CN109536429A

CN109536429A - 一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN109536429A
Application number: CN201811523470.0A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 刘中美; 周丽; 崔文璟; 郭军玲; 于佳印
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2019-03-29

Abstract

本发明公开了一种产L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶的基因工程菌及其应用，属于生物工程领域。本发明通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶菌株，将重组菌株摇瓶发酵，以L‑Asp‑Na作为底物，进行全细胞催化反应制备L‑丙氨酸。此法与化学生产法相比，生产工艺安全清洁，无环境污染，催化效率高，终产物L‑丙氨酸产率96％以上，简化产物的分离纯化步骤。

Description

一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，在日化、食品和医药行业中有着广泛的用途。在日化领域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的原料；在食品领域，L-丙氨酸具有甜味，能与谷氨酸钠制成混合调味品，可调制并明显改善食品风味，而不破坏食品原有的风格；在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6和L-氨基丙醇(盐酸左氧氟沙星合成前体)的主要原料；同时，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液和输液的主要成分，也是心肌功能增强剂。

在化学合成生产中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常见思路，但该方法存在产品质量差，合成路线长，收率低，成本高，环境污染严重等缺点，目前基本被淘汰。使用生物酶催化法和发酵法制备L-丙氨酸已成为工业生产上主要采用的方法。

目前用于制备L-丙氨酸的生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，敲除次级代谢产物编码基因和L-丙氨酸消耗旁路基因，获得生产L-丙氨酸菌株，在培养微生物过程中合成L-丙氨酸；周丽等以野生型大肠杆菌为出发菌株，敲除代谢产物合成途径编码基因以及丙氨酸消旋酶编码基因，将L-丙氨酸脱氢酶基因转入缺陷型菌株中获得目的菌株，该菌株发酵生产L-丙氨酸在摇瓶水平产量可达67.2g/L。另一种方法使生物酶法合成L-丙氨酸，即通过表达L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去β-羧基生成L-丙氨酸。编码L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因Asd被发现广泛存在于假分枝杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、醋酸杆菌、产气荚膜菌等微生物中。徐虹等人通过诱变获得一株具有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活性的假单胞菌，对底物L-天冬氨酸催化转化率接近100％，但需要5天进行催化反应，时间过长；Wang等人在大肠杆菌异源表达Pseudomonas sp.ATCC 19121来源的Asd酶，该酶比酶活为280U/mg，比酶活很低。

因此，提供一种高产L-丙氨酸的方法、一种酶活更高的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，对于工业应用生产L-丙氨酸具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一株重组来源于不动杆菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的大肠杆菌，并以该重组大肠杆菌为催化剂，利用全细胞催化法生产L-丙氨酸。

本发明的第一个目的是提供一株大肠杆菌重组菌，异源表达了不动杆菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶。

在本发明的一种实施方式中，所述Acinetobacter sp.ACNIH2来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以pET 28a(+)为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述不动杆菌来源的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供上述重组菌的构建方法，所述方法是将L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd与表达载体连接，转入大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：

(1)合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd；

(2)将克隆出的基因连接到pET 28a(+)，构建成为重组质粒pET 28a-Asd；

(3)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-AbAsd。

本发明的第三个目的是提供一种生产L-丙氨酸的方法，是应用上述大肠杆菌重组菌参与转化反应。

在本发明的一种实施方式中，以含L-天冬氨酸的物质作为底物，以权利要求1-4任一所述的大肠杆菌重组菌为全细胞催化剂。

在本发明的一种实施方式中，利用所述大肠杆菌作为全细胞催化剂催化L-天冬氨酸转化生产L-丙氨酸的反应条件为：调整温度为35-38℃，L-天冬氨酸钠以800-1000mmol/L的终浓度加入到OD₆₀₀为8-20的菌液中，缓冲液为40-60mmol/L CH₃COOH/CH₃COONa缓冲液。

本发明的第四个目的是提供一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明的第五个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在制药、化工或食品中的应用。

本发明的有益效果：本发明通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L-天冬氨酸β-脱羧酶菌株，重组L-天冬氨酸β-脱羧酶的纯酶比酶活为4100U/mg；将重组菌株进行摇瓶发酵，以L-Asp-Na作为底物，进行全细胞催化反应制备L-丙氨酸，L-丙氨酸的浓度为960mmol/L，L-丙氨酸产率为96％，简化了产物的分离纯化步骤，发酵周期短，生产效率高。

附图说明

图1：Ab-Asd的基因片段的核酸电泳验证结果，其中M为DNA分子量标准(250-10000bp)，1为L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因片段。

图2：重组质粒pET28a-AbAsd的图谱。

图3：AbAsd蛋白表达的SDS-PAGE验证结果，M：为蛋白分子量标准(20-200kDa)；1：大肠杆菌BL21pET28a-AbAsd重组菌诱导后的细胞破碎液上清。

图4：全细胞催化生产L-丙氨酸示意图。

图5：异源表达Pseudomonas sp.ATCC 19121来源的Asd得到的重组L-天冬氨酸-β-脱羧酶和异源表达来源的Asd得到的重组L-天冬氨酸-β-脱羧酶的酶活比较。

具体实施方式

(一)细胞密度

UV-1800PC型紫外可见分光光度计测量OD₆₀₀，根据吸光值和OD的关系换算，换算关系：1g/L＝0.3683OD ₆₀₀。

(二)酶活的定义和检测方法

酶活的定义(U)：每分钟转化L-天冬氨酸生成1mmol/L L-丙氨酸所需的酶量定义为1U。

比酶活(U/mg)：每毫克Asd的酶活。

(三)天冬氨酸及β-丙氨酸含量的测定

反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500μL反应液于2.0mL离心管，加入250μL 0.1mol/L PITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5h，加入700μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置30-60min，吸取下层溶液，经0.22μm有机滤膜过滤，进样量为10μL。衍生产物用HPLC测定：色谱柱为La Chrom C18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)乙腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH 6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。

(四)亲和层析柱His Trap FF纯化蛋白的方法

将重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的His Trap HP柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品，4℃、2L磷酸盐缓冲液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/LNaCl)透析20h，SDS-PAGE分析鉴定。

实施例1重组大肠杆菌BL21/pET28a-AbAsd的构建

人工合成Ab-Asd基因序列(如SEQ ID NO.2所示)，Ab-Asd基因的基因片段SDS-PAGE验证结果见图1。设计特异性引物P1、P2(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，划线部分分别为EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶酶切位点)。

表1引物表

P1	5'-CCG<u>GAATTC</u>ATGGGGAATGTTGATTACTCAAAATATG-3'
		P2	5'-CCG<u>CTCGAG</u>CTATTTCGCTTTCTTCTTATTGGC-3'

将L-天冬氨酸β-脱羧酶基因Ab-Asd通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到用同样用限制性内切酶酶切的表达载体pET 28a(+)上，获得重组质粒pET 28a-AbAsd(见图2)；将重组质粒转化大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-AbAsd。

实施例2重组L-天冬氨酸β-脱羧酶的表达

将重组大肠杆菌BL21/pET28a-AbAsd接种于5mL卡那霉素浓度为100μg/mL的TB培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的TB培养基，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，30℃诱导培养16-20h，收集菌体超声破碎，通过Tris-tricine SDS-PAGE方法分析鉴定L-天冬氨酸β-脱羧酶重组蛋白表达水平，见图3。通过超声破碎，离心，用亲和层析柱His Trap FF纯化蛋白，重组L-天冬氨酸β-脱羧酶的纯酶比酶活为4100U/mg。

实施例3全细胞催化法生产β-丙氨酸

将摇瓶发酵后的菌液离心收集，水洗后再次离心收集。在含有底物浓度800mM的天冬氨酸钠(L-ASP-Na)50mL反应体系中，加入OD₆₀₀为300的重组大肠杆菌菌液，反应体系中含有50mmol/L CH₃COOH/CH₃COONa缓冲液(pH 5.5)，37℃、200r/min下进行全细胞反应(振荡反应)，每隔1h取样，终止反应时取适量反应液于100℃煮沸10min，12000r/min离心10min，取上清，用0.22μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测反应液中各成分的含量，计算得到L-丙氨酸的浓度为960mmol/L，L-丙氨酸产率为96％，L-天冬氨酸几乎无剩余，如图4所示。

对比例其他来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶在大肠杆菌中重组表达

以Pseudomonas sp.ATCC 19121来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶基因为目的基因(Genbank编号为AF506011.1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核酸序列如SEQ ID NO.6所示，其余条件同实施例1和实施例2。

此方法得到的重组L-天冬氨酸β-脱羧酶的纯酶比酶活为1200U/mg，如图5所示。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 534

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp

<400> 1

Met Gly Asn Val Asp Tyr Ser Lys Tyr Ala Lys Leu Ser Pro Phe Glu

1 5 10 15

Leu Lys Asp Glu Leu Ile Ala Leu Ala Leu Ser His Thr Asp Arg Met

20 25 30

Met Leu Asn Ala Gly Arg Gly Asn Pro Asn Phe Leu Ala Thr Val Pro

35 40 45

Arg Arg Ala Phe Phe Gln Leu Gly Leu Phe Ser Ala Thr Glu Ser Glu

50 55 60

Phe Ser Phe Ser Tyr Met Pro Glu Gly Leu Gly Gly Phe Pro Arg Thr

65 70 75 80

Glu Gly Leu Gln Ser Arg Phe Asp His Phe Val Leu Glu Asn Arg Asp

85 90 95

Lys Pro Gly Val Val Phe Leu Gly Lys Ala Ile Ser Tyr Val Arg Asp

100 105 110

Gln Leu Gly Leu Asp Pro Asp Ala Phe Leu Leu Glu Met Val Glu Gly

115 120 125

Ile Leu Gly Cys Asn Tyr Pro Val Pro Asp Arg Met Leu Lys Val Ser

130 135 140

Glu Lys Ile Ile Lys Glu Tyr Val Leu Arg Glu Met Gly Val Gln Gly

145 150 155 160

Met Pro Gln Glu Gly Leu Asp Leu Phe Ala Val Glu Gly Gly Thr Ala

165 170 175

Ala Met Ala Tyr Ile Phe Asn Ser Leu Lys Glu Asn Lys Ile Ile Ser

180 185 190

Thr Gly Asp Arg Ile Ala Ile Gly Ser Pro Ile Phe Thr Pro Tyr Leu

195 200 205

Glu Ile Pro Lys Leu Asn Asp Tyr Gln Leu Glu Glu Val Leu Ile Glu

210 215 220

Ala Asp Ala Asn Leu Gly Trp Gln Tyr Pro Glu Ser Glu Leu Arg Lys

225 230 235 240

Leu Glu Asp Pro Ser Ile Lys Ala Phe Phe Leu Val Asn Pro Ser Asn

245 250 255

Pro Pro Ser Val Lys Met Ser Asp Glu Gly Leu Ala Ile Leu Ala Asp

260 265 270

Ile Val Lys Lys Arg Pro Asp Leu Ile Ile Leu Thr Asp Asp Val Tyr

275 280 285

Gly Thr Phe Ala Asp Asn Phe Lys Ser Leu Phe Ala Ile Cys Pro Asp

290 295 300

Asn Thr Ile Leu Val Tyr Ser Phe Ser Lys Tyr Phe Gly Ala Thr Gly

305 310 315 320

Trp Arg Leu Gly Val Ile Ala Leu Ser Asn Asn Asn Ile Leu Asp Lys

325 330 335

Lys Ile Ala Asn Leu Ser Lys Lys Asp Lys Leu Glu Leu Glu Glu Arg

340 345 350

Tyr Ser Ser Leu Thr Thr Asp Pro Ser Ser Ile Lys Phe Ile Asp Arg

355 360 365

Leu Val Ala Asp Ser Arg Asn Val Ala Leu Asn His Thr Ala Gly Leu

370 375 380

Ser Thr Pro Gln Gln Val Gln Met Val Leu Phe Ala Leu Phe Asn Met

385 390 395 400

Met Asp Ser Arg Gln Ser Tyr Lys Lys Ala Val Lys Ser Val Val Arg

405 410 415

Glu Arg Asp Ala Thr Leu Tyr Arg Gln Leu Gly Val Glu Ile Pro Gln

420 425 430

Asp Pro Asn Ser Val Asn Tyr Tyr Thr Leu Val Asn Leu Glu Lys Thr

435 440 445

Ala Arg Thr Leu Tyr Gly Asp Glu Phe Ala Glu Trp Ile Met Lys Asn

450 455 460

Lys Asn Pro Thr Glu Leu Leu Phe Arg Val Ala Asp Glu Thr Gly Val

465 470 475 480

Val Leu Leu Pro Gly Ser Gly Phe Gly Val Gln His Pro Ser Ala Arg

485 490 495

Ala Ser Leu Ala Asn Leu Asn Glu Phe Gln Tyr Ala Ala Ile Gly Thr

500 505 510

Ser Leu Arg Lys Phe Ala Glu Glu Ala Tyr Glu Glu Phe Lys Lys Ala

515 520 525

Asn Lys Lys Lys Ala Lys

530

<210> 2

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggggaatg ttgattactc aaaatatgca aaactaagcc catttgaact taaagatgaa 60

ctgattgcac tggctttaag ccatacagat cgtatgatgc tcaatgcggg tcgcggaaat 120

ccaaactttc ttgcaaccgt accacgccgt gctttttttc agcttggttt attctcggca 180

actgagtctg aattttcatt ttcctacatg ccagaagggc taggtggttt tcctagaacc 240

gaagggctac agtcacgctt tgatcatttc gtactagaaa atcgtgataa acctggtgtc 300

gtctttttag gtaaagcaat ttcctatgtc cgtgatcaat tgggtttaga tcctgatgct 360

ttcttgctag agatggttga aggtattctc ggttgtaact accccgtacc agatcgaatg 420

cttaaagtca gtgaaaaaat tattaaagaa tatgttttac gtgaaatggg tgttcaagga 480

atgccacaag aagggttaga tctgtttgcc gttgaaggtg gtacagctgc aatggcctat 540

atttttaatt cactgaaaga aaataaaatt atttctactg gcgaccgaat tgcaattggt 600

tctccaattt tcacccctta tttagaaatc ccaaaactca atgattatca acttgaagaa 660

gtgctgattg aagcagatgc taaccttggc tggcagtatc cagaatctga attacgtaaa 720

ttagaagacc cctctatcaa ggcattcttt ttagttaacc caagcaaccc accatcagtg 780

aaaatgagtg atgaaggctt agcaattttg gcggatatcg tcaaaaaacg tccagacctg 840

attattctaa cagatgacgt atatggcaca tttgcagata actttaaatc cttatttgcg 900

atatgcccag acaatacgat tttggtttat tcattctcga aatattttgg agctacgggt 960

tggagactcg gtgtaattgc actcagtaac aataatattt tagataagaa aattgcgaat 1020

ctctctaaaa aagataagtt agaactcgaa gaacgttatt catctttgac cacagatcca 1080

tcaagcatca agtttattga tcgtcttgta gccgacagtc gcaatgtcgc cttaaatcat 1140

actgcgggct tatcaacgcc gcagcaagtt caaatggtgc tttttgcatt atttaatatg 1200

atggattcac gtcaaagcta caaaaaagcg gtgaaatctg tggtacgtga acgtgatgcc 1260

actttatatc gtcaacttgg tgttgaaatt ccacaagacc caaattctgt caattattac 1320

acattggtga atttggaaaa aaccgctcgt accttatatg gcgatgagtt tgctgaatgg 1380

attatgaaaa ataagaatcc aacagaatta ttattccgtg ttgcggatga aaccggtgtt 1440

gtacttttac ctggttctgg cttcggcgtt caacatccat ctgctcgagc atcattggca 1500

aatttaaatg agtttcaata tgcggccata ggaacatctt tacgtaaatt tgccgaagaa 1560

gcctatgagg aatttaaaaa agccaataag aagaaagcga aatag 1605

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccggaattca tggggaatgt tgattactca aaatatg 37

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccgctcgagc tatttcgctt tcttcttatt ggc 33

<210> 5

<211> 531

<212> PRT

<213> Pseudomonas sp

<400> 5

Met Ser Lys Asp Tyr Arg Ser Leu Ala Asn Leu Ser Pro Phe Glu Leu

1 5 10 15

Lys Asp Glu Leu Ile Lys Val Ala Ser Gly Lys Ala Asn Arg Leu Met

20 25 30

Leu Asn Ala Gly Arg Gly Asn Pro Asn Phe Leu Ala Thr Thr Pro Arg

35 40 45

Arg Ala Phe Phe Arg Leu Gly Leu Phe Ala Ala Ala Glu Ser Glu Leu

50 55 60

Ser Tyr Ser Tyr Met Thr Val Gly Val Gly Gly Leu Ala Lys Leu Asp

65 70 75 80

Gly Ile Glu Gly Arg Phe Glu Arg Phe Ile Ala Glu His Arg Asp Gln

85 90 95

Glu Gly Val Lys Phe Leu Gly Lys Ser Leu Ser Tyr Val Arg Asp Gln

100 105 110

Leu Gly Leu Asp Pro Ala Ala Phe Leu His Glu Met Val Asp Gly Ile

115 120 125

Leu Gly Cys Asn Tyr Pro Val Pro Pro Arg Met Leu Thr Val Ser Glu

130 135 140

Gln Ile Val Arg Gln Tyr Ile Val Arg Glu Met Ala Gly Gly Ala Val

145 150 155 160

Pro Pro Glu Ser Val Asp Leu Phe Ala Val Glu Gly Gly Thr Ala Ala

165 170 175

Met Ala Tyr Ile Phe Glu Ser Leu Arg Ile Ser Gly Leu Leu Lys Ala

180 185 190

Gly Asp Lys Val Ala Ile Gly Met Pro Val Phe Thr Pro Tyr Ile Glu

195 200 205

Ile Pro Glu Leu Ala Gln Tyr Asp Leu Lys Glu Val Pro Ile His Ala

210 215 220

Asp Pro Asp Asn Gly Trp Gln Tyr Ser Asp Ala Glu Leu Asp Lys Leu

225 230 235 240

Lys Asp Pro Asp Val Lys Ile Phe Phe Cys Val Asn Pro Ser Asn Pro

245 250 255

Pro Ser Val Lys Met Asp Gln Arg Ser Leu Asp Arg Val Arg Ala Ile

260 265 270

Val Ala Glu Gln Arg Pro Asp Leu Leu Ile Leu Thr Asp Asp Val Tyr

275 280 285

Gly Thr Phe Ala Asp Glu Phe Gln Ser Leu Phe Ser Val Cys Pro Arg

290 295 300

Asn Thr Leu Leu Val Tyr Ser Phe Ser Lys Tyr Phe Gly Ala Thr Gly

305 310 315 320

Trp Arg Leu Gly Val Ile Ala Ala His Lys Asp Asn Val Phe Asp His

325 330 335

Ala Leu Ser Gln Leu Pro Glu Ser Ala Lys Lys Ala Leu Asp His Arg

340 345 350

Tyr Arg Ser Leu Leu Pro Asp Val Arg Ser Leu Lys Phe Ile Asp Arg

355 360 365

Leu Val Ala Asp Ser Arg Val Val Ala Leu Asn His Thr Ala Gly Leu

370 375 380

Ser Thr Pro Gln Gln Val Gln Met Val Leu Phe Ser Leu Phe Ala Leu

385 390 395 400

Met Asp Glu Ala Asp Ala Tyr Lys Gln Ala Leu Lys Gln Leu Ile Arg

405 410 415

Arg Arg Glu Ala Thr Leu Tyr Arg Glu Leu Gly Met Pro Pro Leu Glu

420 425 430

Asn Pro Asn Ser Val Asn Tyr Tyr Thr Leu Ile Asp Leu Gln Asn Val

435 440 445

Thr Cys Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Gln Trp Ala Val Gln Gln

450 455 460

Ser Ser Thr Gly Asp Met Leu Phe Arg Val Ala Asp Glu Thr Gly Ile

465 470 475 480

Val Leu Leu Pro Gly Arg Gly Phe Gly Ser Asp Arg Pro Ser Gly Arg

485 490 495

Ala Ser Leu Ala Asn Leu Asn Glu Tyr Glu Tyr Ala Ala Ile Gly Arg

500 505 510

Ala Leu Arg Arg Leu Ala Asp Glu Leu Tyr Glu Gln Tyr Lys Ala Leu

515 520 525

Gly Lys Glu

530

<210> 6

<211> 1596

<212> DNA

<213> Pseudomonas sp

<400> 6

atgagcaagg attatcggag tctggcgaat ttgagcccgt tcgaactcaa ggacgaactg 60

atcaaggtgg cctcgggcaa ggccaaccgc ctcatgctca atgcggggcg cggcaatccc 120

aacttcctgg cgaccacgcc gcgccgggcc ttcttccggc tggggctgtt cgcggcggcg 180

gagtcggagt tgtcgtactc ctacatgacg gtgggcgtgg gcgggctggc caagctcgac 240

ggcatcgagg ggcgcttcga gcgcttcatc gccgagcacc gcgaccagga gggcgtcaag 300

ttcctgggca agtcgctgag ctatgtgcgc gaccaactgg ggctggaccc cgccgccttc 360

ctgcacgaga tggtggacgg catcctgggc tgcaactacc ccgtgccgcc gcgcatgctc 420

accgtgagcg agcagatcgt gcgccagtac atcgtgcgcg agatggcagg cggcgcagtg 480

ccgcccgagt cggtggacct gttcgcggtc gagggcggca cggcggccat ggcctatatc 540

ttcgagagcc tgcgcatcag cggcctgctc aaggccggcg acaaggtggc catcggcatg 600

ccggtgttca cgccgtatat cgagatcccc gaactggccc agtacgacct caaggaagtg 660

cctatacacg cggaccccga caacggctgg cagtactccg acgccgagct ggacaagctc 720

aaggacccgg acgtcaagat cttcttctgc gtgaacccca gcaacccgcc gtccgtgaag 780

atggaccagc gcagcctgga ccgcgtgcgc gccatcgttg ccgagcagcg gcccgacctg 840

ctgatcctca ccgacgatgt ctacggcacc tttgccgatg aattccagtc ccttttctcg 900

gtctgccccc ggaacacgct gctggtgtat tcgttctcca agtatttcgg ggccacgggc 960

tggcgcctgg gcgtgatcgc ggcgcacaag gacaacgtgt tcgaccatgc actgtcgcag 1020

ttgcccgagt ccgctaagaa ggcgctggac caccgctacc gctcgctgct gcccgatgtg 1080

cgctcgctca agttcatcga ccgcctggtg gccgacagcc gcgtggtggc gttgaaccac 1140

acggccggcc tgtccacgcc gcaacaggtg cagatggtgc tgttctcgct gtttgcgcta 1200

atggatgaag cggacgccta caagcaggcg ctcaagcaac tgatccgccg ccgcgaggcc 1260

acgctgtacc gcgagctggg catgcccccg ctggagaacc ccaactcggt caactactac 1320

acgctgatcg atctgcagaa cgtcacctgc cgactctacg gcgaggcctt ctcgcaatgg 1380

gccgtgcagc agtcctcgac cggcgacatg ctgttccgcg tggcggacga gaccggcatc 1440

gtgctgctgc cgggccgggg cttcgggtcc gaccgcccct cgggccgcgc ctcgctggcc 1500

aacctcaacg agtatgagta cgccgccata ggccgcgccc tgcgccggct ggccgacgag 1560

ctgtacgagc agtacaaggc gctgggcaag gagtag 1596

Claims

1.一株大肠杆菌重组菌，其特征在于，异源表达了不动杆菌(Acinetobactersp.ACNIH2)来源的L-天冬氨酸-β-脱羧酶。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主。

3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，以pET 28a(+)为表达载体。

4.根据权利要求1-3任一所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因。

5.权利要求1-4任一所述重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因Asd与表达载体连接，转入大肠杆菌中。

6.一种生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，应用权利要求1-4任一所述大肠杆菌重组菌参与转化反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以含L-天冬氨酸的物质作为底物，以权利要求1-4任一所述的大肠杆菌重组菌为全细胞催化剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，催化反应温度为35-38℃，底物以800-1000mmol/L的终浓度加入到OD₆₀₀为8-20的菌液中。

9.一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

10.权利要求1所述的大肠杆菌重组菌在制药、化工或食品中的应用。