NO338542B1 - Polynukleotid, polypeptid, ekspresjonsvektor og dyrket celle. - Google Patents

Description

REKOMBINANT MODIFISERT PLASMIN

Bakgrunn for oppfinnelsen

Humant plasminogen er et enkeltkjede protein inneholdende 791 aminosyreresiduer. Aktivering av plasminogen til plasmin resulterer fra en enkel spaltning av Arg561-Val562-peptidbindingen i zymogenet. Det resulterende plasminmolekylet er en tokjedet, disulfid-bundet serinprotease med trypsin-lignende spesifisitet (spalter etter Lys og Arg).

Den aminoterminale tungkjeden av plasmin (residuer 1-561, -60 kDa) er sammensatt av fem kringledomener, hver inneholdende omtrent 80 aminosyreresiduer. Kringledomenene er ansvarlig for de regulatoriske egenskapene til plasminogen, slik som interaksjon med aktiveringsinhibitorer, f. eks. Cl"<1>ioner; med aktiveringsstimulatorer, f. eks.,&-aminokapronsyre; med pattedyr- og bakterieceller; og med andre proteiner, slik som plasmins fysiologiske substrat fibrin og plasmininhibitor a2-antiplasmin. Av alle fem kringler er kringle 1 én av de mest multifunksjonelle: dens lysinbindingsaktivitet er vist å være ansvarlig for plasmins interaksjon med a2-antiplasmin og fibrin. Se Wiman, B., et al, Biochim. Biophys. Acta 579:142-154 (1979); og Lucas, M.A., et al, J. Biol. Chem. 255:4249-4256

(1983).

Lin LF. ET AL., Biochemistry. 2000, vol.39, nr. 16, sidene 4740-4745 beskriver epsilon aminokaproinsyre som inhiberer streptokinase-plasminogen aktivatorkompleksdannelse og substratbinding gjennom kringle-avhengige mekanismer.

Burck PJ. ET AL., J Biol Chem. 1990, vol 265, nr.9, sidene 5170-5177 beskriver karakterisering av en modifisert human vev-plasminogenaktivator omfattende en kringle-2 og en proteasedomene.

van Zonneveld AJ. ET AL., Proe Nati Acad Sei USA. 1986, vol. 83, nr. 13, sidene 4670-4674 beskriver autonome funksjoner til de strukturelle domenene av human vev-type plasminogenaktivator.

Den C-terminale lettkjeden av plasmin (residuer 562-791,~25kDa) er en typisk serinprotease, homolog til trypsin og inneholdende den klassiske serinprotease katalytiske triaden: His603, Asp646 og Ser741. Plasminogen inneholder 24 disulfidbroer og 2 glykosyleringsseter, på Asn289 og Thr346.

Den begrensete proteolysen av plasminogen med elastase er vist å resultere i tre fragmenter (Sottrup-Jensen, L., et al, Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol, 3:191-209 (1978)). Første fragment, Kl-3, omfatter de første tre kringler og kan isoleres i to versjoner, Tyr79- Val338 og Tyr79-Val354. Det andre fragmentet, K4, svarer til den fjerde kringlen og omfatter residuer Val355-Ala440. Den siste, C-terminalt fragment (det såkalte mini-plasminogen), omfatter residuer Val443-Asn791 og består av den femte kringlen og serinproteasedomenet. Mini-plasminogen kan aktiveres på samme måte som plasminogen, danner mini-plasmin.

På grunn av den komplekse strukturen til fullengde plasminogenmolekylet, er bakterielle ekspresjonssystemer ikke dokumentert anvendelige for rekombinant plasminogenproduksjon. Plasminogen blir produsert i form av uoppløselige inklusjonslegemer og er ikke refoldbare fra den tilstanden. Videre er ekspresjonen av plasminogen i pattedyrceller komplisert ved intracellulær aktivering av plasminogen til plasmin og den resulterende cytotoksisiteten. Produksjon av fullstendig aktiv plasminogen ved anvendelse av insektceller er mulig, imidlertid er dette systemet ikke egnet for storskala produksjon på grunn av lavt utbytte.

Følgelig er et modifisert rekombinant protein, som har de ønskelige karakteristika til plasmin/plasminogen mens mangler visse negative karakteristika og som er i stand til produksjon i bakterieceller i vesentlige mengder ønskelig.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et polynukleotid omfattende en

nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har et enkelt N-terminalt kringledomene som er minst 90% identisk med kringle 1 domenen til nativt humant plasminogen; og et C-terminalt domene som er minst 90% identisk med aktiveringssete og serinproteasedomenen til humant plasminogen, idet polypeptidet binder til immobilisert lysin og kan bli aktivert av en plasminogenaktivator. Det N-terminale kringledomenet kan være homologt til kringle 1 eller kringle 4 i nativt humant plasminogen.

I noen utførelsesformer er det kodete polypeptidet minst 90%, 95% eller 98% identisk med sekvensen vist i SEKV ID NR: 2. Videre kan det kodete polypeptidet være sekvensen vist i SEKV ID NR: 2.

Nukleotidsekvensen av polynukleotidet kan være sekvensen vist i SEKV ID NR:1 eller degenerert variasjoner derav. Nukleotidsekvensen kan kode for et polypeptid som har et N-terminalt kringledomene homologt til kringle 1 eller kringle 4-domenet i nativt humant plasminogen; og et C-terminaldomene aktiveringssete og serinproteasedomene homologt til de tilsvarende domenene i humant plasminogen. Nukleotidsekvensen kan også koder for et polypeptid som har et enkelt N-terminalt kringledomene minst 90% identisk med kringle 1 eller kringle 4-domenet i nativt humant plasminogen; og en C-terminaldomene minst 90% identisk med aktiveringssetet og serinproteasedomenet for humant plasminogen. De kodede polypeptidene kan binde immobilisert lysin.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen polypeptider som er kodet av nukleinsyren ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7. Idet polypeptidet utviser en fibrinolytisk aktivitet som er hemmet av et a2-antiplasmin ved en inhibisjonsrate som er minst omtrent 5-ganger hurtigere enn inhibisjonsraten til den fibrinolytiske aktiviteten til mini-plasmin til a2-antiplasmin.

I noen utførelsesformer kan polypeptidene ha et N-terminalt kringledomene homologt til kringle 1 eller kringle 4 i nativt humant plasminogen.

I noen utførelsesformer kan polypeptidene vise en fibrinolytisk aktivitet som er hemmet av a2-antiplasmin ved en hastighet som er minst ca. 5-ganger raskere enn hemningshastigheten av den fibrinolytiske aktiviteten til mini-plasmin ved a.2-antiplasmin. Hemningshastigheten til (X2-antiplasmin kan også være minst ca. 10-ganger, 20-ganger, 30-ganger eller 40-ganger raskere enn hemningshastigheten til mini-plasmin.

I noen utførelsesformer kan polypeptidene binde immobilisert lysin. Det immobiliserte lysinet kan være lysin bundet til en fast bærer-matriks valgt fra gruppen bestående av lysin-agarose, lysin-BIOGEL (BioRad, Hercules, CA), lysin-HYPERD (Pall Life Sciences, East Hills, NY, en lysinhydrogel), lysin-SEPHAROSE (SEPHAROSE er kryssbundet agarose). Det immobiliserte lysinet kan være lysin-SEPHAROSE.

I noen utførelsesformer kan polypeptidene vise en lavere bindingsaffinitet til fibrinogen enn bindingsaffiniteten for fibrinogen til mini-plasmin.

I noen utførelsesformer kan polypeptidene vise høyere bindingsaffinitet til delvis spaltet fibrin enn bindingsaffiniteten for delvis spaltet fibrin til mini-plasmin.

I noen utførelsesformer kan polypeptidene ha et enkelt kringledomene lokalisert N-terminalt til et plasminogen aktiveringssete og plasminogen serinproteasedomene, hvor kringledomenet har minst én residue større aminosyresekvensidentitet med kringle 1 eller kringle 4 i nativt humant plasminogen enn med kringle 5 i nativt humant plasminogen. For disse utførelsesformer vil det forstås at konservative substitusjoner av kringleregionene av polypeptidene ifølge oppfinnelsen, i forhold til de native sekvensene av kringler 1 og 4 i humant plasminogen, ikke ville være betraktet som ulik fra de native sekvensene for formål av identitetsammenligningen med kringle 5.

I noen utførelsesformer kan polypeptidene ha aminosyresekvensen som vist i SEKV ID NR:2 og konservative substitusjoner derav. Polypeptidene kan ha en residue med en relative posisjon analog med den til posisjon 76 av aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 2 som er arginin.

I et annet aspekt omfatter oppfinnelsen vektorer omfattende polynukleotidene ifølge oppfinnelsen og dyrkete vertsceller omfattende vektorene.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en skjematisk fremstilling av nativt plasmin etter aktivering ved proteolytisk spaltning. K1-K5 er kringleregioner 1-5; og SP er serinproteasedomenet. "a2-AP" er a2-antiplasminbindingssetet på kringle 1. Figur 2 er en skjematisk fremstilling av en plasminogen delesjonsmutant ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av samme nomenklatur som i figur 1 og som viser delesjon av K2-5. Figur 3 viser aminosyresekvensen for humant plasminogen, som viser den 19-residuers ledersekvensen nummerert som -19 til -1 og plasminogensekvensen vist som residuer 1-791 (se SEKV ID NR: 3 (cDNA-sekvens for humant plasminogen; og SEKV ID NR:4, den kodede aminosyresekvens, som vist i figur 3). Flere trekk er vist, omfattende de følgende: delta-plasminogensekvensen (skyggelagt); kringledomener 1-5 (dobbelt understreket); glykosyleringsseter Asn289 og Thr346 (i halvfet); plasminogenaktivering Arg-Val aktiveringssetet (i halvfet); og lysinbindingsseter i kringle 1 (i understreket og med spesifikk posisjonsnummerering). Figur 4 viser polypeptidsekvens sammenligninger mellom de fem kringledomenene (1-5) av nativt humant plasmin(ogen). Aminosyreresiduer som er identiske med de til samme relative posisjon i kringle 1 er vist i understreket. Figur 5 viser en 8-25% gradient-SDS-PAGE av en ikke-redusert (spor 1) og redusert (spor 2) delta-plasminogenfremstilling. Aktivering av delta-plasminogen til delta-plasmin med streptokinase (spor 3), tissue plasminogen aktivator (tPA) (spor 4) og urokinase (spor 5) resulterer i dannelsen av det tokjedete molekylet bestående av kringle 1 (Kl) og serinproteasedomenet (SP) forbundet med to disulfidbroer. Figur 6 er en grafisk fremstilling av aktivering av delta-plasminogen med urokinase. Urokinase (5,8 nM) ble satt til en løsning av 5 uM delta-plasminogen i PBS inneholdende 1,0 mM S-2251 ved 37°C. Økninger i absorbans ble overvåket ved 405 nm. Figur 7 er et kromatogram som viser binding av delta-plasminogen til lysin-SEPHAROSE 4B: 0,5 mg renset delta-plasminogen ble applisert på lysin-SEPHAROSE 4B kolonnen (1x3 cm) ekvilibrert med Tris-bufret saltløsning, pH 7,4. Bundet protein ble eluert fra kolonnen med en 0-20 mM gradient av8-aminokapronsyre (e-ACA) som en enkel topp. Absorbansen ved 280 nm og konsentrasjonen av s-ACA, som en funksjon av effluenrvolumet er presentert på kurven. Figur 8 viser binding av delta-plasminogen til fibrin. Varierende konsentrasjoner av delta-plasminogen ble inkubert med fibrinkoagler i en mikrotiterplate i 1 time ved 37°C. Etter inkubering ble koaglene vasket i stor utstrekning med PBS og en 0,1 mg/ml løsning av tPA ble satt til hver brønn. Etter en 2-times inkubering ved 37 °C ble væsken fjernet og gjenværende faste koagler ble rekonstituert med 100 ul av IM NaOH. Mengden av gjenværende fibrin ble kvantifisert ved å måle 280 nm absorbansen av disse rekonstituerte koaglene. Graden av fibrinolyse, som er et resultat av delta-plasminogenbinding til fibrin, ble plottet på kurven som en funksjon av delta-plasminogenkonsentrasjon (hel linje). Den stiplete linjen representerer den beste tilpasning av eksperimentelle data til en bindingsligning. Figur 9 viser en 8-25% gradient-SDS-PAGE av startende delta-plasminogen under ikke-reduserte (spor 1) og reduserte betingelser (spor 2) og endelige delta-plasminfremstilling også under ikke-reduserte (spor 3) og reduserte (spor 4) betingelser. Figur 10 viser skjematiske diagrammer av plasmin, mini-plasmin, mikro-plasmin og delta-plasmin, sammen med en tilsvarende karakterisering av enzymatisk aktivitet (koat og Km med hensyn til substrat S-2251 (D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH)). Figur 11 er en grafisk fremstilling av delta-plasminfremkalt lyse av tilbakedannete helblods koagler. Hver koagel (0,8x7 cm) ble injisert med en 1 ml volum av konstituent (surgjort saltløsning, pH 3,6), plasmin (1,0 mg/ml) eller delta-plasmin (0,44 mg/ml) og koageloppløsning fikk forløpe ved 37 °C i 1 time.

Beskrivelse ifølge oppfinnelsen

For å gi et enkelt, ikke-glykosylert molekyl som har fibrin- og antiplasmin-bindingsegenskapene til fullengde plasmin tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en delesjonsmutant av plasminogen. I denne mutanten, referert til her som delta-plasminogen, er minst en del av den native aminosyresekvensen mellom en domene homologt til kringle 1 og aktiveringssetet deletert. I ett aspekt kan domenet homologt til det native kringle 1-domenet for humant plasminogen være direkte bundet til serinproteasedelen av plasminogen eller en homolog, funksjonell analog derav, med hovedsakelig bare den mellomliggende native sekvensen inneholdende plasminogenaktiveringssetet gjenværende mellom domenene.

Delta-plasmin(ogen) ifølge foreliggende oppfinnelse kan karakteriseres ved: lavere molekylvekt (37.198 Da) av delta-plasmin kan resultere i øket spesifikk aktivitet (pr. mg protein); mangelen på minst to glykosyleringsseter funnet i det native proteinet (se figur 3), kombinert med den relativt lave molekylvekten, kan lette rekombinant produksjon av dette proteinet ved anvendelse av relativt billige bakterielle- og gjærekspresjonssystemer; delta-plasminogen kan aktiveres ved plasminogen aktivatorer tPA, urokinase og streptokinase; tilstedeværelsen av domenet homologt til nativ kringle 1 bevarer fibrinbindingsegenskapene til plasmin som kan være viktig for trombolytisk effektivitet; tilstedeværelse av a2-antiplasminbindingsseter på domenet homologt til kringle 1 kan tillate delta-plasmin å være raskt hemmet av denne fysiologiske inhibitoren av plasmin (et trekk som kan forhindre blødning); den mindre størrelsen av delta-plasmin kan lette dens hemning av (X2-makroglobulin, videre minkning av sjansen av blødningskomplikasjoner i forhold til nativt plasmin. Spesiele utførelsesformer, fravær av kringle 5, som beholder det primære bindingssetet for intakt, ufordøyet fibrin(ogen), kan tillate anvendelse av delta-plasmin med redusert utarming av sirkulerende fibrinogen.

Generelt tilveiebringer oppfinnelsen rekombinante plasmin(ogen)molekyler, som har en enkel kringleregion N-terminalt til aktiveringssetet og serinproteasedomenet, som har visse fordeler i forhold til mini-plasmin(ogen). Selv om delta-plasminogenpolypeptider ifølge oppfinnelsen bare har én kringleregion, slik som N-terminal til aktiveringssetet, omfatter noen utførelsesformer ytterligere sekvenser N-terminal til aktiveringssetet. Ytterligere N-terminale sekvenser kan avledes fra de av native kringleregioner til plasminogen.

De N-terminale kringledomenene beskrevet omfatter kringlesekvenser av kringler 1 og 4 av nativt plasmin(ogen) og funksjonelle ekvivalenter derav. Spesielt, se omtalen nedenfor som tilveiebringer veiledning angående preservering av funksjon i polypeptidvarianter, omfattende preservering av residuer som deltar i eller influerer lysinbinding.

Definisjoner

Betegnelsene "domene" og "region" av et polypeptid er generelt synonyme som anvendt her, hvis ikke annet er angitt for det motsatte. Når angitt sammen med velgj enkj ent strukturell eller funksjonell betegnelser slik som "kringle" eller "serinprotease," etc., slike betegnelser vil innføre et polypeptidtrekk relatert til minst noen karakteristisk(er) vanlig gjenkjent og forstått å være forbundet med polypeptidstrukturenene svarende til slike betegnelser.

En "dyrket vertscelle," som anvendt her, angir en prokaryot eller eukaryot celle som inneholder heterolog DNA som er innført i cellen ved hvilket som helst middel, f. eks., elektroporering, kalsiumfosfatutfelling, mikroinjeksjon, transformasjon, viral infeksjon og lignende.

"Heterolog" som anvendt her betyr "av forskjellig naturlig opprinnelse" eller som representerer en ikke-naturlig tilstand. For eksempel hvis en dyrket vertscelle blir omdannet med et DNA eller gen avledet fra en annen organisme, spesielt fra en annen art, er det genet heterologt med hensyn til den dyrkete vertscellen og også med hensyn til etterkommere av den dyrkede vertscellen som bærer det genet. Tilsvarende angir "heterolog" en nukleotidsekvens avledet fra og innsatt i samme naturlig, opprinnelige celletype, men som er til stede i en ikke-naturlig tilstand, f. eks., et ulikt kopitall eller under kontroll av forskjellig regulatoriske elementer.

Et "vektor"molekyl er et nukleinsyremolekyl som heterolog nukleinsyre kan være innsatt i som deretter kan være innført i en passende dyrket vertscelle. Vektorer har fortrinnsvis én eller flere origo for replikasjon og én eller flere seter som det rekombinante DNAet kan være innsatt i. Vektorer har ofte hensiktsmessig betydning for hvilke celler med vektorer kan velges fra de uten, f. eks., de som koder for medikamentresistente gener. Vanlige vektorer omfatter plasmider, virale genomer og (primært i gjær og bakterier) "kunstige kromosomer."

Som anvendt her, betegnelsen "transkripsjonen kontrollsekvens" angir nukleinsyresekvenser, slik som initiatorsekvenser, enhancersekvenser og promotersekvenser, som fremkaller, undertrykker eller på annen måte kontrollerer transkripsjonen av protein som koder for nukleinsyresekvenser til som de er operabelt bundet.

Betegnelsen "polypeptid" blir anvendt om hverandre her med betegnelsene "peptid" og "protein."

Betegnelsene "polynukleotid" og "nukleinsyre" blir anvendt om hverandre her og kan referere til hvilken som helst nukleinsyre som inneholder informasjonen nødvendig for formålet angitt i sammenhengen. Det er, nukleinsyren kan være DNA eller RNA, enten enkeltrådet eller dobbeltrådet eller andre nukleinsyrer, så lenge polymeren kan representere den passende informasjonen, f. eks., i relasjon til et kodet peptid og kan omfatte komplementær sekvenser, f. eks., sens-tråder og antisens-tråder av nukleinsyrepolymerer.

Betegnelsen "variant" av et polypeptid angir en aminosyresekvens som er endret i én eller flere aminosyrer. Varianten kan ha "konservative" endringer, hvor en substituert aminosyre har lignende strukturelle eller kjemiske egenskaper, f. eks., erstatning av leucin med isoleucin. Alternativt kan en variant ha "ikke-konservative" endringer, f. eks., erstatning av en gly ein med en tryptofan. Analog mindre variasjon kan også omfatte aminosyredelesjon eller -insersjon eller begge. En spesiell form av et "variant"polypeptid er et "funksjonelt ekvivalent"-polypeptid, f. eks., et polypeptid som oppviser hovedsakelig lignende in vivo eller in vitro aktivitet som eksemplene på polypeptidet ifølge oppfinnelsen, som beskrevet mer detaljert nedenfor. Veiledning for bestemmelse av hvilke aminosyreresiduer som kan være substituert, innsatt eller deletert uten eliminering av biologisk eller immunologisk aktivitet kan finnes ved anvendelse av dataprogrammer velkjente på området, for eksempel DNASTAR programvare (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Videre er spesifikk veiledning gitt nedenfor, omfattende det tilveiebrakt innen de siterte referanser som er fullstendig inntatt her ved referanse.

Betegnelsene "N-terminal" og "C-terminal" blir anvendt her for å betegne den relative posisjonen av hvilken som helst aminosyresekvens eller polypeptiddomene eller struktur som de blir påført. Den relative posisjonering vil fremgå av sammenhengen. Det er, et "N-terminalt"trekk vil være lokalisert minst nærmere mot N-terminus av polypeptidmolekylet enn et annet trekk beskrevet i samme sammenheng (det andre trekk mulig referert til som "C-terminalt" til det første trekk). Tilsvarende, betegnelsene "5'-" og "3'-" kan anvendes her for å betegne relative posisjoner av trekk til polynukleotider.

Delta-plasminogen/plasminpolypeptidene referert til her, som har en N-terminaldomene "homolog til et kringledomene i nativt humant plasminogen", viser strukturelle og funksjonelle karakteristika lignende native kringledomener til plasminogen. Videre viser delta-plasminogen/plasminpolypeptidene referert til her, som har en N-terminaldomene "homolog til kringle 1", karakteristika lignende nativ kringle 1, minst i den grad at polypeptidene kan ha en høyere affinitet for co-aminokarboksylsyrer (og funksjonelle homologer slik som *røws-4-aminometylcykloheksan-l-karboksylsyre, en syklisk syre) enn kringle 5. Se, f. eks., Chang, Y., et al, Biochemistry 37:3258-3271 (1998), for betingelser og protokoller til sammenligning av binding for isolerte kringledomenepolypeptider til 5-aminopentansyre (5-APnA); 6-aminoheksansyre (6-AHxA) også kjent som s-aminokaprionsyre (sACA); 7-aminoheptansyre (7-AHpA); og

*>*a«s-4-aminometylcykloheksan-1 -karboksylsyre (t-AMCHA).

Referanser til kringledomener "homolog til kringle 4" er definert tilsvarende, som angitt ovenfor angående uttrykket "homolog til kringle 1." Det er, de viser funksjonelle karakteristika lignende kringle 1 i nativt humant plasminogen som beskrevet ovenfor. Disse polypeptidene binder også immobilisert lysin som beskrevet ovenfor.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen binder immobilisert lysin. Som anvendt her, uttrykket "binding av immobilisert lysin" betyr at polypeptidene slikkarakteriserter retardert i deres progress i forhold til mini-plasminogen når underkastet kolonnekromatografi ved anvendelse av lysin-SEPHAROSE som det kromatografiske media. Typisk kan polypeptidene ifølge oppfinnelsen elueres fra slik kromatografisk media (lysinaffinitetsresiner) ved anvendelse av løsninger inneholdende den spesifikke liganden, f. eks., eACA, som eluenter.

Videre i tillegg til Chang et al, supra kan andre referanser bli konsultert av fagfolk på området for å bestemme hvilke residuer som kan varieres ved konservative eller ikke-konservative substitusjon, delesjon eller addisjon, for å innbringe en delesjonsmutant innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. For eksempel tilveiebringer de følgende referanser informasjon angående spesielle residuer av de native kringledomenene som kan være viktige for binding av co aminokarboksylsyrer: U.S. pat. nr. 6.538.103 til Ji, et al; U.S. pat. nr. 6.218.517 til Suzuki; Douglas, J.T., et al, Biochemistry 41 ( 10) 3302- 10

(2002); Zajicek, J., et al, J. Mol. Biol, 301( 2) 333- 47 (2000); Lee, H, et al, Arch Biochem Biophys., 3750:359-63 (2000); Castellino, F. and S. McCance, Ciba Found Symp. 272:46-60 (1997); McCance, S., et al, J. Biol. Chem., 259:32405-32410 (1994); Rejante, M.R. and M. Llinas, Eur. J. Biochem., 2270:939-49 (1994); Wu, T.P., et al, Blood Coagul. Fibrinolysis, 50:157-66 (1994); Hoover, C.J., et al, Biochemistry, 32( 41) : 10936-43 (1993); Menhart, N., et al, Biochemistry, 32:8799-8806 (1993); Thewes, T., et al, J. Biol. Chem., 265 0:3906-3915 (1990); Novokhatny, V., et al, Thromb Res., 53(0:243-52 (1989); Motta, A., et al, Biochemistry, 26( 13J:3827-36 (1987); Novokhatny, V., et al, J. Mol. Biol, 779:215-232 (1984); Lerch, P.G., et al, Eur. J. Biochem., 107( 1) :1- 13 (1980); Sottrup-Jensen, L., et al, Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol, 3:191-209 (1978); og Wiman, B. and D. Coilen, Nature 272, 549-545 (1978). Fordi foreliggende oppfinnere har gjenkjent at et verdifullt, forenklet plasmin(ogen)molekyl kan fremstilles som har et N-terminalt kringledomene, som har fordelaktig funksjonelle karakteristika (som delvis kan evalueres ved testing for bindingen av immobilisert lysin som beskrevet her), kan foreliggende oppfinnelse omfatte andre fibrinbindende domener eller regioner N-terminalt til aktiveringssetet. For eksempel kan oppfinnelsen omfatte polypeptider hvor serinproteasedomenet til plasmin er bundet til en fibrinbindende kringle valgt fra en gruppe omfattende, men ikke begrenset til, kringle 4 for humant plasminogen, kringle 2 for tPA eller en kringle for apolipoprotein (a). Videre kan oppfinnelsen omfatte polypeptider hvor et serinproteasedomene til plasmin er bundet til hvilken som helst annen av kjent fibrinbindende moduler, slik som "finger"domenet til tPA eller fibronektin eller Fab-fragmentet til fibrinspesifikk IgG. Spesielt utførelsesformer er residuer ved visse posisjoner av det N-terminale kringledomenet av delta-plasminogen konservert i forhold til kringle 1 i nativt humant plasminogen. Disse kan være residuer i posisjoner forbundet med lysinbinding og omfatter Prol36-Prol40, Prol43-Tyrl46 og Argl53-Tyrl56 (posisjoner nummerert som vist i figur 3). Noen utførelsesformer av delta-plasminogenet ifølge oppfinnelsen kan ha Arg i posisjon 153. I andre utførelsesformer kan de spesifikke posisjonene av de betegnete residuene variere noe mens fortsatt være til stede i polypeptidet i strukturelt og funksjonelt analoge posisjoner ( f. eks. i forhold til kringlestrukturen av det N-terminale domenet; se Chang, Y., et al. som beskrevet ovenfor). I noen utførelsesformer har den N-terminale kringleregionen av delta-plasmin(ogen)polypeptidet minst én residue større prosent identitet med kringle 1 eller kringle 4 i nativt humant plasminogen enn med kringle 5 i nativt humant plasminogen. I tillegg kan spesielle utførelsesformer ifølge oppfinnelsen karakteriseres funksjonelt i kontrast til mini-plasmin(ogen) som har en lignende domenefremstilling, f. eks., kringleserinprotease (K-SP) (se Sottrup-Jensen, L., et al, Progress in Chemical Fibrinolysis and Trombolysis, Vol. 3, (Eds: J. F. Davidson, et al.) Raven Press, New York

(1978)). I foretrukne utførelsesformer oppviser delta-plasmin ifølge oppfinnelsen en øket hemningshastighet av (X2-antiplasmin, f. eks., så meget som omtrent én eller to størrelsesordener raskere enn hemningshastigheten av mini-plasmin. Videre spesielt utførelsesformer binder delta-plasmin immobilisert lysin ( f. eks., lysin-SEPHAROSE).

Karakterisering av kringledomenet til delta-plasminogen som "N-terminalt" betyr bare at domenet er til stede N-terminalt til aktiveringssetet og betyr ikke at ytterligere aminosyreresiduer N-terminalt til domenet selv ikke er til stede. Videre antallet og identiteten av residuer plassert imellom domenet homolog til kringle 1 og aktiveringssetet av plasminogen kan varieres uten å avvike fra omfanget av foreliggende oppfinnelse. En fagmann på området vil være i stand til å bestemme disse variasjoner som oppnår fordelene ifølge oppfinnelsen (kringle 1-lignende binding av oo-aminokarboksylsyrer, uten vesentlige økning i størrelse av delesjonsmutanten eller innføring av potensielt problematiske glykosyleringsseter) uten unødvendig eksperimentering basert på det vist frem her og referansene sitert her for veiledning angående kringle 1-funksjon og struktur.

Følgelig angår oppfinnelsen polynukleotider, polypeptider, vektorer inneholdende polynukleotidene, og dyrkete vertsceller omfattende slike ekspresjonssystemer.

Som angitt, i ett aspekt, angår oppfinnelsen et polynukleotid som koder for polypeptidet beskrevet her eller et polypeptid som har konservative aminosyresubstitusjoner derav. Veiledning angående seleksjon av "konservative" aminosyresubstitusjoner er tilveiebrakt mer detaljert nedenfor. I én utførelsesform er polynukleotidet DNA.

I et annet aspekt angår oppfinnelsen en vektor omfattende innsetting av polynukleotidet ifølge oppfinnelsen inn i en vektor.

I et annet aspekt angår oppfinnelsen en dyrket vertscelle omfattende innføring av vektoren ifølge oppfinnelsen inn i en dyrket vertscelle. Et isolert polypeptid ifølge oppfinnelsen, kan bli produsert ved en metode omfattende: (a) innføring av en vektor omfattende et polynukleotid som koder for polypeptidet inn i en dyrket vertscelle; (b) dyrkning av vertscellen; og (c) gjenvinning av polypeptidet. En metode for å produsere et polypeptid kan omfatte: (a) dyrkning av vertscellen ifølge oppfinnelsen under betingelser hvor vektoren er uttrykt; og (b) gjenvinning av polypeptidet.

Polynukleotider

Polynukleotidene omfatter ifølge oppfinnelsen varianter som har substitusjoner, delesjoner og/eller addisjoner som kan involvere én eller flere nukleotider. Variantene kan endres i kodende regioner, ikke-kodende regioner eller begge. Endringer i de kodende regionene kan produsere konservative eller ikke-konservative aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller addisjoner. Spesielt foretrukket blant disse er stumme substitusjoner, addisjoner og delesjoner, som ikke endre egenskapene og aktiviteter av delta-plasmin(ogen)protein eller deler derav. Også spesielt foretrukket i dette henseende er konservative substitusjoner (se nedenfor).

Videre utførelsesformer ifølge oppfinnelsen omfatter nukleinsyremolekyler omfattende et polynukleotid som har en nukleotidsekvens minst 90% identisk og mer foretrukket minst 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med (a) en nukleotidsekvens som koder for delta-plasminogenpolypeptid som har den fullstendige aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 2; (b) en nukleotidsekvens som koder for delta-plasminogenpolypeptid som har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:2; og (c) en nukleotidsekvens komplementær til hvilken som helst av nukleotidsekvensene i (a) eller (b) ovenfor.

Med et polynukleotid som har en nukleotidsekvens minst for eksempel 95% "identisk" med en referansenukleotidsekvens som koder for et delta-plasminogenpolypeptid er det tilsiktede at nukleotidsekvensen av polynukleotidet er identisk med referansesekvensen bortsett fra at polynukleotidsekvensen kan omfatte opptil fem punktmutasjoner pr. 100 nukleotider av referansenukleotidsekvensen som koder for delta-plasminogenpolypeptid. Med andre ord, for å oppnå et polynukleotid som har en nukleotidsekvens minst 95% identisk med en referansenukleotidsekvens, opptil 5% av nukleotidene i referansesekvensen kan deleteres eller substitueres med en annen nukleotid eller flere nukleotider, opptil 5% av de totale nukleotider i referansesekvensen kan være innsatt i referansesekvensen. Disse mutasjoner av referansesekvensen kan forekomme i de 5'- eller 3'-terminale posisjonene av referansenukleotidsekvensen eller hvor som helst mellom de terminale posisjonene, flettet inn enten individuelt blant nukleotider i referansesekvensen eller i én eller flere påfølgende grupper innen referansesekvensen.

Som angitt ovenfor to eller flere polynukleotidsekvenser kan sammenlignes ved å bestemme deres prosent identitet. To eller flere aminosyresekvenser kan likeledes sammenlignes ved å bestemme deres prosent identitet. Prosent identiteten av to sekvenser, hvorvidt nukleinsyre- eller peptidsekvenser, er generelt beskrevet som antallet nøyaktige matcher mellom to oppstilte sekvenser dividert med lengden av den kortere sekvensen og multiplisert med 100. En omtrentlig oppstilling for nukleinsyresekvenser er tilveiebrakt av den lokale homologi algoritmen av Smith og Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Denne algoritmen kan bli utvidet til å anvendes med peptidsekvenser ved anvendelse av scoringsmatriksen utviklet av Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA og normalisert av Gribskov, Nucl. Acids Res. 740:6745-6763 (1986). En implementering av denne algoritmen for nukleinsyre- og peptidsekvenser er tilveiebrakt av "the Genetics Computer Group" (Madison, Wis.) i deres BESTFIT-nytteapplikasjon. De forhåndsgitte parameterne for denne metoden er beskrevet i "the Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, versjon 8 (1995)

(tilgjengelig fra Genetics Computer Group, Madison, Wis.).

Selvfølgelig, på grunn av degenereringen av den genetiske kode, vil en fagmann på området umiddelbart gjenkjenne at et stort antall av nukleinsyremolekylene som har en sekvens minst 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med nukleinsyresekvensen av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 1 vil koder for et delta-plasminogenpolypeptid. Faktisk, fordi degenererte varianter av disse nukleotidsekvensene som alle koder for samme polypeptid, vil dette være klart for fagfolk selv uten å utføre hvilket som helst funksjonelt forsøk eller målinger beskrevet her. Det vil videre være gjenkjent på området at, for slike nukleinsyremolekyler som ikke er degenererte varianter, et rimelig antall også vil kode for et polypeptid som har delta-plasminogenpolypeptidaktivitet. Dette er fordi fagfolk er fullstendig bevist på aminosyresubstitusjoner som er enten mindre sannsynlige eller ikke sannsynlige for betydelig effekt på proteinfunksjon ( f. eks., erstatning av én alifatisk aminosyre med en annen alifatisk aminosyre).

Nylig har fremskritt i den syntetiske produksjonen av lengre polynukleotidsekvenser enablert den syntetiske produksjonen av nukleinsyrer som koder for betydelig lengre polypeptider uten anvendelse av tradisjonelle kloningsteknikker. Kommersielle tilveiebringere av slike tjenester omfatter Blue Heron, Inc., Bothell, W A (http://www.blueheronbio.com). Teknologi anvendt av Blue Heron, Inc. er beskrevet i U.S. patent nr. 6.664.112; 6.623.928; 6.613.508; 6.444.422; 6.312.893; 4.652.639; U.S. publisert patentsøknad nr. 20020119456A1; 20020077471Al; og publiserte internasjonale patentsøknader (publikasjon nr) WO03054232A3; WO0194366A1; W09727331A2; og WO9905322A1.

Selvfølgelig kan tradisjonelle teknikker fra molekylærbiologi, mikrobiologi og rekombinant nukleinsyre også anvendes for å produsere polynukleotidene ifølge oppfinnelsen. Disse teknikkene er velkjent og er forklart i for eksempel Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausebel, ed., Vols. I, II and III (1997); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); DNA Cloning: A Practical Approach, D. N. Glover, ed., Vols. I and JJ (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. L. Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, eds. (1985); Transcription and Translation, Hames and Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, "A Practical Guid to Molecular Cloning"; seriene, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1984); Gen Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory

(1987); og Methods in Enzymology, Wu and Grossman and Wu, eds., henholdsvis vol. 154 og 155.

Vektorer og dyrkete vertsceller

Foreliggende oppfinnelse angår også vektorer som omfatter de isolerte nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse, og dyrkete vertsceller som er genetisk konstruert med de rekombinante vektorene.

Rekombinante konstruksjoner kan innføres i dyrkete vertsceller ved anvendelse av velkjente teknikker slik som infeksjon, transduksjon, transfeksjon, transveksjon, elektroporering og transformasjon. Vektoren kan for eksempel være en fag, plasmid, viral eller retroviral vektor. Retrovirale vektorer kan være replikasjons kompetent eller replikasjons defekte. I det sistnevnte tilfelle vil viral formering generelt forekomme bare i komplement dyrkete vertsceller.

Polynukleotidene kan være bundet til en vektor inneholdende en selekterbar markør for formering i en dyrket vert. Generelt blir en plasmidvektor innført i et presipitat, slik som et kalsiumfosfatpresipitat eller i et kompleks med et ladet lipid. Hvis vektoren er et virus kan det pakkes in vitro ved anvendelse av en passende innpaknings ("packaging") cellelinje og deretter transdusert inn i dyrkete vertsceller.

Foretrukket er vektorer omfattende c/5-regulerende kontrollregioner til polynukleotidet av interesse. Passende £rø«s-regulerende faktorer kan bli levert av den dyrkede vert, levert av en komplementvektor eller levert av vektoren selv ved innføring i den dyrkede verten.

I visse utførelsesformer i dette henseende tilveiebringer vektorene for spesifikk ekspresjon, som kan være induserbare og/eller celletypespesifikke. Spesielt foretrukket blant slike vektorer er de induserbare ved miljøbestemte faktorer som er lette å manipulere, slik som temperatur og næringsmiddel additiver.

Ekspresjonsvektorer anvendelige i foreliggende oppfinnelse omfatter kromosomal-, episomal- og virusavledete vektorer, f. eks., vektorer avledet fra bakterielle plasmider, bakteriofager, gjær episomer, gjær kromosomale elementer, virus slik som baculoviruser, papova-viruser, vaccinia viruser, adenoviruser, fugle poxviruser, pseudorabies viruser og retroviruser og vektorer avledet fra kombinasjoner derav, slik som kosmider og fagmider.

DNA inserter skal være operativt bundet til en passende promoter, slik som fag lambda PL-promoteren, E. coli lac, trp og tac promoterene, SV40 tidlige og sene promoterene og promotere av retroviral LTRer, for å nevne noen få. Andre egnede promotere vil være kjent for fagfolk. Ekspresjonskonstruksjonenene vil videre inneholde seter for transkripsjonsinitiering, -terminering og, i den transkriberte regionen, et ribosombindingssete for translasjon. Den kodende del av de modne transkriptene uttrykt ved konstruksjonene vil fortrinnsvis omfatte en translasjonsinitiering i begynnelsen og et termineringskodon (UAA, UGA eller UAG) passende posisjonert ved slutten av polypeptidet som blir translatert.

Som angitt vil ekspresjonsvektorene fortrinnsvis omfatter minst én selekterbar markør. Slike markører omfatter dihydrofolatreduktase eller neomycinresistens for eukaryot cellekultur og tetracyklin- eller ampicillinresistens gener for dyrkning av i E. coli og andre bakterier. Representative eksempler på passende dyrkete verter omfatter, men er ikke begrenset til, bakterieceller, slik som E. coli, Streptomyces og Salmonella typhimurium celler; fungale celler, slik som gjærceller; insektceller slik som Drosophila S2 og Spodoptera Sf9 celler; dyreceller slik som CHO, COS og Bowes melanomceller; og planteceller. Passende dyrkningsmedier og betingelser for de ovenfor beskrevne dyrkete vertscellene er kjent på området.

Blant vektorer foretrukket for anvendelse i bakterier omfattes pQE70, pQE60 og pQE-9, tilgjengelige fra Qiagen Inc., Valencia, CA; pBS-vektorer, PHAGESCRIPT-vektorer, BLUESCRIPT-vektorer, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, tilgjengelige fra Stratagene, LaJolla, CA; og ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 tilgjengelige fra Pharmacia (nå Pfizer, Inc., New York, NY). Blant foretrukne eukaryote vektorer er pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl og pSG tilgjengelige fra Stratagene; og pSVK3, pBPV, pMSG og pSVL tilgjengelige fra Pharmacia. Andre egnede vektorer vil lett være klart for fagfolk.

Bakterielle promoterer egnet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse omfatter E. coli lad og lacZ promoterene, T3 og T7 promoterene, gpt promoteren, lambda PR og

PL promoterene og trp promoteren. Egnete eukaryote promoterer omfatter CMV svært tidlig ("immediate early") promoteren, HSV thymidinkinasepromoteren, de tidlige og sene SV40-promoterene, promoterene til retrovirale LTRer, slik som de til Rous sarkom viruser (RSV) og metallotioneinpromotere, slik som muse metallotionein-I-promoteren.

Innføring av en vektorkonstruksjon inn i den dyrkede vertscellen kan utføres ved kalsiumfosfattransfeksjon, DEAE-dekstranmediert transfeksjon, kationisk lipidmediert transfeksjon, elektroporering, transduksjon, infeksjon eller andre metoder. Slike metoder er beskrevet i mange standard laboratoriemanualer, slik som Davis et al, Basic Methods In Molecular Biology, 2. Ed. (1995).

Transkripsjon av DNAet som koder for polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse av høyere eukaryoter kan økes ved innsetting av en enhancersekvens inn i vektoren. Enhancere er czs-regulerende elementer av DNA, vanligvis omtrent fra 10 til 300 bp som virker for å øke transkripsjonen aktivitet til en promoter i en gitt dyrket vertscelletype. Eksempler på enhancere omfatter SV40 enhanceren, som er lokalisert på den sene siden av replikasjonsorigoet ved bp 100 til 270, cytomegalovirus tidlig promoter enhanceren, polyoma enhanceren på den sene siden av replikasjonsorigoet og adenovirus enhancere.

For sekresjon av det translaterte proteinet i lumenet av det endoplasmatiske reticulumet, i det periplasmiske rommet eller i den ekstracellulære omgivelsen kan passende sekresjonssignaler innføres i det uttrykte polypeptidet. Signalene kan være endogene til polypeptidet eller de kan være heterologe signaler.

Polypeptidet kan uttrykkes i en modifisert form, slik som et fusjonsprotein, og kan omfatte ikke bare sekresjonssignaler, men også ytterligere heterologe funksjonelle regioner. For eksempel kan en region av ytterligere aminosyrer, spesielt ladet aminosyrer, settes til N-terminus av polypeptidet for å forbedre stabilitet og persistens i den dyrkede vertscellen, under rensning eller under påfølgende håndtering og lagring. Peptidgrupper kan også tilsettes til polypeptidet for å lette rensning. Slike regioner kan fjernes før endelig fremstilling av polypeptidet. Tilsetningen av peptidgrupper til polypeptider for blant annet å fremkalle sekresjon eller utskilling, for å forbedre stabilitet og for å lette rensning er familiære og rutinemessige teknikker på området. Et foretrukket fusjonsprotein omfatter en heterolog region fra immunoglobulin som er anvendelig for å løse opp proteiner. For eksempel EP 0 464 533 Al (kanadisk motstykke 2.045.869) beskriver fusjonsproteiner omfattende forskjellige deler av konstant region til immunoglobulinmolekyler sammen med et annet humant protein eller del derav. I mange tilfeller er Fc-delen i et fusjonsprotein grundig fordelaktig for anvendelse i terapi og diagnoser og således resultater, for eksempel i forbedrete farmakokinetiske egenskaper. På den andre siden for noen anvendelser ville det være ønskelig å være i stand til å fjerne Fc-delen etter at fusjonsproteinet er uttrykt, detektert og renset på den fordelaktige måten beskrevet. Dette er tilfellet når Fc-del anerkjennes å være en hindring for anvendelse i terapi og diagnose for eksempel når fusjonsproteinet skal anvendes som antigen for immuniseringer. I medikament oppdagelse er for eksempel humane proteiner kondensert med Fc-deler for formålet av høygjennomstrømnings screeningsforsøk (slik som hTL5-reseptor, for å identifisere antagonister av hIL-5). Se Bennett, D., et al, J. Molecular Recognition, 5:52-58(1995) og Johanson, K. et al, J. Biol. Chem., 270(7^:9459-9471 (1995).

Delta-plasminogenprotein kan gjenvinnes og renses fra rekombinante cellekulturer ved velkjente metoder omfattende de spesifikt beskrevet i eksemplene her. Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter naturlige rensete produkter, produkter av kjemisk-syntese prosedyrer og produkter produsert ved rekombinante teknikker fra en prokaryot eller eukaryot dyrket vert, omfattende for eksempel bakterielle, gjær, høyere plante, insekt og pattedyrceller. I tillegg kan polypeptider ifølge oppfinnelsen også omfatte en innledende modifisert metioninresidue, i noen tilfeller som et resultat av vertsmedierte prosesser.

Polypeptider

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter de som koder for variasjoner og spesielle eksempler på polypeptidene ifølge oppfinnelsen. For eksempel er veiledning angående hvorledes man lager fenotypisk stumme aminosyresubstitusjoner tilveiebrakt i Bowie, J. U. et al, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990), hvor forfatterne indikerer at proteiner er overraskende tolerante til aminosyresubstitusjoner. Selv om hvilket som helst antall av substitusjoner innenfor omfanget ifølge oppfinnelsen kan oppnås ved anvendelse av slik generelle prinsipper, for spesifikk veiledning angående substitusjoner kan referansene sitert her angående struktur og funksjon av kringle 1-domener bli konsultert av fagfolk på området.

Det vil videre forstås at, avhengig av kriteriene anvendt, den nøyaktige "posisjonen" av kringle 1, aktiveringssetet og serinproteasedomenene til delta-plasminogenpolypeptidet kan avvike lett, spesielt variasjoner innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. For eksempel den nøyaktige lokasjonen av kringle 1-domenet i forhold til aktiveringssetet kan variere lett og/eller sekvensen N-terminalt til kringle 1-domenet kan variere i lengde. Således omfatter oppfinnelsen slike variasjoner av delta-plasminogenpolypeptidet som viser delta-plasminogenpolypeptidaktivitet som beskrevet her. Slike varianter omfatter delesjoner, insersjoner, inversjoner, repetisjoner og substitusjoner. Som angitt ovenfor kan veiledning angående hvilke aminosyreendringer som er sannsynlige å være fenotypisk stumme bli funnet i Bowie, J. U. et al, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310(1990).

Således kan fragmenter, derivater eller analoger av polypeptidet med SEKV ID NR: 2 være (i) en hvor én eller flere av aminosyreresiduene ( f. eks., 3, 5, 8, 10, 15 eller 20) er substituert med en konservert eller ikke-konservert aminosyreresidue (fortrinnsvis en konservert aminosyreresidue). Slike substituerte aminosyreresiduer kan eller kan ikke være én kodet for av den genetiske kode eller (ii) en hvor én eller flere av aminosyreresiduene omfatter en substituent gruppe ( f. eks., 3, 5, 8, 10, 15 eller 20) eller (iii) en hvor det modne polypeptidet er kondensert med en annen forbindelse, slik som en forbindelse for å øke halveringstiden til polypeptidet (for eksempel polyetylenglykol) eller (iv) en hvor de ytterligere aminosyrene er kondensert til det modne polypeptidet, slik som et IgG-Fc-fusjonsregion peptid eller leder eller sekretorisk sekvens eller en sekvens som blir anvendt for rensning av det modne polypeptidet eller en proproteinsekvens. Slike fragmenter, derivater og analoger er ansett å være innenfor omfanget av fagfolk på området fra undervisningene her.

Som angitt er endringer fortrinnsvis av en mindre nature, slik som konservative aminosyresubstitusjoner som ikke betydelig påvirker foldingen eller aktiviteten til proteinet. Selvfølgelig vil antallet aminosyresubstitusjoner en fagmann gjør avhenge av mange faktorer, omfattende de beskrevet ovenfor. Generelt talende om antallet substitusjoner for hvilken som helst gitt delta-plasminogenpolypeptid vil ikke være mer enn 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 eller 3.

Aminosyrer i delta-plasminogenpolypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse som er essensiell for funksjon kan identifiseres ved metoder kjent på området, slik som setedirigert-mutagenese eller alaninscanning-mutagenese (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Den sistnevnte prosedyren innfører enkle alaninmutasjoner ved hver residue i molekylet. De resulterende mutantmolekylene blir deretter testet for biologisk aktivitet, f. eks., som vist i eksemplene tilveiebrakt her. Seter som er kritisk for ligandbinding kan også bestemmes ved strukturell analyse slik som krystallisering, kjernemagnetisk resonans eller fotoaffinitet merking (Smith, et al, J. Mol. Biol. 224:399-904 (1992) og de Vos, et al. Science 255:306-312 (1992)). Selv om delesjon av én eller flere aminosyrer fra N-terminus av et protein resulterer i modifikasjon eller tap av én eller flere biologiske funksjoner til proteinet, kan andre biologisk aktiviteter fortsatt være beholdt.

Det er også antatt at polypeptider anvendelige i produksjon av de "isolerte polypeptidene" ifølge oppfinnelsen kan produseres ved fastfase syntesemetoder. Se Houghten, R. A., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 52:5131-5135 (1985); og U.S. pat. nr. 4.631.211 til Houghten et al. (1986).

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringes i en isolert form. Med "isolert polypeptid" er det tilsiktede et polypeptid fjernet fra sin native omgivelse. Således er et polypeptid produsert og/eller inneholdt innen en rekombinant dyrket vertscelle betraktet isolert for formål ifølge foreliggende oppfinnelse. Også tilsiktede som et "isolert polypeptid" er polypeptider som er renset, delvis eller hovedsakelig, fra en rekombinant dyrket vert.

Polypeptider som har en aminosyresekvens av en angitt prosent identitet med en referanseaminosyresekvens av et delta-plasminogenpolypeptid kan bestemmes ved anvendelse av metodene, omfattende dataassisterte metoder, angitt ovenfor angående polynukleotider. Polypeptidaminosyresekvenser er undersøkt og sammenlignet på samme måte som nukleotidsekvensene er i foregående omtale. En fagmann på området vil forstå at slike begrep som de molekylære endepunktene beskrevet for polynukleotider vil har direkte analoger når overveiet de tilsvarende anvendelse av slike metoder og programmer for polypeptidanalyse. For eksempel de manuelle korreksjoner beskrevet angående polynukleotider refererer til 5'- og 3'-endepunkter av nukleinsyrer, men samme omtale vil være gjenkjent som anvendbar til N-termini og C-termini av polypeptider.

Oppfinnelsen omfatter delta-plasminogenpolypeptider som er differensiert modifisert under eller etter translasjon,/e£s., ved glykosylering, acetylering, fosforylering, amidering, derivatisering med kjente beskyttelse-/blokkeringsgrupper, proteolytisk spaltning, binding til et antistoffmolekyl eller andre cellulære ligand, etc. Hvilken som helst av en rekke kjemisk modifikasjoner kan utføres ved kjente teknikker omfattende, men ikke begrenset til, spesifikk kjemisk spaltning ved cyanogenbromid, trypsin, chymotrypsin, papain, S. aurens V8-protease, NaBH*; acetylering, formylering, oksidasjon, reduksjon; metabolsk syntese i nærvær av tunicamycin; etc.

Ytterligere posttranslasjonelle modifikasjoner omfattet av oppfinnelsen omfatter for eksempel f. eks., N-bundet eller O-bundet karbohydratkjeder, prosessering av N-terminal eller C-terminal ender, binding av kjemiske grupper til aminosyreryggraden, kjemiske modifikasjoner av N-bundet eller O-bundet karbohydratkjeder og tilsetning av en N-terminal metioninresidue som et resultat av vektorer og konstruksjoner tilpasset for ekspresjon av delta-plasminogenpolypeptider i prokaryote dyrkete vertsceller. Polypeptidene kan også modifiseres med et detekterbart merke, slik som et enzymatisk, fluorescerende, isotopisk eller affinitetsmerke for å tillate for deteksjon og isolering av proteinet.

Farmasøytiske preparater og metoder for behandling

Delta-plasmin(ogen) kan formuleres for terapeutisk anvendelse i henhold til metodene og preparatene beskrevet i US 2003/0012778 Al; og Novokhatny, V., et al., J. Thromb. Haemost. 70:1034-41 (2003), begge inntatt her ved referanse. For eksempel kan en lav-pH (fra ca. 2,5 til ca. 4), lav bufringskapasitets buffer anvendes for formulering av delta-plasmin. I tillegg kan andre metoder og formuleringer kjent for fagfolk på området, som praktisert med plasmin, mini-plasmin og/eller mikro-plasmin, anvendes for å formulere delta-plasmin ifølge oppfinnelsen til terapeutisk administrering.

Delta-plasmin(ogen) kan anvendes for å behandle en rekke trombotiske sykdommer eller lidelser, for eksempel i henhold til metodene som beskrevet i U.S. patent nr. 6.355.243; og publisert U.S. patentsøknad nr. US 2003/0026798 Al; US 2003/0175264 Al. Igjen, som med de mulige farmasøytiske formuleringer anvendbare for delta-plasmin, kan delta-plasmin også administreres terapeutisk ved metoder kjent på området, for eksempel de som for tiden praktiseres med plasmin, mini-plasmin og/eller mikro-plasmin.

EKSEMPLER

Ekspresj onsvektordesign

Aminosyresekvensen for delta-plasminogen er vist i SEKV ID NR: 2. En antatt sekvens som koder for delta-plasminogen ble kodonoptimalisert for E. coli- ekspresj on og mRNA-stabilitet for å produsere DNA-sekvensen som vist i SEKV ID NR: 1.

Dette DNAet ble kjemisk syntetisert (Blue Heron, Inc,) og innsatt i Ndel- og BamHl-setene til E. co//'-ekspresjonsvektor pET22b(+) (Novagen; Madison, WI) for å produsere cytosolisk protein. Denne konstruksjonen gir delta-plasminogen med en ytterligere, ikke-native, N-terminal metionin. (pET-22b(+) = pET ekspresjonssystem 22b (Kat. nr. 70765), EMD Biosciences, Inc., Novagen Brand, Madison, WI; se http://www.emdbiosciences.com produktinformasjonskapittel angående pET-22b for detaljer angående vektor).

Delta-plasminogenekspresjon og rensning

DNAet som koder for delta-plasminogensekvens ble transformert inn i en rekke celler og protein overekspresjon etterfulgt av induksjon ved ImM IPTG (isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid) ble analysert ved SDS-PAGE. Celletype BL21(DE3)-RIL (Stratagene, La Jolla, CA)-celler, konstruert for å uttrykke sjelden E. coli tRNAer som koder for Arg, Ile og Leu, ble anvendt for produksjon av delta-plasminogen.

Produksjon av delta-plasminogen ble bekreftet i større skala ekspresjon hvor celler ble lysert og både oppløselig protein og rensete inklusjonslegemer ble undersøkt ved SDS-PAGE. BL21(DE3)-RTL-celler produserte betydelig delta-plasminogenprotein i form av inklusjonslegemer. Ekspresjonsestimater ble 50-80 mg/L cellekultur.

Den følgende typiske protokollen har vært anvendt for ekspresjon av delta-plasminogen: En enkel koloni av BL21(DE3)-RIL-celler inneholdende delta-plasminogenvektoren ble anvendt for å inokulere 5 ml LB/ampicillin (100 ug/ml) /kloramfenikol (50 ug/ml) og ble inkubert i 8 timer ved 37°C på en ristemaskin. Etter dette ble en 50 ul-alikvot tatt fra den dyrkede bakterielle suspensjonen for videre vekst i frisk media. Metoden ble gjentatt etter 16 timer med 6 ml bakteriell kultur og 250 ml av mediet. Kulturer ble dyrket ved 37°C med risting til en OD600 nm på~1,0 og IPTG ble tilsatt til 1 mM endelig konsentrasjon. Kulturer ble dyrket i ytterligere 5 timer. Celler ble høstet ved sentrifugering ved 5,000 x g og cellepelleter ble løst opp i 20 mM Tris pH 8,0 inneholdende 20 mM EDTA og frosset ved -80 °C.

For å rense delta-plasminogen ble cellepelleter tint og buffer tilsatt inntil løsningsvolumet ble omtrent 1/20-del av det opprinnelige cellekulturvolumet. Etter det ble lysozym tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/ml og cellene ble omrørt raskt ved 4°C i 10 - 15 minutt. Deretter ble Triton X-100 tilsatt til 1% endelig konsentrasjon og omrøring fortsatte i enda 10 min. DNAse I (0,05 mg/ml) og MgCk (2,5 mM) ble tilsatt og omrøring fortsatte ved 4°C i 30 minutter eller inntil løsningen ikke lenger var viskøs. Den endelige løsning ble sentrifugert ved 4°C i 30 min ved 15.000 x g og supernatanten ble kastet.

Cellepelleten ble vasket tre ganger med vaskeløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7,4 inneholdende 10 mM EDTA, 1 % Triton-X-100 og 0,5 M urinstoff) og den endelige pelleten ble løst opp i 40 ml ekstraksjonsbuffer (PBS, pH 7,4 inneholdende 10 mM EDTA, 20 mM DTT og 6 M guanidin-HCl) og lagret ved 4 °C natten over. Etter 16 timer ble løsningen sentrifugert i 30 minutter ved 15.000 x g for å fjerne faste stoffer og supernatanten ble langsomt satt til refoldingsløsningen (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3,5 M guanidin-HCl, 0,5 M arginin-HCl, 10 mM EDTA, 3 mM GSH, 0,3 mM GSSG) under omrøring ved 4°C. Refoldingsprosedyren ble utført ved proteinkonsentrasjon på 0,03 mg/ml eller mindre.

Refoldingsløsningen ble holdt i 2 dager ved 4°C uforstyrret og deretter dialysert mot en 8-ganger volum av 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 inneholdende 10 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,15 M arginin-HCl, over en periode på 8-10 timer med frekvent utbytting av bufferløsningen.

Proteinløsningen ble deretter fjernet fra dialyse og konsentrert ved anvendelse av AMICON-filtrer med membran-cut-off på 10 kDa til omtrent 10 -20 ml og dialysert natten over versus en 100-ganger volum av 0,1 M Tris pH 8,0 inneholdende 10 mM EDTA, 0,15 M NaCl. Dette materialet ble sentrifugert for å fjerne partikkelformige materialer, deretter passert over lysinaffinitetsresin (Lysin-SEPHAROSE 4B; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Delta-plasminogen ble eluert fra resinet ved anvendelse av Tris-bufret saltløsning, pH 8,0 inneholdende 0,2 M epsilon-aminokapronsyre (sACA).

Typisk kan 80 mg inklusjonslegemer isoleres fra 1 liter cellekultur og 40 mg kan bli eluert i lysin-SEPHAROSE-kromatografitrinnet.

Egenskaper til delta-plasminogen

Renset delta-plasminogen fremtrer som et enkelt band i 35-40 kDa regionen ved SDS-PAGE-analyse med redusert (ditiotreitol-behandlet) og ikke-redusert protein (se fig. 5). Dens nøyaktige molekylære masse, bestemt ved MALDI massespektrometri, ble 37.089 Da, meget nær til den forventete verdien på 37.198 Da.

For å teste hvorvidt delta-plasminogen (APg) kunne bli aktivert til delta-plasmin, ble delta-plasminogen inkubert med urokinase (1:1000 molarforhold) og økningen i serinproteaseaktivitet ble overvåket ved å måle økningen i hastigheten av S-2251-hydrolyse (S-2251 = D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH). Som vist i fig. 6 er en parabolisk økning i aktivitet typisk for den koblete aktiveringsreaksjonen (zymogen blir omdannet til aktivt enzym (1); og enzym spalter det kromogene substratet (2)) observert. Aktivering av delta-plasminogen til delta-plasmin var fullstendig innen 3 minutter under disse betingelsene. Meget lignende resultater ble oppnådd med tPA og streptokinase.

Kinetikken for urokinaseaktiveringen av delta-plasminogen ble sammenlignet med den for fullengde plasminogen ved anvendelse av metoden til Wohl et al. (Wohl, R.C., Summaria, L., Arzadon, L. and Robbins, K.C.; J. Biol. Chem. 253: 1402-1407 (1978)). For dette formålet ble 5,8 nM urokinase satt til løsninger inneholdende forskjellige konsentrasjoner av plasmintyper i nærvær av 1 mM S-2251-substrat ved 37 °C, pH 7,5. Økningen i absorbans ved 405nm ble overvåket og akselereringshastigheten av S-2251-produktdannelse ble beregnet ved anvendelse av en parabolisk ligning hvor hastighet = k»t<2>. Data ble tilpasset til en Michaelis-Menten kinetisk modell ved anvendelse av Lineweaver-Burk-analyser, hvilket resulterer i verdiene nedenfor:

Fullengde plasminogen ble godt aktivert av urokinase med Km-verdier lignende de funnet i litteraturen (1,7 uM; Wohl, R.C., Summaria, L. and Robbins, K.C.; J. Biol. Chem 255( 5) : 2005-2013 (1980)) og ekvivalente kcat-verdier.

Km-verdier for urokinaseaktivering av delta-plasminogen ble omtrent 30-ganger høyere enn for plasminogen, muligens indikerende en lavere affinitet av urokinase for denne mutanten av plasminogen. Samtidig ble kcat-verdien for aktivering av delta-plasminogen meget høyere enn for plasminogen. Til tross for ovennevnte forskjeller i kcat og Km er deres forhold, eller katalytisk effektivitet, omtrent det samme for aktivering av de naturlige og rekombinantmodifiserte plasminogentypene med urokinase. Således indikerer disse data at tilstedeværelsen av en "fremmed" kringle 1 ikke betraktelig påvirker aktiveringsegenskapene til serinproteasedomenet i delta-plasminogen.

I enda et annet aktiveringsforsøk ble delta-plasminogen inkubert med streptokinase, tPA og urokinase og analysert på redusert-SDS-PAGE for å observere omdannelsen av enkjede delta-plasminogenmolekylet til tokjede delta-plasmin (se fig. 5, spor 3-5). I alle tre tilfeller, to kjeder (-12 kDa kringle 1 og~25 kDa serinproteasekjeden) av delta-plasmin kunne sees, hvilket indikerer at delta-plasminogen virkelig kan aktiveres av alle tre plasminogen aktivatorer.

Som forventet binder delta-plasminogen til lysin-SEPHAROSE via kringle 1 og kunne elueres fra kolonnen ved gradienten av sACA som en enkel topp (se figur 7). Evnen til refoldet delta-plasminogen for å binde lysin-SEPHAROSE indikerer at kringledomenet av molekylet er riktig foldet og lysinbindingssetet er fullstendig aktivt.

For å videre bekrefte funksjonaliteten til kringle 1 ble bindingen av eACA til delta-plasminogen målt ved overvåkning av de assosierte endringene i proteinfluorescens som beskrevet av Matsuka et al. (Matsuka, Y.V., Novokhatny, V.V. and Kudinov, S.A., Eur. J. Biochem. 790:93-97 (1990)) og Douglas et al. (Douglas, J.T., von Haller, P.D., Gehrmann, M., Llinas, M. and Schaller. J., Biochemistry 47:3302-3310(2002)). Binding av sACA til kringle 1 av delta-plasminogen resulterer i en reduksjon i fluorescens, sannsynlig på grunn av quenching av tryptofanresiduene som er del av lysinbindingssetet.

For å overvåke denne prosessen ble 4 ul til 16 ul alikvoter av en konsentrert løsning av sACA satt til 2 ml 5 uM delta-plasminogen i 50 mM Tris-buffer inneholdende 20 mM NaCl, pH 8,0, 25°C. Fluorescensen ble overvåket ved en eksitasjonsbølgelengde på 298nm og en emisjonsbølgelengde på 340nm i et FLUORMAKS fluorescens spektrofotometer (Jobin Yvon, Inc., Edison, NJ); etter hver tilsetning av sACA fikk løsningen ekvilibrere inntil ingen videre endringer i fluorescens ble observert.

De resulterende fluorescensverdiene ble korrigert for fortynning og plottet versus konsentrasjonen av sACA over et område på 0 - 50 uM sACA. Data ble tilpasset ved ikke-lineær regresjon for å oppnå en Kdpå 11,1 +/- 2,3 uM, i god overensstemmelse med litteraturverdier for kringle 1-affinitet for eACA på 3,2 uM (Matsuka, et al) og 13 uM (Douglas, et al).

En egenskap til plasmin er dens evne til å binde fibrin. For å bestemme hvorvidt delta-plasminogen beholder evnen til å interagere med fibrin ble dens fibrinbindendesegenskaper testet i et mikrotiterplateforsøk hvor binding av delta-plasminogen til fibrin ble bedømt ved dens påfølgende aktivering med tPA og resulterende koagel lyse. For dette formål ble 100 ul av 5 mg/ml fibrinogen polymerisert med trombin i hver brønn av en mikrotiterplate. Forskjellige konsentrasjoner av delta-plasminogen ble tilsatt på toppen av fibrinkoaglene og inkubert i 1 time ved 37°C. Platen ble vasket i stor utstrekning med PBS mens fibrinkoaglene fortsatt var intakte og bundet til brønnene. Etter vasking ble en 0,1-mg/ml løsning av tPA satt til hver brønn og platen ble inkubert 2 timer ved 37°C. Som et resultat var noen av koaglene fullstendig oppløst og noen ble delvis oppløst, mens brønner med meget lave mengder av delta-plasminogen og kontrollbrønner forble praktisk talt intakte. Graden av fibrinolyse ble overvåket ved å måle 280nm absorbansen av rester av de innledende koagler rekonstituert i IM NaOH. Absorbansverdiene ble plottet som en funksjon av delta-plasminogenkonsentrasjon.

Som sett i fig. 8 følger bindingen av delta-plasminogen til fibrin en klassisk, sigmoidal bindingskurve. Ved anvendelse av dette forsøket ble det funnet at delta-plasminogen binder fibrin med affinitet sammenlignbar med det for fullengde plasminogen og C50av denne interaksjonen (-0,2 uM) er sammenlignbar med Ka for fibrinbinding av fullengde plasminogen (Lucas, M.A., Fretto, L.J. and McKee, P.A.; J. Biol. Chem. 258( 7) : 4249-4256 (1983)). Disse forsøkene indikerer at delta-plasminogen kan binde fibrin.

Således indikerer interaksjonen av delta-plasminogen med lysin-SEPHAROSE, dens evne til å binde sACA med den forventete Ka, dens evne til å binde fibrin, dens evne å bli aktivert av alle hovedplasminogenaktivatorer og potensen av delta-plasmin mot det kromogene plasminsubstratet S-2251 alle at dette molekylet ble produsert i E. coli-systemet i en fullstendig funksjonell form.

Delta-plasminrensning og formulering

Delta-plasminogen, dialysert mot 0,1M Tris-buffer, pH 8,0 inneholdende 10 mM EDTA og 0,15 M NaCl, ble aktivert til delta-plasmin ved anvendelse av urokinase immobilisert på SEPHAROSE 4B i det vesentlige som beskrevet tidligere for plasmin (Marder, V.J., et al, Thromb Haemost., 86( 3) :739- 45 (2001)). Aktivering skjedde ved romtemperatur og ble overvåket i samtid ved økningen i S-2251-aktivitet. Avhengig av mengden av delta-plasminogen, som varierte fra batch til batch (typisk 1-2 mg/ml), ble inkuberingstid 30-60 min. Ved fullføring av aktivering, når S-2251-aktiviteten nådde et platå, ble urokinase-SEPHAROSE filtrert fra og aktiv delta-plasmin ble oppfanget på benzamidin-SEPHAROSE (Pharmacia). Delta-plasmin ble eluert fra resinet ved anvendelse av lav-pH buffer (0,2 M glycin, pH 3,0, 0,3 M NaCl, 0,2M sACA).

Proteinkonsentrasj onene og S-2251-aktiviteten i elueringsfraksjoner ble målt. Høy spesifikk aktivitets fraksjoner ble samlet og dialysert mot multiple utbyttinger av 0,15 M NaCl, pH 3,6 ved 4°C. SDS-PAGE-analyser av ikke-redusert delta-plasminprøver (se fig. 9, spor 3) viser at renheten av dette materialet vanligvis er mer enn 95%. Under reduserte betingelser (fig. 9, spor 4), i tillegg til serinprotease- og kringlekj edene, er det to svake bånd ovenfor og nedenfor kringlebandet. Disse båndene representerer auto-nedbrytningsprodukter av serinproteasedomenet som resultat fra indre spaltninger av dens polypeptidkjede; de er normalt holdt sammen ved disulfidbindinger, men blir synlige med PAGE under reduserende betingelser. Mengden av auto-nedbrytningsprodukter, som typisk ikke oversteg 10%, ble sterkt redusert ved å utføre benzamidin-SEPHAROSE-rensningstrinnet i batch-modus istedenfor kolonneformatet.

Fordi delta-plasmin, lignende fullengde plasmin, er tilbøyelig til auto-nedbrytning ved fysiologisk pH, ble pH 3,6 valgt for den endelige formuleringen (surgjort med eddiksyre-saltløsning). Som vist tidligere for plasmin (Novokhatny, V. et al, J Thromb Haemost., 70:1034-41 (2003), inntatt ved referanse) og bekreftet i forsøk med delta-plasmin, denne lave bufringskapasiteten, lav pH formulering ikke bare tillater sikker lagring av aktiv plasminer for forlenget tidsrom, men er også kompatibel med parenteral administrering av disse direkte trombolytika. Når blandet med plasma eller nøytral-pH-buffere er delta-plasmin raskt reaktivert.

Enzymatisk egenskaper til delta-plasmin

Den amidolytiske aktiviteten til delta-plasmin ble undersøkt ved anvendelse av plasminsubstratet D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid (S-2251) (DiaPharma, West Chester, OH). Ved pH 7,4, 25 °C i PBS-buffer ble Michaelis-Menten-konstanten (Km) for S-2251 funnet å være 138 uM (tabell 2). kcat for fremstillingen ble funnet å være 510 min"<1>. Ved anvendelse av 4-nitrofenyl 4-guanidinobenzoathydroklorid (pNPGB)-titrering (Chase, T. and E. Shaw, Methods Enzymol. 797:20-27(1970)), prosenten av funksjonelle aktive seter ble funnet til å være 67%. Korrigert kcat for prosent aktive seter ble en kcat på 755 +/- 45 min"<1>bestemt. Denne verdien var meget nær til verdien bestemt i samme forsøk for fullengde plasmin, 760 +/-23 min-1 og for mikro-plasmin (som mangler alle fem kringler), 795 +/- 24 min"<1>(se figur 9). Disse data indikerer at tilstedeværelse eller fravær av kringler ikke påvirke den katalytiske aktiviteten til serinproteasedomenet.

Hemningshastigheten av delta-plasmin ved OK-makroglobulin ble målt ved anvendelse av metoden ifølge Anonick et al. (Anonick, P., et al, Thrombosis Res. 59:449-462 (1990)). Hemningshastigheten ble funnet å være 7,6 +/- 0,6 x IO<5>NTV1 ved 22 °C i PBS-buffer.

Hemningshastigheten av delta-plasmin ved a2-antiplasmin ble bestemt til å være 1,1 x IO<7>M"<x>s"<x>ved anvendelse av metoden ifølge Wiman og Coilen (Wiman, B. and D. Coilen, Eur. J. Biochem. 54:573-578 (1978)) hvor plasmin og a2-antiplasmin blir blandet deretter undersøkt for S-2251-aktivitet ved spesifikke tidspunkter (tabell 3). Disse verdiene er sammenlignbare med angitt verdier for plasmin av 2,5 x IO<7>M^s"<1>(fra Anonick, et al, Thrombosis Res. 59:449 (1990)).

Samme forsøk utført med mikro-plasmin avslørte (X2-antiplasmin hemningshastigheter på 1,8 x 10<5>M"1s"1og 3,1 x 10<5>M"<1>s"<1>i to separat forsøk. Hastigheten av a2-antiplasminhemning til mini-plasmin (mini-plasmindomenepreparat, K5-SP) ble bestemt å være 2,4 x 10<5>M"<1>s"<1>. Disse data er i rimelig samsvar med litteraturverdier for mikro- og mini-plasmin og viser at hemning av delta-plasmin ved ai-antiplasmin er 40-ganger raskere enn hemning av enten mikro-plasmin eller mini-plasmin. Således indikerer disse resultater at delta-plasmin raskt skulle være hemmet av <xi-antiplasmin på grunn av tilstedeværelsen av kringle 1 i dens struktur.

Totalt viser dataene presentert i dette kapittelet at de enzymatiske og hemmende egenskapene til delta-plasmin er lignende fullengde plasmin.

Litteraturverdier er tatt fra Anonick, et al, Thrombosis Res. 59:449(1990). Alle hastigheter ble målt i henhold til metodene publisert i Anonick, et al.

In vitro trombolytisk effektivitet

Den trombolytiske effektiviteten av delta-plasmin ble testet i en in vz'£ro-modell av kateterassistert trombolyse (Novokhatny, V. et al, J Thromb Haemost., 70:1034-41

(2003), inntatt ved referanse) ved anvendelse av den følgende eksperimentelle protokollen.

Frisk humant fullblod ble oppsamlet i 20 x 0,95 cm glassrør og tillat å koagulere spontant uten additiver. Rør ble inkubert i 20 timer ved 37°C for å tillate full retraksjon. Tilbakedannete koagler ble separert fra serum ved anvendelse av USA-standardtestingssikter Dl6 med 14 mesh og deres vekts ble bestemt. Blodkoagler ble overført til mindre diameter glassrør hvor de tilbakedannete koaglene tilpasset stramt (0,8 x 7 cm). Gjennomsnittsvekten av koaglene var -3,6 g.

Enkle 1-ml doser av surgjort saltløsning, plasmin eller delta-plasmin ble injisert inn i koagelet ved anvendelse av en sprøyte. Koaglene ble inkubert i 1 time ved 37°C i en THELCO-laboratorieovn (Jouan, Inc., Winchester, VA). Etter inkuberingen ble koaglene igjen plassert på sikten for å fjerne det løste materialet og vekten til de fordøyete koaglene ble målt. Omfanget av koagellyse ble bestemt fra forskjellen mellom den innledende koagelvekten og vekten til gjenværende koagel og ble uttrykt som en prosent av koagelvektreduksj on.

Figur 10 viser resultatene av lyseforsøk med delta-plasmin i denne modellen. Infusjonen av enkel 0,44 mg (ekvivalent til 1 mg/ml plasmin på en molarbasis)-dose av delta-plasmin resulterte i 36% koagelvektreduksj on innen 60 min. Samtidig redusertes vekten til koaglene infusert med saltløsning bare med 4%. Plasmin (1,0 mg) resulterte i 50% koagelvektreduksj on i samme periode. Således viser disse data at delta-plasmin oppviser trombolytisk potens og kan anvendes som et direkte trombolytisk middel.

Claims (18)

1. Polynukleotid,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har et enkelt N-terminalt kringledomene som er minst 90% identisk med kringle 1 domenen til nativt humant plasminogen; og et C-terminalt domene som er minst 90% identisk med aktiveringssete og serinproteasedomenen til humant plasminogen, idet polypeptidet binder til immobilisert lysin og kan bli aktivert av en plasminogenaktivator.

2. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det kodete polypeptidet er SEKV JD NR: 2 med ikke mer enn 30 aminosyrersubstitusjoner.

3. Polynukleotid ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat det kodete polypeptidet er minst 90% identisk med sekvensen vist i SEKV ID NR:2.

4. Polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert vedat det kodete polypeptidet er minst 95% identisk med sekvensen vist i SEKV ID NR: 2.

5. Polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert vedat det kodete polypeptidet er minst 98% identisk med sekvensen vist i SEKV ID NR: 2.

6. Polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert vedat det kodete polypeptidet er sekvensen vist i SEKV ID NR:2.

7. Polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert vedat nukleotidsekvensen til polynukleotidet er sekvensen vist i SEKV ID NR: 1 eller en degenerert variant derav.

8. Polypeptid,karakterisert vedat det er kodet av nukleinsyren ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

9. Polypeptid ifølge krav 8,karakterisert vedat polypeptidet utviser en fibrinolytisk aktivitet som er hemmet av et a2-antiplasmin ved en inhibisjonsrate som er minst omtrent 5-ganger hurtigere enn inhibisjonsraten til den fibrinolytiske aktiviteten til mini-plasmin til a2-antiplasmin.

10. Polypeptid ifølge krav 9,karakterisert vedat inhibisjonsraten er minst omtrent 10-ganger, 20-ganger, 30-ganger eller 40-ganger hurtigere enn inhibisjonsraten til mini-plasmin.

11. Polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 10,karakterisert vedat det immobiliserte lysinet er lysin bundet til en fast bærermatriks og valgt fra gruppen bestående av lysin-agarose, lysin-hydrogel, lysin-kryss-bundet agarose.

12. Polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 11, karakterisert vedat det immobiliserte lysinet er lysin-kryss-bundet agarose.

13. Polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 12, karakterisert vedat polypeptidet utviser en lavere bindingsaffinitet for fibrinogen enn bindingsaffiniteten for fibrinogen til mini-plasmin.

14. Polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 13, karakterisert vedat polypeptidet utviser høyere bindingsaffinitet for delvis spaltet fibrin enn bindingsaffiniteten for delvis spaltet fibrin til mini-plasmin.

15. Polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 14, karakterisert vedat polypeptidet har en aminosyresekvens som vist i SEKV ID NR:2, og konservative substitusjoner derav.

16. Polypeptid ifølge krav 15,karakterisert vedat polypeptidet har et argininresidie ved en relativ posisjon analog med den til posisjon 76 av aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR:2.

17. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7.

18. Dyrket celle,karakterisert vedat den omfatter ekspresjonsvektoren ifølge krav 17.