JP5789521B2 - プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット;ならびにそれから製造されるプラスミン - Google Patents
プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット;ならびにそれから製造されるプラスミン Download PDFInfo
- Publication number
- JP5789521B2 JP5789521B2 JP2011553035A JP2011553035A JP5789521B2 JP 5789521 B2 JP5789521 B2 JP 5789521B2 JP 2011553035 A JP2011553035 A JP 2011553035A JP 2011553035 A JP2011553035 A JP 2011553035A JP 5789521 B2 JP5789521 B2 JP 5789521B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasminogen
- plasmin
- recombinant
- peg
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
今や、プラスミノーゲンを製造するため;およびそれからプラスミンを製造するための
組成物および方法が提供される。
(a)組換えプラスミノーゲン封入体を産生させるのに十分な発現条件下で組換え発現系を使用して組換えプラスミノーゲンを発現させること;
(b)可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を得るのに十分な可溶化条件下で組換えプラスミノーゲン封入体を可溶化緩衝液と接触させること;
(c)可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を再折りたたみ条件下で再折りたたみ溶液と接触させて組換えプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ること;
(d)工程(c)の後に該組成物をダイアフィルトレーションすること;
(e)陽イオン交換媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分であるイオン交換条件下で該組成物を陽イオン交換媒体と接触させること;
(f)陽イオン交換媒体により捕捉された組換えプラスミノーゲンを溶出して組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換媒体溶出液を得ること;
(g)第一のアフィニティー媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分である第一のアフィニティー条件下で陽イオン交換媒体溶出液を第一のアフィニティー媒体と接触させること;および
(h)第一のアフィニティー媒体により結合された組換えプラスミノーゲンを溶出して、組換えプラスミノーゲンを含んでなるプラスミノーゲン溶液を得ること
を含んでなる。
(a)陽イオン交換媒体がプラスミノーゲンを結合するのに十分である陽イオン交換条件下で、プラスミノーゲンを含んでなる組成物を陽イオン交換媒体と接触させること;
(b)プラスミノーゲンをプラスミンに転化するのに十分な活性化条件下で、プラスミノーゲンを活性化溶液中でプラスミノーゲンアクチベーターと接触させること;および
(c)陰イオン交換媒体がプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを優先的に結合するような陰イオン交換条件下で陰イオン交換媒体とプラスミンを接触させることを含んでなる。
I.プラスミノーゲン
一局面において、本発明はプラスミノーゲンの製造方法を提供し、該方法は:
陽イオン交換媒体がプラスミノーゲンを結合するのに十分である陽イオン交換条件下で、プラスミノーゲンを含んでなる組成物を陽イオン交換媒体と接触させること
を含んでなる。
陽イオン交換媒体は組成物中に存在するプラスミノーゲンを結合する固相であり得る。陽イオン交換クロマトグラフィー媒体は、陽イオン交換媒体、好ましくは強陽イオン交換媒体として一般に記述される媒体の群のいずれからも選択し得る。該媒体は、組成物からのプラスミノーゲンの選択的若しくは優先的捕捉を見込むことができる、それに結合されている化学的構造(chemistry)すなわちリガンドを保有し得る。有用なクロマトグラフィー媒体は、支持体、およびプラスミノーゲンに対する選択的若しくは優先的結合能力を提供する、それに結合されている1種若しくはそれ以上のリガンドを含んでなる。有用な支持体は、具体的に説明する例として、アガロースおよびセルロースのような多糖、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレートおよびポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーのような有機ポリマーを包含する。有機支持体のみが媒体の支持体の使用に適することを意味することを本明細書で意図していないことが認識されるべきである。シリカおよびガラスのような無機支持体素材もまた使用し得るためである。
、6.0、7.0、8.0および9.0であり得る。いくつかの態様において、適する緩衝液は酸性のpH、好ましくは最低約pH4.0を有する。別の態様において、適する緩衝液はアルカリ性のpH、好ましくは最低約pH8.0のトリスに基づく緩衝液を有する。負荷工程の後にカラムを平衡化緩衝液、若しくは実質的な量の組換えプラスミノーゲンが媒体に結合されたままである限りは異なる緩衝液で洗浄し得る。
組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換溶出液を、アフィニティークロマトグラフィーのため適するアフィニティー媒体に直接負荷し得る。あるいは、溶出液をアフィニティークロマトグラフィーの前にさらなる調製工程にかけることができる。いくつかの態様において、プラスミノーゲンの製造方法は、アフィニティー媒体がプラスミノーゲンを結合するのに十分である第一のアフィニティー条件下で陽イオン交換媒体溶出液を第一のアフィニティー媒体と接触させることをさらに含んでなる。
いくつかの態様において、プラスミノーゲンは組換えプラスミノーゲンである。例えば、本発明のプラスミノーゲンをコードする核酸分子をいくつかの供給源から、例えば既知DNA配列を使用する化学合成により、若しくは当業者に既知の標準的クローニング技術の使用により製造し得る。プラスミノーゲンのコーディング配列を保有するcDNAクローンは、プラスミノーゲンの既知配列に基づき特異的に設計されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの使用により同定し得る。
i)特定の態様において、増大された比活性(タンパク質1mgあたり)をもたらす天然の完全長プラスミン(プラスミノーゲン)分子に関してより小さい分子量;
ii)特定の態様において、比較的低分子量と組み合わせられた、天然のタンパク質中で見出される最低2個のグリコシル化部位の欠如が、比較的安価な発現系を使用するこのタンパク質の組換え産生を容易にし;
iii)特定の態様において、プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、tPAおよび/若しくはスタフィロキナーゼにより活性化されるプラスミノーゲンの能力;
iv)特定の態様において、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のN末端クリングルドメインの存在であって、ここで、血栓溶解効力に重要であるプラスミンのフィブリン結合特性が保存されており;
v)特定の態様において、プラスミンがプラスミンのこの生理学的阻害剤により迅速に阻害されることを可能にし得る(出血を予防し得る特徴)、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のN末端クリングルドメインのα2−アンチプラスミン結合部位の存在;
vi)特定の態様において、無傷の消化されていないフィブリン(フィブリノーゲン)の主結合部位を保持するクリングル5の非存在が、循環フィブリノーゲンの低下された枯渇を伴うプラスミンの使用を可能にし得;
vii)特定の態様において、天然のヒトプラスミノーゲンの1クリングルドメインに相同な単一のN末端クリングルドメインの存在(該クリングルドメイン内の最後の4アミノ酸残基がV、P、QおよびCである)が、セリンプロテアーゼドメインへの天然様の結合を提供し(すなわち、ヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメインとセリンプロテアーゼドメインの間の天然に存在するドメイン接合部に類似の結合);ならびに
viii)特定の態様において、組換えプラスミノーゲンの発現後にそのN末端が戻し切断されて(cleave back)(例えば活性化の間に戻し切断されて)天然様のN末端を提供する、
の最低1つを特徴とし得る。
ングル1および4のクリングル配列を包含し得る。さらに、組換えプラスミノーゲンおよびそれから製造されるプラスミンの特定の態様は、天然様構造によって低下された免疫原性を表し得る。例えば、いくつかの態様において、組換えプラスミノーゲンは、プラスミノーゲンアクチベーター(例えばストレプトキナーゼ)による活性化に際して天然様N末端を含んでなるプラスミンポリペプチドを生じる、天然に存在する形態のヒト血漿由来プラスミノーゲンの1種のものに同一のN末端を有する。加えて、他の態様において、組換えプラスミノーゲンは、天然に存在するヒトプラスミン中のクリングル5とSPドメインの間の接合部に類似である、クリングルとセリンプロテアーゼドメインの間の配列を有し得る。
若しくはアラニンスキャニング突然変異誘発(CunninghamとWells、Science 244:1081−1085(1989))のような当該技術分野で既知の方法により同定し得る。後者の手順は分子中のすべての残基で単一アラニン突然変異を導入する。生じる変異体分子をその後、例えば本明細書に提供される実施例で示されるとおり生物学的活性について試験する。リガンド結合に決定的に重要である部位は、結晶化、核磁気共鳴若しくは光親和性標識(Smithら、J.Mol.Biol.244:399−904(1992)およびde Vosら Science 255:306−312(1992))のような構造分析によってもまた決定し得る。タンパク質のN末端からの1個若しくはそれ以上のアミノ酸の欠失が該タンパク質の1種若しくはそれ以上の生物学的機能の改変若しくは喪失をもたらす場合であっても、他の生物学的活性はなお保持され得る。
他の局面において、本発明は、本発明の組換えプラスミノーゲン分子を包含するキットおよびベクター;該組換えベクターで遺伝子改変されている培養宿主細胞;ならびに組換え技術によるプラスミノーゲンポリペプチドの組換え発現にもまた関する。一態様において、プラスミノーゲン若しくはそれから製造されるプラスミンの製造方法は、組換え発現
系を使用して組換えプラスミノーゲンを発現させることを含んでなる。
施する。例えば、原核生物細胞を使用してプラスミノーゲンを製造する場合、全般として例えばSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory
Press、ニューヨーク 1989)に記述されるようにプロモーターを構成的に若しくは人工的に誘導し得る適する培地中でそれらを培養し得る。従って、組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、電気穿孔法および形質転換のような公知の技術を使用して培養宿主細胞に導入し得る。
株を包含する霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株を挙げることができる。好ましくは、双方とも慣習的方法によるベクターDNAの安定な組込みおよび組込まれたベクターDNAのその後の複製のために、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が選択すべき哺乳動物宿主細胞として使用される。他の適する細胞株は、限定されるものでないが、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎細胞(COS−1)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHep G2)、ヒトアデノウイルス形質転換293細胞、マウスL−929細胞、HaKハムスター細胞株、Swiss、Balb−c若しくはNIHマウス由来マウス3T3細胞および多数の他の細胞株を挙げることができる。別の適する哺乳動物細胞株はCV−1細胞株である。正常二倍体細胞、初代組織のin vitro培養物由来の細胞株、ならびに初代体外移植組織もまた適する。候補細胞は、選択遺伝子が遺伝子型で欠損していても、若しくは優性に作用する選択遺伝子を含有していてもよい。
In Molecular Biology、第2版(1995)のような多くの標準的実験室手引き書に記述されている。
め、発現されるポリペプチドに適切な分泌シグナルを組み込み得る。該シグナルは該ポリペプチドに内因性であり得るか、若しくはそれらは異種シグナルであり得る。
A1号明細書(カナダの対蹠物第2,045,869号明細書)は、別のヒトタンパク質若しくはその部分と一緒になって免疫グロブリン分子の定常領域の多様な部分を含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は治療および診断での使用に全面的に有利であり、そして従って例えば改良された薬物動態特性をもたらす。他方、いくつかの用途のため、融合タンパク質が記述される有利な様式で発現、検出および精製された後にFc部分を除去することが可能であることが望ましいことができる。これは、Fc部分が治療および診断で使用するために妨害となることが判明している場合、例えば融合タンパク質を免疫化のための抗原として使用するはずである場合に真実である。例えば創薬において、ヒトタンパク質がハイスループットスクリーニングアッセイの目的上Fc部分と融合されている(hIL−5のアンタゴニストを同定するためのhIL−5受容体のような)。Bennett,D.ら、J.Molecular Recognition、8:52−58(1995)およびJohanson,K.ら、J.Biol.Chem.、270(16):9459−9471(1995)を参照されたい。
の冷水洗浄での生存細胞の処理を必要とする浸透圧ショックを包含する。
再折りたたみインキュベーションは、RIA若しくはHPLCにより測定されるところの、正しく折り畳まれたプラスミノーゲンコンフォーマーの収量および回収される誤って折り畳まれたプラスミノーゲンコンフォーマーに対する正しく折り畳まれたプラスミノーゲンコンフォーマーの比が最大になるように、ならびに例えば物質収支により決定されるところの多量体の会合したプラスミノーゲンの収量を最小化するように実施する。
(b)該混合物を、第一の時間および第一の温度について約0.25kbarないし約12kbarの第一の圧にさらすこと;
(c)該混合物を、第二の時間、約0.25kbarないし約3.3kbarの第二の圧にさらすこと;および
(d)該混合物を第三の圧にさらして、それにより混合物中のプラスミノーゲンを脱凝集しかつ再び折りたたむこと
を含んでなる再折りたたみを含んでなる。
ることにより、該生じる溶液をさらに精製し得る。
(b)可溶化された組換えプラスミノーゲンを得るのに十分な可溶化条件下で該組換えプラスミノーゲンを可溶化緩衝液と接触させること;
(c)可溶化された組換えプラスミノーゲンを再折りたたみ条件下で再折りたたみ溶液と接触させて、組換えプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ること;
(d)工程(c)の後に該組成物をダイアフィルトレーションすること;
(e)陽イオン交換媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分であるイオン交換条件下で該組成物を陽イオン交換媒体と接触させること;
(f)陽イオン交換媒体により捕捉された組換えプラスミノーゲンを溶出して組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換媒体溶出液を得ること;
(g)第一のアフィニティー媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分である第一のアフィニティー条件下で陽イオン交換媒体溶出液を第一のアフィニティー媒体と接触させること;および
(h)第一のアフィニティー媒体により結合された組換えプラスミノーゲンを溶出して、組換えプラスミノーゲンを含んでなるプラスミノーゲン溶液を得ること
を含んでなる。
他の局面において、本発明はプラスミンの製造方法を提供する。一態様において、該方法はアフィニティー媒体(例えばベンズアミジン−SEPHAROSETM)とプラスミン組成物を接触させることを含んでなり、該プラスミン組成物はプラスミノーゲンアクチベーターでプラスミノーゲンを活性化することにより製造されるプラスミンを含んでなる。いくつかの態様において、プラスミノーゲンは本発明に従って製造される。一態様において、プラスミノーゲンは本発明に従って製造される組換えプラスミノーゲンである。
いくつかの態様において、該プラスミンの製造方法は、プラスミノーゲンをプラスミンに転化するのに十分な活性化条件下で、プラスミノーゲンを活性化溶液中でプラスミノーゲンアクチベーターと接触させることを含んでなる。
き、そして、典型的には最低数分若しくはそれ以上、好ましくは最低約1、2、4時間若しくはそれ以上かかることができる。プラスミノーゲンは、ω−アミノ酸、塩、ショ糖、アルコール(例えばエタノール、メタノール、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、グリセロール、エチレングリコール)およびそれらの組合せのような安定剤および/若しくは賦形剤を包含する1種若しくはそれ以上の試薬の存在下で切断され得る。ω−アミノ酸はリシン、ε−アミノカプロン酸(ε−ACA)、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギニン、およびそれらの組合せ若しくはアナログを包含し得る。安定剤は例えば米国特許公開第20030012778号明細書(そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)により記述されている。
73:301(1963)により論考されている。これらの著者らは、固定されたストレプトキナーゼを利用してプラスミノーゲンの活性化の機序を研究した。Sugitachiら、Thromb.Haemost.(Stuttg.)39:426(1978)はナイロン上のプラスミノーゲンアクチベーターウロキナーゼの固定を論考している。固定されたプラスミノーゲンアクチベーターのその教示のために引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第4,305,926号明細書は、ナイロン、Dacron、コラーゲン、ポリビニルピロリジン若しくはコポリマー性p−アミノフェニルアラニンおよびロイシンのような生物適合性ポリマー上へのストレプトキナーゼの固定を提案する。
他の局面において、本発明はプラスミンの製造方法を提供する。該方法は、プラスミンを含んでなる組成物を陰イオン交換体と接触させて、それにより、組成物中に存在する場合は、プラスミンのものより下の等電点を有するタンパク質性物質をプラスミンから分離することを含んでなる。
する。
Q(Sarorius、ニューヨーク州ボヘミア)、Mustang(R) Q Port(Pall Corporation、ニューヨーク州ワシントン)およびChromaSorbTM(Millipore、マサチューセッツ州ビルリカ)を包含する。別の態様において、陰イオン交換体はSartobin(R) MA 5Qメンブレンである。
プラスミンを含んでなるプラスミン組成物は、組成物中に含有されるプラスミンを結合するアフィニティー媒体を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製し得る。例えば、いくつかの態様において、陰イオン交換体の素通り画分を、該素通り画分に含有されるプラスミンを結合するのに十分な第二のアフィニティー条件下で第二のアフィニティー媒体と接触させる。特定の態様において、該第二のアフィニティー条件は、該アフィニティー媒体が、存在しうるプラスミノーゲンアクチベーターに関してプラスミンを選択的若しくは優先的に結合するようである。
ゼンコポリマーのような有機ポリマーを包含する。有機支持体のみが媒体の支持体の使用に適していることを意味することを本明細書で意図していないことが認識されるべきである。シリカおよびガラスのような無機支持体素材もまた使用し得るためである。
Mクロマトグラフィーの前に、ω−アミノ酸および塩化ナトリウムのような添加剤の添加により中性のpHで数日間さらに安定化し得る。
いくつかの態様において、プラスミンの製造方法は疎水性相互作用クロマトグラフィーをさらに含み得る。一態様において、疎水性クロマトグラフィーは任意である。他の態様において、該プラスミンの製造方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体がプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを優先的に結合するような十分な疎水性相互作用条件下で、プラスミンを含んでなる第二のアフィニティー媒体溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体と接触させることを含んでなる。特定の態様において、疎水性相互作用条件は、該疎水性相互作用媒体が、存在する場合はプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを選択的若しくは優先的に結合するようである。
他の局面において、プラスミノーゲンおよび/若しくはそれから製造されるプラスミンは、例えば、米国特許第6,964,764号明細書;およびNovokhatny,V.ら、J.Thromb.Haemost.1(5):1034−41(2003)(双方とも引用することにより本明細書に組み込まれる)に記述される方法に従った治療的使用のため処方し得る。例えば、低pH(約2.5から約4まで)の低緩衝能力の緩衝剤を本発明に従って製造されるプラスミンの製剤に使用し得る。いくつかの態様において、プラスミノーゲンおよび/若しくはそれから製造されるプラスミンを使用して、例えば、米国特許第6,355,243号明細書および同第6,969,515号明細書(それぞれ、処置方法のその教示のために引用することにより本明細書に組み込まれる)に記述されるところの方法に従って、多様な血栓性疾患若しくは状態を処置し得る。加えて、プラスミン、ミニプラスミンおよび/若しくはマイクロプラスミンで実践されるところの当業者に既知の他の方法および製剤を使用して、本発明のプラスミノーゲンおよび/若しくはそれから製造されるプラスミンを治療的投与のため処方し得る。
配列番号1に示される組換えプラスミノーゲンポリペプチドをコードするDNA(図2に示される影を付けられたアミノ酸配列もまた参照されたい)を含んでなる発現ベクターを、BL21(DE3)RIL(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)、BL21(DE3)(遺伝子型:F−ompT hsdSB(rB −mB −)gal dcm(DE3))(EMB Biosciences,Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ)およびBLR(DE3)(遺伝子型:F−ompT hsdSB(rB −mB −)gal dcm(DE3)Δ(srl−recA)306::Tn10(TetR))を包含する多様な細胞に形質転換し、そして1mM IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)による誘導後のタンパク質過剰発現をSDS−PAGEにより分析した。発現推定値は振とうフラスコ中細胞培養物1Lあたり最低約250mgであった。
組換えプラスミノーゲンベクターを含有する大腸菌(E.coli)細胞(例えばBL21(DE3)RIL、BL21(DE3)若しくはBLR(DE3))の単一コロニーを使用して5mlのLB/カナマイシン(30μg/ml)に接種し、そして振とう機上37℃で8時間インキュベートした。それの後に、新鮮培地中でのさらなる増殖のため50μlアリコートを培養細菌懸濁液から採取した。6mlの細菌培養物および250mlの培地を用いて該手順を16時間後に反復した。培養物を約1.0のOD600nmまで37℃で振とうしながら増殖させ、そしてIPTGを1mM最終濃度まで添加した。培養物を追加の5時間増殖させた。細胞を5,000×gの遠心分離により収集し、そして細胞ペレットを20mM EDTAを含有する20mMトリスpH8.0に溶解しかつ−80℃で凍結させた。
破砕し凍結させた封入体(26g)を480mlの冷可溶化緩衝液(7M尿素、10mM還元型グルタチオン、10mMトリス、0.25Mアルギニン、2mM EDTA、pH7.5)に添加し、そしてこの懸濁液を6℃で4時間活発に攪拌した。可溶化された封入体のこの溶液をその後冷再折りたたみ緩衝液(0.5M尿素、還元型および酸化型グルタチオンそれぞれ1.0mM、0.5Mアルギニン、1.0mM EDTA、5.0mM
ε−ACA、50mMトリス、pH8.0)で1:20に希釈しかつ低温で17時間攪拌した。この再折りたたみ環境中の組換えプラスミノーゲン濃度はおよそ0.5mg/mlであった。
実施例2の再折りたたみ混合物を、0.054m2のMillipore Millistak Pod+ A1HCデプスフィルターを通過させることにより澄明化した。この濾液を0.01m2のMillipore Express SHC Opticap
XL 150フィルター(0.5/0.2μm)を通してさらに濾過した。この後者の濾液のダイアフィルトレーションは、2個の0.11m2の30kDa GE Healthcare Kvickカセットを用いて実施した。ダイアフィルトレーション緩衝液は10mMトリス、1.0mM EDTA、5.0mM ε−ACA、50mM尿素、pH9.0であった。37と40Lの間の緩衝液交換が1〜2mS/cmという標的伝導率に達するのに必要であった。
固体ポリエチレングリコール(PEG)を、酸化的再折りたたみ後に存在しうる凝集されたタンパク質を沈殿させるため、組換えプラスミノーゲンの再折りたたみ組成物(0.5Mアルギニンおよび0.85M尿素を含んでなる透析されていない再折りたたみ組成物)に添加した。
分間遠心分離して、生じたいかなる沈殿物もペレットにした。澄明な上清を収集し、そして総タンパク質含量(A280の測定により)および活性組換えプラスミノーゲンの含量(SK活性化アッセイ、DiaPharma、オハイオ州ウエストチェスターにより)について評価し、また、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC−HPLC)により分析した。結果を表1および図6に要約し、そして、PEGの添加が(i.)活性組換えプラスミノーゲンでなかったタンパク質の比較的選択的な沈殿;(ii.)可溶性のままであった組換えプラスミノーゲンの比活性の結果として生じる増加;および(iii.)凝集されたタンパク質の排除をもたらしたことを示す。これらの結果は、透析されていない再折りたたみ混合物へのPEGの添加が(活性組換えプラスミノーゲンでなかった)若干のタンパク質の沈殿を引き起こし、また、溶液中の活性のSK活性組換えプラスミノーゲンのほとんどを保存したことを示す。さらに、SEC−HPLCは、透析されていない再折りたたみ混合物へのPEGの添加が、凝集されたタンパク質の進行性の減少およびPEG上清中の単量体の組換えプラスミノーゲンの対応する増加をもたらしたことを示した。該結果は、PEGが、誤って再折りたたみ若しくは凝集された組換えプラスミノーゲンをいくぶん選択的に沈殿させ、そしてそれによりPEG上清中の正しく再度折りたたまれた組換えプラスミノーゲンを濃縮したことを示す。この透析されていない再折りたたみ混合物中のSK活性組換えプラスミノーゲンの比活性は20%PEG上清中で0.33から0.53に増加した。該結果は、PEG沈殿が、クロマトグラフィー若しくはSK活性化工程前の再折りたたみ混合物中に存在するSK不活性組換えプラスミノーゲンの少なくとも一部分の実現可能な選択的排除方法であることを示した。
固体硫酸アンモニウムを、酸化的再折りたたみ後に存在しうる凝集されたタンパク質を沈殿させるため、組換えプラスミノーゲンの再折りたたみ組成物(0.5Mアルギニンおよび0.85M尿素を含んでなる透析されていない再折りたたみ組成物)に添加した。
えプラスミノーゲンとして硫酸アンモニウム上清中に存在する全組換えプラスミノーゲンのパーセンテージ(SEC−HPLCに基づく);列8、凝集されたタンパク質として硫酸アンモニウム上清中に存在する全組換えプラスミノーゲンのパーセンテージ(SEC−HPLCに基づく)。
固体(NH4)2SO4を、組換えプラスミノーゲンを含有する再折りたたみ組成物(pH8.0)に1Mまで添加した。形成された沈殿物を濾過(0.45μm)により除去し、そして濾過後溶液を以下の疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体、すなわち
分析1。HiTrapTMフェニルセファロースFF:負荷:25ml(A280;0.839);素通り画分(FT)/洗浄液:49.4g(A280:0.266);溶出液:画分を含む96ウェルプレート。
分析2。HiTrapTMオクチルセファロースFF:負荷:25ml(A280;0.839);素通り画分(FT)/洗浄液:49.6g(A280:0.407);溶出液:画分を含む96ウェルプレート。この分析はいかなる現実の溶出物ピークも示さなかった。
分析3。HiTrapTMブチルセファロースFF:負荷:25ml(A280;0.839);素通り画分(FT)/洗浄液:49.05g(A280:0.215);溶出液:画分を含む96ウェルプレート。
分析4。HiTrapTMフェニルセファロースHP:負荷:25ml(A280;0.839);素通り画分(FT)/洗浄液:49.01g(A280:0.183);溶出液:画分を含む96ウェルプレート。
と接触させた。
再度折りたたまれたダイアフィルトレーションされた組換えプラスミノーゲンを室温でSPセファロースFF(GE Healthcare、ペンシルバニア州ピッツバーグ)の206mlのカラムで捕捉した。カラム平衡化緩衝液は25mMトリス、1.0mM EDTA、pH8.0であった。該カラムを10カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えプラスミノーゲンを25mMトリス、200mM NaCl、1.0mM EDTA、pH8.0で溶出した。
b値は生物分析アッセイのため取り出したサンプルの容量について補正していない。
c比活性、総タンパク質1mgあたりの活性組換えプラスミノーゲンのmg。
d分析はこれらのサンプルで実施しなかった。
SPセファロースカラムから溶出された組換えプラスミノーゲンをその後ECH−Lysineセファロースカラムに結合しかつそれから溶出した。この後者のアフィニティークロマトグラフィー工程は、処理されたタンパク質の全部若しくは実質的に全部がクリングルドメイン上の正しく再度折りたたまれたリシン結合部位をさらに下流に含有することを確認するのにもまた役立った。
融解した組換えプラスミノーゲンを、以下の溶液条件下すなわち2.5mgのプラスミノーゲン/ml;12.5%(v/v)1,2−プロパンジオール;200mM ε−ACA;87.5%(v/v)ECH−Lysineセファロース溶出緩衝液;25μgのストレプトキナーゼ(SK)/ml;pH7.0で、室温で4時間SKで活性化した。
10mMトリス−HCl(pH8.0)および100mM NaCl中の組換えポリヒスチジン標識ストレプトキナーゼ(100μg)を、100μlの固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)マトリックスに添加する。22℃で5分間のインキュベーション後に、0.45μmセルロースアセテートフィルターを取り付けたSpin−X微小遠心スピンカラム(Costar、マサチューセッツ州ケンブリッジ)に該スラリーを適用する。マトリックスを2,000×gで3分間遠心分離によりペレットにし、そしてその後20mMトリス−HCl、pH7.4で数回洗浄する。マトリックスをSpin−X装置から取り出し、微小遠心管に入れ、200mlの50mMトリス−HCl緩衝液、pH7.4に再懸濁する。
活性化の完了に際して、活性化溶液をガラスフィルター上のストレプトキナーゼ−SEPHAROSETMから濾過し、そして直ちにQメンブレン若しくはベンズアミジン−SEPHAROSETMカラムに適用する。プラスミノーゲン活性化の進行をモニターするため、多様な間隔でサンプルを選択し、そして0.1容量の10×停止緩衝液(1.0M NaHCO3、1.0M ε−アミノカプロン酸(pH9.4))の添加により反応を停止する。サンプルをSpin−X微小遠心管に移し、そして2,000×gで3分間の遠心分離によりペレットにする。固定された反応体を25μlの100mM EDTAの添加により溶出し、次いで5,000×gで10分間遠心分離する。還元SDS−PAGEを慣習的方法論により実施した。
実施例9のSK活性化混合物を200mM ε−ACA/12.5%1,2−プロパンジオールで1:1希釈しそして9.0にpH調節した。この溶液に室温でSartobind SingleSep Q Nano 1mlメンブレン(Sartorius)を通過させた。
実施例11のQメンブレン素通り画分にNaCl(0.5Mまで)を補充し、そして室温で25mMトリス、500mM NaCl、250mM ε−ACA、pH7.0で平衡化されたベンズアミジンセファロース4 FF(high sub)(GE Healthcare、ペンシルバニア州ピッツバーグ)の200mlカラムに負荷される前に7.0にpH調節した。カラムを5カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した後、プラスミンを200mMクエン酸ナトリウム、200mM ε−ACA、300mM NaCl、pH3.0で溶出した。このカラム溶出液を、ピーク前端に存在するプラスミンのpHを(3.0に)迅速に低下させる目的上、1カラム容量の溶出緩衝液を含有する容器に収集した。
ベンズアミジンセファロースカラムからの溶出液中に存在するプラスミンをおよそ5倍(5mg/mlまで)濃縮し、そして5kDa Millipore Pellicon
XL(0.005m2)メンブレンを使用して5.0mMクエン酸ナトリウム(pH3.3)に対しダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション後にこの酸性プラスミン溶液を−80℃で保存した。
全タンパク質を、280nmでのその吸光度に基づいて較正したプラスミノーゲン標準を使用するピロガロールレッド法により、上流の精製中間体中で定量した。純粋な組換えプラスミンの吸光係数はアミノ酸組成に基づき1.66mg−1/mlであると計算され;280nmでの吸光度を使用して下流の精製中間体中のプラスミンタンパク質を定量した。プラスミノーゲン活性はCOAMATIC(R)プラスミノーゲンキット(DiaPharma Group,Inc.)を使用してアッセイした。後者のキットは、しかしアッセイ混合物へのSKの添加を伴わずにプラスミン活性をアッセイするのにもまた使用し;触媒的に活性のチモーゲンの濃度を測定するためこれらのアッセイを較正しかつ検証した。慣習的SDS−PAGEを還元条件下で実施した。サイズ排除HPLCを、10mM酢酸、100mM NaCl、pH3.4を移動相として用いる7.8mm×30cmのTSK−GEL G2000SWXLカラム(トーソー・バイオサイエンス)を用いて実施した。大腸菌(E.coli)BL21宿主細胞タンパク質をCygnus TechnologiesからのELISAキットを用いてアッセイした。SKは特注で調製されアフィニティー精製されたウサギ抗SK血清を使用する半定量的ウエスタンブロットで推定した。
b値は3回の異なる精製運転の平均±該平均からの標準偏差を表す。
c比活性、総タンパク質1mgあたりの活性組換えプラスミンのmg。
d分析はこれらのサンプルで実施しなかった。
e定量のレベル(0.15μg/ml)より下。
Qメンブレンクロマトグラフィーを、SKを使用する組換えプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化直後に実施した。SK活性化混合物を約7から約8までpH調節し、pH8トリス緩衝液で平衡化したQメンブレンに負荷し、そしてプラスミンを含有する素通り画分を収集した。ベンチスケール研究を実施し、そしてSK結合およびプラスミン回収率に伝導性のメンブレン負荷条件を特定した。ベンチスケール実験からのサンプルをSK含量についてアッセイし、そしてサンプル純度を確認した。
血液由来プラスミノーゲンおよび/若しくはそれから製造されるプラスミンは、例えば、米国特許第6,355,243号明細書、同第6,964,764号明細書、同第6,969,515号明細書および同第7,544,500号明細書;米国特許公開第2002/0192794号明細書および同第2003/0012778号明細書;ならびにDeutschら、Science、170:1095−6(1970)(それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)により開示される。従って、プラスミノーゲンは、プラスミンを含んでなる組成物を提供するために血液(例えば血漿、血清)から製造される。
Claims (17)
- 組み換えプラスミノーゲンの製造方法であって、
(a)組換えプラスミノーゲン封入体を産生させるのに十分な発現条件下で組換え発現系を使用して組換えプラスミノーゲンを発現させること;
(b)可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を得るのに十分な可溶化条件下で、組換えプラスミノーゲン封入体を可溶化緩衝液と接触させること;
(c)可溶化された組換えプラスミノーゲン封入体を再折りたたみ条件下で再折りたたみ溶液と接触させて組換えプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ること;
(d)陽イオン交換媒体が組換えプラスミノーゲンを結合するのに十分であるイオン交換条件下で、該組成物を陽イオン交換媒体と接触させること、ここで該イオン交換条件は、該陽イオン交換媒体が、折り畳まれていないプラスミノーゲンおよび誤って折り畳まれたプラスミノーゲンに対して、正しく折り畳まれたプラスミノーゲンを優先的に結合するために十分である;
(e)陽イオン交換媒体により捕捉された組換えプラスミノーゲンを溶出して、正しく折り畳まれた組換えプラスミノーゲンを含んでなる陽イオン交換媒体溶出液を得ること
を含んでなり、
ここで、前記陽イオン交換媒体が支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガンドがスルホプロピルであり、該支持体がアガロースであり、
前記陽イオン交換媒体はpH8.0のトリスに基づく緩衝液で平衡化されており、そして
上記ステップ(e)において、正しく折り畳まれた組換えプラスミノーゲンが、200mMのNaClを含んでなる、pH8.0のトリスに基づく緩衝液で溶出される、前記製造方法。 - (f)第一のアフィニティー媒体がプラスミノーゲンを結合するのに十分である第一のアフィニティー条件下で、陽イオン交換媒体溶出液を第一のアフィニティー媒体と接触させること;および
(g)第一のアフィニティー媒体により結合された組換えプラスミノーゲンを溶出して、組換えプラスミノーゲンを含んでなるプラスミノーゲン溶液を得ること
をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 第一のアフィニティー媒体が支持体に結合されているリガンドを含んでなり、該リガン
ドがプラスミノーゲンに対する親和性を有する、請求項2に記載の方法。 - リガンドがリシンであり、支持体がアガロースである、請求項3に記載の方法。
- 組換え発現系が、エシェリキア属(Escherichia)に基づく、ピキア属(Pichia)に基づく、若しくは哺乳動物細胞に基づく発現系である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(c)と(d)との間で、組成物をダイアフィルトレーションすることをさらに含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法に従って、組み換えプラスミノーゲンを製造すること;
プラスミノーゲンをプラスミンに転化するのに十分な活性化条件下で、前記組み換えプラスミノーゲンを活性化溶液中でプラスミノーゲンアクチベーターと接触させること;および
活性化溶液を陰イオン交換条件下で陰イオン交換媒体と接触させてプラスミンを含んでなる陰イオン交換媒体素通り画分を得ること、ここで陰イオン交換条件は、該陰イオン交換媒体がプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを優先的に結合する
を含んでなる、プラスミンの製造方法。 - プラスミンを結合するのに十分な第二のアフィニティー条件下で陰イオン交換媒体素通り画分を第二のアフィニティー媒体と接触させることをさらに含んでなる、請求項7に記載の方法。
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体がプラスミンに関してプラスミノーゲンアクチベーターを優先的に結合するような十分な疎水性相互作用条件下で、プラスミンを含んでなる第二のアフィニティー媒体溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体と接触させることをさらに含んでなる、請求項8に記載の方法。
- 前記工程(c)と(d)との間で、沈殿条件下で再折りたたみ溶液にPEG若しくは塩を添加することをさらに含んでなり、再折りたたみ溶液はプラスミノーゲンおよび凝集されたポリペプチドを含んでなり、プラスミノーゲンは再度折りたたまれたプラスミノーゲンであり、沈殿条件は凝集されたタンパク質の全部若しくは実質的な部分を沈殿させるのに十分である、請求項1に記載の方法。
- 添加することが、1%ないし20%(w/v)の濃度のPEGを提供することを含んでなる、請求項10に記載の方法。
- PEGが、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG 2000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 4600、PEG 5000、PEG 6000およびPEG 8000よりなる群から選択される、請求項10又は11に記載の方法。
- 塩が硫酸アンモニウム、硫酸カリウム若しくは硫酸ナトリウムである、請求項10に記載の方法。
- 再折りたたみ溶液を澄明化して沈殿物を除去してそれによりプラスミノーゲンを含んでなる組成物を得ることをさらに含んでなる、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体がプラスミノーゲンを優先的に捕捉するために十分な、適する疎水性相互作用条件下で、プラスミノーゲンを含んでなる澄明化された組成物を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体と接触させることをさらに含んでなる、請求項14に記載の方法。
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体が支持体に結合されているリガンドを含んでなる、請求項15に記載の方法。
- リガンドがフェニル若しくはブチル部分であり、支持体がアガロースである、請求項16に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US15699009P | 2009-03-03 | 2009-03-03 | |
US61/156,990 | 2009-03-03 | ||
PCT/US2010/025898 WO2010101903A2 (en) | 2009-03-03 | 2010-03-02 | Compositions, methods and kits for preparing plasminogen; and plasmin prepared therefrom |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015115882A Division JP6045642B2 (ja) | 2009-03-03 | 2015-06-08 | プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット;ならびにそれから製造されるプラスミン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012519487A JP2012519487A (ja) | 2012-08-30 |
JP5789521B2 true JP5789521B2 (ja) | 2015-10-07 |
Family
ID=42710186
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011553035A Active JP5789521B2 (ja) | 2009-03-03 | 2010-03-02 | プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット;ならびにそれから製造されるプラスミン |
JP2015115882A Active JP6045642B2 (ja) | 2009-03-03 | 2015-06-08 | プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット;ならびにそれから製造されるプラスミン |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015115882A Active JP6045642B2 (ja) | 2009-03-03 | 2015-06-08 | プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット;ならびにそれから製造されるプラスミン |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9206410B2 (ja) |
EP (1) | EP2403865B9 (ja) |
JP (2) | JP5789521B2 (ja) |
ES (1) | ES2552337T3 (ja) |
HU (1) | HUE025670T2 (ja) |
PL (1) | PL2403865T3 (ja) |
PT (1) | PT2403865E (ja) |
WO (1) | WO2010101903A2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3036250A1 (en) * | 2013-08-23 | 2016-06-29 | Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG | Microparticles for cell disruption and/or biomolecule recovery |
RU2597782C1 (ru) * | 2015-08-25 | 2016-09-20 | Василий Николаевич Яковлев | Способ определения содержания продуктов протеолиза в плазме крови и диагностическая тест-система для его осуществления |
US20220187303A1 (en) * | 2015-08-25 | 2022-06-16 | Vasily Nikolaevich YAKOVLEV | Method and composition for detection of proteolytic products and diagnosis of malignant neoplastic disease |
US20200208194A1 (en) * | 2017-05-11 | 2020-07-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Coagulation and fibrinolysis assays |
Family Cites Families (113)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2701227A (en) | 1951-06-08 | 1955-02-01 | American Cyanamid Co | Enzyme production |
US2677642A (en) | 1951-08-03 | 1954-05-04 | American Cyanamid Co | Purification of enzymes |
US2677643A (en) | 1951-08-03 | 1954-05-04 | American Cyanamid Co | Method of purifying labile enzymes contaminated with hemolysin-omicron |
US2691620A (en) | 1951-08-18 | 1954-10-12 | American Cyanamid Co | Recovery of streptokinase and streptodornase |
US2784145A (en) | 1955-11-22 | 1957-03-05 | American Cyanamid Co | Recovery of streptokinase |
US3136703A (en) | 1958-04-22 | 1964-06-09 | Ortho Pharma Corp | Method for obtaining fibrinolysin |
US3066079A (en) | 1959-09-18 | 1962-11-27 | American Cyanamid Co | Methods for purifying plasminogen |
US3226304A (en) | 1960-10-24 | 1965-12-28 | American Cyanamid Co | High purity streptokinase and process for preparing same |
US3419472A (en) | 1960-10-24 | 1968-12-31 | American Cyanamid Co | Process for preparing streptokinaserich material |
DK98833C (da) | 1961-04-25 | 1964-05-25 | Novo Terapeutisk Labor As | Fremgangsmåde til stabilisering af terapeutisk anvendelige plasminopløsninger. |
US3255094A (en) | 1963-01-10 | 1966-06-07 | Baxter Laboratories Inc | Method for purification of streptokinase |
US3950513A (en) | 1965-12-03 | 1976-04-13 | Novo Terapeutisk Laboratorium A/S | Process of stabilizing therapeutically useful plasmin solutions |
US3434929A (en) | 1966-07-12 | 1969-03-25 | American Cyanamid Co | Process for purifying plasmin |
US3444045A (en) | 1966-09-20 | 1969-05-13 | American Cyanamid Co | Process for purifying streptokinase |
US3980772A (en) | 1969-12-02 | 1976-09-14 | Baxter Laboratories, Inc. | Methods of dissolving blood clots and the like with streptokinase chemically bonded to a carbohydrate matrix |
BE758425A (fr) | 1969-12-02 | 1971-04-16 | Baxter Laboratories Inc | Streptokinase liee chimiquement a une matrice en carbohydrate ( |
JPS5137343B2 (ja) | 1972-12-07 | 1976-10-15 | ||
FR2254316B1 (ja) | 1973-12-18 | 1977-04-22 | Choay Sa | |
US3865692A (en) | 1974-01-11 | 1975-02-11 | Abbott Lab | Method for making highly potent plasminogen |
US4177262A (en) | 1974-12-17 | 1979-12-04 | Choay S.A. | Plasminogen compositions containing preactivated plasminogens with or without native plasminogens, process for making same, pharmaceutical compositions and control of blood clots |
US4082612A (en) | 1976-09-24 | 1978-04-04 | Michael Reese Research Foundation | Plasminogen activator complex |
US4259448A (en) | 1978-01-03 | 1981-03-31 | Nippon Soda Company, Ltd. | Protein adsorbent and process for the purification of urokinase |
NZ191320A (en) | 1978-09-07 | 1982-09-14 | Beecham Group Ltd | In vivo fibrinolytic enzyme having active site blocked by hydrolytically removable group pharmaceutical compositions |
US4305926A (en) | 1979-09-13 | 1981-12-15 | Johannes Everse | Immobilization of Streptokinase |
USRE32271E (en) | 1979-11-13 | 1986-10-28 | Isolation of plasminogen activators useful as therapeutic and diagnostic agents | |
US4381346A (en) | 1979-11-13 | 1983-04-26 | Huasin Syed S | Isolation of plasminogen activators useful as therapeutic and diagnostic agents |
JPS56106594A (en) | 1980-01-25 | 1981-08-24 | Green Cross Corp:The | Stabilizing method of plasminogen |
JPS5716824A (en) | 1980-07-03 | 1982-01-28 | Green Cross Corp:The | Plasminogen pharmaceutical and stabilizing method thereof |
US4418052A (en) | 1980-08-12 | 1983-11-29 | Wong Dennis W | Diagnostic compositions and method for radiologic imaging of fibrinogen deposition in the body |
SU1002356A1 (ru) | 1980-12-31 | 1983-03-07 | Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР | Способ получени иммобилизованного фибринолизина |
GB2090599B (en) | 1981-01-05 | 1984-06-13 | Novo Industri As | Stabilized plasmin compositions and method for preparation thereof |
IT1194135B (it) | 1981-01-05 | 1988-09-14 | Novo Industri As | Composizioni di plasmina stabilizzata e metodo per la loro preparazione |
DE3119157A1 (de) | 1981-05-14 | 1982-12-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur herstellung von und danach hergestelltes plasminogen |
US4499073A (en) | 1981-08-24 | 1985-02-12 | Cutter Laboratories, Inc. | Intravenously injectable immune serum globulin |
US4652639A (en) | 1982-05-06 | 1987-03-24 | Amgen | Manufacture and expression of structural genes |
CA1231306A (en) | 1983-03-03 | 1988-01-12 | Erich Hochuli | Purification of interferon |
US4663146A (en) | 1983-07-29 | 1987-05-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Methods and compositions for the diagnosis of bloodclots using plasminogen activator |
GB8334498D0 (en) | 1983-12-24 | 1984-02-01 | Beecham Group Plc | Compounds |
US4631211A (en) | 1985-03-25 | 1986-12-23 | Scripps Clinic & Research Foundation | Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same |
DK163174C (da) | 1985-05-28 | 1992-06-22 | Wellcome Found | Vandig koncentreret parenteral oploesning af vaevs-plasminogenaktivater (t-pa) og fremgangsmaade til fremstilling heraf |
KR880701107A (ko) | 1986-05-15 | 1988-07-25 | 원본미기재 | 피브린용해 조성물 |
CA1304886C (en) | 1986-07-10 | 1992-07-07 | Heinz Dobeli | Metal chelate resins |
JP2507339B2 (ja) | 1986-08-11 | 1996-06-12 | 三井東圧化学株式会社 | 粗tPAの精製方法 |
US5149533A (en) | 1987-06-04 | 1992-09-22 | Zymogenetics, Inc. | Modified t-PA with kringle-/replaced by another kringle |
DE3718889A1 (de) | 1987-06-05 | 1988-12-22 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung einer loesung hoher spezifischer volumenaktivitaet von einem protein mit gewebe-plasminogenaktivator (t-pa)-aktivitaet, loesung, enthaltend protein mit t-pa-aktivitaet und verwendung der loesung in der human- und veterinaermedizin |
US4774087A (en) | 1987-08-14 | 1988-09-27 | Northwestern University | Micro-size fibrinolytic plasmin |
AT390801B (de) | 1988-07-28 | 1990-07-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von lys-plasminogen |
GB8824496D0 (en) | 1988-10-19 | 1988-11-23 | Beecham Group Plc | Process |
SE462454B (sv) | 1988-11-10 | 1990-06-25 | Pharmacia Ab | Maetyta foer anvaendning i biosensorer |
US5024829A (en) | 1988-11-21 | 1991-06-18 | Centocor, Inc. | Method of imaging coronary thrombi |
US5237050A (en) | 1989-03-29 | 1993-08-17 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Bacterial plasmin receptors as fibrinolytic agents |
US5328996A (en) | 1989-03-29 | 1994-07-12 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Bacterial plasmin receptors as fibrinolytic agents |
EP0397366A1 (en) | 1989-05-09 | 1990-11-14 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Hybrid streptokinases with fibrin binding domains and methods for the synthesis of same |
EP0399321B1 (en) | 1989-05-24 | 1993-06-23 | Miles Inc. | Gel filtration of heat treated factor viii |
JPH0411892A (ja) * | 1989-07-11 | 1992-01-16 | Otsuka Pharmaceut Factory Inc | ストレプトキナーゼ類蛋白質、対応遺伝子、対応プラスミド組換え体、対応形質転換体及び之等の製造法 |
DK408289D0 (da) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | Novo Nordisk As | Diagnostisk reagens |
WO1991013976A1 (en) * | 1990-03-14 | 1991-09-19 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for producing purified tissue plasminogen activator or its derivative |
US5017292A (en) | 1990-05-10 | 1991-05-21 | Millipore Corporation | Membrane, process and system for isolating virus from solution |
US7253264B1 (en) | 1990-06-28 | 2007-08-07 | Sanofi-Arentideutschland GmbH | Immunoglobulin fusion proteins, their production and use |
ES2251009T3 (es) | 1990-06-28 | 2006-04-16 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Proteinas de fusion con partes de inmunoglobulinas, su preparacion y uso. |
US5174903A (en) * | 1990-08-07 | 1992-12-29 | Miller Jack C | Process for removing proteinaceous materials, fats and oils from food processing wastewater and recovering same |
AT402367B (de) | 1990-10-11 | 1997-04-25 | Immuno Ag | Pharmazeutische zubereitung auf basis von lys-plasminogen |
JP2500330B2 (ja) | 1991-03-26 | 1996-05-29 | 工業技術院長 | 血栓溶解能を有する生体適合性材料 |
US5288489A (en) | 1991-08-28 | 1994-02-22 | Orion Therapeutic Systems, Inc. | Fibrinolysis and fibrinogenolysis treatment |
AT398004B (de) | 1992-04-14 | 1994-08-25 | Berbi Gmbh | Verfahren zur bestimmung von plasmin-alpha2- antiplasmin-komplexen unter verwendung eines komplexspezifischen monoklonalen antikörpers |
US5399352A (en) | 1993-04-14 | 1995-03-21 | Emory University | Device for local drug delivery and methods for using the same |
US5523092A (en) | 1993-04-14 | 1996-06-04 | Emory University | Device for local drug delivery and methods for using the same |
US5472692A (en) | 1993-07-02 | 1995-12-05 | New England Deaconess Hospital Corporation | Pro-urokinase mutants |
JPH0739375A (ja) | 1993-07-29 | 1995-02-10 | Green Cross Corp:The | プラスミノーゲンの精製方法 |
US5407678A (en) | 1993-09-01 | 1995-04-18 | Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. | Petroleum jelly cream |
US5455338A (en) | 1993-11-05 | 1995-10-03 | Zymogenetics, Inc. | DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto |
DE4411143C2 (de) | 1994-03-30 | 1996-08-01 | Immuno Ag | Thrombosemittel |
US5505713A (en) | 1994-04-01 | 1996-04-09 | Minimed Inc. | Indwelling catheter with stable enzyme coating |
US5928218A (en) | 1994-12-16 | 1999-07-27 | Gelbfish; Gary A. | Medical material removal method and associated instrumentation |
US5629213A (en) | 1995-03-03 | 1997-05-13 | Kornguth; Steven E. | Analytical biosensor |
WO1996038726A1 (en) | 1995-05-30 | 1996-12-05 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Covalently immobilized phospholipid bilayers on solid surfaces |
US6139819A (en) | 1995-06-07 | 2000-10-31 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Targeted contrast agents for diagnostic and therapeutic use |
US5854049A (en) | 1995-06-09 | 1998-12-29 | President And Fellows Of Harvard College | Plasmin-resistant streptokinase |
EP0835931A4 (en) | 1995-06-26 | 2000-11-15 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | STABLE PLASMINE SOLUTION |
AU7298296A (en) | 1995-10-25 | 1997-05-15 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Lubeluzole n-oxide |
US5876999A (en) | 1995-12-06 | 1999-03-02 | National Science Council | Preparation of novel streptokinase mutants as improved thrombolytic agents |
US6312893B1 (en) | 1996-01-23 | 2001-11-06 | Qiagen Genomics, Inc. | Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules |
ATE191750T1 (de) | 1996-01-23 | 2000-04-15 | Rapigene Inc | Verfahren und zusammenstellungen zur sequenzbestimmung von nukleinsäuremolekulen |
US6613508B1 (en) | 1996-01-23 | 2003-09-02 | Qiagen Genomics, Inc. | Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques |
US6207066B1 (en) | 1996-07-23 | 2001-03-27 | Nuvue Technologies, L.L.C. | Method for purification of a blood component |
US5767269A (en) | 1996-10-01 | 1998-06-16 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics |
US6372887B1 (en) | 1996-11-07 | 2002-04-16 | Heska Corporation | Flea serine protease inhibitor proteins |
JPH10158300A (ja) | 1996-11-28 | 1998-06-16 | Suzuki Motor Corp | 血管新生抑制効果を有するタンパク質とその製造方法及びアンギオスタチンの製造方法 |
EP0860444A1 (en) | 1997-02-24 | 1998-08-26 | Stichting Centraal Laboratorium van de Bloedtransfusiedienst van het Nederlandse Rode Kruis (CLB) | Method for removing viruses from a protein solution |
EP1000176A1 (en) | 1997-07-22 | 2000-05-17 | Rapigene, Inc. | Computer method and system for correlating sequencing data by ms |
AU3959499A (en) * | 1998-05-28 | 1999-12-13 | Korea Green Cross Corporation | Process of purifying angiogenesis inhibitors |
US6406921B1 (en) | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
CA2337231A1 (en) | 1998-07-14 | 2000-01-27 | Bristol-Myers Squibb Company | Lysine binding fragments of angiostatin |
CU22732A1 (es) | 1998-08-14 | 2002-02-28 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Mutantes de estreptoquinasa |
WO2000018436A1 (en) | 1998-09-29 | 2000-04-06 | Leuven Research & Development Vzw | Use of compounds that reduce alpha2-antiplasmin in vivo for the preparation of a composition for the treatment of ischemic stroke |
US6270672B1 (en) | 1999-08-06 | 2001-08-07 | Baxter Aktiengesellschaft | Devices and methods for removing pathogens from biological fluids |
US6355243B1 (en) | 1999-11-13 | 2002-03-12 | Bayer Corporation | Method of thrombolysis by local delivery of active plasmin |
US6969515B2 (en) | 1999-11-13 | 2005-11-29 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin |
US7544500B2 (en) * | 1999-11-13 | 2009-06-09 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Process for the production of a reversibly inactive acidified plasmin composition |
US6964764B2 (en) | 1999-11-13 | 2005-11-15 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin |
US6623655B1 (en) | 2000-04-24 | 2003-09-23 | Sigma-Aldrich Co. | Metal chelating compositions |
EP1287010A1 (en) | 2000-06-02 | 2003-03-05 | Blue Heron Biotechnology, Inc. | Methods for improving the sequence fidelity of synthetic double-stranded oligonucleotides |
JP4047170B2 (ja) | 2000-12-21 | 2008-02-13 | トロム−イクス・ナムローゼ・フエンノートシャップ | 酵母発現ベクターおよび酵母細胞における発現による組換えタンパク質の製造方法 |
US7105327B1 (en) | 2001-06-15 | 2006-09-12 | Bharat Biotech International, Ltd. | Recombinant streptokinase |
AU2002357249A1 (en) | 2001-12-13 | 2003-07-09 | Blue Heron Biotechnology, Inc. | Methods for removal of double-stranded oligonucleotides containing sequence errors using mismatch recognition proteins |
DE10390418D2 (de) | 2002-02-06 | 2005-01-13 | N Zyme Biotec Gmbh | Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen in Mikroorganismen |
US7776026B2 (en) | 2002-02-06 | 2010-08-17 | Nuvue Technologies, Inc. | Method for vitreous liquefaction |
GB0228409D0 (en) | 2002-12-06 | 2003-01-08 | Thromb X Nv | Pharmacological vitreolysis |
US6694764B1 (en) | 2003-03-21 | 2004-02-24 | Delphi Technologies, Inc. | Air conditioning system with electric compressor |
SI1740698T1 (sl) | 2004-04-22 | 2010-11-30 | Talecris Biotherapeutics Inc | Rekombinantno modificiran plazmin |
WO2007047874A2 (en) | 2005-10-20 | 2007-04-26 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Recombinantly modified plasmin |
US20100144622A1 (en) * | 2006-09-29 | 2010-06-10 | Xinli Lin | Methods for production of recombinant plasminogen and plasmin polypeptides |
PT2220221E (pt) * | 2007-11-29 | 2015-04-16 | Grifols Therapeutics Inc | Plasmina modificada de forma recombinante |
-
2010
- 2010-03-02 PT PT107491938T patent/PT2403865E/pt unknown
- 2010-03-02 HU HUE10749193A patent/HUE025670T2/en unknown
- 2010-03-02 US US13/147,491 patent/US9206410B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-02 ES ES10749193.8T patent/ES2552337T3/es active Active
- 2010-03-02 WO PCT/US2010/025898 patent/WO2010101903A2/en active Application Filing
- 2010-03-02 EP EP10749193.8A patent/EP2403865B9/en active Active
- 2010-03-02 PL PL10749193T patent/PL2403865T3/pl unknown
- 2010-03-02 JP JP2011553035A patent/JP5789521B2/ja active Active
-
2015
- 2015-06-08 JP JP2015115882A patent/JP6045642B2/ja active Active
- 2015-08-05 US US14/819,001 patent/US20150329845A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2403865B9 (en) | 2015-12-09 |
PL2403865T3 (pl) | 2016-01-29 |
JP2012519487A (ja) | 2012-08-30 |
PT2403865E (pt) | 2015-11-18 |
EP2403865A4 (en) | 2012-08-01 |
WO2010101903A2 (en) | 2010-09-10 |
EP2403865A2 (en) | 2012-01-11 |
US9206410B2 (en) | 2015-12-08 |
US20120009650A1 (en) | 2012-01-12 |
JP2015171376A (ja) | 2015-10-01 |
US20150329845A1 (en) | 2015-11-19 |
HUE025670T2 (en) | 2016-04-28 |
WO2010101903A3 (en) | 2011-01-13 |
ES2552337T3 (es) | 2015-11-27 |
JP6045642B2 (ja) | 2016-12-14 |
EP2403865B1 (en) | 2015-08-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101529743B1 (ko) | 재조합적으로 변형된 플라스민 | |
US8420079B2 (en) | Recombinantly modified plasmin | |
US20100144622A1 (en) | Methods for production of recombinant plasminogen and plasmin polypeptides | |
JP6045642B2 (ja) | プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット;ならびにそれから製造されるプラスミン | |
US20040265298A1 (en) | Methods for production of recombinant urokinase | |
JP2010540432A (ja) | ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータの精製方法 | |
CA2949238C (en) | Method for monomerizing matrix metalloproteinase 7 (mmp-7) aggregate |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20121227 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20121227 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20130104 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130116 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20121227 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140527 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140528 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140811 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150608 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20150617 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150728 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150803 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5789521 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |