CN109055346A - 一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热稳定性提高的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶，属于基因工程技术领域。本发明通过对来源于赤拟谷盗的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶进行定点突变，获得K49R，G369A和K221R三个酶突变体，将突变体重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，表达分离纯化后，催化底物L‑天冬氨酸生成β‑丙氨酸。在50℃处理温度下，K49R可以使热稳定性相较于野生酶提高14％，G369A可以使热稳定性相较于野生酶提高20％，K221R可以使热稳定性相较于野生酶提高23％。其中，K221R还可以使比酶活达到约320U/g，相较于野生酶酶活提高了23％。这一发现对于工业化制备β‑丙氨酸具有重要的研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-a-decarboxylase，EC4.1.1.11，panD)催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸，是泛酸生物合成途径中重要的调控酶。
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，它的用途十分广泛。工业上，β-丙氨酸是合成泛酸钙的重要原料，也是合成肌肽的两种氨基酸之一；医药上，β-丙氨酸可以作为原料用于合成抑制恶性肿瘤骨转移的帕米膦酸钠和抗结肠炎药物巴柳氮，同时还可作为铅中毒的解毒剂以及用于合成甜味剂等。
在工业生产中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法或β-氨基丙腈水解法，但是这些方法大多需要在高温、高压、强酸或强碱的条件下，而且产物纯化步骤繁琐，制备过程中会对环境造成污染。因此，寻找其他方法替代化学合成法制备β-丙氨酸是十分有必要的。
目前研究所发现的L-天冬氨酸-α-脱羧酶普遍存在酶活较低的问题，而且在工业生产中，需要酶具有较好的热稳定性，因此，提高L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性和热稳定性对于工业上合成β-丙氨酸具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶具有SEQ ID NO.2-4任一所示的氨基酸序列，或者，是在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的热稳定性提高的其他蛋白质。
本发明的第二个目的是提供编码上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6-8任一所示。
本发明的第三个目的是提供携带上述基因的载体、细胞、转化体。
本发明的第四个目的是提供制备上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的方法，根据SEQ IDNO.5所示的基因序列，设计定点突变引物，对基因进行定点突变，获得核苷酸序列如SEQ IDNO.6-8任一所示的基因，并在大肠杆菌中进行表达。
在本发明的一种实施方式中，利用上述方法得到的L-天冬氨酸-α-脱羧酶包括K49R、K221R、G369A，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，是以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，是以pET 28a(+)为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，制备上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的方法的具体步骤包括：
(1)通过全质粒pcr得到核苷酸序列如SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因与pET 28a(+)表达载体相连的质粒；
(2)将pcr产物经DpnI消化后，通过热激法转入大肠杆菌JM109中；
(3)挑取转化后的单克隆菌落，35-40℃，200-220rpm摇菌12-16h，提取重组质粒；
(4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21表达。
本发明的第五个目的是提供一种重组大肠杆菌，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主，以pET 28a(+)为载体，表达如SEQ ID NO.2-4任一所示的L-天冬氨酸-α-脱羧酶。
本发明的第六个目的是提供上述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶在制备β-丙氨酸中的应用。
本发明的第七个目的是提供上述的重组大肠杆菌在制备β-丙氨酸中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过对来源于赤拟谷盗的L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行定点突变，获得K49R，G369A和K221R三个酶突变体，将突变体重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21中，表达分离纯化后，催化底物L-天冬氨酸生成β-丙氨酸。在50℃处理温度下，K49R可以使热稳定性相较于野生酶提高14％，G369A可以使热稳定性相较于野生酶提高20％，K221R可以使热稳定性相较于野生酶提高23％。其中，K221R还可以使比酶活达到约320U/g，相较于野生酶酶活提高了23％。这一发现对于工业化制备β-丙氨酸具有重要的研究价值。
附图说明
图1：野生型PanD酶和突变型酶比酶活比较；
图2：野生型PanD酶和突变型K49R温度稳定性图；
图3：野生型PanD酶和突变型G369A温度稳定性图；
图4：野生型PanD酶和突变型K221R温度稳定性图；
图5：野生型PanD酶最适反应pH图；
图6：突变型K49R酶最适反应pH图；
图7：突变型G369A酶最适反应pH图；
图8：突变型K221R酶最适反应pH图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行更详细的说明。
(一)培养基
2YT培养基：蛋白胨16g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl 5g/L。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH 7.4左右。
(二)天冬氨酸及β-丙氨酸含量的测定
反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500μL反应液于2.0mL离心管，加入250μL 0.1mol/L PITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5h，加入700μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置30-60min，吸取下层溶液，经0.22μm有机滤膜过滤，进样量为10μL。衍生产物用HPLC测定：色谱柱为La Chrom C18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)乙腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH 6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。
(三)目的蛋白的纯化方法：
(1)收集待测液，低速离心后完全弃上清，用Binding Buffer重悬，洗去残留培养液，再次低速离心弃上清，将菌体重悬后进行冰浴超声破碎；
(2)破碎完全后，4℃、13000rpm离心20-30min。粗酶液用0.45μm的无菌滤膜过滤，于冰上保存；
(3)使用1mL的His Trap FF纯化柱，先用含25mmol/L咪唑的Binding Buffer平衡层析柱；
(4)取20-30mL样品上样，用上述Binding Buffer将吸附在柱上的非特异性杂蛋白除去；
(5)用含500mmol/L咪唑的Washing Buffer进行线性洗脱蛋白，洗脱体积为15-20个柱体积，收集目标蛋白所在的峰；
(6)收集样品后用透析袋密封，置于50mmol/L，pH为7.0的Tris-HCl缓冲液中4℃下处理6-8h，去除残余咪唑，避免咪唑影响后续的酶学性质测定实验，13 000rpm离心10min，保留上清酶液；
(7)用SDS-PAGE凝胶电泳检测目标蛋白是否满足要求；
(8)Brandford法测目的蛋白浓度
(四)大肠杆菌感受态热击转化方法
向大肠杆菌感受态细胞中加入10μL PCR产物，充分混匀，将体系放在冰水混合物中静置30-40min，42℃热击90s，在放回冰水混合物中冷却5min，往离心管中加300-400μLLB培养基，37℃，振荡培养40-60min后，3 000rpm离心1min，弃200μL培养液上清，将剩余培养液重悬后，均匀涂布在含卡那抗生素的LB平板，37℃倒置培养12-16h。
实施例1重组突变型大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD的构建
以如SEQ ID NO.5所示的野生型赤拟谷盗来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因为模板，设计引物：
F49，序列信息如SEQ ID NO 9所示；R49，序列信息如SEQ ID NO 10所示。
F369，序列信息如SEQ ID NO 11所示；R369，序列信息如SEQ ID NO 12所示。
F221，序列信息如SEQ ID NO 13所示；R221，序列信息如SEQ ID NO 14所示。
用全质粒PCR方法得到突变后的基因与表达载体pET 28a(+)相连的质粒，DpnI消化3h左右，采用感受态热激发转入大肠杆菌JM109中，挑选出单克隆菌落，37℃，220rpm摇菌过夜，提取质粒送至测序公司测序，将测序结果正确的质粒转入大肠杆菌BL21中，构建成功的突变型分别命名为K49R，G369A，K221R。
实施例2重组突变型L-天冬氨酸-α-脱羧酶的表达及纯化
将重组野生型及突变型大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD接种于5mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基，37℃，200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的2YT培养基，37℃，200r/min振荡培养至菌液OD600至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，20℃诱导培养16-20h，收集菌体超声破碎，通过Tris-tricine SDS-PAGE方法分析鉴定L-天冬氨酸α-脱羧酶重组蛋白表达水平。通过超声破碎，离心，用亲和层析柱His Trap FF纯化蛋白。
实施例3重组突变型酶活和热稳定性检测
收集L-天冬氨酸α-脱羧酶重组大肠杆菌，用亲和层析柱进行纯化。用SDS-PAGE凝胶电泳检测目标蛋白后，采用Brandford法测目的蛋白浓度。
(1)酶活力的比较：
酶活的定义：在37℃，pH6.5条件下，每小时转化生成1mM产物β-丙氨酸所需酶量定义为1U。
比酶活定义：每g蛋白所含的酶活力单位数。
L-天冬氨酸-α-脱羧酶活力的测定：将能够正常表达的大肠杆菌大量培养，离心收集成熟的细胞，用50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)重悬，反复离心重悬两次后，用超声波破碎法破碎细胞，离心得到上清，然后进行纯化，得到纯化的酶测定酶浓度。取相同浓度酶液，加入终浓度为100mmol/L的L-天冬氨酸溶液，37℃反应10min后进行衍生。用HPLC检测酶活。图1显示野生型与突变型的酶活，其中K221R可以使比酶活达到约320U/g，相较于野生酶酶活提高了23％。
(2)酶的热稳定性比较：
将纯化后的酶稀释到相同的浓度，分别于0℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃处理半小时，然后于37℃下反应半小时后置于100℃处理十分钟终止反应。HPLC检测残余酶活。图2，图3，图4显示不同反应温度下野生型和突变型的热稳定性。
由图2，图3，图4可知，在50℃处理温度下，K49R可以使热稳定性相较于野生酶提高14％，G369A可以使热稳定性相较于野生酶提高20％，K221R可以使热稳定性相较于野生酶提高23％。
(3)酶的最适pH比较：
比较了野生型、K49R，K221R，G369A在不同pH条件下的酶活，将各自在最适pH下的酶活定义为100％，结果分别如图5，图6，图7，图8所示。结果显示，野生酶，K49R，K221R最适pH为6.5，G369A最适pH为6.0。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> PRT
<213> Tribolium castaneum Herbst
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Leu Lys Gly Ile Glu Arg Ala Asp Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys
340 345 350
Leu Leu Thr Ala Pro Gln Gln Cys Ser Thr Leu Leu Leu Arg His Glu
355 360 365
Gly Val Leu Ala Glu Ala His Ser Thr Asn Ala Ala Tyr Leu Phe Gln
370 375 380
Lys Asp Lys Phe Tyr Asp Thr Lys Tyr Asp Thr Gly Asp Lys His Ile
385 390 395 400
Gln Cys Gly Arg Arg Ala Asp Val Leu Lys Phe Trp Phe Met Trp Lys
405 410 415
Ala Lys Gly Thr Ser Gly Leu Glu Lys His Val Asp Lys Val Phe Glu
420 425 430
Asn Ala Arg Phe Phe Thr Asp Cys Ile Lys Asn Arg Glu Gly Phe Glu
435 440 445
Met Val Ile Ala Glu Pro Glu Tyr Thr Asn Ile Cys Phe Trp Tyr Val
450 455 460
Pro Lys Ser Leu Arg Gly Arg Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Lys Asp Lys
465 470 475 480
Leu His Lys Val Ala Pro Arg Ile Lys Glu Arg Met Met Lys Glu Gly
485 490 495
Ser Met Met Val Thr Tyr Gln Ala Gln Lys Gly His Pro Asn Phe Phe
500 505 510
Arg Ile Val Phe Gln Asn Ser Gly Leu Asp Lys Ala Asp Met Val His
515 520 525
Leu Val Glu Glu Ile Glu Arg Leu Gly Ser Asp Leu
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<210> 4
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Met Pro Ala Thr Gly Glu Asp Gln Asp Leu Val Gln Asp Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ala Thr Phe Ser Asp Ala Val Leu Ser Ser Asp Glu Glu Leu
20 25 30
Phe His Gln Lys Cys Pro Lys Pro Ala Pro Ile Tyr Ser Pro Val Ser
35 40 45
Lys Pro Val Ser Phe Glu Ser Leu Pro Asn Arg Arg Leu His Glu Glu
50 55 60
Phe Leu Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Leu Gln Glu Ala Val Phe Glu
65 70 75 80
Gly Thr Asn Arg Lys Asn Arg Val Leu Gln Trp Arg Glu Pro Glu Glu
85 90 95
Leu Arg Arg Leu Met Asp Phe Gly Val Arg Ser Ala Pro Ser Thr His
100 105 110
Glu Glu Leu Leu Glu Val Leu Lys Lys Val Val Thr Tyr Ser Val Lys
115 120 125
Thr Gly His Pro Tyr Phe Val Asn Gln Leu Phe Ser Ala Val Asp Pro
130 135 140
Tyr Gly Leu Val Ala Gln Trp Ala Thr Asp Ala Leu Asn Pro Ser Val
145 150 155 160
Tyr Thr Tyr Glu Val Ser Pro Val Phe Val Leu Met Glu Glu Val Val
165 170 175
Leu Arg Glu Met Arg Ala Ile Val Gly Phe Glu Gly Gly Lys Gly Asp
180 185 190
Gly Ile Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ala Asn Gly Tyr Ala Ile Ser
195 200 205
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210 215 220
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Ile Lys Lys Leu Ala Ser Phe Gln Gly Ile Gly Thr Asp Asn Val Tyr
245 250 255
Leu Ile Arg Thr Asp Ala Arg Gly Arg Met Asp Val Ser His Leu Val
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305 310 315 320
Ala Ala Trp Gly Gly Gly Ala Leu Val Ser Ala Lys His Arg His Leu
325 330 335
Leu Lys Gly Ile Glu Arg Ala Asp Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys
340 345 350
Leu Leu Thr Ala Pro Gln Gln Cys Ser Thr Leu Leu Leu Arg His Glu
355 360 365
Ala Val Leu Ala Glu Ala His Ser Thr Asn Ala Ala Tyr Leu Phe Gln
370 375 380
Lys Asp Lys Phe Tyr Asp Thr Lys Tyr Asp Thr Gly Asp Lys His Ile
385 390 395 400
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405 410 415
Ala Lys Gly Thr Ser Gly Leu Glu Lys His Val Asp Lys Val Phe Glu
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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gctccgatct actctccggt ttctaagcca gttagcttcg aatctctgcc aaaccgtcgt 180
ctgcacgaag aattcctgcg ttcttctgtt gacgttctgc tgcaagaggc tgtcttcgaa 240
ggcaccaacc gtaaaaaccg tgttctgcag tggcgtgaac cggaagaact gcgtcgtctg 300
atggacttcg gtgttcgttc tgctccgtct acccacgaag aactgctgga agttctgaaa 360
aaagttgtta cctactctgt taaaaccggt cacccgtact tcgttaacca gctgttctct 420
gctgttgacc cgtacggtct ggttgctcag tgggctaccg acgctctgaa cccgtctgtt 480
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cgtgctatcg ttggtttcga aggtggtaaa ggtgacggta tcttctgccc gggtggttct 600
atcgctaacg gttacgctat ctcttgcgct cgttaccgtt tcatgccgga catcaaaaaa 660
aaaggtctgc actctctgcc gcgtctggtt ctgttcacct ctgaagacgc tcactactct 720
atcaaaaaac tggcttcttt ccagggtatc ggtaccgaca acgtttacct gatccgtacc 780
gacgctcgtg gtcgtatgga cgtttctcac ctggttgaag aaatcgaacg ttctctgcgt 840
gaaggtgctg ctccgttcat ggtttctgct accgctggta ccactgttat aggtgcgttc 900
gacccgatcg agaaaatcgc tgacgtttgc cagaaataca aactgtggct gcacgttgac 960
gctgcttggg gtggtggtgc tctggtttct gctaaacacc gtcacctgct gaaaggtatc 1020
gaacgtgctg actctgttac ctggaacccg cacaaactgc tgaccgctcc gcagcagtgc 1080
tctaccctgc tgctgcgtca cgaaggtgtt ctggctgaag ctcactctac caacgctgct 1140
tacctgttcc agaaagacaa attctacgac accaaatacg acaccggtga caaacacatc 1200
cagtgcggtc gtcgtgctga cgttctgaaa ttctggttca tgtggaaagc taaaggtacc 1260
tctggtctgg aaaaacacgt tgacaaagtt ttcgaaaacg ctcgtttctt caccgactgc 1320
atcaaaaacc gtgaaggttt cgaaatggtt atcgctgaac cggaatacac caacatctgc 1380
ttctggtacg ttccgaaatc tctgcgtggt cgtaaagacg aagctgacta caaagacaaa 1440
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acctaccagg ctcagaaagg tcacccgaac ttcttccgta tcgttttcca gaactctggt 1560
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<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 1620
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<213> 人工合成
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<211> 33
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<400> 13
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
cagagagtgc agacctcttt ttttgatgtc cgg 33
Claims (10)
1.一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，其特征在于，具有SEQ ID NO.2-4任一所示的氨基酸序列，或者，是在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的热稳定性提高的其他蛋白质。
2.编码权利要求1所述的一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.6-8任一所示。
3.携带权利要求2所述基因的载体、细胞、转化体。
4.制备权利要求1所述的一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶的方法，其特征在于，根据SEQ IDNO.5所示的基因序列，设计定点突变引物，对基因进行定点突变，获得核苷酸序列如SEQ IDNO.6-8任一所示的基因，并在大肠杆菌中进行表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以pET 28a(+)为表达载体。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)通过全质粒pcr得到核苷酸序列如SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因与pET 28a(+)表达载体相连的质粒；
(2)将pcr产物经DpnI消化后，通过热激法转入大肠杆菌JM109中；
(3)挑取转化后的单克隆菌落，35-40℃，200-220rpm摇菌12-16h，提取重组质粒；
(4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21表达。
8.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主，以pET 28a(+)为载体，表达如SEQ ID NO.2-4任一所示的L-天冬氨酸-α-脱羧酶。
9.权利要求1所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶在制备β-丙氨酸中的应用。
10.权利要求8所述的重组大肠杆菌在制备β-丙氨酸中的应用。
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