 들면, 모두 전체적으로 본원에 원용에 의해 포함된 하기 참고문헌이 ω 아미노카르복실산의 결합에 중요할 수 있는 천연 크린글 도메인의 특정 잔기에 관한 정보를 제공한다: 미국특허 제6,538,103호(Ji, et al.); 미국특허 제6,218,517호(Suzuki); Douglas, J.T., et al., Biochemistry 41(10):3302-10 (2002); Zajicek, J., et al., J. Mol . Biol ., 301(2):333-47 (2000); Lee, H., et al., Arch Biochem Biophys ., 375(2):359-63 (2000); Castellino, F. and S. McCance, Ciba Found Symp. 212:46-60 (1997); McCance, S., et al., J. Biol. Chem., 269:32405-32410 (1994); Rejante, M.R. and M. Llinas, Eur . J. Biochem ., 221(3):939-49 (1994); Wu, T.P., et al., Blood Coagul . Fibrinolysis, 5(2):157-66 (1994); Hoover, C.J., et al., Biochemistry, 32(41):10936-43 (1993); Menhart, N., et al., Biochemistry, 32:8799-8806 (1993); Thewes, T., et al., J. Biol . Chem ., 265 (7):3906-3915 (1990); Novokhatny, V., et al., Thromb Res., 53(3):243-52 (1989); Motta, A., et al., Biochemistry, 26(13):3827-36 (1987); Novokhatny, V., et al., J. Mol. Biol ., 179:215-232 (1984); Lerch, P.G., et al., Eur . J. Biochem ., 107(1):7-13 (1980); Sottrup-Jensen, L., et al., Prog . Chem . Fibrinol . Thrombol ., 3:191-209 (1978); and Wiman, B. and D. Collen, Nature 272, 549-545 (1978).
본 발명가는 유리한 기능적 특성(부분적으로, 본원에 기재된 고정화된 라이신의 결합에 대해 시험함으로써 평가될 수 있음)을 갖는 귀중한, 단순화된 플라스민(노겐) 분자가 제조될 수 있다는 것을 인식하기 때문에, 본 발명은 활성화 부위에 대해 N-말단인 기타 피브린-결합 도메인 또는 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 플라스민의 세린 프로테아제 도메인이 인간 플라스미노겐의 크린글 4, tPA의 크린글 2, 또는 아포리포단백질(a)의 크린글을 포함하나, 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된 피브린-결합 크린글에 부착된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 플라스민의 세린 프로테아제 도메인이 임의의 기타 공지된 피브린-결합 모듈, 예를 들면, tPA 또는 피브로넥틴의 "핑거(finger)" 도메인, 또는 피브린 특이적 IgG의 FAB 단편에 부착된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 델타-플라스미노겐의 N-말단 크린글 도메인의 특정 위치에서의 잔기는 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 1에 대해 보존된다. 이는 라이신 결합과 관련된 위치에서의 잔기일 수 있으며, Pro136-Pro140, Pro143-Tyr146, 및 Arg153-Tyr156 (도 3에 제시된 바와 같이 넘버링된 위치)를 포함할 수 있다. 본 발명의 델타-플라스미노겐의 특정 구현예는 위치 153에서 Arg를 가질 수 있다. 기타 구현예에서, 명명된 잔기의 특정 위치는 구조적으로 및 기능적으로 유사한 위치(즉, N-말단 도메인의 크린글 구조에 대해; 전술한 바와 같이, Chang, Y., et al. 참고)에서 폴리펩티드에 여전히 존재하면서 다소 변할 수 있다. 특정 구현예에서, 델타-플라스민(노겐) 폴리펩티드의 N-말단 크린글 영역은 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 5보다 천연 인간 플라스미노겐의 크린글 1 또는 크린글 4와 하나 이상의 잔기의 더 큰 동일성 퍼센트를 가진다.
부가적으로, 본 발명의 특정 구현예는 유사한 도메인 조성, 즉, 크린글-세린 프로테아제 (K-SP)를 갖는 미니-플라스민(노겐)과 대조하여 기능적으로 규명될 수 있다 (Sottrup-Jensen, L., et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, (Eds: J. F. Davidson, et al.) Raven Press, New York (1978) 참고). 바람직한 구현예에서, 본 발명의 델타-플라스민은 α2-항플라스민에 의한 증가된 저해 속도, 예를 들면, 미니-플라스민의 저해 속도보다 약 1 또는 2 차수(order)의 크기만큼 더 빠른 저해 속도를 나타낸다. 또한, 특정 구현예에서, 델타-플라스민은 고정화된 라이신 (예를 들면, 라이신-SEPHAROSE)에 결합한다.
"N-말단"으로서 델타-플라스미노겐의 크린글 도메인의 규명은 단지 상기 돔인이 활성화 부위의 N-말단에 존재하는 것을 의미하며, 도메인 자체의 N-말단의 부가적인 아미노산 잔기가 존재하지 않는 것을 의미하지는 않는다. 또한, 크린글 1에 유사한 도메인 및 플라스미노겐의 활성화 부위 사이에 위치한 잔기의 수 및 실체는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 변할 수 있다. 당업자는 크린글 1 기능 및 구조에 관한 지침에 대해 본원의 개시 및 본원에 인용된 참고문헌에 기초하여 부당한 실험화 없이 본 발명의 이점을 달성하는 상기 변이(결손형 돌연변이체의 크기의 실질적인 증가 또는 잠재적으로 문제되는 글리코실화 자리의 도입 없는 ω 아미노카르복실산의 크린글 1 유사 결합)를 결정할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 제조하는 재조합 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리펩티드를 생산하는 발현 시스템, 및 상기 발현 시스템을 포함하는 배양된 숙주 세포에 관한 것이다.
언급된 바와 같이, 하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 이의 보존 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. "보존" 아미노산 치환의 선택에 관한 지침은 하기에 더욱 상세히 제공된다. 하나의 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 벡터 내로 삽입하는 것을 포함하는 벡터의 제조 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 벡터에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 배양된 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 배양된 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 배양된 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 본 발명의 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다: (a) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 배양된 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (b) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계. 또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다: (a) 벡터가 발현되는 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 치환, 결손, 및/또는 부가를 갖는 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 코딩 영역, 비코딩 영역, 또는 양자에서 변경될 수 있다. 코딩 영역에서의 변경은 보존 또는 비보존 아미노산 치환, 결손, 또는 부가를 제조할 수 있다. 이 중에서 특히 바람직한 것은 델타-플라스민(노겐) 단백질 또는 이의 부분의 성질 및 활성을 변경하지 않는 침묵 치환, 부가 및 결손이다. 또한 이에 대해 특히 바람직한 것은 보존 치환이다 (하기 참고).
본 발명의 추가의 구현예는 (a) 서열번호 2에서 전체 아미노산 서열을 갖는 델타-플라스미노겐 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 2에서 아미노산 서열을 갖는 델타-플라스미노겐 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)에서 임의의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
델타-플라스미노겐 폴리펩티드를 코딩하는 기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들면 적어도 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 폴리뉴클레오티드 서열이 델타-플라스미노겐 폴리펩티드를 코딩하는 기준 뉴클레오티드 서열의 각각 100 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 기준 서열과 동일한 것을 의도한다. 즉, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열에서 5% 이하의 뉴클레오티드가 결손되거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열에서 5% 이하의 총 뉴클레오티드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 상기 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 기준 서열 또는 상기 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 그룹의 뉴클레오티드 사이에서 개별적으로 배치된 상기 말단 위치 사이의 임의의 장소에서 일어날 수 있다.
전술한 바와 같이, 2 이상의 폴리뉴클레오티드 서열이 이의 동일성 퍼센트를 측정함으로써 비교될 수 있다. 마찬가지로 2 이상의 아미노산 서열은 이의 동일성 퍼센트를 측정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 또는 펩티드 서열이든지 간에, 2개의 서열의 동일성 퍼센트는 일반적으로 더 짧은 서열의 길이에 의해 나누어지며, 100에 의해 곱해지는 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 매치의 수로서 기재된다. 핵산 서열에 대한 대략적인 정렬은 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국부적인 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 상기 알고리즘은 [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]에 의해 개발되고, [Gribskov, Nucl . Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 정상적으로 된 스코링 매트릭스(scoring matrix)를 이용하여 펩티드 서열에 대한 이용으로 확장될 수 있다. 핵산 및 펩티드 서열에 대한 상기 알고리즘의 수행은 이의 BestFit 유용성 적용에서 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 제공된다. 상기 방법에 대한 디폴트 파라미터는 [Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (Genetics Computer Group 시판, Madison, Wis.)]에 기재된다.
당연히, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 당업자는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열의 핵산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 수많은 핵산 분자가 델타-플라스미노겐 폴리펩티드를 코딩할 것이라는 것을 즉시 인식할 것이다. 실제로, 상기 뉴클레오티드 서열의 축퇴 변이체는 모두 동일한 폴리펩티드를 코딩하기 때문에, 본원에 기재된 임의의 기능적 분석 또는 측정을 수행하지 않고도 당업자에게 명백할 것이다. 축퇴 변이체가 아닌 핵산 분자에 대해, 합당한 수는 델타-플라스미노겐 폴리펩티드 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 것이라는 것을 인식할 것이다. 이는 당업자가 단백질 기능에 영향을 줄 것 같지 않거나 또는 현저하게 영향을 줄 것 같지 않은 아미노산 치환(예를 들면, 지방족 아미노산의 제2 지방족 아미노산으로의 치환)을 충분히 인식하기 때문이다.
최근에, 더 긴 폴리뉴클레오티드 서열의 합성 생산에서의 진전은 전통적인 클로닝 기술을 이용하지 않고, 현저하게 더 긴 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 합성 생산을 가능하게 하였다. 상기 서비스의 상업적 제공자는 [Blue Heron, Inc., Bothell, WA (http://www.blueheronbio.com)]을 포함한다. Blue Heron, Inc. 사에 의해 이용된 기술은 모두 원용에 의해 본원에 포함된 미국특허 제6,664,112호; 제6,623,928호; 제6,613,508호; 제6,444,422호; 제6,312,893호; 제4,652,639호; 미국공개 특허출원 제20020119456A1호; 제20020077471A1호; 및 국제공개 특허출원 (공개 번호) WO03054232A3; WO0194366A1; WO9727331A2; 및 WO9905322A1에 기재된다.
당연히, 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 핵산의 전통적인 기술이 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 상기 기술은 주지이며, 예를 들면, 모두 원용에 의해 본원에 포함된 하기에 설명된다: Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausebel, ed., Vols. I, II and III (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); DNA Cloning: A Practical Approach, D. N. Glover, ed., Vols. I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. L. Gait, ed. (1984); Nucleic acid Hybridization, Hames and Higgins, eds. (1985); Transcription and Translation, Hames and Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; the series, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); and Methods in Enzymology, Wu and Grossman and Wu, eds., respectively, Vols. 154 and 155.
벡터 및 배양된 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 재조합 벡터로 유전자 조작된 배양된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 델타-플라스민(노겐) 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.
재조합 구축물은 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 트랜스벡션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 벡터는 예를 들면, 파아지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 적격 또는 복제 결함일 수 있다. 후자의 경우에, 바이러스 증식은 일반적으로 단지 배양된 숙주 세포를 보충할 때 일어날 것이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 배양된 숙주에서 증식을 위한 선택성 마커를 포함하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산칼슘 침전물과 같은 침전물, 또는 하전된 지질과의 복합체에서 도입된다. 상기 벡터가 바이러스라면, 적당한 패키징 세포주를 이용하여 시험관 내에서 패키지한 후 배양된 숙주 세포 내로 형질도입될 수 있다.
바람직한 것은 목적 폴리뉴클레오티드에 대한 시스-액팅(cis-acting) 조절 영역을 포함하는 벡터이다. 적당한 트랜스-액팅 인자는 배양된 숙주에 의해 공급되거나, 보충 벡터에 의해 공급되거나 또는 배양된 숙주 내로 도입시 벡터 자체에 의해 공급될 수 있다.
이에 대한 특정 구현예에서, 상기 벡터는 유도성 및/또는 세포 유형 특이적일 수 있는 특이적인 발현을 제공한다. 상기 벡터 중에서 특히 바람직한 것은 온도 및 영양분 첨가제와 같은 다루기 쉬운 환경 인자에 의해 유도가능한 것이다.
본 발명에 유용한 발현 벡터는 염색체-, 에피좀- 및 바이러스-유도된 벡터, 예를 들면, 박테리아 플라스미드, 박테리오파아지, 효모 에피좀, 효모 염색체 성분, 바이러스, 예를 들면, 배큘로바이서, 파포바 바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 조류폭스바이러스, 슈도레이비스바이러스 및 레트로바이러스 유래 벡터, 및 코스미드 및 파아지미드와 같은 이의 조합 유래 벡터를 포함한다.
DNA 인서트는 적당한 프로모터, 예를 들면, 파아지 람다 PL 프로모터, 대장균 lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 기타 적당한 프로모터는 당업자에게 알려질 것이다. 발현 구축물은 또한 전사 개시, 종결 자리, 및 전사 영역에서, 번역을 위한 리보좀 결합 자리를 포함할 것이다. 상기 구축물에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 초기에 개시하는 번역 및 번역되는 폴리펩티드의 말단에 적당하게 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 것이다.
표시한 바와 같이, 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 진핵세포 배양에 대해 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성을 포함하며, 대장균 및 기타 박테리아에서 배양을 위해 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성 유전자를 포함한다. 적당한 배양된 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 진균 세포, 예를 들면, 효모 세포; 곤충 세포, 예를 들면, 초파리 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들면, CHO, COS 및 Bowes 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전술한 배양된 숙주 세포에 대한 적당한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.
박테리아에 이용하기에 바람직한 벡터는 pQE70, pQE60 및 pQE-9(Qiagen Inc. 시판, Valencia, CA); pBS 벡터, PHAGESCRIPT 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene 시판, LaJolla, CA); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia 시판, 지금은 Pfizer, Inc., New York, NY)를 포함한다. 바람직한 진핵세포 벡터는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG(Stratagene 시판); 및 pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL(Pharmacia 시판)이다. 기타 적당한 벡터는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
본 발명에 이용하기에 적합한 박테리아 프로모터는 대장균 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터, 및 trp 프로모터를 포함한다. 적당한 원핵세포 프로모터는 CMV 즉시 초기(immediate early) 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들면, 라우스 육종바이러스 (RSV)의 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예를 들면, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다.
배양된 숙주 세포 내로 벡터 구축물의 도입은 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 양이온성 지질 매개 트랜스펙션, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 기타 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예를 들면, [Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology, 2nd Edition (1995)]에 기재된다.
고등 진핵세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 제시된 배양된 숙주 세포 유형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키기 위해 작용하는 약 10-30 bp의 DNA의 시스-액팅 원소이다. 인핸서의 예는 100-270 bp로 복제 원점의 후방부에 위치한 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후방부의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
소포체의 루멘 내로, 원형질막공간 내로 또는 세포외 환경으로 번역된 단백질의 분비를 위해, 적당한 분비 신호가 발현된 폴리펩티드에 혼입될 수 있다. 상기 신호는 폴리펩티드에 내재할 수 있거나 또는 이종 신호일 수 있다.
상기 폴리펩티드는 변형된 형태, 예를 들면 융합 단백질로 발현될 수 있으며, 분비 신호뿐만 아니라, 부가적인 이종 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 부가적인 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역은 폴리펩티드의 N-말단에 첨가되어 정제 동안 또는 이은 취급 및 저장 동안 배양된 숙주 세포에서 안정성 및 지속을 개선시킬 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티는 폴리펩티드에 첨가되어 정제를 용이하게 할 수 있다. 상기 영역은 폴리펩티드의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 여러 가지 중에서 분비 또는 배출을 하게 하고, 안정성을 개선하고, 정제를 용이하게 하기 위해, 폴리펩티드에 펩티드 모이어티의 첨가는 당업계에 친숙하고 통상적인 기술이다. 바람직한 융합 단백질은 단백질을 가용화하기에 유용한 면역글로불린 유래의 이종 영역을 포함한다. 예를 들면, EP 0 464 533 A1 (Canadian counterpart, 2,045,869)은 또 다른 인간 단백질 또는 이의 부분과 함께 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 많은 경우에, 융합 단백질에서 Fc 파트는 치료 및 진단에 이용하기에 전적으로 유리하므로, 예를 들면, 개선된 약동학적 성질을 초래한다. 다른 한편으로는, 일부 용도에 대해, 융합 단백질이 기재된 유리한 방식으로 발현되고, 검출되고, 정제된 후에 Fc 파트를 제거할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 이는 Fc 부분이 예를 들면, 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로서 이용되는 경우에 치료 및 진단에 이용하는데 장애물로 증명되는 경우에 사실이다. 예를 들면, 약물 개발에서, 인간 단백질은 고처리 스크리닝 분석 목적으로 Fc 부분과 융합되었다 (예를 들면, hIL-5의 길항제를 확인하기 위한 hIL5-수용체). Bennett, D., et al., J. Molecular Recognition, 8:52-58(1995) 및 Johanson, K. et al., J. Biol.Chem., 270(16):9459-9471 (1995) 참고.
델타-플라스미노겐 단백질은 본원의 실시예에 구체적으로 기재된 것을 포함하는 주지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 산물, 화학 합성 절차의 산물, 및 예를 들면, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포 배양된 숙주로부터 재조합 기술에 의해 제조된 산물을 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 특정 경우에 숙주 매개 과정의 결과로서, 초기 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다.
폴리펩티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드의 변이체 및 특정 예를 코딩하는 것을 포함한다. 예를 들면, 표현형적으로 침묵 아미노산 치환을 제조하는 방법에 관한 지침은 [Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substituions, Science 247:1306-1310(1990)]에 제공되며, 여기에서 저자는 단백질이 아미노산 치환에 놀랍게도 내성이라는 것을 나타낸다. 본 발명의 범위 내의 임의의 수의 치환이 상기 일반적인 원리의 적용에 의해 수득될 수 있지만, 치환에 관한 특정 지침에 대해, 크린글 1 도메인의 구조 및 기능에 관해 본원에 인용된 참고문헌은 당업자에 의해 참고될 수 있다.
또한, 이용된 기준에 따라, 크린글 1의 정확한 "위치", 활성화 부위, 및 델타-플라스미노겐 폴리펩티드의 세린 프로테아제 도메인은 본 발명의 범위 내의 특정 변이에서 약간 상이할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 활성화 부위에 대한 크린글 1 도메인의 정확한 위치는 약간 변할 수 있고/있거나 크린글 1 도메인의 N-말단 서열은 길이가 변할 수 있다. 그리하여, 본 발명은 본원에 개시된 델타-플라스미노겐 폴리펩티드 활성을 나타내는 델타-플라스미노겐 폴리펩티드의 상기 변이를 포함한다. 상기 변이체는 결손, 삽입, 역위, 반복 및 치환을 포함한다. 전술한 바와 같이, 어느 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵할 것인가에 대한 지침은 [Bowie, J. U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, Science 247: 1306-1310(1990]에서 발견될 수 있다.
그리하여, 서열번호 2의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들면, 3, 5, 8, 10, 15 또는 20)가 보존 또는 비보존 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존 아미노산 잔기)로 치환된 것일 수 있다. 상기 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩된 것일 수 있거나 아닐 수 있으며, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기(예를 들면, 3, 5, 8, 10, 15 또는 20)를 포함하는 것이거나, 또는 (iii) 성숙 폴리펩티드가 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 또 다른 화합물과 융합된 것이거나, 또는 (iv) 부가적인 아미노산이 성숙 폴리펩티드, 예를 들면, IgG Fc 융합 영역 펩티드 또는 리더 또는 분비 서열 또는 성숙 폴리펩티드의 정제를 위해 이용되는 서열 또는 프로단백질 서열에 융합된 것일 수 있다. 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 교시로부터 당업자의 범위 내인 것으로 생각된다.
표시된 바와 같이, 변화는 바람직하게는 사소한 특성, 예를 들면, 단백질의 폴딩 또는 활성에 현저하게 영향을 주지 않는 보존 아미노산 치환이다. 당연히, 당업자가 할 수 있는 아미노산 치환의 수는 전술한 것을 포함하는 많은 인자에 의존할 것이다. 일반적으로 말해서, 임의의 제시된 델타-플라스미노겐 폴리펩티드에 대한 치환의 수는 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 또는 3을 초과하지는 않을 것이다.
기능에 필수적인 본 발명의 델타-플라스미노겐 폴리펩티드에서 아미노산은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 자리 지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 의해 확인될 수 있다 (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). 후자 절차는 분자 내의 모든 잔기에서 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 생성된 돌연변이체 분자는 이어서 예를 들면, 본원에 제공된 실시예에서 보여준 바와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다. 리간드 결합에 결정적인 자리는 또한 결정화, 핵자기공명 또는 광친화성 표지와 같은 구조 분석에 의해 측정될 수 있다 (Smith, et al., J. Mol . Biol. 224:399-904 (1992) 및 de Vos, et al. Science 255:306-312 (1992)). 단백질의 N-말단 유래의 하나 이상의 아미노산의 결손이 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능의 변형 또는 손실을 초래할지라도, 기타 생물학적 활성은 여전히 유지될 수 있다.
또한, 본 발명의 "분리된 폴리펩티드"의 제조에 유용한 폴리펩티드는 고체상 합성 방법에 의해 제조될 수 있다는 것이 고려된다. Houghten, R. A., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 82:5131-5135 (1985); 및 미국특허 제4,631,211호(Houghten et al. (1986)) 참고.
본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태로 제공될 수 있다. "분리된 폴리펩티드"는 이의 천연 환경으로부터 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 그리하여, 재조합 배양된 숙주 세포 내에 포함되고/되거나 제조된 폴리펩티드는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 고려된다. 또한, "분리된 폴리펩티드"로서 의도되는 것은 재조합 배양된 숙주로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드이다.
델타-플라스미노겐 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열과 표시된 퍼센트 동일성의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드에 관하여 상기 나타낸 컴퓨터 보조 방법을 포함하는 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 이전 논의에서 뉴클레오티드 서열과 같이 폴리펩티드 아미노산 서열을 조사하고, 비교한다. 당업자는 폴리뉴클레오티드에 대해 논의된 분자 종점(molecular endpoint)과 같은 개념이 폴리펩티드 분석에 대한 상기 방법 및 프로그램의 해당하는 용도를 고려할 때 직접적인 유사체를 가질 것이라는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드에 관해 논의된 인위적인 수정은 핵산의 5' 및 3' 종점을 언급하나, 동일한 논의가 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 적용가능한 것으로서 인식될 것이다.
본 발명은 예를 들면, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/봉쇄기에 의한 유도화, 단백질분해 절단, 항체 분자 또는 기타 세포 리간드에 연결 등에 의한 번역 동안 또는 후에 차별적으로 변형된 델타-플라스미노겐 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 수많은 화학적 변형이 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, 황색포도상구균(S. aureus) V8 프로테아제, NaBH4에 의한 특이적 화학적 절단; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 튜니카마이신의 존재하의 대사적 합성; 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 공지 기술에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 의해 포함되는 부가적인 번역 후 변형은 예를 들면, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 사슬, N-말단 또는 C-말단의 가공, 아미노산 골격에 화학적 모이어티의 부착, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 사슬의 화학적 변형, 및 원핵세포 배양된 숙주 세포에서 델타-플라스미노겐 폴리펩티드의 발현에 적합한 벡터 및 구축물의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 부가를 포함한다. 상기 폴리펩티드는 또한 단백질의 검출 및 분리를 허용하기 위해 검출가능한 표지, 예를 들면, 효소, 형광, 또는 방사성 또는 친화성 표지를 이용하여 변형될 수 있다.
약학 조성물 및 치료 방법
델타-플라스민(노겐)은 본원에 원용에 의해 포함된 US 2003/0012778 A1; 및 Novokhatny, V., et al., J. Thromb . Haemost . 1(5):1034-41 (2003)에 기재된 방법 및 조성물에 따라 치료 용도로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 저 pH (약 2.5 내지 약 4), 저 완충능 완충액이 델타-플라스민의 제형화에 이용될 수 있다. 부가적으로, 플라스민, 미니-플라스민, 및/또는 마이크로-플라스민에 대해 실시된, 당업자에게 공지된 기타 방법 및 제형물이 치료학적 투여를 위해 본 발명의 델타-플라스민을 제형화하기 위해 이용될 수 있다.
상기 델타-플라스민(노겐)은 예를 들면, 모두 본원에 원용에 의해 포함된 미국특허 제6,355,243호; 및 미국공개 특허출원 제US 2003/0026798 A1; US 2003/0175264 A1호에 기재된 방법에 따라, 다양한 혈전 질환 또는 증상을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 다시, 델타-플라스민에 적용가능한 가능한 약학 제형물에 대해, 델타-플라스민은 또한 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 플라스민, 미니-플라스민, 및/또는 마이크로-플라스민에 대해 현재로 실시될 수 있는 방법에 의해 치료학적으로 투여될 수 있다.
도 1은 단백질분해 절단에 의한 활성화 후에 천연 플라스민의 모식도이다. K1-K5은 크린글 영역 1-5이며; SP는 세린 프로테아제 도메인이다. "α2-AP"는 크린글 1에 대한 α2-항플라스민 결합 자리이다.
도 2는 도 1과 동일한 명명법을 이용한 본 발명의 플라스미노겐 결손형 돌연변이체의 모식도이며, K2-5의 결손을 보여준다.
도 3은 -19 내지 -1로서 넘버링된 19-잔기 리더 서열을 보여주는 인간 플라스미노겐의 아미노산 서열, 및 잔기 1- 791로서 보여준 플라스미노겐 서열(도 3에 보여준 서열번호 3 (인간 플라스미노겐에 대한 cDNA 서열; 및 서열번호 4(코딩된 아미노산 서열) 참고)을 보여준다. 하기를 포함하는 수많은 특징을 보여준다: 델타-플라스미노겐 서열 (음영 부분); 크린글 도메인 1-5 (이중 밑줄); 글리코실화 자리 Asn289 및 Thr346 (진함); 플라스미노겐 활성화 Arg-Val 활성화 부위 (진함); 및 크린글 1에서 라이신-결합 자리 (밑줄 및 특정 위치 넘버링).
도 4는 천연 인간 플라스민(노겐)의 5개의 크린글 도메인 (1-5) 사이의 폴리펩티드 서열 비교를 보여준다. 크린글 1에서 동일한 상대적 위치의 것과 동일한 아미노산 잔기를 밑줄로 보여준다.
도 5는 비환원된 (레인 1) 및 환원된 (레인 2) 델타-플라스미노겐 제제의 8-25% 구배 SDS-PAGE를 보여준다. 스트렙토키나아제 (레인 3), 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA) (레인 4), 및 유로키나아제 (레인 5)를 이용한 델타-플라스미노겐의 델타-플라스민으로의 활성화는 2개의 이황화 가교에 의해 연결된 크린글 1 (K1) 및 세린 프로테아제 도메인 (SP)으로 이루어진 2개 사슬 분자의 형성을 초래한다.
도 6은 유로키나아제에 의한 델타-플라스미노겐의 활성화의 그래프를 나타낸다. 유로키나아제(5.8 nM)를 37℃에서 1.0 mM S-2251를 포함하는 PBS 중의 5 μM 델타-플라스미노겐의 용액에 첨가하였다. 흡광도의 증가를 405 nm에서 모니터링하였다.
도 7은 라이신-SEPHAROSE 4B에 대한 델타-플라스미노겐의 결합을 보여주는 크로마토그램이다: 0.5 mg의 정제된 델타-플라스미노겐을 Tris 완충 염수, pH 7.4로 평형화된 라이신-SEPHAROSE 4B 칼럼 (1x3 cm)에 적용하였다. 결합된 단백질을 단일 피크로서 0-20 mM 구배의 ε-아미노카프로산 (ε-ACA)에 의해 칼럼으로부터 용출하였다. 280 nm에서 흡광도 및 용출물 부피의 함수로서 ε-ACA의 농도를 그래 프 상에 표시하였다.
도 8은 피브린에 대한 델타-플라스미노겐의 결합을 보여준다. 다양한 농도의 델타-플라스미노겐을 37℃에서 1시간 동안 미세역가 플레이트에서 피브린 응혈(clot)과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 상기 응혈을 PBS로 잘 세정하고, tPA의 0.1mg/ml 용액을 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후에, 상기 액체를 제거하고, 남아 있는 고체 응혈을 100 ㎕의 1M NaOH로 재구성하였다. 남아 있는 피브린의 양을 상기 재구성된 응혈의 280 nm 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다. 피브린에 대한 델타-플라스미노겐 결합의 결과인 섬유소용해 정도를 델타-플라스미노겐 농도의 함수로서 그래프 상에 플롯팅하였다(실선). 점선은 결합 식에 대한 실험 데이타의 가장 잘 맞는 것을 나타낸다.
도 9는 비환원된 (레인 1) 및 환원된 조건 (레인 2) 하의 출발하는 델타-플라스미노겐 및 비환원된 (레인 3) 및 환원된 (레인 4) 조건하의 최종 델타-플라스민 제제의 8-25% 구배 SDS-PAGE를 보여준다.
도 10은 해당하는 효소 활성(기질 S-2251 (D-Val-Leu-Lys-p-니트로아닐리드, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH)에 대한 kcat 및 KM)의 규명과 함께, 플라스민, 미니-플라스민, 마이크로-플라스민, 및 델타-플라스민의 모식도를 보여준다.
도 11은 퇴축(retracted) 전혈 응혈의 델타-플라스민 유도된 용해의 그래프를 나타낸다. 각 응혈(0.8x7 cm)을 1 ml 부피의 운반체(산성화된 염수, pH 3.6), 플라스민 (1.0 mg/ml), 또는 델타-플라스민 (0.44 mg/ml)로 주사하고, 응혈 용해를 37℃에서 1시간 동안 진행하도록 허용하였다.
발현 벡터 디자인
델타-플라스미노겐에 대한 아미노산 서열을 서열번호 2에 제시한다. 델타-플라스미노겐을 코딩하는 가상적인 서열을 대장균 발현 및 mRNA 안정성에 대해 코돈 최적화하여 서열번호 1에 제시한 DNA 서열을 생성하였다.
상기 DNA를 화학적으로 합성하고 (Blue Heron, Inc,), 대장균 발현 벡터 pET22b(+) (Novagen; Madison, WI)의 NdeI 및 BamH1 자리에 삽입하여 세포질 단백질을 제조하였다. 상기 구축물은 부가적인 비천연 N-말단 메티오닌을 갖는 델타-플라스미노겐을 생성한다(pET-22b(+) = pET Expression System 22b (Cat. No. 70765), EMD Biosciences, Inc., Novagen Brand, Madison, WI; 벡터에 관한 상세한 것을 위해 pET-22b에 관한 http://www.emdbiosciences.com 제품 정보 섹션 참고).
델타- 플라스미노겐 발현 및 정제
델타-플라스미노겐 서열을 코딩하는 DNA를 다양한 세포 내로 형질전환하고, 1mM IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)의 유도에 따른 단백질 과발현을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. Arg, Ile, 및 Leu를 코딩하는 드문 대장균 tRNA를 발현하도록 조작된 세포 유형 BL21(DE3) RIL (Stratagene, La Jolla, CA) 세포를 델타-플라스미노겐의 생산에 이용하였다.
델타-플라스미노겐의 생산을 세포가 용해되고, 가용성 단백질 및 정제된 봉입체가 SDS-PAGE에 의해 조사된 대규모 발현에서 확인되었다. BL21(DE3) RIL 세포 는 봉입체의 형태로 현저한 델타-플라스미노겐 단백질을 생산하였다. 발현 평가는 50-80 mg/L 세포 배양물이었다.
하기 전형적인 절차를 델타-플라스미노겐의 발현에 이용하였다:
델타-플라스미노겐 벡터를 포함하는 BL21(DE3) RIL 세포의 단일 콜로니를 이용하여 5 ml의 LB/암피실린(100 ㎍/ml)/클로람페니콜(50 ㎍/ml)에 접종하고, 진탕기에서 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 50㎕ 분취량을 신선한 배지에서 추가의 성장을 위해 배양된 박테리아 현탁액으로부터 취하였다. 상기 절차를 6 ml의 박테리아 배양물 및 250 ml의 배지를 이용하여 16시간 후에 반복하였다. 배양물을 진탕하면서 37℃에서 약 1의 OD600 nm로 키우고, IPTG를 1 mM 최종 농도로 첨가하였다. 배양물을 추가로 5시간 동안 키웠다. 세포를 5,000 x g에서 원심분리에 의해 수확하고, 세포 펠렛을 20 mM EDTA를 포함하는 20 mM Tris pH 8.0에 용해하고, -80℃에서 동결하였다.
델타-플라스미노겐을 정제하기 위해, 세포 펠렛을 녹이고, 용액 부피가 원래 세포 배양물 부피의 약 1/20이 될 때까지 완충액을 첨가하였다. 그 후에, 리소자임을 0.5 mg/ml의 최종 농도로 첨가하고, 세포를 10-15분 동안 4℃에서 신속하게 교반하였다. 이어서, Triton X-100을 1% 최종 농도로 첨가하고, 교반을 다시 10분 동안 계속하였다. DNAse I (0.05 mg/ml) 및 MgCl2 (2.5 mM)를 첨가하고, 교반을 30분 또는 용액이 더 이상 끈적이지 않을 때까지 4℃에서 계속하였다. 최종 용액을 15,000 x g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 버렸다.
세포 펠렛을 세정액(10 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 및 0.5 M 우레아를 포함하는 50 mM Tris-HCl, pH 7.4)으로 3회 세정하고, 최종 펠렛을 40 ml의 추출 완충액(10 mM EDTA, 20 mM DTT, 및 6 M 구아니딘-HCl을 포함하는 PBS, pH 7.4)에 용해하고, 4℃에서 밤새 저장하였다. 16시간 후에, 용액을 15,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 고체를 제거하고, 상층액을 4℃에서 교반하면서 리폴딩 용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 3.5 M 구아니딘 HCl, 0.5 M 아르기닌 HCl, 10 mM EDTA, 3 mM GSH, 0.3 mM GSSG)에 천천히 첨가하였다. 상기 리폴딩 과정을 0.03 mg/ml 이하의 단백질 농도에서 수행하였다.
상기 리폴딩 용액을 4℃에서 교란되지 않은 상태로 2일 동안 유지한 후, 완충액을 자주 교환하면서, 8-10시간에 걸쳐, 10 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.15 M 아르기닌-HCl을 포함하는 8배 부피의 0.1 M Tris-HCl pH 8.0에 대해 투석하였다.
단백질 용액을 이어서 투석으로부터 제거하고, 10 kDa의 막 컷오프를 갖는 Amicon 필터를 이용하여 대략 10-20 ml로 농축하고, 10 mM EDTA, 0.15 M NaCl를 포함하는 100배 부피의 0.1 M Tris pH 8.0에 대해 밤새 투석하였다. 상기 물질을 원심분리하여 입자를 제거한 후, 라이신 친화성 수지 (Lysine-SEPHAROSE 4B; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 통과시켰다. 델타-플라스미노겐을 0.2 M 엡실론 아미노카프로산 (εACA)을 포함하는 트리스 완충 염수, pH 8.0을 이용하여 상기 수지로부터 용출하였다.
전형적으로, 80 mg의 봉입체가 1 리터의 세포 배양물로부터 분리될 수 있었으며, 40 mg이 라이신-SEPHAROSE 크로마토그래피 단계에서 용출될 수 있었다.
델타- 플라스미노겐의 특성
정제된 델타-플라스미노겐은 환원(디티오트레이톨 처리) 및 비환원 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 35-40 kDa 영역에서 단일 밴드로서 나타났다 (도 5 참고). MALDI 질량 분석법에 의해 측정된 정확한 분자 질량은 37,198 Da의 예상된 값과 매우 유사한 37,089 Da이었다.
델타-플라스미노겐 (△Pg)이 델타-플라스민으로 활성화될 수 있는지를 시험하기 위해, 델타-플라스미노겐을 유로키나아제 (1:1000 몰비)와 함께 인큐베이션하고, 세린 프로테아제 활성의 증가를 S-2251 가수분해(S-2251 = D-Val-Leu-Lys-p-니트로아닐리드, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH)의 속도의 증가를 측정함으로써 모니터링하였다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 활성화의 커플링된 반응에 대해 전형적인 활성(자이모겐이 활성 효소(1)로 전환되며; 상기 효소는 발색성 기질(2)을 절단한다)의 포물선 증가가 관찰된다. 델타-플라스미노겐의 델타-플라스민으로의 활성화는 상기 조건하에 3분 내에 종료하였다. 매우 유사한 결과가 tPA 및 스트렙토키나아제에 대해 수득되었다.
델타-플라스미노겐의 유로키나아제 활성화에 대한 역학은 Wohl 등 (Wohl, R.C., Summaria, L., Arzadon, L., and Robbins, K.C.; J. Biol . Chem . 253: 1402-1407 (1978), 전체적으로 원용에 의해 포함됨)의 방법을 이용하여 전장 플라스미노겐에 대한 것과 비교하였다. 상기 목적을 위해, 5.8 nM 유로키나아제를 37℃, pH 7.5에서 1 mM S-2251 기질의 존재하의 다양한 농도의 플라스민 종을 포함하는 용액에 첨가하였다. 405nm에서의 흡광도의 증가를 모니터링하고, S-2251 생성물 형성 의 가속도를 포물선형 편미분 방정식 속도 = k?t2을 이용하여 계산하였다. 데이타를 Lineweaver-Burk 분석을 이용하여 Michaelis-Menten 역학 모델에 맞추어, 하기 값을 수득하였다:
델타- 플라스미노겐의 유로키나아제 활성화에 대한 역학.
종: Km(μM) kcat(min-1) kcat/Km(μM-1min-1)
델타-플라스미노겐 30 +/- 5 80 +/- 10 2.67
플라스미노겐 1.2 +/- 0.1 2.3 +/- 0.3 1.92
전장 플라스미노겐을 문헌에 발견된 것과 유사한 Km 값(1.7 μM; Wohl, R.C., Summaria, L., and Robbins, K.C.; J. Biol . Chem 255(5): 2005-2013 (1980)) 및 동등한 kcat 값을 가지면서, 유로키나아제에 의해 잘 활성화되었다.
델타-플라스미노겐의 유로키나아제 활성화에 대한 Km 값은 플라스미노겐에 대한 것보다 대략 30배 높았는데, 아마도 플라스미노겐의 상기 돌연변이체에 대한 유로키나아제의 더 낮은 친화성을 나타낸다. 동시에, 델타-플라스미노겐의 활성화에 대한 kcat 값은 플라스미노겐에 대한 것보다 훨씬 높았다. kcat 및 Km에서 전술한 차이에도 불구하고, 이의 비율 또는 촉매 효율은 유로키나아제에 의한 천연 및 재조합적으로 변형된 플라스미노겐의 활성화에 대해 대략 동일하였다. 그리하여, 상기 데이타는 "외래" 크린글 1의 존재는 델타-플라스미노겐에서 세린 프로테아제 도메인의 활성화 특성에 현저하게 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
여전히 또 다른 활성화 실험에서, 델타-플라스미노겐을 스트렙토키나아제, tPA, 및 유로키나아제와 함께 인큐베이션하고, 환원 SDS-PAGE에서 분석하여 2개의 사슬 델타-플라스민에서 1개 사슬 델타-플라스미노겐 분자의 전환을 관찰하였다 (도 5, 레인 3-5 참고). 모든 3가지 경우에, 델타-플라스민의 2개 사슬(~12 kDa 크린글 1 및 ~25 kDa 세린 프로테아제 사슬)이 관찰될 수 있었는데, 이는 델타-플라스미노겐이 정말로 모든 3가지 플라스미노겐 활성화제에 의해 활성화될 수 있다는 것을 제시한다.
예상한 바와 같이, 델타-플라스미노겐은 크린글 1을 통해 라이신-SEPHAROSE에 결합되었으며, 단일 피크로서 εACA의 구배에 의해 칼럼으로부터 용출될 수 있었다 (도 7 참고). 라이신-SEPHAROSE에 결합하는 리폴딩된 델타-플라스미노겐의 능력은 상기 분자의 크린글 도메인이 올바르게 폴딩되며, 라이신-결합 자리가 충분히 활성인 것을 나타낸다.
크린글 1의 기능성을 추가로 확인하기 위해, 델타-플라스미노겐에 대한 εACA의 결합을 모두 원용에 의해 본원에 포함된 Matsuka 등 (Matsuka, Y.V., Novokhatny, V.V., and Kudinov, S.A., Eur . J. Biochem . 190:93-97 (1990)) 및 Douglas 등 (Douglas, J.T., von Haller, P.D., Gehrmann, M., Llinas, M., and Schaller. J., Biochemistry 41:3302-3310(2002))에 기재된 단백질 형광의 관련된 변화를 모니터링함으로써 측정하였다. 델타-플라스미노겐의 크린글 1에 대한 εACA의 결합은 아마도 라이신-결합 자리의 일부인 트립토판 잔기의 켄칭(quenching)으로 인해 형광의 감소를 초래한다.
상기 과정을 모니터링하기 위해, εACA의 농축액의 4 ㎕ 내지 16 ㎕ 분취량을 25℃에서, 20 mM NaCl, pH 8.0을 포함하는 50 mM 트리스 완충액 중의 2 ml의 5 μM 델타-플라스미노겐에 첨가하였다. 상기 형광을 FLUOROMAX 형광 광도계(Jobin Yvon, Inc., Edison, NJ)에서 298nm의 여기 파장 및 340nm의 방출 파장에서 모니터링하였으며; εACA의 각 첨가 후에, 용액을 형광의 추가의 변화가 관찰되지 않을 때까지 평형화시켰다.
생성된 형광 값을 희석에 대해 보정하고, 0-50μM εACA의 범위에 걸쳐 εACA의 농도에 대해 플롯팅하였다. 데이타를 비선형 회귀에 맞추어 3.2 μM (Matsuka, et al.) 및 13 μM (Douglas, et al.)의 εACA에 대한 크린글 1 친화성에 대한 문헌 값과 잘 일치하는 11.1 +/- 2.3 μM의 Kd를 수득하였다.
플라스민의 하나의 특성은 피브린에 결합하는 이의 능력이다. 델타-플라스미노겐이 피브린과 상호작용하는 능력을 보유하는지를 결정하기 위해, 이의 피브린-결합 특성을 피브린에 대한 델타-플라스미노겐의 결합이 tPA의 이은 활성화 및 생성된 응혈 용해에 의해 분석되는 미세역가 플레이트 분석에서 시험하였다. 상기 목적을 위해, 100 ㎕의 5mg/ml 피브리노겐을 미세역가 플레이트의 각 웰에서 트롬빈과 함께 중합하였다. 다양한 농도의 델타-플라스미노겐을 피브린 응혈의 상단에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 피브린 응혈을 여전히 본래대로 두고, 웰에 부착된 상태로 PBS로 상기 플레이트를 철저히 세정하였다. 세정 후에, tPA의 0.1-mg/ml 용액을 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 결과, 응혈의 일부가 완전히 용해되었으며, 일부는 부분적으로 용해된 반면, 매우 소량의 델타-플라스미노겐을 갖는 웰 및 대조군 웰은 실제적으로 본래대로 있었다. 섬유소용해 정도를 1M NaOH 중에 재구성된 초기 응혈의 나머지의 280nm 흡광도를 측정함으로써 모니터링하였다. 상기 흡광도 값을 델타-플라스미노겐 농도의 함수로서 플롯팅하였다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 피브린에 대한 델타-플라스미노겐의 결합은 고전적인 S자형 곡선을 따른다. 상기 분석을 이용하여, 델타-플라스미노겐이 전장 플라스미노겐의 것과 필적할만한 친화성으로 피브린과 결합하며, 상기 상호작용의 C50(~0.2 μM)이 전장 플라스미노겐의 피브린-결합의 Kd에 필적할만하다는 것을 발견하였다 (Lucas, M.A., Fretto, L.J., and McKee, P.A.; J. Biol . Chem . 258(7): 4249-4256 (1983)). 상기 실험은 델타-플라스미노겐이 피브린에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
그리하여, 델타-플라스미노겐과 라이신-SEPHAROSE의 상호작용, 예상된 Kd로서 εACA에 결합하는 능력, 피브린에 결합하는 능력, 모든 주요 플라스미노겐 활성화제에 의해 활성화되는 능력, 및 발색성 플라스민 기질 S-2251에 대한 델타0플라스민의 잠재력 모두는 상기 분자가 충분히 기능적 형태로 대장균 시스템에서 생산되었다는 것을 나타내었다.
델타- 플라스민 정제 및 제형화
10 mM EDTA 및 0.15 M NaCl을 포함하는 0.1M Tris 완충액, pH 8.0에 대해 투석된 델타-플라스미노겐을 플라스민에 대해 이전에 기재된 바와 같이 본질적으로 SEPHAROSE 4B 상에 고정화된 유로키나아제를 이용하여 델타-플라스민으로 활성화시켰다 (Marder, V.J., et al., Thromb Haemost ., 86(3):739-45 (2001), 원용에 의해 포함됨). 활성화는 실온에서 일어났으며, S-2251 활성의 증가에 의해 실시간으로 모니터링하였다. 배치마다 변하는(전형적으로 1-2 mg/ml) 델타-플라스미노겐의 양에 의존하여, 인큐베이션 시간은 30-60분이었다. S-2251 활성이 정제기에 도달한 활성화 완료시, 유로키나아제-SEPHAROSE를 여과하여 제거하고, 활성 델타-플라스민을 벤즈아미딘-SEPHAROSE(Pharmacia) 상에 포획하였다. 델타-플라스민을 상기 수지로부터 저 pH 완충액(0.2 M 글리신, pH 3.0, 0.3 M NaCl, 0.2M εACA)을 이용하여 용출하였다.
용출 분획 중의 단백질 농도 및 S-2251 활성을 측정하였다. 높은 비활성 분획을 모으고, 4℃에서 0.15 M NaCl, pH 3.6의 다수의 교환에 대해 투석하였다. 비환원 델타-플라스민 시료의 SDS-PAGE 분석 (도 9, 레인 3 참고)은 상기 물질의 순도가 통상적으로 95% 이상이라는 것을 보여준다. 환원 조건(도 9, 레인 4)하에, 세린 프로테아제 및 크린글 사슬 외에, 크린글 밴드 위 아래에 2개의 희미한 밴드가 존재한다. 상기 밴드는 폴리펩티드 사슬의 내부 절단으로부터 생기는 세린 프로테아제 도메인의 자가 분해 산물을 나타내며; 이는 정상적으로 이황화결합에 의해 결합되나, 환원 조건하에 PAGE를 이용하여 보이게 된다. 전형적으로 10%를 초과하지 않는 자가 분해 산물의 양은 칼럼 포멧 대신에 배취 방식으로 벤즈아미딘-SEPHAROSE 정제 단계를 수행함으로써 현저하게 감소되었다.
전장 플라스민과 유사한 델타-플라스민은 생리학적 pH에서 자가 분해되기 쉬우므로, pH 3.6이 최종 제형물에 대해 선택되었다(아세트산-염수를 이용하여 산성화시킴). 플라스민에 대해 이전에 보여주고(Novokhatny, V. et al., J Thromb Haemost., 1(5):1034-41 (2003), 원용에 의해 포함됨), 델타-플라스민에 대한 실험에서 확인된 바와 같이, 상기 낮은 완충능, 낮은 pH 제형물은 장기간 동안 활성 플라스민의 안전한 저장을 허용할 뿐만 아니라, 직접적인 혈전용해의 비경구적 투여와 상용성이다. 혈장 또는 중성 pH 완충액과 혼합될 때, 델타-플라스민은 신속하게 재활성화된다.
델타- 플라스민의 효소학적 특성
델타-플라스민의 아미드 분해 활성을 플라스민 기질 (D-Val-Leu-Lys-p-니트로아닐리드 (S-2251) (DiaPharma, West Chester, OH)을 이용하여 조사하였다. PBS 완충액에서 25℃, pH 7.4에서, S-2251에 대한 Michaelis-Menten 상수(Km)은 138 μM인 것으로 밝혀졌다 (표 2). 상기 제제에 대한 kcat은 510 min-1인 것으로 밝혀졌다. 4-니트로페닐 4-구아니디노벤조에이트 히드로클로라이드(pNPGB) 적정을 이용하여 (Chase, T. and E. Shaw, Methods Enzymol . 197:20-27(1970)), 기능적 활성 자리의 퍼센트는 67%인 것으로 밝혀졌다. 퍼센트 활성 자리에 대한 kcat을 수정하여, 755 +/- 45 min- 1 의 kcat가 측정되었다. 상기 값은 전장 플라스민에 대한 동일한 분석에서 측정된 값 760 +/-23 min-1 및 마이크로-플라스민(모든 5개의 크린글이 부족)에 대한 값 795 +/- 24 min-1과 매우 유사하였다 (도 9 참고). 상기 데이타는 크린글의 존재 또는 부재가 세린 프로테아제 도메인에 대한 촉매 활성에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
α2-마크로글로불린에 의한 델타-플라스민의 저해 속도를 Anonick 등(Anonick, P., et al., Thrombosis Res. 59:449-462 (1990))의 방법을 이용하여 측정하였다. 저해 속도는 PBS 완충액에서 22℃에서 7.6 +/- 0.6 x 105 M-1s-1인 것으로 밝혀졌다.
α2-항플라스민에 의한 델타-플라스민의 저해 속도는 플라스민 및 α2-항플라스민이 혼합된 후 특정 시간에서 S-2251 활성에 대해 분석되는 Wiman 및 Collen (Wiman, B. and D. Collen, Eur . J. Biochem . 84:573-578 (1978))의 방법을 이용하여 1.1 x 107 M-1s-1인 것으로 밝혀졌다(표 3). 상기 값은 2.5 x 107 M-1s-1의 플라스민에 대해 보고된 값에 필적할만하다 (Anonick, et al., Thrombosis Res. 59:449 (1990)).
마이크로-플라스민에 대해 수행된 동일한 실험은 2가지 별도의 실험에서 1.8 x 105 M-1s-1 및 3.1 x 105 M-1s-1의 α2-항플라스민 저해 속도를 나타냈다. 미니-플라스민(미니-플라스민 도메인 조성, K5-SP)의 α2-항플라스민 저해 속도는 2.4 x 105 M-1 s-1인 것으로 측정되었다. 상기 데이타는 마이크로- 및 미니-플라스민에 대한 문헌 값과 합당하게 일치하며, α2-항플라스민에 의한 델타-플라스민의 저해는 마이크로-플라스민 또는 미니-플라스민의 저해보다 40배 빠르다는 것을 보여준다. 그리하여, 상기 결과는 델타-플라스민이 이의 구조에서 크린글 1의 존재로 인해 α2-항플라스민에 의해 신속하게 저해되어야 한다는 것을 나타낸다.
전체적으로, 상기 섹션에서 제시된 데이타는 델타-플라스민의 효소학적 및 저해 특성이 전장 플라스민과 유사하다는 것을 보여준다.
25℃, PBS 완충액 , pH 7.4에서 기질 S-2251을 갖는 다양한 플라스민 종에 대한 정류 상태 역학 변수
Km kcat
플라스민 193 +/- 7 μM 760 +/- 23 min -1
미니-플라스민 160 +/- 30 μM 770 +/- 70 min -1
마이크로-플라스민 145 +/- 13 μM 795 +/- 24 min -1
델타-플라스민 138 +/- 5 μM 755 +/- 45 min -1
다양한 플라스민 종 및 저해제에 대한 저해 속도를 22℃, PBS 완충액 , pH 7.4에서 측정하였다.
α2-마크로글로불린 α2-항플라스민
플라스민 6.5 +/- 0.5 x 105 M-1s-1 2.5 +/- 0.5 x 107 M-1s-1 (lit.)
미니-플라스민 7.5 +/- 0.3 x 105 M-1s-1 2.4 +/- 0.5 x 105 M-1s-1
마이크로-플라스민 7.8 +/- 0.6 x 105 M-1s-1 1.8 +/- 0.2 x 105 M-1s-1
델타-플라스민 7.6 +/- 0.6 x 105 M-1s-1 1.0 +/- 0.1 x 105 M-1s-1
문헌 값을 [Anonick, et al., Thrombosis Res. 59:449(1990)]으로부터 취하였다. 모든 속도를 Anonick 등에 공개된 방법에 따라 측정하였다.
시험관 내 혈전용해 효율
델타-플라스민의 혈전용해 효능을 하기 실험 프로토콜을 이용하여 카테터-보조 혈전용해의 시험관 내 모델(Novokhatny, V. et al., J Thromb Haemost ., 1(5):1034-41 (2003), 원용에 의해 포함됨)에서 시험하였다.
신선한 인간 전혈을 20 x 0.95 cm 유리관에 모으고, 첨가제 없이 자발적으로 응혈되게 하였다. 관을 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션하여 충분한 퇴축(retraction)을 허용하였다. 퇴축된 응혈을 14 메쉬를 갖는 미국 표준 시험 체 D16을 이용하여 혈청으로부터 분리하고, 이의 중량을 측정하였다. 혈액 응혈을 퇴축된 응혈이 꼭 맞은 더 작은 직경 유리관(0.8 x 7 cm)에 옮겼다. 응혈의 평균 중량은 ~3.6 g 이었다.
단일 1-ml 투여량의 산성화된 염수, 플라스민, 또는 델타-플라스민을 주사기를 이용하여 응혈 내로 주사하였다. 상기 응혈을 THELCO 실험실 오븐 (Jouan, Inc., Winchester, VA)에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 상기 응혈을 다시 체 위에 위치하여 액체화된 물질을 제거하고, 절단된 응혈의 중량을 측정하였다. 응혈 용해의 정도를 초기 응혈 중량 및 잔류 응혈의 중량의 차이로부터 측정하고, 응혈 중량 감소의 퍼센트로서 표시하였다.
도 10은 상기 모델에서 델타-플라스민을 이용한 용해 실험의 결과를 보여준다. 단일 0.44 mg (몰 기재로 1 mg/ml의 플라스민과 동량) 투여량의 델타-플라스민의 주입은 60분 내에 36% 응혈 중량 감소를 초래하였다. 동시에, 염수를 이용하여 주입된 응혈의 중량은 단지 4% 감소하였다. 플라스민 (1.0 mg)은 동일한 기간에 50% 응혈 중량 감소를 초래하였다. 그리하여, 상기 데이타는 델타-플라스민이 혈전용해 효능을 나타내며, 직접적인 혈전용해제로서 이용될 수 있다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Talecris Biotherapeutics, Inc. Hunt, Jennifer A. Novokhatny, Valery <120> Recombinantly Modified Plasmin <130> B185 1240-PCT(8017) <150> US 60/564,472 <151> 2004-04-22 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucletoide comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide having a single N-terminal kringle domain homoogous to a kringle domain of native human plasminogen <400> 1 aaagtctatt tatctgaatg taaaacaggc aatggtaaaa actatcgcgg taccatgtcc 60 aaaacaaaaa acggtatcac ttgtcaaaaa tggtctagca cttcacccca tcgtcctcgt 120 ttctcccctg cgacccatcc ctctgaaggc ctcgaagaaa actactgccg caaccccgat 180 aatgatcctc aaggcccatg gtgttatact accgatcctg aaaaacgtta tgactattgc 240 gatatcttag aatgcgcagc cccttctttt gattgcggca aaccacaagt tgaacccaag 300 aaatgtccag gtcgtgttgt cggcggttgt gttgcgcatc cccacagttg gccgtggcag 360 gtctcattac gtacccggtt tggaatgcac ttttgtggcg gcactctcat ctcgcccgaa 420 tgggttctta cagctgcaca ctgtttggaa aaaagccccc gtccttcttc ttataaagtt 480 atcctcggcg cacatcaaga 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Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly 260 265 270 His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 275 280 285 Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser 290 295 300 Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg 305 310 315 320 Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 325 330 335 <210> 3 <211> 2432 <212> DNA <213> Homo sapien <220> <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> Human plasminogen <400> 3 atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagag 60 cctctggatg actatgtgaa tacccagggg gcttcactgt tcagtgtcac taagaagcag 120 ctgggagcag gaagtataga agaatgtgca gcaaaatgtg aggaggacga agaattcacc 180 tgcagggcat tccaatatca cagtaaagag caacaatgtg tgataatggc tgaaaacagg 240 aagtcctcca taatcattag gatgagagat gtagttttat ttgaaaagaa agtgtatctc 300 tcagagtgca agactgggaa tggaaagaac tacagaggga cgatgtccaa aacaaaaaat 360 ggcatcacct gtcaaaaatg gagttccact tctccccaca gacctagatt ctcacctgct 420 acacacccct cagagggact ggaggagaac tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480 gggccctggt gctatactac tgatccagaa aagagatatg actactgcga cattcttgag 540 tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600 atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660 ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720 ctgcggcctt ggtgtttcac caccgacccc aacaagcgct gggaactttg cgacatcccc 780 cgctgcacaa cacctccacc atcttctggt cccacctacc agtgtctgaa gggaacaggt 840 gaaaactatc gcgggaatgt ggctgttacc gtttccgggc acacctgtca gcactggagt 900 gcacagaccc ctcacacaca taacaggaca ccagaaaact tcccctgcaa aaatttggat 960 gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020 caagtgcggt gggagtactg taagataccg tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080 caattggctc ccacagcacc acctgagcta acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140 gatggacaga gctaccgagg cacatcctcc accaccacca caggaaagaa gtgtcagtct 1200 tggtcatcta tgacaccaca ccggcaccag aagaccccag aaaactaccc aaatgctggc 1260 ctgacaatga actactgcag gaatccagat gccgataaag gcccctggtg ttttaccaca 1320 gaccccagcg tcaggtggga gtactgcaac ctgaaaaaat gctcaggaac agaagcgagt 1380 gttgtagcac ctccgcctgt tgtcctgctt ccagatgtag agactccttc cgaagaagac 1440 tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 1500 ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 1560 aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 1620 ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 1680 gcggcccctt catttgattg tgggaagcct caagtggagc cgaagaaatg tcctggaagg 1740 gttgtggggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 1800 aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 1860 gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920 caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980 cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040 gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100 atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160 ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220 tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280 ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340 ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400 acttggattg agggagtgat gagaaataat ta 2432 <210> 4 <211> 810 <212> PRT <213> Homo sapien <220> <221> PEPTIDE <222> (0)...(0) <223> Human plasminogen <400> 4 Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser 1 5 10 15 Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu 35 40 45 Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe 50 55 60 Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg 65 70 75 80 Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys 85 90 95 Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg 100 105 110 Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser 115 120 125 Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser 130 135 140 Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln 145 150 155 160 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 165 170 175 Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn 180 185 190 Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala 195 200 205 Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe 210 215 220 Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu 225 230 235 240 Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu 245 250 255 Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr 260 265 270 Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala 275 280 285 Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro 290 295 300 His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp 305 310 315 320 Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His 325 330 335 Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys 340 345 350 Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro 355 360 365 Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser 370 375 380 Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser 385 390 395 400 Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr 405 410 415 Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp 420 425 430 Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr 435 440 445 Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro 450 455 460 Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp 465 470 475 480 Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr 485 490 495 Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg 500 505 510 His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys 515 520 525 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr 530 535 540 Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys 545 550 555 560 Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys 565 570 575 Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp 580 585 590 Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly 595 600 605 Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu 610 615 620 Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His 625 630 635 640 Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg 645 650 655 Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser 660 665 670 Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser 675 680 685 Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp 690 695 700 Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln 705 710 715 720 Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn 725 730 735 Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly 740 745 750 Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu 755 760 765 Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys 770 775 780 Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val 785 790 795 800 Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 805 810 <210> 5 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kringle domain 1 of native human plasmin(ogen) <400> 5 Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr 1 5 10 15 Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg 20 25 30 Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 50 55 60 Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys 65 70 75 <210> 6 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kringle domain 2 of native human plasmin(ogen) <400> 6 Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala 20 25 30 His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr 50 55 60 Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys 65 70 75 <210> 7 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kringle domain 3 of native human plasmin(ogen) <400> 7 Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr 1 5 10 15 Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr 20 25 30 His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr 50 55 60 Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys 65 70 75 <210> 8 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kringle domain 4 of native human plasmin(ogen) <400> 8 Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg 20 25 30 His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr 50 55 60 Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys 65 70 75 <210> 9 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kringle domain 5 of native human plasmin(ogen) <400> 9 Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg 20 25 30 His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys 35 40 45 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr 50 55 60 Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys 65 70 75 80

Claims (22)

  1. 천연(native) 인간 플라스미노겐의 크린글(kringle) 1 도메인과 상동성이고, 천연 인간 플라스미노겐과 상동성인 세린 프로테아제 도메인의 C-말단 활성화 부위에 직접 결합된 것인 단일 N-말단 크린글 도메인을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서; 상기 코딩된 폴리펩티드는 고정화된 라이신에 결합하고, 플라스미노겐 활성화제(plasminogen activator)에 의해 활성화될 수 있는 것인 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 크린글 도메인은 서열번호 2의 7번 내지 81번 잔기에 90% 이상 동일하고, 상기 코딩된 폴리펩티드의 C-말단 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인은 서열번호 2의 86번 내지 335번 잔기에 90% 이상 동일한 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 크린글 도메인은 서열번호 2의 7번 내지 81번 잔기에 95% 이상 동일하고, 상기 코딩된 폴리펩티드의 C-말단 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인은 서열번호 2의 86번 내지 335번 잔기에 95% 이상 동일한 것인 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 크린글 도메인은 서열번호 2의 7번 내지 81번 잔기에 98% 이상 동일하고, 상기 코딩된 폴리펩티드의 C-말단 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인은 서열번호 2의 86번 내지 335번 잔기에 98% 이상 동일한 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 코딩된 폴리펩티드는 서열번호 2에 기재된 서열인 것인 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 기재된 서열이거나, 또는 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열을 코딩하는, 서열번호 1의 축퇴(degenerate) 변이체인 것인 폴리뉴클레오티드.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 코딩된 폴리펩티드는 α2-항플라스민에 의한 미니-플라스민(mini-plasmin)의 섬유소용해 활성의 저해 속도보다 5배 이상 더 빠른 저해 속도로 α2-항플라스민에 의해 저해되는 섬유소용해 활성을 나타내는 것인 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 코딩된 폴리펩티드는 α2-항플라스민에 의한 미니-플라스민의 섬유소용해 활성의 저해 속도보다 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상 또는 40배 이상 더 빠른 α2-항플라스민에 의한 섬유소용해 활성의 저해 속도를 보이는 것인 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 고정화된 라이신은 라이신-아가로스, 라이신-히드로겔 및 라이신-가교(lysine-cross-linked) 아가로스로 이루어진 군으로부터 선택된 고체 지지체 매트릭스에 결합된 라이신인 것인 폴리뉴클레오티드.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 고정화된 라이신은 라이신-가교 아가로스인 것인 폴리뉴클레오티드.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 코딩된 폴리펩티드는 미니-플라스민의 피브리노겐에 대한 결합 친화성보다 피브리노겐에 대한 더 낮은 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리뉴클레오티드.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 코딩된 폴리펩티드는 미니-플라스민의 피브린에 대한 결합 친화성보다 피브린에 대한 더 높은 결합 친화성을 나타내는 것인 폴리뉴클레오티드.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제 1 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  21. 제 20 항의 발현 벡터를 포함하는 배양된 세포.
  22. 제 21 항의 세포에서 제1항의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는, 코딩된 폴리펩티드를 제조하는 방법.
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