CN105158454A - 一种试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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CN105158454A CN201510579964.0A CN201510579964A CN105158454A CN 105158454 A CN105158454 A CN 105158454A CN 201510579964 A CN201510579964 A CN 201510579964A CN 105158454 A CN105158454 A CN 105158454A
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Abstract

本发明涉及医疗器械技术领域，本发明公开了一种试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括以下组份：一抗地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、3H标记羊角拗苷甲、聚乙二醇6000、3H闪烁液、三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的混合溶液以及含有或者不含有羊角拗苷甲。本发明试剂盒冻存后复苏效果极佳，可经解冻复苏后直接使用，反复冻存不影响活性，保存、携带都很方便；此外，试剂盒的操作简单、灵敏度高且特异性强，能够稳定可靠的早期诊断孕期子痫，为之后的治疗提供有利依托。

Description

一种试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种检测孕期先兆子痫或子痫的试剂盒及其检测方法。
背景技术
孕期早痫是一种病发原因复杂的综合征，如果不及时治疗，可发展为子痫，危及生命。主要症状有高血压、蛋白尿，水肿，惊厥，肾功能损伤等，已成为世界上孕妇致死率最高的一种疾病，目前具体病因不明。有研究证明，胎盘产生的一种导致易感妇女母体血管内皮功能障碍的物质可能是早痫病发的其中一个原因。血压升高是该疾病最明显的标志，同时造成对产妇内皮，肾脏和肝脏的损害，并释放血管收缩因子。
早痫在全球孕妇中发病率为6-8％，通常发病于妊娠二期晚期或妊娠三期，大部分在孕期32周之后发病(32周前发病被认为是早期发病)。极少数孕妇会在孕期20周发病。初次怀孕的孕妇发病率最高，并且随着妊娠次数的增加，该疾病发病率大幅度降低。早痫多发于具有高血压史，糖尿病史，肥胖症史，自身免疫性疾病史如狼疮，和多胎妊娠(双胞胎或多胞胎)的孕妇中，其发病过程因人而异，大多数病例可以在分娩前被确诊。少数病例在分娩后六周才被确诊，称为“产后早痫”。确诊后除了剖腹产或引产手术，没有其他治疗方式。早痫是最常见的的妊娠综合症，同时影响母亲和胎儿，导致早产儿甚至对母婴造成生命危险。
传统上早痫的确诊标志是孕期高血压(两个独立的至少相隔六小时的测量值，收缩压为140以上和/或舒张压为90以上)和24小时尿液样本中的蛋白含量高于300毫克(蛋白尿)。比基线血压(BP)高30毫米汞柱的收缩压或高15毫米汞柱的舒张压，不能达到140/90的绝对标准，仍然被认为是重要发病信号，但并不能就此确诊。肿胀或水肿(尤其是在手和脸)最初曾被认为是诊断早痫的一个重要标志，但目前的医学实践证明，只有高血压和蛋白尿可以作为诊断标准。
虽然早痫是一种致命性疾病，但其早期发病通常无症状。而且一般情况下，早痫的信号都不是特异性的，比如孕期惊厥，在怀孕过程中，其他原因比子痫更容易导致惊厥。因此早痫的早期诊断一直是医学界无法攻克的一个难题。
在早痫病人的症状中，一种钠钾泵抑制因子-内源性洋地黄样因子(endogenousdigitalis-likefactor，EDLF)水平的升高，是早痫的重要标志。这种因子能够导致血压升高，存在于人体和动物组织及体液中，其化学结构和生物活性与植物洋地黄中提取的类固醇强心剂相似，故名“洋地黄样因子”。此因子能够以与地高辛等强心剂类似的机制结合到钠钾泵上，并抑制其活性。
为了实现对妊娠早痫的早期诊断，达到早期治疗的目的，需要以地高辛抗体作为工具，开发一种可以特异性精确测量样品中内源性洋地黄样因子的方法，并制成操作简便快捷的试剂盒。CN103439492B提供了一种试剂盒，包括：一抗地高辛抗体12微克/毫升、二抗鼠抗羊IgG5×10-7摩尔/升、3H标记羊角拗苷甲为10Ci/mmol、浓度为20％聚乙二醇6000水溶液、pH＝7.4的磷酸缓冲液、3H闪烁液；含有或者不含有羊角拗苷甲。该试剂盒具有操作简单方便、灵敏度高、特异性强等优点，并且能够稳定可靠的早期诊断孕期子痫，为之后的治疗提供有利依托。然而，由于其活性成分为蛋白质类的抗体，不能反复冻存，对此试剂盒的保存和携带带来了极大的障碍，严重影响其推广和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冻存后复苏效果极佳，可经解冻复苏后直接使用，且操作简单方便、灵敏度高、特异性强，能够稳定可靠的早期诊断孕期子痫的试剂盒及其检测方法。
为达到以上目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所述的早痫为先兆子痫。
第一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括以下组份：
一抗地高辛抗体、
二抗鼠抗羊IgG、
3H标记羊角拗苷甲、
三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的混合溶液、
聚乙二醇6000水溶液、
3H闪烁液；和
含有或不含有羊角拗苷甲。
其中，不含有羊角拗苷甲的试剂盒，可以按照标准曲线的绘制方法，制备标准曲线后，加入试剂盒说明书中，使用试剂盒人员可以按照标准曲线计算内源性洋地黄因子的浓度。本发明中的组分混合后，可以起到良好的冻存后复苏效果，可经解冻复苏后直接使用，而且可以反复冻存而不影响其使用。由于本发明的主要原料为抗体类物质，属于有活性的蛋白质；在一般条件下进行反复冻存会使蛋白质易于产生冰晶，聚集而失去活性，形成沉淀；与现有技术不同的是，本发明特别添加了三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠，由于分子间氢键和共价键的作用，使反复冻融后蛋白的疏水氨基酸残基不被暴露而包覆于溶液分子的间隙内部，因此不会聚合形成蛋白沉淀，不会产生变性的现象。另外，由于三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠形成的包覆层具有间隙，因此抗体可以与抗原接触，不影响其作用的发挥。
优选地，所述一抗地高辛抗体的浓度为5-15微克/毫升，例如可以是5微克/毫升、6微克/毫升、7微克/毫升、8微克/毫升、9微克/毫升、10微克/毫升、11微克/毫升、12微克/毫升、13微克/毫升、14微克/毫升或15微克/毫升。
优选地，所述二抗鼠抗羊IgG的浓度为4-8×10-7摩尔/升，例如可以是4×10-7摩尔/升、4.5×10-7摩尔/升、5×10-7摩尔/升、5.5×10-7摩尔/升、6×10-7摩尔/升、6.5×10-7摩尔/升、7×10-7摩尔/升、7.5×10-7摩尔/升或×10-7摩尔/升。
优选地，所述3H标记羊角拗苷甲的浓度为7-17Ci/mmol，例如可以是7Ci/mmol、8Ci/mmol、9Ci/mmol、10Ci/mmol、11Ci/mmol、12Ci/mmol、13Ci/mmol、14Ci/mmol、15Ci/mmol、16Ci/mmol或17Ci/mmol。
优选地，所述混合溶液中三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的质量比为1：(0.25-0.75)，例如可以是1：0.25、1：0.3、1：0.35、1：0.4、1：0.45、1：0.5、1：0.55、1：0.6、1：0.65、1：0.7或1：0.75。所述三羟甲基氨基甲烷的质量分数为13-28％，例如可以是13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％或28％。
优选地，所述聚乙二醇6000水溶液的质量分数为15-30％，例如可以是15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。其中，所述一抗地高辛抗体的优选浓度为12μg/mL，制备方法为取0.12mg地高辛抗体，溶于10mL去离子水中，轻轻混合均匀，避免使用搅拌器。所述聚乙二醇6000水溶液的优选浓度为20％，制备方法为取20mgPEG6000，置于100mL去离子水中，用搅拌器充分搅拌，使固体溶解，充分混匀。所述作为参照的非放射性3H标记羊角拗苷甲标准品的优选浓度梯度分别为2nM，5nM，10nM，20nM，50nM，0.1M及0.2M。
本发明所述的nM为纳摩尔/升；本发明所述的M为摩尔/升。
本发明所述的试剂盒需要可以测量3H放射性的仪器设备进行测量。(设备名为scintillationcounter。任何做放射性实验的实验室都有，操作过程为把样品放进去，运行操作软件，直接出结果。)
上述所述的试剂盒用于检测人体血清，胎盘组织分泌液，以及冷冻胎盘组织中的内源性洋地黄样因子的含量。
上述所述的试剂盒用于检测用于检测检孕期先兆子痫或子痫。
试剂盒用于检测孕期先兆子痫和子痫的方法为：
(1)采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；
(2)将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；
(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；
(4)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗、放射性标记羊角拗苷甲，分别等量加入，充分混合，室温孵育；
(5)再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；
(6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液；
(7)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。
或者：取孕妇血样，获得血清，取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、3H标记羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)，分别等量加入，充分混合，室温孵育；再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液200μL；测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。
测得孕妇高于10nM，为先兆子痫。
标准曲线绘制方法：
(1)采集胎盘(确诊为子痫孕妇，签署知情同意书)，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；
(2)将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；
(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；
(4)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、2nM羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)，分别等量加入，充分混合，室温孵育；
(5)再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；
(6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液2μL；
(7)测量样品放射量，得到样品中所含内源性洋地黄样因子浓度，
(8)重复上述操作，步骤(4)羊角拗苷甲依次替换为5nM，10nM，20nM，50nM，0.1M和0.2M，同时，将步骤(6)加入3H闪烁液依次替换成5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL，测得数值绘制成标准曲线。
上述所述的标准曲线可以放在试剂盒中，用于检测结果使用，也可以在检测时绘制标准曲线，再根据标准曲线测定检测结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种试剂盒，包括一抗地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、3H标记羊角拗苷甲、聚乙二醇6000、3H闪烁液、三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的混合溶液；其可以快速简单、方便而特异性地测量出样品中内源性洋地黄样因子的含量，从而稳定、可靠而灵敏地进行孕期子痫的早期诊断。本发明的冻存后复苏效果极佳，可经解冻复苏后直接使用，由于特殊成分的添加，可以反复冻存而不影响其活性；便于携带、存储和运输，保存期长。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明所述的一抗地高辛抗体购自GlaxoSmithKline(又名抗地高辛抗体)、二抗鼠抗羊IgG购自JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc、3H标记羊角拗苷甲购自PerkinElmer、聚乙二醇6000购自Calbiochem、pH＝7.4的磷酸缓冲液(PBS缓冲液)自配、3H闪烁液购自NationalDiagnostics、羊角拗苷甲(为羊角拗苷分离得到，羊角拗苷为羊角拗苷甲和羊角拗苷乙的混合物)购自Sigma、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)购自Sigma。
本发明所述的试剂盒需要可以测量3H放射性的仪器设备进行测量。(设备名为scintillationcounter。任何做放射性实验的实验室都有，操作过程为把样品放进去，运行操作软件，直接出结果。)
实施例1
本实施例的试剂盒含有：
一抗地高辛抗体(浓度为5微克/毫升)、
二抗鼠抗羊IgG(浓度为8×10-7摩尔/升)、
3H标记羊角拗苷甲(浓度为17Ci/mmol)、
三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的混合溶液(二者的质量比为1：0.25，三羟甲基氨基甲烷的质量分数为13％)和
聚乙二醇6000水溶液(质量分数30％)。
实施例2
本实施例的试剂盒含有：
一抗地高辛抗体(浓度为15微克/毫升)、
二抗鼠抗羊IgG(浓度为4×10-7摩尔/升)、
3H标记羊角拗苷甲(浓度为12Ci/mmol)、
三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的混合溶液(二者的质量比为1：0.5，三羟甲基氨基甲烷的质量分数为21％)、
聚乙二醇6000水溶液(质量分数23％)和羊角拗苷甲(浓度梯度为2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、0.1M及0.2M)。
实施例3
本实施例的试剂盒含有：
一抗地高辛抗体(浓度为10微克/毫升)、
二抗鼠抗羊IgG(浓度为6×10-7摩尔/升)、
3H标记羊角拗苷甲(浓度为7Ci/mmol)、
三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的混合溶液(二者的质量比为1：0.75，三羟甲基氨基甲烷的质量分数为28％)和
聚乙二醇6000水溶液(质量分数15％)。
实施例4试剂盒用于测量胎盘组织分泌的内源性洋地黄样因子含量
(1)采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；
(2)将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；
(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；
(4)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗、放射性标记羊角拗苷甲，分别等量加入，充分混合，室温孵育；
(5)再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；
(6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液200μL；
(7)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。
标准曲线的绘制：
(1)采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；
(2)将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；
(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；
(4)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、2nM羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)，分别等量加入，充分混合，室温孵育；
(5)再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；
(6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液2μL；
(7)测量样品放射量，得到样品中所含内源性洋地黄样因子浓度，
(8)重复上述操作，步骤(4)羊角拗苷甲依次替换为5nM，10nM，20nM，50nM，0.1M和0.2M，同时，将步骤(6)加入3H闪烁液依次替换成5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL，测得数值绘制成标准曲线。
结果显示，利用此试剂盒测量出独立胎盘组织中分泌的内源性洋地黄样因子浓度，单位为nM，此浓度可以被本发明提供的试剂盒精确测量。
实施例5该试剂盒用于测量人体冷冻胎盘组织中内源性洋地黄样因子的含量
(1)用刀片将冷冻胎盘组织块切成薄片；
(2)将组织薄片置于匀浆器中，液氮冷冻1分钟；
(3)以1500rpm的速度匀浆5分钟；
(4)取出组织匀浆，加等量甲醇，离心去除蛋白；
(5)将上清液浓缩，保存；
测量样品方法同实施例4中步骤(4)-(7)。标准曲线绘制同实施例4。
结果显示，此试剂盒可测量冷冻胎盘组织中内源性洋地黄样因子的浓度，样品来源均被确诊为早痫病发者。
实施例6该试剂盒用于测量人体血清中内源性洋地黄样因子的含量
测量方法同实施例4中步骤(4)-(7)。结果显示，该试剂盒可以精确测量出人体血清中低含量的内源性洋地黄样因子。
实施例7该试剂盒用于测量胎盘组织中分泌内源性洋地黄样因子的累积
方法同实施例4。结果显示，随着组织培养时间的累积，该试剂盒测出人胎盘分泌的内源性洋地黄样因子含量逐步增加。
此结果进一步证明本发明提供的试剂盒的精确可靠性，更为重要的是，为今后进一步研究该因子在人体内的生物合成以及生物调节打下基础。
对比例1
本对比例的试剂盒取自专利CN103439492B提供的试剂盒。
功能鉴定：
将实施例1-3和对比例1的试剂盒进行冷冻，放入-80℃超低温冰箱中，在不同冷冻次数下取以上4种冻存试剂盒，每种取三袋，小心放于冰上缓慢融化，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别测定蛋白质的活性，结果如表1所示。
表1蛋白质活性测定结果(n＝3)
冻存次数 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
5次 96.6％±0.5％ 95.5％±0.3％ 97.0％±0.3％ 87.3％±0.4％
10次 94.6％±0.4％ 93.8％±0.2％ 95.1％±0.5％ 58.5％±0.4％
15次 92.2％±0.5％ 93.1％±0.2％ 93.5％±0.4％ 32.6％±0.3％
20次 91.5±0.3％ 91.7％±0.2％ 91.3％±0.5％ 17.9％±0.4％
从表1可以看出，本发明的试剂盒经过多次反复冻存，蛋白质的活性仍然较高，即使经过20次反复冻存，蛋白质活性仍然保持在90％以上；而对比例的蛋白质活性经过反复冻存下降很快，反复冻存10次以后基本已经不能使用。可见，本发明的试剂盒不仅可以快速简单、方便而特异性地测量出样品中内源性洋地黄样因子的含量，从而稳定、可靠而灵敏地进行孕期子痫的早期诊断；还具有极佳的冻存后复苏效果，可经解冻复苏后直接使用，且反复冻存后不影响其活性，便于携带、存储和运输，保存期长。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.一种试剂盒，其特征在于，包括以下组份：
一抗地高辛抗体、
二抗鼠抗羊IgG、
3H标记羊角拗苷甲、
三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的混合溶液、
聚乙二醇6000水溶液、
3H闪烁液；和
含有或者不含有羊角拗苷甲。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述一抗地高辛抗体的浓度为5-15微克/毫升；
优选地，所述二抗鼠抗羊IgG的浓度为4-8×10-7摩尔/升；
优选地，所述3H标记羊角拗苷甲的浓度为7-17Ci/mmol；
优选地，所述混合溶液中三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠的质量比为1：(0.25-0.75)；所述三羟甲基氨基甲烷的质量分数为13-28％；
优选地，所述聚乙二醇6000水溶液的质量分数为15-30％。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测人体血清、胎盘组织分泌液以及冷冻胎盘组织中的内源性洋地黄样因子的含量。
4.根据权利1-3之一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测检孕期先兆子痫和/或子痫。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测孕期先兆子痫和子痫的方法为：
(1)采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；
(2)将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；
(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；
(4)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、3H标记羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，分别等量加入，充分混合，室温孵育；
(5)再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；
(6)沉淀物用500μLpH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液200μL；
(7)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度；
或者：取孕妇血样，获得血清，取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、3H标记羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，分别等量加入，充分混合，室温孵育；再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液200μL；测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的标准曲线的绘制方法为：
(1)采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；
(2)将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；
(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；
(4)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、2nM羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，分别等量加入，充分混合，室温孵育；
(5)再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；
(6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液200μL；
(7)测量样品放射量，得到样品中所含内源性洋地黄样因子浓度；
(8)重复上述操作，步骤(4)羊角拗苷甲依次替换为5nM，10nM，20nM，50nM，0.1M和0.2M，同时，将步骤(6)加入3H闪烁液依次替换成5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL，测得数值绘制成标准曲线。
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