ES2349555T3 - Plasmina modificada recombinántemente. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene un único dominio en rosquilla del extremo N que es idéntico al menos el 90% al dominio en rosquilla 1 de plasminógeno humano nativo; y un dominio del extremo C que es idéntico al menos el 90% al sitio de activación y al dominio de serina proteasa de plasminógeno humano, polipéptido que se une a lisina inmovilizada y puede activarse por un activador de plasminógeno.

Description

Antecedentes de la invención

El plasminógeno humano es una proteína de una sola cadena que contiene 791 restos de aminoácidos. La activación de plasminógeno a plasmina es el resultado de una escisión única del enlace peptídico Arg561-Va1562 en el cimógeno. La molécula de plasmina resultante es una serina proteasa de dos cadenas ligada por disulfuro con especificidad similar a tripsina (después escinde Lys y Arg).

La cadena pesada del extremo amino de plasmina (restos 1-561, ∼60 kDa) está compuesta por cinco dominios en rosquilla (kringle), conteniendo cada uno aproximadamente 80 restos de aminoácidos. Los dominios en rosquilla son responsables de las propiedades reguladoras del plasminógeno tales como interacción con inhibidores de la activación, por ejemplo, iones Cl-1; con estimuladores de la activación, por ejemplo, ácido ε-aminocaproico; con células de mamífero y bacterianas; y con otras proteínas tales como el sustrato fisiológico de plasmina fibrina y el inhibidor de plasmina α2-antiplasmina. De las cinco rosquillas, la rosquilla 1 es una de las más multifuncionales: se ha demostrado que su actividad de unión a lisina es responsable de la interacción de plasmina con α2-antiplasmina y fibrina. Véanse Wiman, B. y col., Biochim. Biophys. Acta 579:142-154 (1979); y Lucas, M.A. y col., J. Biol. Chem. 258:4249-4256 (1983).

La cadena ligera del extremo C de plasmina (restos 562-791, ~251 Da) es una serina proteasa típica, homóloga a tripsina y que contiene la triada clásica de la serina proteasa catalítica: His603, Asp646 y Ser741. El plasminógeno contiene 24 puentes disulfuro y 2 sitios de glicosilación en Asn289 y Thr346.

Se ha demostrado que la proteólisis limitada del plasminógeno por elastasa da como resultado tres fragmentos (Sottrup-Jensen, L. y col., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3:191-209 (1978)). El primer fragmento, K1-3, incluye las tres primeras rosquillas y puede aislarse en dos versiones, Tyr79-Val338 y Tyr79-Val354. El segundo fragmento, K4, se corresponde con la cuarta rosquilla e incluye los restos Val355-Ala440. El último, el fragmento del extremo C (el llamado mini-plasminógeno) incluye los restos Val443-Asn791 y está constituido por la quinta rosquilla y el dominio de serina proteasa. El mini-plasminógeno puede activarse de la misma forma que el plasminógeno, formando mini-plasmina.

Debido a la compleja estructura de la molécula de plasminógeno de longitud completa, los sistemas de expresión bacteriana no se han demostrado útiles en la producción de plasminógeno recombinante. El plasminógeno se produce en forma de cuerpos de inclusión insolubles y no puede replegarse de ese estado. Además, la expresión de plasminógeno en células de mamífero se complica por la activación intracelular de plasminógeno en plasmina y la citotoxicidad resultante. La producción de plasminógeno completamente activo usando células de insecto es posible, sin embargo, este sistema no es adecuado para la producción a gran escala debido al bajo rendimiento.

Por consiguiente, se desea una proteína recombinante modificada que posea las características deseables de plasmina/plasminógeno a la vez que carezca de ciertas características negativas y que sea capaz de producir células bacterianas en cantidades sustanciales. Resumen de la invención

La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se define en la reivindicación 1 ó 2.

En algunas realizaciones, el polipéptido codificado es idéntico en al menos el 90%, el 95%

o el 98% a la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2. Además, el polipéptido codificado puede ser la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2. La secuencia de nucleótidos del polinucleótido puede ser la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 1 o variaciones degeneradas de la misma. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos codificados por el polinucleótido como se definen anteriormente.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden presentar una actividad fibrinolítica que es inhibida por α2-antiplasmina a una tasa que es al menos aproximadamente 5 veces más rápida que la tasa de inhibición de la actividad fibrinolítica de mini-plasmina por α2-antiplasmina. La tasa de inhibición por α2-antiplasmina también puede ser al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces o 40 veces más rápida que la tasa de inhibición de mini-plasmina.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden unirse a lisina inmovilizada. La lisina inmovilizada puede ser lisina unida a una matriz de soporte sólido seleccionada del grupo que está constituido por lisina-agarosa, lisina-BIOGEL (BioRad, Hercules, CA), lisina-HYPERD (Pall Life Sciences, East Hills, NY, un hidrogel de lisina), lisina-SEPHAROSE (SEPHAROSE es agarosa reticulada). La lisina inmovilizada puede ser lisina-SEPHAROSE.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden presentar una menor afinidad de unión por el fibrinógeno que la afinidad de unión por el fibrinógeno de mini-plasmina.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden presentar mayor afinidad de unión por fibrina parcialmente escindida que la afinidad de unión por fibrina parcialmente escindida de miniplasmina.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden tener la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID Nº: 2 y sustituciones conservativas de la misma. Los polipéptidos pueden tener un residuo en una posición relativa análoga a la de la posición 76 de la secuencia de

aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2 que es arginina.

En otro aspecto, la invención incluye vectores que comprenden los polinucleótidos de la invención, y células huésped cultivadas que comprenden los vectores. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática de plasmina nativa después de la activación por escisión proteolítica. K1-K5 son regiones en rosquilla 1-5; y SP es el dominio de serina proteasa. “α2-AP” es el sitio de unión a α2-antiplasmina en la rosquilla 1.

La Figura 2 es una representación esquemática de un mutante de deleción de plasminógeno de la invención usando la misma nomenclatura que en la Figura 1 y mostrando la deleción de K2-5.

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de plasminógeno humano, mostrando la secuencia conductora de 19 restos numerada como -19 a -1 y la secuencia de plasminógeno mostrada como restos 1-791 (véase SEC ID Nº: 3 (secuencia de ADNc para plasminógeno humano; y SEC ID Nº: 4, la secuencia de aminoácidos codificada, como se muestra en la Figura 3). Se muestran varias características que incluyen las siguientes: la secuencia de deltaplasminógeno (sombreada); dominios en rosquilla 1-5 (con subrayado doble); sitios de glicosilación Asn289 y Thr346 (en negrita); el sitio de activación de Arg-Val de la activación de plasminógeno (en negrita); y sitios de unión a lisina en la rosquilla 1 (subrayados y con numeración de la posición específica).

La Figura 4 muestra comparaciones de secuencias de polipéptidos entre los cinco dominios en rosquilla (1-5) de plasmina (plasminógeno) humana(o) nativa(o). Los restos de aminoácidos que son idénticos a los de la misma posición relativa en la rosquilla 1 se muestran subrayados.

La Figura 5 muestra una SDS-PAGE del 8-25% de gradiente de una preparación de deltaplasminógeno sin reducir (Carril 1) y reducida (Carril 2). La activación de delta-plasminógeno en delta-plasmina con estreptocinasa (Carril 3), activador tisular del plasminógeno (tPA) (Carril 4) y urocinasa (Carril 5) da como resultado la formación de la molécula de dos cadenas constituida por la rosquilla 1 (K1) y el dominio de serina proteasa (SP) conectado por dos puentes disulfuro.

La Figura 6 es una representación gráfica de la activación de delta-plasminógeno por urocinasa. La urocinasa (5,8 nM) se añadió a una disolución de delta-plasminógeno 5 µM en PBS que contenía S-2251 1,0 mM a 37ºC. Los aumentos en la absorbancia se vigilaron a 405 nm.

La Figura 7 es un cromatograma que muestra la unión de delta-plasminógeno a lisina-SEPHAROSE 4B: se aplicaron 0,5 mg de delta-plasminógeno purificado sobre la columna de lisina-SEPHAROSE 4B (1x3 cm) equilibrada con solución salina tamponada con Tris, pH 7,4. La proteína unida se eluyó de la columna por un gradiente 0-20 mM de ácido ε-aminocaproico (εACA) como un único pico. En la gráfica se presentan la absorbancia a 280 nm y la concentración de ε-ACA en función del volumen de eluyente.

La Figura 8 muestra la unión de delta-plasminógeno a fibrina. Se incubaron concentraciones variables de delta-plasminógeno con coágulos de fibrina en una placa de microvaloración durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, los coágulos se lavaron exhaustivamente con PBS y a cada pocillo se añadió una disolución 0,1 mg/ml de tPA. Después de una incubación de 2 horas a 37ºC, el líquido se eliminó y los coágulos sólidos restantes se reconstituyeron con 100 µl de NaOH 1 M. La cantidad de fibrina restante se cuantificó midiendo la absorbancia a 280 nm de estos coágulos reconstituidos. El grado de fibrinólisis, que es un resultado de la unión de delta-plasminógeno a fibrina, se representó en la gráfica como una función de la concentración de delta-plasminógeno (línea continua). La línea discontinua representa el ajuste óptimo de los datos experimentales a una ecuación de unión.

La Figura 9 muestra una SDS-PAGE del 8-25% de gradiente de delta-plasminógeno de partida bajo condiciones no reducidas (Carril 1) y reducidas (Carril 2) y la preparación de deltaplasmina final, también bajo condiciones no reducidas (Carril 3) y reducidas (Carril 4).

La Figura 10 muestra diagramas esquemáticos de plasmina, mini-plasmina, microplasmina y delta-plasmina, junto con una caracterización correspondiente de la actividad enzimática (kcat y KM con respecto a sustrato S-2251 (D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilida, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH)).

La Figura 11 es una representación gráfica de lisis inducida por delta-plasmina de coágulos extraídos de sangre completa. Cada coágulo (0,8x7 cm) se inyectó con un volumen de 1 ml de vehículo (solución salina acidificada, pH 3,6), plasmina (1,0 mg/ml) o delta-plasmina (0,44 mg/ml) y se dejó que la disolución de coágulos se realizara a 37ºC durante 1 hora. Descripción de la invención

Con el fin de proporcionar una única molécula no glicosilada que tenga las propiedades de unión a fibrina y antiplasmina de plasmina de longitud completa, la presente invención proporciona un mutante de deleción de plasminógeno. En este mutante, denominado en este documento deltaplasminógeno, al menos una parte de la secuencia nativa de aminoácidos se deleciona entre un dominio homólogo a la rosquilla 1 y el sitio de activación. En un aspecto, el dominio homólogo al dominio en rosquilla 1 nativo de plasminógeno humano puede unirse directamente a la porción de serina proteasa de plasminógeno, o un homólogo, análogo funcional del mismo, con sustancialmente sólo la secuencia nativa interviniente que contiene el sitio de activación de plasminógeno que queda entre los dominios.

La delta-plasmina (el delta-plasminógeno) según la presente invención puede caracterizarse por: el peso molecular más bajo (37,198 Da) de la delta-plasmina puede dar como resultado un aumento de la actividad específica (por mg de proteína); la falta de al menos dos sitios de glicosilación encontrados en la proteína nativa (véase la Figura 3), combinada con el peso molecular relativamente bajo, pueden facilitar la producción recombinante de esta proteína usando sistemas de expresión bacterianos y de levadura relativamente económicos; el deltaplasminógeno puede activarse por activadores de plasminógeno tPA, urocinasa y estreptocinasa; la presencia del dominio homólogo a la rosquilla 1 nativo conserva las propiedades de unión a fibrina de plasmina que puede ser importante para la eficacia trombolítica; la presencia de sitios de unión a α2-antiplasmina en el dominio homólogo a la rosquilla 1 puede permitir que la deltaplasmina sea rápidamente inhibida por este inhibidor fisiológico de plasmina (una característica que puede evitar hemorragia); el tamaño más pequeño de delta-plasmina puede facilitar su inhibición por α2-macroglobulina, disminuyendo adicionalmente el riesgo de complicaciones hemorrágicas con respecto a la plasmina nativa. En realizaciones particulares, la ausencia de la rosquilla 5, que conserva el sitio de unión primario para fibrina (fibrinógeno) sin digerir intacta(o) puede permitir el uso de delta-plasmina con disminución reducida del fibrinógeno en circulación.

Generalmente, la invención proporciona moléculas de plasmina (plasminógeno) recombinantes que tienen un único extremo N de la región en rosquilla para el sitio de activación y el dominio de serina proteasa, teniendo ciertas ventajas con respecto a mini-plasmina (plasminógeno). Aunque los polipéptidos de delta-plasminógeno de la invención sólo tienen una región en rosquilla, tal como el extremo N con respecto al sitio de activación, algunas realizaciones incluyen secuencias adicionales del extremo N con respecto al sitio de activación. Las secuencias del extremo N adicionales pueden derivarse de aquellas de regiones en rosquilla nativas de plasminógeno.

Los dominios en rosquilla del extremo N de la presente invención incluyen secuencias en rosquilla de la rosquilla 1 de plasmina (plasminógeno) nativa(o) y equivalentes funcionales de las mismas. En particular, véase más adelante la discusión que facilita orientación con respecto a la preservación de la función en variantes de polipéptidos que incluyen la preservación de restos que participan en o influyen en la unión a lisina. Definiciones

Los términos “dominio” y “región” de un polipéptido son generalmente sinónimos como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario. Si se enumeran junto con designaciones estructurales o funcionales bien reconocidas tales como “rosquilla” o “serina proteasa,” etc., tales términos presentarán una característica de polipéptido que se refiere a al menos alguna(s) característica(s) comúnmente reconocida(s) y entendida(s) por estar asociada(s) a las estructuras de polipéptidos correspondientes a tales designaciones.

Una “célula huésped cultivada” como se usa en este documento se refiere a una célula

procariota o eucariota que contiene ADN heterólogo que ha sido introducido en la célula mediante cualquier medio, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección, transformación, infección viral y similares.

“Heterólogo” como se usa en este documento significa “de diferente origen natural” o que representa un estado no natural. Por ejemplo, si una célula huésped cultivada se transforma con un ADN o gen derivado de otro organismo, particularmente de otra especie, ese gen es heterólogo con respecto a esa célula huésped cultivada y también con respecto a descendientes de la célula huésped cultivada que llevan ese gen. De forma similar, “heterólogo” se refiere a una secuencia de nucleótidos derivada de e insertada en el mismo tipo de célula natural original, pero que está presente en un estado no natural, por ejemplo, un número de copias diferente o bajo el control de diferentes elementos reguladores.

Una molécula “vector” es una molécula de ácido nucleico en la que puede insertarse el ácido nucleico heterólogo, que a continuación puede introducirse en una célula huésped cultivada apropiada. Los vectores tienen preferentemente uno o más orígenes de replicación y uno o más sitios en los que puede insertarse el ADN recombinante. Los vectores tienen frecuentemente medios convenientes por los que las células con vectores pueden seleccionarse de aquellas sin vectores, por ejemplo, codifican genes de resistencia a fármacos. Vectores comunes incluyen plásmidos, genomas virales y “cromosomas artificiales” (principalmente en levadura y bacterias).

Como se usa en este documento, el término “secuencia de control de la transcripción” se refiere a secuencias de ácidos nucleicos tales como secuencias iniciadoras, secuencias potenciadoras y secuencias promotoras que inducen, reprimen o controlan de otra forma la transcripción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas a las que están operativamente ligadas.

El término “polipéptido” se usa indistintamente en este documento con los términos “péptido” y “proteína.”

Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan indistintamente en este documento y pueden referirse a cualquier ácido nucleico que contenga la información necesaria para el fin indicado por el contexto. Es decir, el ácido nucleico puede ser ADN o ARN, tanto monocatenario como bicatenario, u otro ácido nucleico, siempre y cuando el polímero pueda representar la información apropiada, por ejemplo, en relación con un péptido codificado, y pueda incluir secuencias complementarias, por ejemplo, cadenas de transcripción y cadenas complementarias de polímeros de ácidos nucleicos.

El término “variante” de un polipéptido se refiere a una secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más aminoácidos. La variante puede tener cambios “conservativos”, teniendo un aminoácido sustituido propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, sustitución de leucina por isoleucina. Alternativamente, una variante puede tener cambios “no conservativos”, por ejemplo, sustitución de una glicina por un triptófano. Una variación menos análoga también puede incluir deleción o inserción de aminoácidos, o ambas. Una forma particular de un polipéptido “variante” es un polipéptido “funcionalmente equivalente”, es decir, un polipéptido que presenta actividad in vivo o in vitro sustancialmente similar a la de los ejemplos del polipéptido de invención como se describe más adelante en más detalle. La orientación en la determinación de qué restos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin eliminar actividad biológica o inmunológica puede encontrarse usando programas informáticos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Además, más adelante se facilita orientación específica que incluye la proporcionada en las referencias citadas.

Los términos “extremo N” y “extremo C” se usan en este documento para designar la posición relativa de cualquier secuencia de aminoácidos o dominio o estructura de polipéptidos a la que se aplican. La posición relativa será evidente del contexto. Es decir, una característica de “extremo N” se localizará al menos más próxima al extremo N de la molécula de polipéptido que otra característica tratada en el mismo contexto (la otra característica posible se denomina en lo sucesivo “extremo C” con respecto a la primera característica). De forma similar, los términos “5'-” y “3'-” pueden usarse en este documento para designar posiciones relativas de características de polinucleótidos.

Los polipéptidos de delta-plasminógeno/plasmina de los que se dice en este documento que tienen un dominio del extremo N “homólogo a un dominio en rosquilla de plasminógeno humano nativo” presentan características estructurales y funcionales similares a dominios en rosquilla nativos de plasminógeno. Además, los polipéptidos de delta-plasminógeno/plasmina denominados en este documento que tienen un dominio del extremo N “homólogo a la rosquilla 1” presentan características similares a la rosquilla nativa, al menos hasta el punto de que los polipéptidos puedan tener una mayor afinidad por ácidos ω-aminocarboxílicos (y homólogos funcionales tales como ácido trans-4-aminometilciclohexano-1-carboxílico, un ácido cíclico) que por la rosquilla 5. Véase, por ejemplo, Chang, Y. y col., Biochemistry 37:3258-3271 (1998), para condiciones y protocolos para comparación de la unión de polipéptidos de dominios en rosquilla aislados a ácido 5-aminopentanoico (5-APnA); ácido 6-aminohexanoico (6-AHxA), también conocido como ácido ε-aminocaproico (ε-ACA); ácido 7-aminoheptanoico (7-AHpA); y ácido trans4-aminometilciclohexano-1-carboxílico (t-AMCHA).

Referencias a dominios en rosquilla “homólogos a la rosquilla 4” se definen de forma similar como se señala anteriormente con respecto a la frase “homólogo a la rosquilla 1”. Es decir, presentan características funcionales similares a la rosquilla 1 de plasminógeno humano nativo como se trata anteriormente. Estos polipéptidos también unen lisina inmovilizada como se

describe anteriormente.

Los polipéptidos de la invención se unen a lisina inmovilizada. Como se usa en este documento, la frase “unión a lisina inmovilizada” significa que los polipéptidos así caracterizados están retrasados en su progreso con respecto a mini-plasminógeno cuando se someten a cromatografía en columna usando lisina-SEPHAROSE como medio cromatográfico. Normalmente, los polipéptidos de la invención pueden eluirse de tales medios cromatográficos (resinas de afinidad por lisina) usando disoluciones que contienen el ligando específico, por ejemplo, ε-ACA, como eluyentes.

Además de Chang y col., anteriormente, aquellos expertos en la materia pueden consultar otras referencias para determinar qué restos pueden variarse por sustitución conservativa o no conservativa, deleción o adición para dar un mutante de deleción dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, las siguientes referencias proporcionan información respecto a restos particulares de los dominios en rosquilla nativos que pueden ser importantes para la unión de ácidos ω-aminocarboxílicos: patente de EE.UU. nº 6.538.103 a Ji y col.; patente de EE.UU. nº

6.218.517 a Suzuki; Douglas, J.T. y col., Biochemistry 41(10):3302-10 (2002); Zajicek, J. y col., J. Mol. Biol., 301(2):333-47 (2000); Lee, H. y col., Arch Biochem Biophys., 375(2):359-63 (2000); Castellino, F. y S. McCance, Ciba Found Symp. 212:46-60 (1997); McCance, S. y col., J. Biol. Chem., 269:32405-32410 (1994); Rejante, M.R. y M. Llinas, Eur. J. Biochem., 221(3):939-49 (1994); Wu, T.P. y col., Blood Coagul. Fibrinolysis, 5(2):157-66 (1994); Hoover, C.J. y col., Biochemistry, 32(41):10936-43 (1993); Menhart, N. y col., Biochemistry, 32:8799-8806 (1993); Thewes, T. y col., J. Biol. Chem., 265 (7):3906-3915 (1990); Novokhatny, V. y col., Thromb Res., 53(3):243-52 (1989); Motta, A. y col., Biochemistry, 26(13):3827-36 (1987); Novokhatny, V. y col.,

J. Mol. Biol., 179:215-232 (1984); Lerch, P.G. y col., Eur. J. Biochem., 107(1):7-13 (1980); Sottrup-Jensen, L. y col., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3:191-209 (1978); y Wiman, B. y D. Collen, Nature 272, 549-545 (1978).

Debido a que los presentes inventores han reconocido que puede prepararse una molécula de plasmina (plasminógeno) simplificada valiosa que tiene un dominio en rosquilla del extremo N que tiene características funcionales ventajosas (que pueden evaluarse, en parte, probando la unión a lisina inmovilizada como se describe en este documento), la solicitud describe otros dominios de unión a fibrina o regiones del extremo N con respecto al sitio de activación. Por ejemplo, la solicitud describe polipéptidos en los que el dominio de serina proteasa de plasmina está unido a una rosquilla de unión a fibrina seleccionada de un grupo que incluye, pero no se limita a, rosquilla 4 de plasminógeno humano, rosquilla 2 de tPA o una rosquilla de apolipoproteína (a). Además, la solicitud describe polipéptidos en los que un dominio de serina proteasa de plasmina está unido a cualquier otro módulo de unión a fibrina conocido tal como el dominio

“finger” de tPA o fibronectina, o el fragmento FAB de IgG específica de fibrina.

En realizaciones particulares, restos en ciertas posiciones del dominio en rosquilla del extremo N de delta-plasminógeno están conservados con respecto a la rosquilla 1 de plasminógeno humano nativo. Éstos pueden ser restos en posiciones asociadas a unión a lisina e incluyen Pro136-Pro140, Pro143-Tyr146 y Arg153-Tyr156 (posiciones numeradas como se muestra en la Figura 3). Algunas realizaciones del delta-plasminógeno de la invención pueden tener Arg en la posición 153. En otras realizaciones, las posiciones específicas de los restos mencionados pueden variar algo, a la vez que todavía están presentes en el polipéptido en posiciones estructuralmente y funcionalmente análogas (es decir, con respecto a la estructura en rosquilla del dominio del extremo N; véase Chang, Y. y col. como se trata anteriormente).

Adicionalmente, realizaciones particulares de la invención pueden caracterizarse funcionalmente a diferencia de mini-plasmina (plasminógeno) que tiene una composición de dominio similar, es decir, serina proteasa en rosquilla (K-SP) (véase Sottrup-Jensen, L. y col., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, vol. 3, (Eds: J. F. Davidson y col.) Raven Press, Nueva York (1978)). En realizaciones preferidas, la delta-plasmina de la invención presenta una tasa aumentada de inhibición por α2-antiplasmina, por ejemplo, nada menos que aproximadamente uno o dos órdenes de magnitud más rápida que la tasa de inhibición de miniplasmina. Además, en realizaciones particulares, la delta-plasmina se une a lisina inmovilizada (por ejemplo, lisina-SEPHAROSE).

La caracterización del dominio en rosquilla de delta-plasminógeno como “extremo N” sólo significa que el dominio está presente en el extremo N con respecto al sitio de activación y no significa que no estén presentes restos de aminoácidos adicionales del extremo N con respecto al propio dominio. Además, el número y la identidad de restos interpuestos entre el dominio homólogo a la rosquilla 1 y el sitio de activación de plasminógeno pueden variarse sin apartarse del alcance de la presente invención. Un experto en la materia podrá determinar estas variaciones que consiguen los beneficios de la invención (unión similar a la rosquilla 1 de ácidos ωaminocarboxílicos, sin aumento sustancial en el tamaño del mutante de deleción o introducción de sitios de glicosilación posiblemente problemáticos) sin experimentación adicional basándose en la divulgación en este documento y las referencias citadas en este documento para orientación con respecto a la función y estructura de la rosquilla 1.

Por consiguiente, la invención se refiere a polinucleótidos, polipéptidos, procedimientos recombinantes para producir los polipéptidos, vectores que contienen los polinucleótidos, sistemas de expresión para producir los polipéptidos y células huésped cultivadas que comprenden tales sistemas de expresión.

Como se ha apuntado en un aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que

codifica el polipéptido desvelado en este documento o un polipéptido que tiene sustituciones conservativas de aminoácidos del mismo. La orientación respecto a la selección de sustituciones “conservativas” de aminoácidos se proporciona más abajo en más detalle. En una realización, el polinucleótido es ADN.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de un vector que comprende insertar el polinucleótido de la invención en un vector. En otro aspecto, la invención se refiere a un vector producido mediante el procedimiento de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de una célula huésped cultivada que comprende introducir el vector de la invención en una célula huésped cultivada. En otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped cultivada producida mediante el procedimiento de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado de la invención producido mediante un procedimiento que comprende: (a) introducir un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido en una célula huésped cultivada; (b) cultivar la célula huésped; y (c) recuperar el polipéptido. En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir un polipéptido que comprende: (a) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones tales que se exprese el vector; y (b) recuperar el polipéptido.

En otro aspecto, la invención se refiere a células que contienen al menos un polinucleótido de la invención.

En una realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEC ID Nº: 1. En otra realización, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID Nº: 2. Polinucleótidos

Los polinucleótidos de la invención incluyen variantes que tienen sustituciones, deleciones y/o adiciones que pueden implicar a uno o más nucleótidos. Las variantes pueden alterarse en regiones codificantes, regiones no codificantes, o ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos, deleciones o adiciones. Especialmente preferidos entre éstas son sustituciones silenciosas, adiciones y deleciones, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína de deltaplasmina (plasminógeno) o porciones de la misma. A este respecto también se prefieren especialmente sustituciones conservativas (véase más adelante).

Otras realizaciones de la invención incluyen moléculas de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica al menos el 90%, y más preferentemente idéntica al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de delta-plasminógeno que tiene la secuencia de aminoácidos completa en SEC ID Nº: 2; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de delta-plasminógeno que tiene la secuencia de aminoácidos en SEC ID Nº: 2; y (c) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en

(a) o (b) anteriores.

Por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos “idéntica” al menos, por ejemplo, el 95% a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido de deltaplasminógeno se indica que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido de delta-plasminógeno. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica al menos el 95% a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o varios nucleótidos, hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones de los extremos 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones de los extremos intercaladas tanto individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como se ha señalado anteriormente, dos o más secuencias de polinucleótidos pueden compararse determinando su identidad en porcentaje. Asimismo, dos o más secuencias de aminoácidos pueden compararse determinando su identidad en porcentaje. La identidad en porcentaje de dos secuencias, tanto secuencias de ácidos nucleicos como de péptidos, se describe generalmente como el número de apareamientos exactos entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. Un alineamiento aproximado para secuencias de ácidos nucleicos se proporciona por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo puede extenderse al uso con secuencias de péptidos usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE.UU., y normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Una implementación de este algoritmo para secuencias de ácidos nucleicos y péptidos se proporciona por Genetics Computer Group (Madison, Wis.) en su aplicación de utilidad BESTFIT. Los parámetros por defecto para este procedimiento se describen en Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, versión 8 (1995) (disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wis.).

Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, un experto en la materia

reconocerá inmediatamente que un gran número de las moléculas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia idéntica al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% a la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEC ID Nº: 1 codificará un polipéptido de delta-plasminógeno. En realidad, debido a que todas las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican el mismo polipéptido, esto será evidente para el experto incluso sin realizar ningún ensayo funcional ni mediciones descritas en este documento. Se reconocerá adicionalmente en la técnica que, para tales moléculas de ácidos nucleicos que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido que tiene actividad de polipéptido de delta-plasminógeno. Esto es debido a que el experto es completamente consciente de sustituciones de aminoácidos que son o menos probables o no probables para efectuar significativamente la función de proteínas (por ejemplo, sustitución de un aminoácido alifático por un segundo aminoácido alifático).

Recientemente, los avances en la producción sintética de secuencias de polinucleótidos más largas han permitido la producción sintética de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos significativamente más largos sin el uso de técnicas de clonación tradicionales. Los proveedores comerciales de tales servicios incluyen Blue Heron, Inc., Bothell, WA (http://www.blueheronbio.com). La tecnología utilizada por Blue Heron, Inc. se describe en las patentes de EE.UU. nº 6.664.112; 6.623.928; 6.613.508; 6.444.422; 6.312.893; 4.652.639; solicitudes de patentes publicadas nº 20020119456A1; 20020077471A1; y solicitudes de patentes internacionales publicadas (publicaciones nº) WO03054232A3; WO0194366A1; WO9727331A2; y WO9905322A1.

Por supuesto, las técnicas tradicionales de biología molecular, microbiología y ácido nucleico recombinante también pueden usarse para producir los polinucleótidos de la invención. Estas técnicas son muy conocidas y se explican en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, ed., vol. I, II y III (1997); Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); DNA Cloning: A Practical Approach, D. N. Glover, ed., Vols. I y II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M.

L. Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames y Higgins, eds. (1985); Transcription and Translation, Hames y Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”; las series Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller y M. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); y Methods in Enzymology, Wu y Grossman y Wu, eds., respectivamente, vol. 154 y 155.

Vectores y células huésped cultivadas

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen las moléculas de ácidos

nucleicos aisladas de la presente invención, células huésped cultivadas que están manipuladas genéticamente con los vectores recombinantes y la producción de los polipéptidos de deltaplasmina (plasminógeno) por técnicas recombinantes.

Los constructos recombinantes pueden introducirse en células huésped cultivadas usando técnicas muy conocidas tales como infección, transducción, transfección, transvección, electroporación y transformación. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral

o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser de replicación competente o de replicación defectuosa. En este último caso, la propagación viral sólo se producirá generalmente en células huésped cultivadas complementarias.

Los polinucleótidos pueden unirse a un vector que contiene un marcador de selección para la propagación en un huésped cultivado. Generalmente, un vector de plásmido se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede encapsidarse in vitro usando una línea celular de encapsidación apropiada y luego transducirse en células huésped cultivadas.

Se prefieren vectores que comprendan regiones de control que actúan en cis al polinucleótido de interés. Factores que actúan en trans apropiados pueden suministrarse por el huésped cultivado, suministrarse por el vector complementario o suministrarse por el propio vector tras la introducción en el huésped cultivado.

En ciertas realizaciones a este respecto, los vectores proporcionan expresión específica que puede ser inducible y/o específica del tipo de célula. Entre tales vectores se prefieren particularmente aquellos inducibles por factores medioambientales que son fáciles de manipular tales como la temperatura y aditivos nutritivos.

Los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episomas de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus de la variolovacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus y retrovirus de la seudorrabia, y vectores derivados de combinaciones de los mismos tales como cósmidos y fagémidos.

Los insertos de ADN deben estar operativamente ligados a un promotor apropiado tal como el promotor del fago lambda PL, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardíos de SV40 y los promotores de LTR retrovirales, por nombrar algunos. Otros promotores adecuados serán conocidos para el experto. Los constructos de expresión contendrán adicionalmente sitios para la iniciación, terminación de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluirán preferentemente un codón de iniciación de la traducción al principio y uno de terminación (UAA, UGA o UAG) apropiadamente posicionado al final del polipéptido que va a traducirse.

Como se indica, los vectores de expresión incluirán preferentemente al menos un marcador de selección. Tales marcadores incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa o a neomicina para cultivo de células eucariotas y genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de huéspedes cultivados apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas tales como células de levadura; células de insecto tales como células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células de animal tales como células CHO, COS y de melanoma de Bowes; y células vegetales. En la técnica se conocen medios y condiciones de cultivo apropiados para las células huésped cultivadas anteriormente descritas.

Entre los vectores preferidos para uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de Qiagen Inc., Valencia, CA; vectores pBS, vectores PHAGESCRIPT, vectores BLUESCRIPT, pNH8A, pNHl6a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene, LaJolla, CA; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia (ahora Pfizer, Inc., Nueva York, NY). Entre los vectores eucariotas preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán rápidamente evidentes para el experto.

Los promotores bacterianos adecuados para uso en la presente invención incluyen los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores PR y PL lambda y el promotor trp. Los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor temprano intermedio de CMV, el promotor de la timidina cinasa HSV, los promotores tempranos y tardíos de SV40, los promotores de LTR retrovirales tales como aquellos del virus del sarcoma de Rous (RSV) y promotores de metalotioneína tales como el promotor I de metalotioneína de ratón.

La introducción de un constructo de vector en la célula huésped cultivada puede efectuarse por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos. Tales procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar tales como Davis y col., Basic Methods In Molecular Biology, 2ª edición (1995).

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, normalmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan para aumentar la actividad de transcripción de un promotor en un tipo de célula huésped cultivada dada. Ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador SV40, que se localiza en el lado temprano del origen de replicación a 100 a 270 pb, el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus.

Para la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido puede expresarse en una forma modificada tal como una proteína de fusión y puede incluir no sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede añadirse al extremo N del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped cultivada durante la purificación o durante la posterior manipulación y almacenamiento. Por tanto, pueden añadirse restos de péptidos al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones pueden eliminarse antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos de péptidos a polipéptidos para engendrar la secreción o excreción, mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otros, son técnicas familiares y rutinarias en la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas. Por ejemplo, el documento EP 0 464 533 A1 (equivalente canadiense, 2.045.869) desvela proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es perfectamente ventajosa para uso en terapia y diagnóstico y, por tanto, da como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas. Por otra parte, para algunos usos sería deseable poder delecionar la parte Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado en el modo ventajoso descrito. Este es el caso en el que la porción Fc demuestra ser un impedimento para usar en terapia y diagnóstico, por ejemplo, cuando la proteína de fusión va a usarse como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, las proteínas humanas se han fusionado a porciones Fc con el fin de ensayos de selección de alto rendimiento (tales como el receptor ML5 para identificar antagonistas de hIL-5). Véanse, Bennett, D. y col., J. Molecular Recognition, 8:52-58(1995) y Johanson, K. y col., J. Biol. Chem., 270(16):9459-9471 (1995).

La proteína de delta-plasminógeno puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante procedimientos muy conocidos que incluyen aquellos específicamente descritos en los ejemplos en este documento. Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped cultivado procariota o eucariota que incluye, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procedimientos mediados por huéspedes.

Polipéptidos

Los polinucleótidos de la invención incluyen aquellos que codifican variaciones y ejemplos particulares de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, la orientación referente a cómo preparar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosos se proporciona en Bowie, J. U. y col., “Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions”, Science 247:1306-1310 (1990), en el que los autores indican que las proteínas son sorprendentemente tolerantes con sustituciones de aminoácidos. Aunque dentro del alcance de la invención puede obtenerse cualquier número de sustituciones mediante aplicación de tales principios generales, para la orientación específica con respecto a las sustituciones, un experto en la materia puede consultar las referencias citadas en este documento con respecto a la estructura y función de dominios en rosquilla 1.

Se apreciará adicionalmente que, dependiendo de los criterios usados, la “posición” exacta de la rosquilla 1, el sitio de activación y los dominios de serina proteasa del polipéptido de deltaplasminógeno pueden diferenciarse ligeramente en variaciones particulares dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, la localización exacta del dominio en rosquilla 1 con respecto al sitio de activación puede variar ligeramente y/o la secuencia del extremo N con respecto al dominio en rosquilla 1 puede variar en longitud. Por tanto, la invención incluye tales variaciones del polipéptido de delta-plasminógeno que presentan actividad de polipéptido de deltaplasminógeno como se desvela en este documento. Tales variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones. Como se indica anteriormente, la orientación referente a qué cambios de aminoácidos son probables que sean fenotípicamente silenciosos puede encontrarse en Bowie, J. U. y col., “Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions”, Science 247:1306-1310 (1990).

Por tanto, los fragmentos, derivados o análogos del polipéptido de SEC ID Nº: 2 pueden ser (i) aquellos en los que uno o más de los restos de aminoácidos (por ejemplo, 3, 5, 8, 10, 15 ó 20) están sustituidos con un residuo conservado o no conservado de aminoácido (preferentemente un residuo conservado de aminoácido). Tales restos sustituidos de aminoácidos pueden o pueden no estar codificados por el código genético, o (ii) aquellos en los que uno o más de los restos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente (por ejemplo, 3, 5, 8, 10, 15 ó 20), o

(iii) aquellos en los que el polipéptido maduro está fusionado a otro compuesto tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) aquellos en los que los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro tal como un péptido de la región de fusión de IgG Fc o secuencia conductora o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proteínas. Tales fragmentos, derivados y análogos se consideran que están dentro del alcance de aquellos expertos en la materia de las enseñanzas en este documento.

Como se indica, los cambios son preferentemente de una naturaleza menor, tales como sustituciones conservativas de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento o a la actividad de la proteína. Por supuesto, el número de sustituciones de aminoácidos que haría un experto depende de muchos factores que incluyen aquellos descritos anteriormente. En términos generales, el número de sustituciones para cualquier polipéptido de delta-plasminógeno dado no será superior a 30, 25, 20, 15, 10, 5 ó 3.

Los aminoácidos en el polipéptido de delta-plasminógeno de la presente invención que son esenciales para la función pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis por barrido con alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Este último procedimiento introduce mutaciones individuales de alanina en cada residuo en la molécula. Entonces, las moléculas de mutante resultantes se prueban para la actividad biológica, por ejemplo, como se muestra en los ejemplos proporcionados en este documento. Los sitios que son críticos para la unión de ligando también pueden determinarse mediante análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith y col., J. Mol. Biol. 224:399-904 (1992) y de Vos y col. Science 255:306-312 (1992)). Aunque la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N de una proteína da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, todavía pueden conservarse otras actividades biológicas.

Se contempla también que los polipéptidos útiles en la producción de los “polipéptidos aislados” de la invención puedaen producirse por procedimientos de síntesis en fase sólida. Véanse Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985); y la patente de EE.UU. nº 4.631.211 a Houghten y col. (1986).

Los polipéptidos de la presente invención pueden proporcionarse en una forma aislada. Por “polipéptido aislado” se indica un polipéptido sacado de su entorno nativo. Por tanto, un polipéptido producido y/o contenido dentro de una célula huésped cultivada recombinante se considera aislado para fines de la presente invención. También se indica que un “polipéptido aislado” son polipéptidos que han sido purificados, parcialmente o sustancialmente, a partir de un huésped cultivado recombinante.

Los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de una identidad indicada en porcentaje con respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido de deltaplasminógeno pueden determinarse usando procedimientos que incluyen los procedimientos asistidos por ordenador indicados anteriormente con respecto a polinucleótidos. Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos se examinan y se comparan precisamente como las secuencias de nucleótidos en la discusión anterior. Un experto en la materia reconocerá que conceptos tales como los criterios de valoración moleculares tratados para los polinucleótidos tendrán análogos directos cuando se considera el uso correspondiente de tales procedimientos y programas para el análisis de polipéptidos. Por ejemplo, las correcciones manuales tratadas con respecto a polinucleótidos se refieren a los criterios de valoración de 5' y 3' de ácidos nucleicos, pero se reconocerá que la misma discusión puede aplicarse a extremos N y extremos C de polipéptidos.

La invención engloba polipéptidos de delta-plasminógeno que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Pueden llevarse a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa de V8 de S. aureus, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.

Las modificaciones postraduccionales adicionales englobadas por la invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidratos ligadas a N o ligadas a O, procesamiento de extremos del extremo N o del extremo C, unión de restos químicos al esqueleto de aminoácidos, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos ligadas a N o ligadas a O y adición de un residuo de metionina del extremo N como resultado de vectores y constructos adaptados para la expresión de polipéptidos de delta-plasminógeno en células huésped cultivadas procariotas. Los polipéptidos también pueden modificarse con una marca detectable tal como una marca enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento de la proteína. Composiciones farmacéuticas y procedimientos de tratamiento

La delta-plasmina (plasminógeno) puede formularse para uso terapéutico según los procedimientos y composiciones descritos en el documento US 2003/0012778 A1; y Novokhatny,

V. y col., J. Thromb. Haemost. 1(5):1034-41 (2003). Por ejemplo, para la formulación de deltaplasmina puede usarse un tampón de baja capacidad de tamponamiento de bajo pH (de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4). Adicionalmente, otros procedimientos y formulaciones conocidos para aquellos expertos en la materia, como se ponen en práctica con plasmina, mini-plasmina y/o micro-plasmina, pueden usarse para formular la delta-plasmina de la invención para administración terapéutica.

La delta-plasmina (el plasminógeno) puede usarse para tratar una variedad de

enfermedades o afecciones trombóticas, por ejemplo, según los procedimientos que se describen en la patente de EE.UU. nº 6.355.243; y las solicitudes de patente de EE.UU. publicadas nº US 2003/0026798 A1; US 2003/0175264 A1. De nuevo, al igual que con las posibles formulaciones farmacéuticas aplicables a delta-plasmina, la delta-plasmina también puede administrarse terapéuticamente mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, aquellos que pueden ponerse actualmente en práctica con plasmina, mini-plasmina y/o micro-plasmina.

EJEMPLOS Diseño de vectores de expresión

La secuencia de aminoácidos para el delta-plasminógeno se muestra en SEC ID Nº: 2. Una secuencia putativa que codifica delta-plasminógeno se optimizó mediante codones para la expresión de E. coli y la estabilidad de ARNm para producir la secuencia de ADN como se muestra en SEC ID Nº: 1.

Este ADN se sintetizó químicamente (Blue Heron, Inc.) y se insertó en los sitios NdeI y BamH1 del vector de expresión de E. coli pET22b(+) (Novagen; Madison, WI) con el fin de producir proteína citosólica. Este constructo produce delta-plasminógeno con una metionina del extremo N no nativa adicional. (pET-22b(+) = pET Expression System 22b (nº de cat. 70765), EMD Biosciences, Inc., Novagen Brand, Madison, WI; véase la sección de información de productos en http://www.emdbiosciences.com con respecto a pET-22b para detalles con respecto al vector). Expresión y purificación de delta-plasminógeno

El ADN que codifica la secuencia de delta-plasminógeno se transformó en una variedad de células y la sobreexpresión de proteínas se analizó tras la inducción por IPTG 1 mM (isopropilbeta-D-tiogalactopiranósido) por SDS-PAGE. Las células del tipo celular BL21(DE3) RIL (Stratagene, La Jolla, CA), manipuladas para expresar ARNt de E. coli raros que codifican Arg, Ile y Leu, se usaron para la producción de delta-plasminógeno.

La producción de delta-plasminógeno se confirmó en la expresión a gran escala en la que las células se lisaron y tanto la proteína soluble como los cuerpos de inclusión purificados se examinaron por SDS-PAGE. Las células BL21 (DE3) RIL produjeron proteína de deltaplasminógeno significativa en forma de cuerpos de inclusión. Los cálculos aproximados de expresión fueron 50-80 mg/l de cultivo celular.

Se ha usado el siguiente protocolo típico para la expresión de delta-plasminógeno:

Se usó una única colonia de células BL21(DE3) RIL que contenía el vector de delta

plasminógeno para inocular 5 ml de LB/ampicilina (100 µg/ml)/cloranfenicol (50 µg/ml) y se

incubó durante 8 horas a 37ºC en un agitador. Después de esto se tomó un alícuota de 50 µl

de la suspensión bacteriana cultivada para el crecimiento adicional en medio reciente. El procedimiento se repitió después de 16 horas con 6 ml de cultivo bacteriano y 250 ml del

medio. Los cultivos se cultivaron a 37ºC con agitación hasta una DO600 nm de ~ 1,0, y se

añadió IPTG a una concentración final 1 mM. Los cultivos se cultivaron durante 5 horas

adicionales. Las células se recogieron por centrifugación a 5.000 x g y los sedimentos de

células se disolvieron en Tris 20 mM, pH 8,0, que contenía EDTA 20 mM y se congelaron a

80ºC.

Para purificar el delta-plasminógeno, los sedimentos de células se descongelaron y se añadió tampón hasta que el volumen de disolución fue aproximadamente 1/20 del volumen del cultivo celular original. Después de esto se añadió lisozima a una concentración final de 0,5 mg/ml y las células se agitaron rápidamente a 4ºC durante 10 -15 minutos. Entonces se añadió Triton X100 a una concentración final del 1% y la agitación continuó durante otros 10 min. Se añadieron ADNsa I (0,05 mg/ml) y MgCl2 (2,5 mM) y la agitación continuó a 4ºC durante 30 minutos o hasta que la disolución ya no era viscosa. La disolución final se centrifugó a 4ºC durante 30 min a

15.000 x g y el sobrenadante se desechó.

El sedimento de células se lavó tres veces con disolución de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, que contenía EDTA 10 mM, Triton-X-100 al 1% y urea 0,5 M) y el sedimento final se disolvió en 40 ml de tampón de extracción (PBS, pH 7,4, que contenía EDTA 10 mM, DTT 20 mM y guanidina-HCl 6 M) y se guardó a 4ºC durante la noche. Después de 16 horas, la disolución se centrifugó durante 30 minutos a 15.000 x g para eliminar los sólidos y el sobrenadante se añadió lentamente a la disolución de replegamiento (Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, guanidina-HCl 3,5 M, arginina-HCl 0,5 M, EDTA 10 mM, GSH 3 mM, GSSG 0,3 mM) mientras se agitaba a 4ºC. El procedimiento de replegamiento se llevó a cabo a concentración de proteínas de 0,03 mg/ml o menos.

La disolución de replegamiento se mantuvo durante 2 días a 4ºC sin agitar y luego se dializó contra un volumen de 8 veces de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, que contenía EDTA 10 mM, NaCl 0,15 M, arginina-HCl 0,15 M, durante un periodo de 8-10 horas con cambios frecuentes de la disolución tampón.

Entonces, la disolución de proteínas se quitó de la diálisis y se concentró usando filtros AMICON con el corte de membrana de 10 kDa hasta aproximadamente 10 -20 ml y se dializó durante la noche frente a un volumen de 100 veces de Tris 0,1 M, pH 8,0, que contenía EDTA 10 mM, NaCl 0,15 M. Este material se centrifugó para eliminar partículas, luego se pasó sobre resina de afinidad por lisina (lisina-SEPHAROSE 4B; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). El deltaplasminógeno se eluyó de la resina usando solución salina tamponada con Tris, pH 8,0, que contenía ácido epsilon-aminocaproico 0,2 M (ε-ACA).

Normalmente pudieron aislarse 80 mg de cuerpos de inclusión de 1 litro de cultivo celular y

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pudieron eluirse 40 mg en la etapa de cromatografía con lisina-SEPHAROSE.

Propiedades del delta-plasminógeno

El delta-plasminógeno purificado apareció como una única banda en la región de 35-40 kDa mediante análisis de SDS-PAGE de proteína reducida (tratada con ditiotreitol) y sin reducir (véase la Fig. 5). Su masa molecular exacta, determinada por espectrometría de masas MALDI, fue 37,089 Da, muy próxima al valor esperado de 37,198 Da.

Para probar si el delta-plasminógeno (�Pg) podría activarse en delta-plasmina, el deltaplasminógeno se incubó con urocinasa (relación molar 1:1000) y el aumento en la actividad de serina proteasa se monitorizó midiendo el aumento en la tasa de hidrólisis de S-2251 (S-2251= D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilida, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH). Como se observa en la Fig. 6, se observa un aumento parabólico en la actividad típico de la reacción de activación acoplada (el cimógeno se convierte en enzima activa (1); y la enzima escinde el sustrato cromogénico (2)). La activación de delta-plasminógeno en delta-plasmina se completó en el plazo de 3 minutos bajo estas condiciones. Se obtuvieron resultados muy similares con tPA y estreptocinasa.

Las cinéticas para la activación por urocinasa de delta-plasminógeno se compararon con las de plasminógeno de longitud completa usando el procedimiento de Wohl y col. (Wohl, R.C., Summaria, L., Arzadon, L. y Robbins, K.C.; J. Biol. Chem. 253: 1402-1407 (1978), incorporado completamente por referencia). Para este fin se añadió urocinasa 5,8 nM a disoluciones que contenían diversas concentraciones de especies de plasmina en presencia del sustrato S-2251 1 mM a 37ºC, pH 7,5. El aumento en la absorbancia a 405 nm se vigiló y la tasa de aceleración de la formación de producto de S-2251 se calculó usando una ecuación parabólica en la que la tasa = k•t2. Los datos se ajustaron a un modelo cinético de Michaelis-Menten usando análisis de Lineweaver-Burk dando como resultado los siguientes valores:

Tabla 1. Cinéticas para la activación por urocinasa de delta-plasminógeno.

Especie:

Km (µM) kcat (min-1) kcat/Km (µM-1 min-1)

Delta-plasminógeno

30 +/-5 80+/-10 2,67

Plasminógeno

1,2 +/-0,1 2,3+/-0,3 1,92

El plasminógeno de longitud total se activó bien por urocinasa, con valores de Km similares a los hallados en la bibliografía (1,7 µM; Wohl, R.C., Summaria, L. y Robbins, K.C.; J. Biol. Chem 255(5): 2005-2013 (1980)) y valores de kcat equivalentes.

Los valores de Km para la activación por urocinasa de delta-plasminógeno fueron aproximadamente 30 veces superiores para plasminógeno, indicando posiblemente una menor afinidad de urocinasa para este mutante de plasminógeno. Al mismo tiempo, el valor de kcat para la activación de delta-plasminógeno fue mucho mayor para el plasminógeno: a pesar de las diferencias anteriormente mencionadas en kcat y Km, su relación, o eficiencia catalítica, es aproximadamente la misma para la activación de las especies de plasminógeno naturales y recombinantemente modificadas por urocinasa. Por tanto, estos datos indican que la presencia de una rosquilla 1 “extraña” no afecta considerablemente las propiedades de activación del dominio de serina proteasa en delta-plasminógeno.

En todavía otro experimento de activación, el delta-plasminógeno se incubó con estreptocinasa, tPA y urocinasa y se analizó en SDS-PAGE reducida para observar la conversión de la molécula de delta-plasminógeno de una sola cadena en delta-plasmina de dos cadenas (véase la Fig. 5, Carriles 3-5). En los tres casos pudieron observarse las dos cadenas (la rosquilla 1 de -12 kDa y la cadena de serina proteasa de -25 kDa) de delta-plasmina, sugiriendo que el delta-plasminógeno puede activarse en efecto por los tres activadores de plasminógeno.

Como es de esperar, el delta-plasminógeno se unió a lisina-SEPHAROSE mediante la rosquilla 1 y pudo eluirse de la columna mediante el gradiente de ε-ACA como un único pico (véase la Figura 7). La capacidad de delta-plasminógeno replegado para unirse a lisina-SEPHAROSE indica que el dominio en rosquilla de la molécula está adecuadamente plegado y el sitio de unión a lisina es completamente activo.

Para confirmar adicionalmente la funcionalidad de la rosquilla 1, la unión de ε-ACA a deltaplasminógeno se midió controlando los cambios asociados a la fluorescencia de proteínas como se describe por Matsuka y col. (Matsuka, Y.V., Novokhatny, V.V. y Kudinov, S.A., Eur. J. Biochem. 190:93-97 (1990)) y Douglas y col. (Douglas, J.T., von Haller, P.D., Gehrmann, M., Llinas, M. y Schaller. J., Biochemistry 41:3302-3310(2002)). La unión de ε-ACA a la rosquilla 1 de deltaplasminógeno da como resultado una disminución en la fluorescencia, probablemente debido a la extinción de los restos de triptófano que son parte del sitio de unión a lisina.

Para controlar este proceso, alícuotas de 4 µl a 16 µl de una disolución concentrada de εACA se añadieron a 2 ml de delta-plasminógeno 5 µM en tampón Tris 50 mM que contenía NaCl 20 mM, pH 8,0, 25ºC. La fluorescencia se controló a una longitud de onda de excitación de 298 nm y una longitud de onda de emisión de 340 nm en un espectrofotómetro de fluorescencia FLUOROMAX (Jobin Yvon, Inc., Edison, NJ); después de cada adición de ε-ACA, la disolución se dejó equilibrarse hasta que no se observaron cambios adicionales en la fluorescencia.

Los valores de fluorescencia resultantes se corrigieron para la dilución y se representaron frente a la concentración de ε-ACA durante un intervalo de ε-ACA 0 -50 µM. Los datos se ajustaron mediante regresión no lineal para obtener una Kd de 11,1 +/-2,3 µM, concordando bien con los valores bibliográficos para la afinidad de la rosquilla 1 por ε-ACA de 3,2 µM (Matsuka y col.) y 13 µM (Douglas y col.).

Una propiedad de plasmina es su capacidad para unirse a fibrina. Con el fin de determinar

si el delta-plasminógeno conserva la capacidad de interactuar con la fibrina, sus propiedades de unión a fibrina se probaron en un ensayo en placa de microvaloración en el que se evaluó la unión de delta-plasminógeno a fibrina por su posterior activación por tPA y la lisis de los coágulos resultantes. Para este fin, 100 µl de fibrinógeno 5 mg/ml se polimerizaron con trombina en cada pocillo de una placa de microvaloración. Se añadieron diversas concentraciones de deltaplasminógeno sobre la parte superior de los coágulos de fibrina y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. La placa se lavó exhaustivamente con PBS mientras que los coágulos de fibrina estaban todavía intactos y unidos a los pocillos. Después de lavar, a cada pocillo se añadió una disolución 0,1 mg/ml de tPA y la placa se incubó 2 horas a 37ºC. Como resultado, algunos de los coágulos se disolvieron completamente y algunos se disolvieron parcialmente, mientras que los pocillos con cantidades muy bajas de delta-plasminógeno y los pocillos de control permanecieron prácticamente intactos. El grado de fibrinólisis se controló midiendo la absorbancia a 280 nm del resto de los coágulos iniciales reconstituidos en NaOH 1 M. Los valores de absorbancia se representaron en función de la concentración de delta-plasminógeno.

Como se observa en la Fig. 8, la unión de delta-plasminógeno a fibrina sigue una curva de unión sigmoide clásica. Usando este ensayo se encontró que el delta-plasminógeno se une a fibrina con afinidad comparable a la del plasminógeno de longitud completa y la C50 de esta interacción (~0,2 µM) es comparable a la Kd de unión a fibrina de plasminógeno de longitud completa (Lucas, M.A., Fretto, L.J. y McKee, P.A.; J. Biol. Chem. 258(7): 4249-4256 (1983)). Estos experimentos indican que el delta-plasminógeno puede unirse a fibrina.

Por tanto, la interacción de delta-plasminógeno con lisina-SEPHAROSE, su capacidad para unirse a ε-ACA con la Kd esperada, su capacidad para unirse a fibrina, su capacidad para ser activado por todos los activadores de plasminógeno importantes y la potencia de la delta-plasmina hacia el sustrato de plasmina cromogénico S-2251 indicaron que esta molécula se produjo en el sistema de E. coli de una forma completamente funcional. Purificación y formulación de delta-plasmina

El delta-plasminógeno, dializado contra tampón Tris 0,1 M, pH 8,0, que contenía EDTA 10 mM y NaCl 0,15 M, se activó a delta-plasmina usando urocinasa inmovilizada sobre SEPHAROSE 4B como se describe esencialmente previamente para plasmina (Marder, V.J. y col., Thromb Haemost., 86(3):739-45 (2001)). La activación se produjo a temperatura ambiente y se monitorizó en tiempo real por el aumento en la actividad de S-2251. Dependiendo de la cantidad de deltaplasminógeno, que varió de lote a lote (normalmente 1-2 mg/ml), el tiempo de incubación fue 3060 min. Tras completarse la activación, cuando la actividad de S-2251 alcanzó una meseta, la urocinasa-SEPHAROSE se separó por filtración y la delta-plasmina activa se capturó sobre benzamidina-SEPHAROSE (Pharmacia). La delta-plasmina se eluyó de la resina usando un

tampón de bajo pH (glicina 0,2 M, pH 3,0, NaCl 0,3 M, ε-ACA 0,2 M).

Se midieron las concentraciones de proteína y la actividad de S-2251 en fracciones de elución. Se reunieron fracciones de alta actividad específica y se dializaron contra cambios múltiples de NaCl 0,15 M, pH 3,6 a 4ºC. El análisis de SDS-PAGE de muestras de delta-plasmina sin reducir (véase la Fig. 9, Carril 3) muestra que la pureza de este material es normalmente superior al 95%. Bajo condiciones reducidas (Fig. 9, Carril 4), además de la serina proteasa y las cadenas de rosquilla, hay dos tenues bandas por encima y por debajo de la banda de la rosquilla. Estas bandas representan productos de auto-degradación del dominio de serina proteasa que resultan de escisiones internas de su cadena de polipéptidos; normalmente se mantienen juntas por enlaces disulfuro, pero se hacen visibles con PAGE bajo condiciones reductoras. La cantidad de productos de auto-degradación, que normalmente no excedió el 10%, se redujo enormemente realizando la etapa de purificación en benzamidina-SEPHAROSE en modo discontinuo en lugar del formato en columna.

Debido a que la delta-plasmina, similar a la plasmina de longitud completa, es propensa a la auto-degradación a pH fisiológico, se eligió pH 3,6 para la formulación final (acidificada con solución salina en ácido acético). Como se muestra previamente para plasmina (Novokhatny, V. y col., J Thromb Haemost., 1(5):1034-41 (2003), incorporado por referencia) y confirmado en experimentos con delta-plasmina, esta formulación de bajo pH con capacidad de bajo tamponamiento no sólo permite un almacenamiento seguro de plasminas activas durante periodos de tiempo prolongados, sino que también es compatible con la administración parenteral de estos agentes trombolíticos directos. Si se mezcla con plasma o tampones de pH neutro, la deltaplasmina se reactiva rápidamente. Propiedades enzimáticas de la delta-plasmina

La actividad amidolítica de la delta-plasmina se examinó usando el sustrato de plasmina D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilida (S-2251) (DiaPharma, West Chester, OH). A pH 7,4, 25ºC en tampón de PBS, se encontró que la constante de Michaelis-Menten (Km) para S-2251 era 138 µM (Tabla 2). Se encontró que la kcat para la preparación era 510 min-1. Usando valoración con clorhidrato de 4guanidinobenzoato de 4-nitrofenilo (pNPGB) (Chase, T. y E. Shaw, Methods Enzymol. 197:2027(1970)) se encontró que el porcentaje de sitios activos funcionales era el 67%. Corrigiendo kcat para los sitios activos en porcentaje se determinó una kcat de 755 +/-45 min-1. Este valor era muy próximo al valor determinado en el mismo ensayo para plasmina de longitud completa, 760 +/-23 min-1 y para micro-plasmina (que carecía de las cinco rosquillas), 795 +/-24 min-1 (véase la Figura 9). Estos datos indican que la presencia o ausencia de rosquillas no afectan la actividad catalítica del dominio de serina proteasa.

Se midió la tasa de inhibición de delta-plasmina por α2-macroglobulina usando el

procedimiento de Anonick y col. (Anonick, P. y col., Thrombosis Res. 59:449-462 (1990)). Se encontró que la tasa de inhibición era 7,6 +/-0,6 x 105 M-1s-1 a 22ºC en tampón PBS. Se determinó que la tasa de inhibición de delta-plasmina por α2-antiplasmina era 1,1 x 107

M-1-1

susando el procedimiento de Wiman y Collen (Wiman, B. y D. Collen, Eur. J. Biochem.

5 84:573-578 (1978)) en el que se mezclan plasmina y α2-antiplasmina, luego se ensayan para la actividad de S-2251 a momentos de tiempos específicos (Tabla 3). Este valor es comparable a valores notificados para plasmina de 2,5 x 107 M-1s-1 (de Anonick y col., Thrombosis Res. 59:449 (1990)).

Los mismos experimentos realizados con micro-plasmina revelaron tasas de inhibición por

M-1-1 M-1-1

10 α2-antiplasmina de 1,8 x 105 sy 3,1 x 105 sen dos experimentos separados. Se determinó que la tasa de inhibición por α2-antiplasmina de mini-plasmina (composición del dominio

M-1-1

de mini-plasmina, K5-SP) era 2,4 x 105 s. Estos datos concuerdan razonablemente con valores bibliográficos para micro-y mini-plasmina y muestran que la inhibición de delta-plasmina por α2-antiplasmina es 40 veces más rápida que la inhibición de tanto micro-plasmina como mini

15 plasmina. Por tanto, estos resultados indican que la delta-plasmina deberá inhibirse rápidamente por α2-antiplasmina debido a la presencia de la rosquilla 1 en su estructura. En resumen, los datos presentados en esta sección muestran que las propiedades enzimáticas e inhibitorias de delta-plasmina son similares a las de plasmina de longitud completa. Tabla 2. Parámetros cinéticos en estado estacionario para diversas especies de plasmina con 20 sustrato S-2251, en tampón PBS, pH 7,4, 25ºC.

Km

kcat

Plasmina

193 +/-7 µM 760 +/-23 min-1

Mini-plasmina

160 +/-30 µM 770 +/-70 min-1

Micro-plasmina

145 +/-13 µM 795 +/-24 min-1

Delta-plasmina

138 +/-5 µM 755 +/-45 min-1

Tabla 3. Las tasas de inhibición para diversas especies de plasmina y los inhibidores se determinaron a 22ºC en tampón PBS, pH 7,4.

α2-Macroglobulina

α2-Antiplasmina

Plasmina

6,5 +/-0,5 x105 M-1s-1 2,5 +/-0,5 x 107 M-1s-1 (lit.)

Mini-plasmina

7,5 +/-0,3 x 105 M-1s-1 2,4 +/-0,5 x 105 M-1s-1

Micro-plasmina

7,8 +/-0,6 x 105 M-1s-1 1,8 +/-0,2 x 105 M-1s-1

Delta-plasmina

7,6 +/-0,6 x105 M-1s-1 1,0 +/-0,1 x 107 M-1s-1

Los valores bibliográficos se toman de Anonick y col., Thrombosis Res. 59:449(1990). Todas las tasas se midieron según los procedimientos publicados en Anonick y col.

25 Eficiencia trombolítica in vitro

La eficacia trombolítica de la delta-plasmina se probó en un modelo in vitro de trombolisis asistida por catéter (Novokhatny, V. y col., J Thromb Haemost., 1(5):1034-41(2003)) usando el siguiente protocolo experimental.

Se recogió sangre humana completa reciente en tubos de vidrio de 20 x 0,95 cm y se dejó coagular espontáneamente sin aditivos. Los tubos se incubaron durante 20 h a 37ºC para permitir la retracción completa. Los coágulos retraídos se separaron del suero usando tamices de ensayo normalizados en EE.UU. D16 con 14 de malla y se determinaron sus pesos. Los coágulos de sangre se transfirieron a tubos de vidrio de diámetro más pequeño en los que los coágulos retraídos se ajustaron estrechamente (0,8 x 7 cm). El peso promedio de los coágulos era ~3,6 g.

Se inyectaron dosis únicas de 1 ml de solución salina acidificada, plasmina o deltaplasmina en el coágulo usando una jeringa. Los coágulos se incubaron durante 1 hora a 37ºC en una estufa de laboratorio THELCO (Jouan, Inc., Winchester, VA). Después de la incubación, los coágulos se colocaron de nuevo sobre el tamiz para eliminar el material licuado y se midió el peso de los coágulos digeridos. El grado de la lisis de coágulos se determinó a partir de la diferencia entre el peso del coágulo inicial y el peso del coágulo residual y se expresó como porcentaje de la reducción de peso del coágulo.

La Figura 10 muestra los resultados de los experimentos de lisis con delta-plasmina en este modelo. La infusión de una única dosis de 0,44 mg (equivalente a 1 mg/ml de plasmina en una base molar) de delta-plasmina dio como resultado el 36% de reducción de peso del coágulo en el plazo de 60 min. Al mismo tiempo, el peso de los coágulos infundidos con solución salina sólo disminuyó el 4%. La plasmina (1,0 mg) dio como resultado el 50% de reducción de peso del coágulo en el mismo periodo. Por tanto, estos datos muestran que la delta-plasmina presenta potencia trombolítica y puede usarse como un agente trombolítico directo. LISTA DE SECUENCIAS

<110> Talecris Biotherapeutics, Inc. Hunt, Jennifer A. Novokhatny, Valery

<120> Plasmina recombinantemente modificada

<130> B185 1240-PCT(8017)

<150> US 60/564.472

<151> 22/04/2004

<160> 9

<170> FastSEQ for Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 1008

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene un único dominio en rosquilla del extremo N homólogo a un dominio en rosquilla de plasminógeno humano nativo

<400> 1

imagen1

<210> 2 10 <211> 335

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

un polipéptido que tiene un único dominio en rosquilla del extremo N homólogo a un 15 dominio en rosquilla de plasminógeno humano nativo

<400> 2

<210> 3

<211> 2432

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (0)...(0)

<223>

Plasminógeno humano 10 <400> 3

imagen1

imagen1

<210> 4

<211> 810 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (0)...(0) 10 <223> Plasminógeno humano

<400> 4

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 5

<211> 79

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio en rosquilla 1 de plasmina (plasminógeno) humana(o) nativa(o)

<400> 5

imagen1

10 <210> 6 <211> 78

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio en rosquilla 2 de plasmina (plasminógeno) humana(o) nativa(o)

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 78

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio en rosquilla 3 de plasmina (plasminógeno) humana(o) nativa(o)

<400> 7

imagen1

15 <210> 8

<211> 78

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> dominio en rosquilla 4 de plasmina (plasminógeno) humana(o) nativa(o)

<400> 8 <210> 9

imagen1

<211> 80

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio en rosquilla 5 de plasmina (plasminógeno) humana(o) nativa(o)

<400> 9

imagen1

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene un único dominio en rosquilla del extremo N que es idéntico al menos el 90% al dominio en rosquilla 1 de plasminógeno humano nativo; y un dominio del extremo C que es idéntico al menos el 90% al sitio de activación y al dominio de serina proteasa de plasminógeno humano, polipéptido que se une a lisina inmovilizada y puede activarse por un activador de plasminógeno.
2. 2.-El polinucleótido de la reivindicación 1, siendo el polipéptido codificado SEC ID Nº: 2 con no más de 30 sustituciones de aminoácidos.
3. 3.-El polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, siendo el polipéptido codificado idéntico al menos el 90% a la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2.
4. 4.-El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, siendo el polipéptido codificado idéntico al menos el 95% a la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2.
5. 5.-El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, siendo el polipéptido codificado idéntico al menos el 98% a la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2.
6. 6.-El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, siendo el polipéptido codificado la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2.
7. 7.-El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 1 o una variante degenerada de la misma.
8. 8.-Un polipéptido codificado por el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9.-El polipéptido de la reivindicación 8, presentando el polipéptido una actividad fibrinolítica que es inhibida por α2-antiplasmina a una tasa de inhibición que es al menos aproximadamente 5 veces más rápida que la tasa de inhibición de la actividad fibrinolítica de miniplasmina por α2-antiplasmina.
10. 10.-El polipéptido de la reivindicación 9, en el que la tasa de inhibición es al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces o 40 veces más rápida que la tasa de inhibición de mini-plasmina.
11. 11.-El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la lisina inmovilizada es lisina unida a una matriz de soporte sólido seleccionada del grupo que está constituido por lisina-agarosa, lisina-hidrogel, lisina-agarosa reticulada.
12. 12.-El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la lisina inmovilizada es lisina-agarosa reticulada.
13. 13.-El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, presentando el polipéptido una menor afinidad de unión por fibrinógeno que la afinidad de unión por fibrinógeno de mini-plasmina.
14. 14.-El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, presentand el 5 polipéptido una mayor afinidad de unión por fibrina parcialmente escindida que la afinidad de unión por fibrina parcialmente escindida de mini-plasmina.
15. 15.-El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, teniendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID Nº: 2 y sustituciones conservativas de la misma.

    10 16.-El polipéptido de la reivindicación 15, teniendo el polipéptido un residuo de arginina en una posición relativa análoga a la de la posición 76 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2.
16. 17.-Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7. 15 18.-Una célula cultivada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 17.