CN107828714A - 一株异源表达L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的大肠杆菌重组菌 - Google Patents

一株异源表达L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的大肠杆菌重组菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株异源表达L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的大肠杆菌重组菌，属于生物工程领域。本发明通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶菌株，将重组菌株高密度发酵，以L‑Asp‑Na作为底物，进行全细胞催化反应制备β‑丙氨酸。此法与化学生产法相比，生产工艺安全清洁，无环境污染，与酶法相比，底物价格便宜，催化效率高，终产物β‑丙氨酸产率95％以上，简化产物的分离纯化步骤。

Description

一株异源表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的大肠杆菌重组菌
技术领域
本发明涉及一株异源表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的大肠杆菌重组菌，属于生物工程技术领域。
背景技术
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，其用途广泛：工业上，是合成泛酸钙的重要原料，也是合成肌肽的两种氨基酸之一；医药上，作为原料用于合成抑制恶性肿瘤骨转移的帕米膦酸钠和抗结肠炎药物巴柳氮，同时还可作为铅中毒的解毒剂以及用于合成甜味剂等。
在工业生产中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法，或β-氨基丙腈水解法，这些方法多需要在高温、高压、强酸或强碱的条件下，而且产物纯化繁琐，存在环境污染问题。因此使用生物催化法替代化学合成法制备β-丙氨酸是发展趋势。
目前生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，在培养微生物过程中合成β-丙氨酸，此法虽然较简便，但是由于微生物代谢过程中会产生大量副产物，对产物的分离纯化带来较大困难，增加了后期纯化成本；另一种方法是生物酶法合成β-丙氨酸，即通过表达L-天冬氨酸α-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去α-羧基生成β-丙氨酸，分离纯化简便。
编码L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因pand被发现广泛地存在于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、结核分枝杆菌、沙门氏菌等微生物中，目前研究较广的Pand主要是来自于原核生物，但原核生物来源的Pand酶活较低，催化反应所需时间长。
发明内容
本发明提供了一株重组来源于真核生物赤拟谷盗L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因的大肠杆菌，高密度发酵重组菌株，并用全细胞催化法生产β-丙氨酸。
本发明的第一个目的是提供一株大肠杆菌重组菌，所述重组菌是异源表达了赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶。
在本发明的一种实施方式中，所述赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21为宿主。
在本发明的一种实施方式中，以pET 28a(+)为表达载体。
本发明的第二个目的是提供上述重组菌的构建方法，所述方法是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD与表达载体连接，转入大肠杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET 28a(+)。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：
(1)扩增编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD；
(2)将克隆出的基因连接到pET 28a(+)，构建成为重组质粒pET 28a-panD；
(3)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD。
本发明的第三个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在生产β-丙氨酸中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是以L-天冬氨酸或L-天冬氨酸钠作为底物，利用所述重组大肠杆菌进行全细胞转化生产β-丙氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌经过高密度发酵，所述高密度发酵的条件为：将培养6-8h的重组大肠杆菌菌液按5-8％的接种量接种于含卡那霉素浓度为80-120μg/mL的2L发酵罐培养基中，35-38℃培养，当OD600达到70-75时，温度降至28-30℃，流加10-15％乳糖诱导，诱导培养35-40h结束发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化生产β-丙氨酸的体系：底物L-Asp-Na的浓度为600-1000mmol/L；其中，重组大肠杆菌浓度为OD600＝200-400；磷酸吡哆醛浓度为2-4mmol/L，40-60mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4缓冲液。
本发明的第四个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在医药、化工或食品中的应用。
本发明的有益效果：本发明通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L-天冬氨酸α-脱羧酶菌株，重组L-天冬氨酸α-脱羧酶的纯酶比酶活为260U/mg；将重组菌株高密度发酵，以L-Asp-Na作为底物，进行全细胞催化反应制备β-丙氨酸。此法与化学生产法相比，生产工艺安全清洁，无环境污染，与酶法相比，底物价格便宜，催化效率高，终产物β-丙氨酸产率95％以上，简化产物的分离纯化步骤。
附图说明
图1：重组质粒pET28a-TcpanD的图谱；
图2：TcpanD基因的PCR结果及重组质粒pET28a-TcpanD的双酶切结果；
1：TcpanD扩增产物；2：重组质粒pET28a-TcpanD的BamH I和HindⅢ双酶切验证
图3：TcpanD蛋白表达的SDS-PAGE验证结果；
1：大肠杆菌BL21pET28a(+)对照菌的细胞破碎液上清；2：大肠杆菌BL21pET28a-TcpanD重组菌诱导后的细胞破碎液上清
图4：全细胞催化生产β-丙氨酸示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
发酵罐发酵培养基(g.L-1)：甘油8.0，工业级蛋白胨2.0，工业级酵母提取物2.0，一水合柠檬酸1.7，MgSO4.7H2O 13.5，(NH4)2HPO44.0，KH2PO413.5，微量元素液10.0ml；其中微量元素液(g.L-1)：FeSO4.7H2O 10，CuSO4.5H2O 1.0，MnSO4·4H2O 0.5,ZnSO4.7H2O 2.3,CaCl22.0,Na2B4O7.10H2O 0.2,(NH4)6Mo7O240.1，溶于1mol/LHCL中。
补料培养基(g.L-1)：甘油500.0，工业级蛋白胨4.0，工业级酵母提取物4.0，MgSO4.7H2O7.4。
天冬氨酸及β-丙氨酸含量的测定：反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500μL反应液于2.0mL离心管，加入250μL 0.1mol/LPITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5h，加入700μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置30-60min，吸取下层溶液，经0.22μm有机滤膜过滤，进样量为10μL。衍生产物用HPLC测定：色谱柱为La Chrom C18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)乙腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH 6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。
实施例1重组大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD的构建
根据丹麦科技大学惠赠的pCfB361(pESC-HIS3-TcpanD)重组质粒中TcpanD基因序列，通过密码子在线优化网站Graphical Codon Usage Analyser进行优化，基因片段由上海生工公司合成。
优化后的TcpanD序列中不含酶切位点，设计特异性引物P1、P2(SEQ ID NO.2、SEQID NO.3划线部分分别为BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切位点)，并且在N端引入His标签。
表1引物表
P1 5'-CGCGGATCCATGCCAGCTACTGGTGAAGAT-3'
P2 5'-CCCAAGCTTGTCACAAATCGGAACCCAATCT-3'
将赤拟谷盗来源的编码L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD通过NdeⅠ和HindⅢ双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的表达载体pET 28a(+)上，获得重组质粒pET 28a-panD；将重组质粒转化大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD。
实施例2重组L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达
将重组大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD接种于5mL卡那霉素浓度为100μg/mL的TB培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的TB培养基，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，20℃诱导培养16-20h，收集菌体超声破碎，通过Tris-tricine SDS-PAGE方法分析鉴定L-天冬氨酸α-脱羧酶重组蛋白表达水平。通过超声破碎，离心，用亲和层析柱His Trap FF纯化蛋白，重组L-天冬氨酸α-脱羧酶的纯酶比酶活为260U/mg。
实施例3重组大肠杆菌高密度发酵
将重组大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD接种于5mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基，37℃、200r/min振荡培养6-8h。将上述培养物按6％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的2L发酵罐发酵培养基中，37℃补料培养，当OD600达到75时，温度降至30℃，流加15％乳糖诱导，诱导培养36h结束发酵。发酵结束后酶活达到1250U/ml。
实施例4全细胞催化法生产β-丙氨酸
将高密度发酵后的菌液离心收集，水洗后再次离心收集。在含有底物浓度800mM的L-ASP-Na 50ml反应体系中，加入OD600为300的重组大肠杆菌菌液，反应体系中含有2mmol/L的PLP，50mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4缓冲液(pH6.5)，37℃、200r/min下进行全细胞反应(振荡反应)，每隔2h取样，终止反应时取适量反应液于100℃煮沸10min，12000r/min离心10min，取上清，用0.22μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测反应液中各成分的含量，计算得到β-丙氨酸的浓度为764mmol/L，β-丙氨酸产率为95.5％。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因的大肠杆菌重组菌
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Pro Ala Thr Gly Glu Asp Gln Asp Leu Val Gln Asp Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ala Thr Phe Ser Asp Ala Val Leu Ser Ser Asp Glu Glu Leu
20 25 30
Phe His Gln Lys Cys Pro Lys Pro Ala Pro Ile Tyr Ser Pro Val Ser
35 40 45
Lys Pro Val Ser Phe Glu Ser Leu Pro Asn Arg Arg Leu His Glu Glu
50 55 60
Phe Leu Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Leu Gln Glu Ala Val Phe Glu
65 70 75 80
Gly Thr Asn Arg Lys Asn Arg Val Leu Gln Trp Arg Glu Pro Glu Glu
85 90 95
Leu Arg Arg Leu Met Asp Phe Gly Val Arg Ser Ala Pro Ser Thr His
100 105 110
Glu Glu Leu Leu Glu Val Leu Lys Lys Val Val Thr Tyr Ser Val Lys
115 120 125
Thr Gly His Pro Tyr Phe Val Asn Gln Leu Phe Ser Ala Val Asp Pro
130 135 140
Tyr Gly Leu Val Ala Gln Trp Ala Thr Asp Ala Leu Asn Pro Ser Val
145 150 155 160
Tyr Thr Tyr Glu Val Ser Pro Val Phe Val Leu Met Glu Glu Val Val
165 170 175
Leu Arg Glu Met Arg Ala Ile Val Gly Phe Glu Gly Gly Lys Gly Asp
180 185 190
Gly Ile Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ala Asn Gly Tyr Ala Ile Ser
195 200 205
Cys Ala Arg Tyr Arg Phe Met Pro Asp Ile Lys Lys Lys Gly Leu His
210 215 220
Ser Leu Pro Arg Leu Val Leu Phe Thr Ser Glu Asp Ala His Tyr Ser
225 230 235 240
Ile Lys Lys Leu Ala Ser Phe Gln Gly Ile Gly Thr Asp Asn Val Tyr
245 250 255
Leu Ile Arg Thr Asp Ala Arg Gly Arg Met Asp Val Ser His Leu Val
260 265 270
Glu Glu Ile Glu Arg Ser Leu Arg Glu Gly Ala Ala Pro Phe Met Val
275 280 285
Ser Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Ile Gly Ala Phe Asp Pro Ile Glu
290 295 300
Lys Ile Ala Asp Val Cys Gln Lys Tyr Lys Leu Trp Leu His Val Asp
305 310 315 320
Ala Ala Trp Gly Gly Gly Ala Leu Val Ser Ala Lys His Arg His Leu
325 330 335
Leu Lys Gly Ile Glu Arg Ala Asp Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys
340 345 350
Leu Leu Thr Ala Pro Gln Gln Cys Ser Thr Leu Leu Leu Arg His Glu
355 360 365
Gly Val Leu Ala Glu Ala His Ser Thr Asn Ala Ala Tyr Leu Phe Gln
370 375 380
Lys Asp Lys Phe Tyr Asp Thr Lys Tyr Asp Thr Gly Asp Lys His Ile
385 390 395 400
Gln Cys Gly Arg Arg Ala Asp Val Leu Lys Phe Trp Phe Met Trp Lys
405 410 415
Ala Lys Gly Thr Ser Gly Leu Glu Lys His Val Asp Lys Val Phe Glu
420 425 430
Asn Ala Arg Phe Phe Thr Asp Cys Ile Lys Asn Arg Glu Gly Phe Glu
435 440 445
Met Val Ile Ala Glu Pro Glu Tyr Thr Asn Ile Cys Phe Trp Tyr Val
450 455 460
Pro Lys Ser Leu Arg Gly Arg Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Lys Asp Lys
465 470 475 480
Leu His Lys Val Ala Pro Arg Ile Lys Glu Arg Met Met Lys Glu Gly
485 490 495
Ser Met Met Val Thr Tyr Gln Ala Gln Lys Gly His Pro Asn Phe Phe
500 505 510
Arg Ile Val Phe Gln Asn Ser Gly Leu Asp Lys Ala Asp Met Val His
515 520 525
Leu Val Glu Glu Ile Glu Arg Leu Gly Ser Asp Leu
530 535 540
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcggatcca tgccagctac tggtgaagat 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccaagcttg tcacaaatcg gaacccaatc t 31

Claims (10)

1.一株大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是异源表达了赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，以pET 28a(+)为表达载体。
5.权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD与表达载体连接，转入大肠杆菌中。
6.权利要求1所述大肠杆菌重组菌在生产β-丙氨酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是以L-天冬氨酸或L-天冬氨酸钠作为底物，利用所述重组大肠杆菌进行全细胞转化生产β-丙氨酸。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌经过高密度发酵，所述高密度发酵的条件为：将培养6-8h的重组大肠杆菌菌液按5-8％的接种量接种于含卡那霉素浓度为80-120μg/mL的2L发酵罐培养基中，35-38℃培养，当OD600达到70-75时，温度降至28-30℃，流加10-15％乳糖诱导，诱导培养35-40h结束发酵。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述全细胞转化生产β-丙氨酸的体系：底物L-Asp-Na的浓度为600-1000mmol/L；其中，重组大肠杆菌浓度为OD600＝200-400；磷酸吡哆醛浓度为2-4mmol/L，40-60mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4缓冲液。
10.权利要求1所述的大肠杆菌重组菌在医药、化工或食品中的应用。
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