CN104694522A - 一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用。采用本发明的制备方法制备的重组阳离子型猪胰蛋白酶和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶具有高的酶活力，重组阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为27800BAEE单位/mg酶；重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为30200BAEE单位/mg酶；商品化猪胰蛋白酶的酶活力为9600BAEE单位/mg酶。本发明的制备方法具有酶产量高、特异性好、无动物来源病毒等有优点，生产与制备工艺简单、成本低，可以应用于生物制药和蛋白质组学研究。

Description

一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用。

背景技术

胰蛋白酶(EC3.4.21.4)，是一种丝氨酸蛋白酶，在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在。在脊椎动物的胰脏中，胰蛋白酶以无活性的酶原(胰蛋白酶原)形式表达，经活化后形成胰蛋白酶。该酶可特异性的在蛋白质底物的赖氨酸和精氨酸的羧基端进行酶切水解，不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶在临床上可用于抗炎消肿，在工业上可用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。此外还常用于动物细胞培养前对组织的处理和蛋白组学研究。

激活的胰蛋白酶被称为β-胰蛋白酶。β-胰蛋白酶可进一步地激活更多的酶原。β-胰蛋白酶除了可以对底物蛋白进行酶切外，也可以发生自消化。比较典型的是在Lys131-Ser132之间发生自切而产生α-胰蛋白酶。α-胰蛋白酶通过分子内二硫键继续维持完整的胰蛋白酶分子形态，但是其活性显著降低。另外，来源于胰脏的胰蛋白酶中还含有胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)。胰凝乳蛋白酶在胰蛋白酶的纯化中很难被完全去除，使得动物来源的胰蛋白酶具有了非特异性酶切的活性。为克服这种非特异的酶切活性，发展了TPCK处理方法，可淬灭纯化的胰蛋白酶产物中的胰凝乳蛋白酶活性。

在生物制药领域，病毒去除是整个生物制药工艺中非常关键的步骤。这使得对动物来源的原材料要求非常严格，极大地限制了动物来源的胰蛋白酶的应用。寻求可生产高活性、特异性强并且无动物来源病毒风险的胰蛋白酶的方法是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备高产量、高活性、高特异性和无动物来源病毒的胰蛋白酶并在此基础上对该胰蛋白酶进行乙酰化修饰获得更稳定的乙酰化产品。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了制备胰蛋白酶的方法。

本发明所提供的制备胰蛋白酶的方法，包括向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的胰蛋白酶原的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞。对所述重组大肠杆菌细胞进行IPTG诱导，启动胰蛋白酶原基因的表达。收集所述重组大肠杆菌细胞，破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包涵体。对所述包涵体进行变性，得到变性后的样品；将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；将所述复性后的样品进行第一次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶原；将所述纯化后的胰蛋白酶原进行激活，得到激活的胰蛋白酶；将所述激活的胰蛋白酶进行第二次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶；

所述复性在复性缓冲液中进行。所述复性缓冲液的pH值可为7.0-9.0，具体可为7.5；所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度可为10-50mM，具体可为20mM；所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度可为1-2M，具体可为2M；所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度可为1-2mM，具体可为1mM；所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度可为3-5mM，具体可为3mM。

所述第一次纯化为将所述复性后的样品进行阳离子交换柱层析，收集所述胰蛋白酶原的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是磺丙基，所采用的洗脱程序为NaCl线性梯度洗脱；所述NaCl线性梯度洗脱采用NaCl线性梯度洗脱液进行洗脱，所述NaCl线性梯度洗脱液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成；所述溶质为NaCl，所述溶剂为pH值为4.6，醋酸根离子浓度可为10-50mM，具体可为10mM的醋酸-醋酸钠缓冲液；所述NaCl线性梯度洗脱的时间是48min；所述NaCl线性梯度洗脱中NaCl的浓度在48min内由0.025M匀速升至0.4M；所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质为冰醋酸和醋酸钠，醋酸根离子的浓度可为10-50mM,具体可为10mM。

所述激活在激活缓冲液中进行。所述激活缓冲液的pH值可为7.5-8.5，具体可为8.0；所述激活缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油；所述三羟甲基氨基甲烷在所述激活缓冲液中的浓度可为10-50mM，具体可为40mM；所述氯化钠在所述激活缓冲液中的浓度可为0.1-0.3M，具体可为0.1M；所述氯化钙在所述激活缓冲液中的浓度可为1-20mM，具体可为10mM；所述甘油在所述激活缓冲液中的体积百分比浓度可为5-15％，具体可为10％。

上述制备胰蛋白酶的方法中，所述激活在20-25℃进行1小时。

所述第二次纯化为将所述激活的胰蛋白酶进行凝胶过滤层析，收集所述激活的胰蛋白酶的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围为10-600kD；所述凝胶过滤层析所用层析柱的柱长度和柱内径比为36：1；所述凝胶过滤层析所采用洗脱剂是凝胶过滤层析洗脱液，所述凝胶过滤层析洗脱液的pH值可为7.5-8.5，具体可为8.0；所述凝胶过滤层析洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和氯化钙；所述三羟甲基氨基甲烷在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度可为10-50mM，具体可为50mM；所述氯化钙在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度可为1-20mM，具体可为10mM。

上述方法中，所述胰蛋白酶原的编码基因，名称为重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因，是如下a)或b)或c)的核酸分子：

a)其编码序列是SEQ ID No.1的第1-699位的DNA分子或cDNA分子；

b)其编码序列是将SEQ ID No.1的第1-699位中的T均替换为U，其它核苷酸不变，得到目的RNA分子；

c)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述胰蛋白酶原的cDNA分子或基因组DNA分子。

上述重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且具有相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.1的第1-699位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

与所述重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因相关的遗传材料，为下述B1)至B5)中至少一种：

B1)含有所述重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因的表达盒；

B2)含有所述重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有所述重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有所述胰蛋白酶原的编码基因的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B5)含有所述重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因的转基因动物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系。

上述遗传材料中，B1)所述的含有重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达重组阳离子型猪胰蛋白酶原的DNA，该DNA不但可包括启动重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因转录的启动子，还可包括终止重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因表达盒的重组载体。

上述遗传材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述与所述重组阳离子型猪胰蛋白酶原基因相关的遗传材料中，B2)所述重组载体可含有SEQ IDNo.1的第1-699位的DNA序列；进一步B2)所述重组载体具体可为pET-11c-trypsinogen；所述pET-11c-trypsinogen为将pET-11c载体的NdeI和BamHI识别位点(识别序列)间的DNA序列替换为SEQ ID No.1的第1-699位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到重组载体pET-11c-trypsinogen。

上述方法中，所述大肠杆菌可为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

上述方法中，将所述重组大肠杆菌细胞接种到发酵培养基中；在条件1下进行培养，得到发酵液。将该发酵液命名为发酵液1。向发酵液1中加入补料，在条件2下培养10-15h，诱导所述重组大肠杆菌细胞表达，得到发酵液。将该发酵液命名为发酵液2。

所述发酵培养基可为：26-27g甘油，39-41g酵母粉，1.6-2.0g磷酸二氢钾，1.6-2.0g柠檬酸，4.9-5.1mL盐溶液，0.9-1.1mL微量金属盐溶液，0.9-1.1mL消泡剂204，加入蒸馏水补充体积至1L，pH值为7.2-7.4；所述发酵培养基具体可为：26.66g甘油，40g酵母粉，1.8g磷酸二氢钾，1.8g柠檬酸，5mL盐溶液，1mL微量金属盐溶液，1mL消泡剂204，加入蒸馏水补充体积至1L，pH值为7.2。其中所述盐溶液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度可为：250g/L MgCl₂·6H₂O、100g/L CaCl₂·2H₂O、100g/LKCl、2M柠檬酸(Citric acid)；所述微量金属盐溶液的配制方法可为：取6.80g ZnCl₂、54.00g FeCl₃·6H₂O、16.20g MnCl₂·4H₂O、2.20g CuSO₄·5H₂O、4.80g CoCl₂·6H₂O、0.024g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.20g KI和119mL 37％(体积百分比浓度)的浓盐酸，加蒸馏水补充体积至1L。

所述补料由水和溶质组成，所述溶质及其浓度可为：270-280g/L甘油和220-230g/L酵母粉，具体可为275g/L甘油和225g/L酵母粉。

所述条件1可为：培养温度可为32-40℃，具体可为37℃；溶氧量(DO)(相对溶氧量)可为15％-50％，具体可为15％；pH值可为6-8，pH值具体为7.0。

所述条件2可为：培养温度为32℃，溶氧量(DO)(相对溶氧量)可为5％-20％，具体可为15％；pH值可为6-8，如pH值为7.0。

所述诱导剂可为IPTG，所述发酵液2中IPTG的浓度可为0.5-1.5mM，具体可为1mM。

上述方法中，重组大肠杆菌细胞收集方法可为离心或过滤中至少一种，具体可为离心收集。

上述方法中，重组大肠杆菌细胞破碎方法可为高压匀浆、冻融或超声破碎中至少一种，具体可为高压匀浆破碎。

上述方法中，包涵体收集方法可为离心收集。

上述方法中，包涵体变性在变性缓冲液中进行。所述变性缓冲液的pH值可为7.0-9.0，具体可为8.5；所述变性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、尿素和二硫苏糖醇，所述三羟甲基氨基甲烷在所述变性缓冲液中的浓度可为10-50mM，具体可为20mM；所述尿素在所述变性缓冲液中的浓度可为7.5-8.5M，具体可为8M；所述二硫苏糖醇在所述变性缓冲液中的浓度为10-30mM，具体可为20mM。所述包涵体变性在20-30℃进行3-4h，完成包涵体变性，离心收集上清液，得到所述变性后的样品。所述包涵体与所述变性缓冲液的比例可为1g:(15-30)mL，具体可为1g:20mL。

上述方法还包括对纯化后的胰蛋白酶原进行浓缩的步骤，和/或，对激活后的胰蛋白酶进行浓缩的步骤，和/或，对纯化后的胰蛋白酶进行浓缩的步骤。所述浓缩的截留分子量为10kD。

为解决上述技术问题，本发明还提供了制备胰蛋白酶的成套试剂A。

本发明所提供的制备胰蛋白酶的成套试剂A分为只由活性成分组成的便于存放的贮存型试剂A1和由所述贮存型试剂和水配成的即用型试剂A2；所述A1由试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成，所述试剂1、所述试剂2、所述试剂3和所述试剂4均独立包装。所述试剂1由三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸组成，三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸的摩尔比可为(10-50):(1000-2000):(1-2):(3-5)，具体可为(10-50):(1000-2000):1:(3-5)、20:(1000-2000):(1-2):(3-5)、(10-50):2000:(1-2):(3-5)、(10-50):(1000-2000):(1-2):3或20:2000:1:3。所述试剂2由氯化钠、乙酸和醋酸钠组成。所述试剂3由三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油组成，三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油的配比可为(10-50)mmol：(100-300)mmol：(1-20)mmol：(50-150)mL，具体可为40mmol：(100-300)mmol：(1-20)mmol：(50-150)mL、(10-50)mmol：100mmol：(1-20)mmol：(50-150)mL、(10-50)mmol：(100-300)mmol：10mmol：(50-150)mL、(10-50)mmol：(100-300)mmol：(1-20)mmol：100mL或40mmol：100mmol：10mmol：100mL。所述试剂4由三羟甲基氨基甲烷和氯化钙组成，三羟甲基氨基甲烷和氯化钙的摩尔比可为(10-50)：(1-20)，具体可为50：(1-20)、(10-50)：10或5:1。

上述试剂2中，氯化钠、乙酸和醋酸钠的配比满足将氯化钠、乙酸和醋酸钠与水配置成所述NaCl线性梯度洗脱液。

上述试剂1、上述试剂2、上述试剂3和上述试剂4分别在制备胰蛋白酶的不同步骤中使用，上述试剂1在复性阶段中使用，上述试剂2在第一次纯化阶段使用，上述试剂3在激活阶段使用，上述试剂4在第二次纯化阶段使用。

所述A2由所述的复性缓冲液、所述的NaCl线性梯度洗脱液、所述的激活缓冲液和所述的凝胶过滤层析洗脱液组成。

上述复性缓冲液、上述NaCl线性梯度洗脱液、上述激活缓冲液和上述凝胶过滤层析洗脱液分别在制备胰蛋白酶的不同步骤中使用，上述复性缓冲液在复性阶段使用，上述NaCl线性梯度洗脱液在第一次纯化阶段使用，上述激活缓冲液在激活阶段使用，上述凝胶过滤层析洗脱液在第二次纯化阶段使用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了制备乙酰化胰蛋白酶的方法。

本发明所提供的制备乙酰化胰蛋白酶的方法，包括将所述激活的胰蛋白酶进行乙酰化修饰，得到乙酰化胰蛋白酶；将所述乙酰化胰蛋白酶进行纯化，得到纯化后的乙酰化胰蛋白酶；

所述乙酰化修饰在乙酰化修饰缓冲液中进行，所述乙酰化修饰缓冲液的pH值可为6.7-7.0，具体可为6.7；所述乙酰化修饰缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH值为4.6的，醋酸根离子浓度可为10-50mM，具体可为10mM的醋酸-醋酸钠缓冲液；所述溶质为甘油；所述甘油在所述乙酰化修饰缓冲液中的体积百分比浓度为10-30％；具体可为20％；所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为冰醋酸和醋酸钠，醋酸根离子的浓度可为10-50mM，具体可为10mM；

上述制备乙酰化胰蛋白酶的方法中，所述乙酰化修饰缓冲液采用0.5M氢氧化钠水溶液将pH值调节至6.7-7.0，具体可为6.7，并在所述乙酰化修饰缓冲液中加入1.2mL800mM乙酸酐(乙酸酐用二氧己烷(dioxane)稀释)，得到乙酰化反应液，20-25℃磁力搅拌，用0.5M氢氧化钠将乙酰化反应液的pH值稳定在6.2-7.2之间，20-25℃反应30min。

所述纯化为将所述乙酰化胰蛋白酶进行凝胶过滤层析，收集所述乙酰化胰蛋白酶的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围为10-600kD，所述凝胶过滤层析所用层析柱的柱长度和柱内径比为36：1，所述凝胶过滤层析所采用的洗脱剂是凝胶过滤层析洗脱液，所述凝胶过滤层析洗脱液的pH值为7.5-8.5，具体可为8.0；所述凝胶过滤层析洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和氯化钙；所述三羟甲基氨基甲烷在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度可为10-50mM，具体可为50mM；所述氯化钙在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度可为1-20mM，具体可为10mM。

上述制备乙酰化胰蛋白酶的方法还包括对乙酰化胰蛋白酶进行浓缩的步骤，对纯化后的乙酰化胰蛋白酶进行浓缩的步骤，所述浓缩的截留分子量为10kD。

采用上述制备胰蛋白酶的方法制备的胰蛋白酶，或采用上述制备乙酰化胰蛋白酶的方法制备的乙酰化胰蛋白酶也属于本发明保护的范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了制备乙酰化胰蛋白酶的成套试剂B。

本发明所提供的制备乙酰化胰蛋白酶的成套试剂B，为B1或B2；由所述试剂4和试剂5组成，所述试剂4和所述试剂5均单独包装；所述试剂4由三羟甲基氨基甲烷和氯化钙组成，三羟甲基氨基甲烷和氯化钙的摩尔比可为(10-50)：(1-20)，具体可为50：(1-20)、(10-50)：10或5:1；所述试剂5含有甘油、乙酸和醋酸钠。

所述试剂5中，甘油、乙酸和醋酸钠的配比满足将甘油、乙酸和醋酸钠与水配置成所述乙酰化修饰缓冲液。

上述试剂4和上述试剂5分别在制备乙酰化胰蛋白酶的不同步骤中使用，上述试剂4在纯化阶段中使用，上述试剂5在乙酰化阶段使用。

所述B2由所述的凝胶过滤层析洗脱液和所述乙酰化修饰缓冲液组成。

上述凝胶过滤层析洗脱液和上述乙酰化修饰缓冲液分别在制备乙酰化胰蛋白酶的不同步骤中使用，上述凝胶过滤层析洗脱液在纯化阶段使用，上述乙酰化修饰缓冲液在乙酰化阶段使用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了成套试剂C。

本发明所提供的成套试剂C，为C1或C2；所述C1含有所述的成套试剂A1和所述的成套试剂B1；所述C2含有所述的成套试剂A2和所述的成套试剂B2；所述成套试剂C1或C2中各试剂均独立包装。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述1)-5)任一所述的应用：

1)所述制备胰蛋白酶的方法在制备乙酰化胰蛋白酶中的应用；

2)所述胰蛋白酶在制备乙酰化胰蛋白酶中的应用；

3)所述成套试剂A在制备胰蛋白酶和/或乙酰化胰蛋白酶中的应用；

4)所述成套试剂B在制备乙酰化胰蛋白酶中的应用；

5)所述成套试剂C在制备胰蛋白酶和乙酰化胰蛋白酶中的应用。

上文中，所述胰蛋白酶原可为重组阳离子型猪胰蛋白酶原，所述重组阳离子型猪胰蛋白酶原的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述胰蛋白酶可为重组阳离子型猪胰蛋白酶，所述重组阳离子型猪胰蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第10-232位所示的氨基酸序列；所述乙酰化胰蛋白酶可为重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶，所述重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第10-232位所示的氨基酸序列。

实验证明，采用本发明的制备方法制备的重组阳离子型猪胰蛋白酶和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶具有高的酶活力，重组阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为27800BAEE单位/mg酶；重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为30200BAEE单位/mg酶；商品化猪胰蛋白酶的酶活力为9600BAEE单位/mg酶。本发明的制备方法具有酶产量高、特异性好、无动物来源病毒污染等有优点，生产与制备工艺简单、成本低，可以应用于生物制药和蛋白质组学研究。

附图说明

图1为重组大肠杆菌BL21(DE3)-trypsinogen的生长曲线图。图中47.2代表诱导时发酵液的OD₆₀₀值，78代表菌体收集时发酵液的OD₆₀₀值。

图2为重组大肠杆菌BL21(DE3)-trypsinogen的蛋白表达鉴定电泳图。泳道诱导前为诱导前的重组大肠杆菌BL21(DE3)-trypsinogen的全菌蛋白，泳道诱导后为诱导后的重组大肠杆菌BL21(DE3)-trypsinogen的全菌蛋白，泳道包涵体为洗涤的重组大肠杆菌BL21(DE3)-trypsinogen的包涵体，泳道M为分子量为10-250kD的蛋白质分子量标准。

图3为重组阳离子型猪胰蛋白酶原的阳离子SP.BB(磺丙基)交换柱层析色谱图，左纵坐标为在280nm处的紫外吸光度，右纵坐标为电导率，横坐标为体积(mL)。

图4为复性后的重组阳离子型猪胰蛋白酶原、纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原和激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶的SDS-PAGE电泳图谱。泳道M为分子量为17-250kD的蛋白质分子量标准，泳道复性样品为复性后的重组阳离子型猪胰蛋白酶原，泳道阳离子交换为纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原，泳道自激活样品为激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶。

图5为重组阳离子型猪胰蛋白酶的Superdex-200凝胶层析色谱图，左纵坐标为在280nm处的紫外吸光度，横坐标为体积(mL)。

图6为重组阳离子型猪胰蛋白酶的质谱图。

图7为重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的Superdex-200凝胶层析色谱图，左纵坐标为在280nm处紫外吸收强度，横坐标为体积(mL)。

图8为重组阳离子型猪胰蛋白酶和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的SDS-PAGE电泳图谱。泳道M为分子量为10-220kD的蛋白质分子量标准，泳道1为重组阳离子型猪胰蛋白酶，泳道2为重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶。

图9为重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

商品化猪胰蛋白酶为Promega公司的产品，产品目录号为：V5111。

乙酸酐为北京北化开元化学品有限公司的产品，产品目录号为10000318；1,4-二氧六环(1,4-Dioxane)为百灵威科技的产品，产品目号为156496；IPTG为AMRESCO公司的产品，产品目号为0487-100G；苯甲酰L-精氨酸乙酯(BAEE)为Sigma公司的产品，产品目录号为B4500-10G；消泡剂204为Sigma公司的产品，产品目录号为A6426-55G。

下述实施例中的pET-11c载体为Novagen公司产品，产品目录号为69442-3。

下述实施例中的相关培养基及溶液如下：

高密度发酵基础培养基：26.7g甘油，40.0g酵母粉，1.8g磷酸二氢钾，1.8g柠檬酸，5mL盐溶液，1mL微量金属盐溶液，1mL消泡剂204，加入蒸馏水补充体积至1L，pH值为7.2。

盐溶液由水和溶质组成，溶质及其浓度为：250g/L MgCl₂·6H₂O、100g/L CaCl₂·2H₂O、100g/L KCl和2M柠檬酸(Citric acid)。

微量金属盐溶液：6.8g ZnCl₂、54.0g FeCl₃·6H₂O、16.2g MnCl₂·4H₂O、2.2g CuSO₄·5H₂O、4.8g CoCl₂·6H₂O、0.024g(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O、0.2g KI、119mL 37％(体积百分比浓度)的浓盐酸，加蒸馏水补充体积至1L。

补料由水和溶质组成，溶质及其浓度为：275g/L甘油和225g/L酵母粉。

包涵体洗涤缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为pH值为7.2-7.5的10mM的PBS缓冲液，溶质及其浓度为：2M尿素。

变性缓冲液的pH值为8.5，由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、8M尿素(urea)和20mM二硫苏糖醇(DTT)。

复性缓冲液的pH值为7.5，由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2M尿素(Urea)、1mM胱氨酸(Cystine)和3mM半胱氨酸(Cysteine)。

平衡缓冲液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成。所述溶剂为水，所述溶质为冰醋酸和醋酸钠，醋酸根离子的浓度为10mM。

NaCl线性梯度洗脱液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成，溶质为NaCl，溶剂为pH值为4.6的，醋酸根离子浓度为10mM的醋酸-醋酸钠缓冲液；醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为冰醋酸和醋酸钠，醋酸根离子的浓度为10mM。

激活缓冲液的pH值为8.0，由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：40mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.1M氯化钠(NaCl)，10mM氯化钙(CaCl₂)和10％(体积百分比浓度)甘油。

乙酰化修饰缓冲液的最终pH值为6.7，由溶剂和溶质组成。溶剂的起始缓冲液pH值为4.6，醋酸根离子浓度可为10-50mM，具体可为10mM的醋酸-醋酸钠缓冲液。溶质及其浓度为20％(体积百分比浓度)的甘油。缓冲液的pH通过0.5M氢氧化钠进行调整。。

凝胶过滤层析洗脱液的pH值为8.0，由溶剂和溶质组成。所述溶剂为水，溶质及其浓度为50mM三羟甲基氨基甲烷和10mM氯化钙。

胰蛋白酶稳定缓冲液的pH值为8.0，由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)和10mM氯化钙(CaCl₂)。

实施例1、重组阳离子型猪胰蛋白酶的制备与鉴定

制备重组阳离子型猪胰蛋白酶的方法，包括向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的胰蛋白酶原的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞。对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集所述重组大肠杆菌细胞，破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包涵体；对所述包涵体进行变性，得到变性后的样品；将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；将所述复性后的样品进行第一次纯化，得到纯化后的重组阳离子型猪胰蛋白酶原；将所述纯化后的重组阳离子型猪胰蛋白酶原进行激活，得到激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶；将所述激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶进行第二次纯化，得到纯化后的重组阳离子型猪胰蛋白酶。具体方法如下：

一、表达重组阳离子型猪胰蛋白酶原重组菌体细胞的制备

将pET-11c载体的NdeI和BamHI识别位点(识别序列)间的DNA序列替换为SEQ IDNo.1的所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到重组载体pET-11c-trypsinogen。pET-11c-trypsinogen表达SEQ ID No.2所示的重组阳离子型猪胰蛋白酶原。DNA测序证明，pET-11c-trypsinogen中的重组阳离子型猪胰蛋白酶基因的核苷酸序列是SEQ IDNo.1的第1-699位所示的核苷酸序列。

通过化学转化法，将pET-11c-trypsinogen导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到含有SEQ ID No.1所示的用于编码SEQ ID No.2所示的重组阳离子型猪胰蛋白酶原的重组菌株，将该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-trypsinogen(下文中简称BL21-trypsinogen菌株)。

二、重组阳离子型猪胰蛋白酶的制备

1、重组菌株的高密度发酵

将步骤一制备的重组菌株BL21-trypsinogen菌株在固体LB/Amp平板上活化，获得BL21-trypsinogen菌株的单克隆。将BL21-trypsinogen菌株的单克隆接种于50mLLB液体培养基中(氨苄青霉素的浓度为100μg/mL)，37℃摇床震荡培养。当LB液体培养体系的OD₆₀₀为1.5-2.0时(以LB液体培养基为空白对照)，得到BL21-trypsinogen菌株的一级种子。将BL21-trypsinogen菌株的一级种子单独接种到经121℃湿热法高压灭菌的装有2.5L高密度发酵基础培养基的5L发酵罐(Applikon Biotechnology公司)中，接种后的培养体系的OD₆₀₀为0.01O(以高密度发酵基础培养基为空白对照)。初始发酵参数：培养温度为37℃，搅拌速度为400rpm，空气流量为6L/min，pH值为7.0。发酵培养基的pH值通过30％氨水(体积百分比浓度)控制。当溶氧(DO)(相对溶氧量)<15％时与转速联动，最高转速1200rpm，保持溶氧量为15％(相对溶氧量)。当初始发酵体系的OD₆₀₀>20(以高密度发酵基础培养基为空白对照)时，获得BL21-trypsinogen菌株发酵液1。向BL21-trypsinogen菌株发酵液1中补料，补料速度控制在16-18mL/h。当含补料发酵体系的OD₆₀₀为47.8(以含补料高密度发酵基础培养基为空白对照)时，降低温度至32℃，并加IPTG至终浓度为1mM，诱导培养10h。诱导培养参数为：培养温度为32℃，搅拌速度为400rpm，空气流量为6L/min，pH值为7.0，发酵培养基的pH值通过30％氨水(体积百分比浓度)控制。溶氧量和转速控制同上，得到BL21-trypsinogen菌株的发酵液2。

采用水平转子对BL21-trypsinogen菌株发酵液2在4000rpm条件下离心30min收集菌体，得到BL21-trypsinogen菌体。在菌体中按照1g:10mL(w/v)的比例加入浓度为10mM的PBS缓冲液，用高速组织剪切机混合均匀，并采用高压匀浆法破碎。高压匀浆压力设定800bar，连续破碎3次后采用水平转子在4000rpm条件下离心30min，获得BL21-trypsinogen菌体的包涵体。对BL21-trypsinogen菌株的诱导前的全菌蛋白、诱导后的全菌蛋白和包涵体进行15％SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示。重组菌株BL21-trypsinogen菌株在诱导后的全菌蛋白和洗涤后的包涵体中含有28kD的蛋白质。电泳结果显示诱导的目的蛋白主要以包涵体形式表达。将BL21-trypsinogen菌体的包涵体按照1g:10mL(w/v)的比例加入到包涵体洗涤缓冲液中，并用高速组织剪切机处理10min，在4000rpm条件下离心30min，收集沉淀。该沉淀为洗涤过的包涵体，收集洗涤过的BL21-trypsinogen包涵体。

2、重组阳离子型猪胰蛋白酶的制备

2.1、复性，得到复性后的样品

将步骤1制备的5g洗涤过的BL21-trypsinogen包涵体按照1g:20mL(w/v)的比例加入100mL变性缓冲液，20-25℃溶解3-4h。在12000rpm条件下离心15min收集上清，得到变性后的样品溶液。将100mL变性后的样品溶液加入到4000mL复性缓冲液中，4℃复性过夜，复性样品采用1M盐酸调节pH值至4.5，并在4000rpm条件下离心20min，获得复性后的样品溶液。

2.2、第一次纯化，得到纯化后的重组阳离子型猪胰蛋白酶原

将复性后的样品溶液在AKTA Purifier上进行阳离子交换柱层析(层析柱为GEhealthcare XK26/40，柱体积65mL，阳离子交换基团是磺丙基。层析柱用平衡缓冲液预先平衡后进行样品上样。上样结束后，用缓冲溶液B(缓冲溶液B由溶质和溶剂组成，溶质是NaCl，溶剂是醋酸-醋酸钠缓冲液，NaCl在缓冲溶液B中的浓度为0.025M；该醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为冰醋酸和醋酸钠，醋酸根离子在该醋酸-醋酸钠缓冲液中的浓度为10mM)进行5个体积的柱平衡，用NaCl线性梯度洗脱液再进行NaCl线性梯度洗脱。该NaCl线性梯度洗脱液的pH值为4.6,由溶剂和溶质组成，溶剂为pH值为4.6的，醋酸根离子浓度为10mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，NaCl线性梯度洗脱的时间是48min。在NaCl线性梯度洗脱中，NaCl的浓度在48min内由0.025M匀速升至0.4M。收集重组阳离子型猪胰蛋白酶原的洗脱峰(图3中洗脱体积为4600-4810mL)，得到210mL纯化后的重组阳离子型猪胰蛋白酶原溶液。图3为重组阳离子型猪胰蛋白酶原的阳离子(SP.BB)交换柱层析色谱图。采用A_280nm吸收法进行蛋白质定量，定量后得到180mg纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原。所有纯化工作均在20-25℃进行。将纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原溶液置于4℃保存。

2.3、激活，得到激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶

取纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原溶液(含100mg纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原)，通过10kD超滤管(Amicon Ultra-15ml，10kDa Centrifugal Filter Unit)对纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原溶液进行超滤浓缩，得到浓缩后重组阳离子型猪胰蛋白酶原溶液。将浓缩后重组阳离子型猪胰蛋白酶原溶液加入到100mL激活缓冲液中，得到浓度为1mg/mL的重组阳离子型猪胰蛋白酶原激活溶液。在20-25℃激活1h，得到激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液。

将复性后的重组阳离子型猪胰蛋白酶原、纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原和激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶进行15％SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示。复性后的重组阳离子型猪胰蛋白酶原和纯化的重组阳离子型猪胰蛋白酶原的分子量为24.5kD，激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶的分子量为23.5kD。

将激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液通过10kD超滤管(Amicon Ultra-15mL，10kDa Centrifugal Filter Unit)进行超滤浓缩至50mM醋酸溶液中，得到20mL激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液。蛋白质定量通过A_280nm吸收值的测定获得。在激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液中，激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶的浓度为3mg/mL。

2.4、第二次纯化，得到重组阳离子型猪胰蛋白酶

取2mL浓度为3mg/mL激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液进行Superdex-200(XK16*600mm自装柱)凝胶过滤层析纯化，采用凝胶过滤层析洗脱液进行洗脱。凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括10-600kD，所用的层析柱的柱长度和柱内径比为36：1。收集激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶的洗脱峰(图5中洗脱体积为84.8-105mL)，获得纯化后的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液。将纯化后的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液通过10kD超滤管(Amicon Ultra-15mL，10kDa Centrifugal Filter Unit)进行超滤浓缩至胰蛋白酶稳定缓冲液中，得到重组阳离子型猪胰蛋白酶的稳定溶液。在重组阳离子型猪胰蛋白酶的稳定溶液中，重组阳离子型猪胰蛋白酶的浓度为1mg/mL。最终获得的重组阳离子型猪胰蛋白酶3.4mg。图5为重组阳离子型猪胰蛋白酶的Superdex-200凝胶层析色谱图。

三、重组阳离子型猪胰蛋白酶的鉴定

步骤2制备的重组阳离子型猪胰蛋白酶的质谱(Waters液质联用Q-TOF)鉴定结果为23464.00Da，其理论值为23463.54Da。这两者吻合。质谱如图6所示。

实施例2、重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的制备与鉴定

制备重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的方法，包括将实施例1中2.3制备的激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液进行乙酰化修饰，得到重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶。将所述重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶进行纯化，得到纯化后的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶。具体方法如下：

一、重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的制备

将实施例1中2.3制备的激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液通过10kD超滤管(Amicon Ultra-15mL，10kDa Centrifugal Filter Unit)进行超滤浓缩，加入到200mL乙酰化修饰缓冲液中，得到浓度为1mg/mL的重组阳离子型猪胰蛋白酶的乙酰化修饰缓冲液，以减少蛋白质在乙酰化修饰过程中的聚合。用0.5M氢氧化钠水溶液将浓度为1mg/mL的重组阳离子型猪胰蛋白酶的乙酰化修饰缓冲液的pH值调节至6.7，并加入1.2mL浓度为800mM的乙酸酐(乙酸酐用二氧己烷(dioxane)稀释)，得到重组阳离子型猪胰蛋白酶乙酰化反应液。用0.5M氢氧化钠调节乙酰化反应液的pH值，使之稳定在6.2-7.2。在20-25℃反应30min，得到重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶。将重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶溶液通过10kD超滤管(Amicon Ultra-15mL，10kDa CentrifugalFilter Unit)进行超滤浓缩至50mM醋酸溶液中，得到20mL重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶溶液。蛋白质定量通过A_280nm吸收值的测定获得。在重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的溶液中，重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的浓度为3mg/mL。

取2mL浓度为3mg/mL重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的醋酸溶液进行Superdex-200(XK16*600mm自装柱)凝胶过滤层析纯化，采用凝胶过滤缓冲液进行洗脱。凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括10-600kD，所用的层析柱的柱长度和柱内径比为36：1。收集激活的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的洗脱峰(图7中洗脱体积为80-100mL)，获得纯化后的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶。将纯化后的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶通过10kD超滤管(Amicon Ultra-15mL，10kDa Centrifugal FilterUnit)进行超滤浓缩，加入到胰蛋白酶稳定缓冲液中，得到重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的稳定溶液。其中，重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的浓度为1mg/mL，共获得的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶3.4mg。图7为重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的Superdex-200凝胶过滤层析图。基于乙酰化前后蛋白在分子筛柱上的保留时间可以看到重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的保留体积(80mL)比未进行乙酰化修饰的重组阳离子型胰蛋白酶的保留体积(84.8mL)小，这一结果表明乙酰化增加了蛋白的表观分子量。

将重组阳离子型猪胰蛋白酶和重组阳离子型乙酰化猪胰蛋白酶进行15％SDS-PAGE电泳检测，结果如图8所示，凝胶过滤层析纯化后的重组猪胰蛋白酶的分子量为23.5kD，凝胶过滤层析纯化后的重组乙酰化猪胰蛋白酶的分子量为23.8kD。

二、重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的鉴定

步骤一制备的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的质谱(Waters液质联用Q-TOF)鉴定结果如下，实测值中主峰为23884.00Da。已知乙酰基的分子量为42Da，推测我们所得的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶为10个乙酰化残基修饰的产物，质谱如图9所示。如图所示，乙酰化修饰产物是7-12个乙酰基修饰的重组阳离子型猪胰蛋白酶的混合物。

实施例3、酶活性测定

采用1mM HCl溶液分别将实施例1和2制备的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液以及重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶溶液稀释至浓度为0.005mg/mL的溶液。同样，用1mMHCl溶液将商品化猪胰蛋白酶溶液稀释至浓度为0.005mg/mL的商品化猪胰蛋白酶溶液。

将0.2mL浓度为0.005mg/mL的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶溶液(待测酶液)加入到3mL浓度为0.25mM的苯甲酰L-精氨酸乙酯(BAEE)溶液(溶质为苯甲酰L-精氨酸乙酯(BAEE)，溶剂为水)中，得到重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶酶活反应液(pH8.0)；将0.2mL浓度为0.005mg/mL的重组阳离子型猪胰蛋白酶溶液(待测酶液)加入到3mL浓度为0.25mM的BAEE溶液中，得到重组阳离子型猪胰蛋白酶酶活反应液(pH8.0)；将0.2mL浓度为0.005mg/mL的商品化猪胰蛋白酶溶液(待测酶液)加入到3mL浓度为0.25mM的BAEE溶液中，得到商品化猪胰蛋白酶酶活反应液(pH8.0)。

在25℃条件下在采用Agilent Cary 60UV-Vis分光光度计，在253nm波长测量紫外吸收值的变化。分别测定5min内的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶酶活反应液、重组阳离子型猪胰蛋白酶酶活反应液和商品化猪胰蛋白酶酶活反应液中的酶活力，空白对照为由0.2mL 1mM HCl溶液和3mL浓度为0.25mM的BAEE溶液混合得到的混合液(pH8.0)。

胰蛋白酶可以将苯甲酰L-精氨酸乙酯(BAEE)水解成为苯甲酰L-精氨酸(BA)。在253nm波长下，BAEE的紫外吸收远低于其水解产物BA。随着产物BA的增加，紫外吸收呈线性增加。通过测定紫外吸光值A₂₅₃，可以计算单位时间的紫外吸收值变化，即获得胰蛋白酶的酶活性。其计算公式如下所示：

$\mathrm{BAEE\; Units}/\mathrm{ml\; enzyme}=\frac{(\mathrm{\&Delta;}{A}_{253\mathrm{nm}}/\min \mathrm{Test}-\mathrm{\&Delta;}{A}_{253\mathrm{nm}}/\min \mathrm{Blank})\left(\mathrm{df}\right)}{\left(0.001\right)\left(0.20\right)}$

$\mathrm{Units}/\mathrm{mg\; solid}=\frac{\mathrm{units}/\mathrm{ml\; enzyme}}{\mathrm{mg\; solid}/\mathrm{ml\; enzemye}}$

其中，Test为重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶酶活反应液、重组阳离子型猪胰蛋白酶酶活反应液或商品化猪胰蛋白酶酶活反应液，Blank为空白对照，df为稀释系数。

胰蛋白酶酶活性单位是以BAEE为底物反应液，在pH8.0,25℃条件下，在3.2mL反应体积中，在光路1cm的条件下，测定A₂₅₃在单位时间的变化值，每分钟使A₂₅₃增加0.001即为一个BAEE单位。

结果表明，在5min内重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶、重组阳离子型猪胰蛋白酶和商品化胰蛋白酶的酶活力均是呈线性增长的。其中重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力是最高的，重组阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力次之，商品化白酶的酶活力最弱。具体结果如表1所示，实施例1制备的重组阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为27800BAEE单位/mg酶，实施例2制备的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为30200BAEE单位/mg酶，商品化猪胰蛋白酶的酶活力为9600BAEE单位/mg酶。本发明的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶和重组阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力均显著高于商品化猪胰蛋白酶。重组阳离子型猪胰蛋白酶经乙酰化修饰后，酶活力没有损失。

表1、BAEE法测量胰蛋白酶的酶活力结果

对比例1、采用复性缓冲液1进行重组阳离子型猪胰蛋白酶原的复性

复性缓冲液1的pH值为7.5，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mM胱氨酸(Cystine)和3mM半胱氨酸(Cysteine)。

将实施例1的复性缓冲液替换为复性缓冲液1，其它操作均同实施例1-3，得到的重组阳离子型猪胰蛋白酶(称为复性对比重组阳离子型猪胰蛋白酶)和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶(称为复性对比重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶)。结果表明复性回收效率非常低，几乎无法拿到有活性的胰蛋白酶。

对比例2、采用NaCl线性梯度洗脱液1进行重组阳离子型猪胰蛋白酶原的纯化

NaCl线性梯度洗脱液1的pH值为6.5，由溶剂和溶质组成，溶质为NaCl，溶剂为pH值为6.5的，醋酸根离子浓度为10mM的醋酸-醋酸钠缓冲液1。醋酸-醋酸钠缓冲液1的pH值为6.5，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为冰醋酸和醋酸钠，醋酸根离子的浓度为10mM。

将实施例1的NaCl线性梯度洗脱液替换为NaCl线性梯度洗脱液1，其它操作均同实施例1-3，得到的重组阳离子型猪胰蛋白酶(称为纯化对比重组阳离子型猪胰蛋白酶)和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶(称为纯化对比重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶)。结果表明蛋白回收效率非常低，几乎无法拿到有活性的胰蛋白酶。

对比例3、采用激活缓冲液1进行重组阳离子型猪胰蛋白酶原的激活

激活缓冲液1由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH值为8.0。

将实施例1的激活缓冲液替换为激活缓冲液1，其它操作均同实施例1-3，得到的重组阳离子型猪胰蛋白酶(称为激活对比重组阳离子型猪胰蛋白酶)。结果表明蛋白回收效率非常低，蛋白稳定性非常差，几乎无法拿到有活性的胰蛋白酶。

对比例4、采用乙酰化修饰缓冲液1进行重组阳离子型猪胰蛋白酶的乙酰化

乙酰化修饰缓冲液1由溶剂和溶质组成，其中溶剂为水，溶质及其浓度为20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)和150mM氯化钠，pH值为7.0。

将实施例2的乙酰化修饰缓冲液替换为乙酰化修饰缓冲液1，其它操作均同实施例1-3。重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶，称为乙酰化对比重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶。结果表明乙酰化对比重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的回收率非常低，大部分蛋白形成聚合体蛋白复合物。

对比例5、采用凝胶过滤层析洗脱液1进行凝胶过滤层析纯化

凝胶过滤层析洗脱液1由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，溶质及其浓度为50mM三羟甲基氨基甲烷，pH值为8.0。

将实施例1和实施例2的凝胶过滤层析洗脱液替换为凝胶过滤层析洗脱液1，其它操作均同实施例1-3。得到的重组阳离子型猪胰蛋白酶，称为凝胶过滤层析纯化对比重组阳离子型猪胰蛋白酶)；得到的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶，称为凝胶过滤层析纯化对比重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶。结果表明凝胶过滤层析纯化对比重组阳离子型猪胰蛋白酶和凝胶过滤层析纯化对比重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的回收率非常低，蛋白很快被自消化而消失。

对比例6、采用阳离子交换对激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶进行层析纯化

将实施例1和实施例2中的对激活的重组阳离子型猪胰蛋白酶激活胰蛋白酶和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶进行的Superdex-200(XK16*600mm自装柱)凝胶过滤层析纯化替换为阳离子(SP.BB)交换柱层析(层析柱为GE healthcare XK26/40，柱体积65mL)纯化，其它操作均同实施例1-3。得到的重组阳离子型猪胰蛋白酶称为阳离子交换层析纯化对比重组阳离子型猪胰蛋白酶，得到的重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶称为阳离子交换层析纯化对比重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶。结果表明阳离子交换层析纯化对比重组阳离子型猪胰蛋白酶和阳离子交换层析纯化对比重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的回收率非常低，蛋白很快被自消化而消失。

Claims (10)

1.制备胰蛋白酶的方法，包括向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的胰蛋白酶原的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集所述重组大肠杆菌细胞；破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包涵体；对所述包涵体进行变性，得到变性后的样品；将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；将所述复性后的样品进行第一次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶原；将所述纯化后的胰蛋白酶原进行激活，得到激活的胰蛋白酶；将所述激活的胰蛋白酶进行第二次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶；

所述复性在复性缓冲液中进行，所述复性缓冲液的pH值为7.0-9.0，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度为10-50mM，所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度为1-2M，所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为1-2mM，所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为3-5mM；

所述第一次纯化为将所述复性后的样品进行阳离子交换柱层析，收集所述胰蛋白酶原的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是磺丙基，所采用的洗脱程序为NaCl线性梯度洗脱，所述NaCl线性梯度洗脱采用NaCl线性梯度洗脱液进行洗脱，所述NaCl线性梯度洗脱液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成，所述溶质为NaCl，所述溶剂为pH值为4.6，醋酸根离子浓度为10-50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液；所述NaCl线性梯度洗脱的时间是48min，所述NaCl线性梯度洗脱中NaCl的浓度在48min内由0.025M匀速升至0.4M；

所述激活在激活缓冲液中进行，所述激活缓冲液的pH值为7.5-8.5，所述激活缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油；所述三羟甲基氨基甲烷在所述激活缓冲液中的浓度为10-50mM，所述氯化钠在所述激活缓冲液中的浓度为0.1-0.3M，所述氯化钙在所述激活缓冲液中的浓度为1-20mM，所述甘油在所述激活缓冲液中的体积百分比浓度为5-15％；

所述第二次纯化为将所述激活的胰蛋白酶进行凝胶过滤层析，收集所述激活的胰蛋白酶的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围为10-600kD，所述凝胶过滤层析所用层析柱的柱长度和柱内径比为36：1，所述凝胶过滤层析所采用的洗脱剂是凝胶过滤层析洗脱液，所述凝胶过滤层析洗脱液的pH值为7.5-8.5，所述凝胶过滤层析洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和氯化钙；所述三羟甲基氨基甲烷在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度为10-50mM，所述氯化钙在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度为1-20mM。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述胰蛋白酶原的编码基因是如下a)或b)或c)的核酸分子：

a)其编码序列是SEQ ID No.1的第1-699位的DNA分子或cDNA分子；

b)其编码序列是将SEQ ID No.1的第1-699位中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；

c)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述胰蛋白酶原的cDNA分子或基因组DNA分子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对纯化后的胰蛋白酶原进行浓缩的步骤，和/或，对激活后的胰蛋白酶进行浓缩的步骤，和/或，对纯化后的胰蛋白酶进行浓缩的步骤。

4.制备胰蛋白酶的成套试剂A，为A1或A2；所述A1由试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成；所述试剂1、所述试剂2、所述试剂3和所述试剂4均独立包装；所述试剂1由三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸组成，三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸的摩尔比为(10-50):(1000-2000):(1-2):(3-5)；所述试剂2由氯化钠、乙酸和醋酸钠组成；所述试剂3由三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油组成，三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油的配比为(10-50)mmol：(100-300)mmol：(1-20)mmol：(50-150)mL；所述试剂4由三羟甲基氨基甲烷和氯化钙组成，三羟甲基氨基甲烷和氯化钙的摩尔比可为(10-50)：(1-20)；

所述A2由权利要求1所述的复性缓冲液、权利要求1所述的NaCl线性梯度洗脱液、权利要求1所述的激活缓冲液和权利要求1所述的凝胶过滤层析洗脱液组成。

5.制备乙酰化胰蛋白酶的方法，包括将按照权利要求1-3任一所述方法得到的激活的胰蛋白酶进行乙酰化修饰，得到乙酰化胰蛋白酶；将所述乙酰化胰蛋白酶进行纯化，得到纯化后的乙酰化胰蛋白酶；

所述乙酰化修饰在乙酰化修饰缓冲液中进行，所述乙酰化修饰缓冲液的pH值为6.7-7.0，所述乙酰化修饰缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为醋酸根离子浓度为10-50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，所述溶质为甘油；所述甘油在所述乙酰化修饰缓冲液中的体积百分比浓度为10-30％；

所述纯化为将所述乙酰化胰蛋白酶进行凝胶过滤层析，收集所述乙酰化胰蛋白酶的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围为10-600kD，所述凝胶过滤层析所用层析柱的柱长度和柱内径比为36：1，所述凝胶过滤层析所采用的洗脱剂是凝胶过滤层析洗脱液，所述凝胶过滤层析洗脱液的pH值为7.5-8.5，所述凝胶过滤层析洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和氯化钙；所述三羟甲基氨基甲烷在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度为10-50mM，所述氯化钙在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度为1-20mM。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对乙酰化胰蛋白酶进行浓缩的步骤，对纯化后的乙酰化胰蛋白酶进行浓缩的步骤。

7.采用权利要求1-3任一所述方法制备的胰蛋白酶，或采用权利要求5或6所述方法制备的乙酰化胰蛋白酶。

8.制备乙酰化胰蛋白酶的成套试剂B，为B1或B2；所述B1由权利要求4所述试剂4和试剂5组成，所述权利要求4试剂4和所述试剂5均单独包装；所述试剂5由甘油、乙酸和醋酸钠组成；

所述B2由权利要求1所述的凝胶过滤层析洗脱液和权利要求5所述乙酰化修饰缓冲液组成。

9.成套试剂C，为C1或C2；所述C1含有权利要求4所述的成套试剂A1和权利要求8所述的成套试剂B1；所述C2含有权利要求4所述的成套试剂A2和权利要求8所述的成套试剂B2；所述成套试剂C1或C2中各试剂均独立包装。

10.下述1)-5)任一所述的应用：

1)权利要求1或2所述方法在制备乙酰化胰蛋白酶中的应用；

2)权利要求7所述胰蛋白酶在制备乙酰化胰蛋白酶中的应用；

3)权利要求4所述成套试剂A在制备胰蛋白酶和/或乙酰化胰蛋白酶中的应用；

4)权利要求8所述成套试剂B在制备乙酰化胰蛋白酶中的应用；

5)权利要求9所述成套试剂C在制备胰蛋白酶和乙酰化胰蛋白酶中的应用。