CN1219795C - 用新的复性方法制备重组人神经生长因子 - Google Patents
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Abstract
一种通过二硫键异构酶(PDI)催化复性制备重组人神经生长因子(rhNGF)的方法，包括步骤①通过工程菌大肠杆菌表达rhNGF，②进行菌体破碎，③通过离心分离包含体，④利用变性体系变性溶解，变性体系含有1-10M尿素，5-50mM Tris，1-5mM EDTA，且pH 7-10；⑤PDI催化复性，rhNGF与PDI的摩尔比为100∶1-10∶1；⑥脱盐以及⑦阳离子交换层析，采用CM-Sepharose阳离子交换柱，洗脱条件为0-1M NaCl，pH4-8。经上述步骤，即可制备得到纯度大于95%，具天然生物学活性的rhNGF。采用此方法降低了成本，并可应用于工业化生产。
Description
技术领域：
本发明属于一种制备重组人神经生长因子rhNGF的方法。
背景技术：
重组人神经生长因子(human nerve growth factor，简称rhNGF)是一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向。对促进大脑的发育，神经系统的生长，损伤神经的再生和功能恢复具有重要作用。
rhNGF可应用于糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤，周围神经损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病，是目前可应用于临床的神经系统蛋白质因子。人神经生长因子在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能，以前人们试图从小鼠中提取鼠源NGF，但存在种属差异及致病微生物污染的问题。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子是唯一的选择。在现有技术中神经生长因子的生产大多是通过从小鼠或蛇毒来产生或通过真核的哺乳细胞来重组表达，目前尚没有通过大肠杆菌表达并产生有活性的重组人神经生长因子的报道；更没有利用二硫键异构酶PDI催化复性制备重组人神经生长因子rhNGF的方法。
发明内容：
发明人利用rhNGF不含糖基化位点的特点，采用大肠杆菌来表达有活性的重组入神经生长因子rhNGF，构建了高效表达rhNGF的工程菌大肠杆菌以表达rhNGF。由于rhNGF含有三对二硫键，用细菌表达的rhNGF形成包含体形式，溶解变性后用常规方法复性很难正确折叠和复性成活性形式，产率很低。这是由于组成三对二硫键的六个半胱氨酸在复性时错误配对造成的。为了提高变性rhNGF的复性率，在通过二硫键异构酶(PDI)催化复性制备重组人神经生长因子(rhNGF)的工艺中，rhNGF与赖以催化复性的PDI的摩尔比的选择是提高rhNGF的产率且正确提高复性率的关键条件，本发明提供了一个适当的比例能充分打开错配的二硫键并重新形成正确的二硫键，从而提高了复性率，最终提高了rhNGF的产率。
本发明的具体技术方案为：一种通过二硫键异构酶(PDI)催化复性制备重组人神经生长因子(rhNGF)的方法，包括步骤①通过工程菌大肠杆菌表达rhNGF，②进行菌体破碎，③通过离心分离包含体，④利用变性体系变性溶解，变性体系含有1-10M尿素，5-50mM Tris，1-5mMEDTA，且pH7-10；⑤PDI催化复性，rhNGF与PDI的摩尔比为100∶1-10∶1；⑥脱盐以及⑦阳离子交换层析，采用CM-Sepharose阳离子交换柱，洗脱条件为0-1M NaCl，pH4-8。
步骤⑦采用最佳的洗脱浓度为0.3-0.4M NaCl。
经上述步骤，即可制备得到纯度大于95％，具天然生物学活性的rhNGF。
本发明采用大肠杆菌表达并产生有活性的重组人神经生长因子rhNGF，利用二硫键异构酶(PDI)催化复性制备重组人神经生长因子(rhNGF)的方法，提供了在通过二硫键异构酶(PDI)催化复性制备重组人神经生长因子(rhNGF)的工艺中关键条件，能充分打开错配的二硫键并重新形成正确的二硫键，从而提高了复性率，获得了纯度大于95％的高产率，且通过PDI复性所获得的rhNGF具有天然生物学活性，最终提高了rhNGF的产率，降低了成本，并可应用于工业化生产。
最佳实施例：
rhNGF的复性体系如下：25mM Tris，pH7～10，1mM EDTA，rhNGF蛋白浓度0.1～1mg/ml。在此复性体系中加入重组人二硫键异构酶PDI，使rhNGF与PDI的摩尔比为100∶1～10∶1。在加入PDI的复性体系中进行复性，rhNGF的复性率比不加PDI时有显著提高，二硫键错配造成的异构体比例大大降低，rhNGF的终产率也相应提高。
rhNGF制备方法如下：将表达后的rhNGF工程菌菌体离心收集，悬浮于25mM Tris，pH8.0，超声破碎并10000×g，30分钟离心后制得rhNGF包含体。包含体用8M尿素，25mM Tris，1mM EDTA充分溶解后，10000×g，30分钟离心，取上清，即为变性的rhNGF。
将变性的rhNGF逐滴滴入已加PDI的复性体系中，使得rhNGF终浓度达到0.5mg/ml，室温下放置过夜。将上述复性液用脱盐柱脱盐后，再经过CM-Sepharose柱层析纯化(平衡缓冲：20mM PB，pH6.0，0.3～0.4M NaCl线性梯度洗脱)，得到纯度＞95％，具天然生物活性的rhNGF。
Claims (2)
1.一种通过二硫键异构酶PDI催化复性制备重组人神经生长因子rhNGF的方法，包括步骤①通过工程菌大肠杆菌表达rhNGF，②进行菌体破碎，③通过离心分离包含体，④利用变性体系变性溶解，⑤PDI催化复性，⑥脱盐以及⑦阳离子交换层析，其特征在于：步骤④的变性体系含有1-10M尿素，5-50mM Tris，1-5mM EDTA，且pH7-10；步骤⑤中rhNGF与PDI的摩尔比为100∶1-10∶1；步骤⑦的交换层析采用CM-Sepharose阳离子交换柱，洗脱条件为O-1M NaCl，pH4-8。
2.根据权利要求1所述的制备rhNGF的方法，其特征在于步骤⑦采用的洗脱浓度为0.3-0.4M NaCl。
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