CN101487015A - 利用酵母表达系统生产DSPAα1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，步骤包括(1)合成DSPAα1基因的核苷酸序列或按照毕赤酵母偏好密码子序列优化DSPAα1基因的核苷酸序列；(2)双酶切合成的或优化的DSPAα1基因序列，构建重组表达质粒X－DSPAα1；(3)转化毕赤酵母菌株细胞及平板筛选阳性转化子；(4)毕赤酵母重组菌株发酵筛选；(5)由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAα1。本发明的方法成本低、周期短、技术上容易实现，摇瓶发酵表达量达到75mg/L，初步达到工业化生产水平，并且分离纯化后的DSPAα1最终纯度大于97％以上，可以直接用于制剂的研究和制备。

Description

利用酵母表达系统生产DSPAα1的方法

技术领域

本发明涉及一种纤溶酶原激活剂的生产方法，尤其涉及一种利用酵母表达系统生产重组吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂去氨普酶α1(DSPAα1)的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

去氨普酶(DSPA)是南美一种吸血蝙蝠唾液中分离的纤溶酶原激活剂，主要包括四种蛋白质：DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ。试验发现，其中DSPAα1具有最好的生物化学和药理学性质，所以被进一步研究。研究表明：在纤维蛋白刺激下，DSPAα1活性增加10500倍，而组织纤溶酶原激活剂(tPA)仅为550倍；在纤维蛋白与纤维蛋白原存在的条件下，DSPAα1活性的比率为12900倍，而tPA仅为72倍，DSPAα1具有更高的纤维蛋白选择性。药理学研究表明，在肺栓塞的模型中，与tPA相比，DSPAα1具有更好的纤维蛋白凝块专一性；在鼠的人工模型中，DSPAα1也表现出比tPA更好的纤维蛋白专一性和更长的半衰期；在狗急性心肌梗塞的冠状血栓形成模型中，DSPAα1具有更快的再灌注和更低的再闭塞率；在鼠肠系膜静脉模型中，相比较与tPA，DSPAα1表现出较低的出血率；另外在鼠和猕猴药理学实验中，DSPAα1也表现出比tPA更低的清除率。在实验过程中，未发现DSPAα1直接的毒性作用，仅在大剂量时表现出副作用。

目前DSPAα1已进行了II期临床实验：DIAS试验及DEDAS试验，其中DIAS试验结果表明：安慰剂对照和给药两组血流再灌注率分别达到46.7％和71.4％，患者脑部栓塞血流获显著改善，有效的阻止了脑部损伤。90天时，两组分别有46.7％和60％的患者达到主要临床终点，颅内出血发生率两组均为3.3％(tPA在大型试验中，出血发生率为6％左右)；DEDAS试验是一个多中心、剂量递增的II期临床试验研究，目的为评价急性脑缺血症状发作3～9小时内，DSPAα1随剂量递增(具体试验剂量未见报道)的疗效和安全性，结果表明：共有38例病人在卒中症状发作3～9小时内接受了安慰剂治疗、90mcg/kg的DSPAα1治疗或125mcg/kg的DSPAα1治疗，受试者的入选标准是MRI证实弥散灌注缺失面积达20％以上和皮层组织低灌注区域超过2cm，在第90天时，安慰剂组有25％的病人临床结果有所改善，90mcg/kg组有28.6％的病人结果有所改善，而125mcg/kg组的比例为60％。重要的是，在接受治疗的病人中，无人出现脑出血。

DSPAα1早期直接从吸血蝙蝠唾液腺中分离，但含量少，纯化成本高，难以大量获得。国外也进行了利用基因工程的方法生产DSPAα1，包括在植物中、昆虫细胞sf9和中国仓鼠卵巢细胞CHO中表达，其表达量分别达到30mg/L、10mg/L和60mg/L，但由于这些表达系统中表达量较低，且具有成本高、周期长、技术难度高等缺点，不利于大规模的工业化生产。

酵母表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又具有真核生物能够对蛋白质进行翻译后修饰的优点，能够表达糖蛋白等结构复杂蛋白。酵母表达系统主要有酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统等。酿酒酵母具有一定的局限性，如产量低、表达质粒易丢失、外源基因过度糖基化、分泌效果差、不适合高密度发酵等。基于上述问题，人们利用其它酵母菌株构建了可高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养型酵母表达系统。作为第二代酵母表达系统，它克服了酿酒酵母表达系统的诸多不足，尤其是其中的毕赤酵母表达系统已成为目前广泛应用的理想的基因表达系统。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是上个世纪70年代随着人们对甲醇利用酵母的研究而发展起来的。最初的目的是寻找甲醇利用菌来消化环境中的甲醇，从而发现了毕赤酵母等几种甲醇利用酵母，当初毕赤酵母只用于制备单细胞蛋白，由此形成了毕赤酵母的发酵技术。80年代毕赤酵母被开发成一种异源表达系统，到1985年，Cregg等首次报道了利用CaCl₂-聚乙二醇介导原生质转化法成功的将带有His4选择标记的质粒转入组氨酸脱氢酶基因缺陷型毕赤酵母菌株GS115中，使转化效率提高到10⁵转化子/μg。在1994年，Faber等又发现了电击法可提高酵母细胞的转化率，且线状的质粒比环状的质粒转化效率高。

毕赤酵母表达系统相比其它表达系统更具有较大的优势：能对蛋白质翻译后加工、糖基化适度、菌体生长速度快、操作简单、费用低廉、适合高密度发酵等。已有大量的蛋白质类药物在毕赤酵母中成功表达，人血清白蛋白在毕赤酵母中通过高密度发酵，其表达量达到10g/L；破伤风毒素片段C的表达量达到12g/L。对溶栓蛋白质来说，前期有tPA在毕赤酵母中表达的报道，但由于较低的酶活而不适于工业化生产；2007年，有报道DSPAα2在毕赤酵母中表达，其表达量仅为25mg/L，但至今还未见DSPAα1在毕赤酵母中成功表达的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适合于工业化生产的利用酵母表达系统生产DSPAα1的方法。

本发明所述的酵母表达系统是毕赤酵母表达系统，这一系统能够高水平表达异源蛋白质。

本发明的技术方案是：合成DSPAα1基因序列或在不改变DSPAα1氨基酸序列的基础上，对DSPAα1基因密码子按照毕赤酵母偏好密码子进行基因序列优化，然后对合成的或优化的基因序列两端进行限制性内切酶酶切后，将其克隆到毕赤酵母中进行稳定表达。实验证实：表达的DSPAα1蛋白质具有真核细胞的修饰基团，且具有生物学活性。

本发明所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，具体步骤包括：(1)合成DSPAα1基因的核苷酸序列或按照毕赤酵母偏好密码子序列优化DSPAα1基因的核苷酸序列；(2)双酶切合成的或优化的DSPAα1基因序列，构建重组表达质粒X-DSPAα1(X代表可选择的表达质粒)；(3)转化毕赤酵母菌株细胞及平板筛选阳性转化子；(4)毕赤酵母重组菌株发酵筛选；(5)由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAα1。

上述步骤(1)中所述合成DSPAα1基因的核苷酸序列指DSPAα1野生型基因序列，Gene Bank登录号为：M63986；DSPAα1的基因序列也可以是DSPAα1突变体，即对DSPAα1野生型进行优化而得。所述按照毕赤酵母偏好密码子序列优化DSPAα1基因的核苷酸序列的方法是：在不改变DSPAα1氨基酸序列的基础上按照毕赤酵母偏好密码子对DSPAα1全基因序列进行合成，并在两种DSPAα1 5’端引入XhoI酶切位点和酿酒酵母α因子信号肽Kex2切割信号氨基酸密码子AAAAGA，同时在3’端引入EcoRI或NotI酶切位点，合成的DSPAα1优化基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述步骤(2)中所述构建重组表达质粒的方法是指利用XhoI和EcoRI双酶切合成的或优化的DSPAα1基因序列，将其克隆到表达质粒α因子下游，再酶切连接获得重组表达质粒X-DSPAα1(X代表可选择的表达质粒，如pPIC9K、pPIC9、pPICZαA/B/C、pGAPZαA/B/C)。

上述重组表达质粒X-DSPAα1可以是：pPIC9K—DSPAα1、pPIC9—DSPAα1、pPICZαA/B/C—DSPAα1、pGAPZαA/B/C—DSPAα1、pPIC3.5K—DSPAα1或pA0815—DSPAα1。

其中：所述重组表达质粒X-DSPAα1优选pPIC9K—DSPAα1或pPIC9—DSPAα1。

其中：重组表达质粒pPIC9K-DSPAα1具体的构建方法是：将DSPAα1克隆到pPIC9α因子下游，然后利用SphI、EcoRI双酶切pPIC9-DSPAα1和pPIC9K，将含有DSPAα1的pPIC9-DSPAα1酶切片段与含卡那霉素抗性基因的pPIC9K片段利用T4DNA连接酶连接，得重组表达质粒pPIC9K-DSPAα1。

上述步骤(3)中所述转化毕赤酵母菌株细胞的方法包括电击转化和化学转化等。

其中：电击转化是指利用SacI或SalI对构建的重组质粒进行线性化，然后以电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，放电时间4.0ms电击转化毕赤酵母菌株感受态细胞；平板筛选阳性转化子是指通过MD平板筛选获得his⁺转化子或含Zeocin的YPDS平板筛选获得阳性转化子。

其中：上述毕赤酵母菌株选自GS115、X-33、KM71、SMD1168；其中优选GS115。

上述步骤(4)中所述毕赤酵母重组菌株发酵筛选是指在平板挑取转化子接种于培养基中，通过摇瓶发酵筛选，获得高分泌表达DSPAα1的毕赤酵母菌株。

其中：所述的培养基包括BMGY/BMMY、BMG/BMM、YPD；其中优选BMGY/BMMY培养基。

上述MD平板的配方是(/L)：1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；2％D-葡萄糖。

上述YPD培养基的配方是(/L)：1％酵母抽提物；2％蛋白胨；2％D-葡萄糖。

上述YPDS培养基的配方是(/L)：1％酵母抽提物；2％蛋白胨；2％D-葡萄糖，1M山梨醇。

上述BMGY培养基的配方是(/L)：1％酵母抽提物；2％蛋白胨；100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；1％甘油。

上述BMMY培养基的配方是(/L)：1％酵母抽提物；2％蛋白胨；100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；0.5％甲醇。

上述BMG培养基的配方是(/L)：100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；1％甘油。

上述BMM培养基的配方是(/L)：100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；0.5％甲醇。

上述步骤(5)中所述由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAα1的方法是：15℃～25℃温度条件下，先将毕赤酵母重组菌株表达上清液用截留分子量10Kda的超滤器超滤，使其浓缩到符合阳离子交换层析柱上样条件，然后将其加样到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换层析柱上进行洗脱，去除杂蛋白和非蛋白杂质，再利用凝胶过滤层析柱进行上样洗脱，去除二聚体和小分子杂质，洗脱中出现唯一的洗脱峰，即为纯化DSPAα1产物。

其中：所述阳离子交换层析柱的层析介质选自羧基、羧甲基、磺酸基、磺甲基、磺乙基、磺丙基或磷酸基衍生的葡聚糖、硅胶微粒、琼脂糖、聚乙烯醇系、苯乙烯及二苯乙烯、纤维素或者交联的聚丙烯酰胺系列介质。

上述分离纯化DSPAα1的方法中：优选的阳离子交换层析柱优选CM sepharose FF层析柱或SP Sephadex C-50层析柱或SP-650-S层析柱。

上述分离纯化DSPAα1的方法中：所述平衡缓冲液选自pH5.0-8.0的磷酸盐缓冲液或Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液。

上述分离纯化DSPAα1的方法中：所述凝胶过滤层析的方法是：将经阳离子交换层析分离，浓缩后的蛋白浓度不超过50mg/ml的样品上样到凝胶过滤层析柱，以pH6.0-7.5，内含0.1-0.2M NaCl的Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液或Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液为洗脱液进行洗脱，以波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脱液，即为纯化DSPAα1的提取液。

其中：所述凝胶过滤层析柱的层析介质选自交联琼脂糖、交联聚乙烯醇、葡聚糖凝胶、烯丙基葡聚糖与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺聚合凝胶或葡聚糖与高交联琼脂糖的复合凝胶；且介质能分离分子量在3,000～300,000Da的蛋白。

上述分离纯化DSPAα1的方法中：优选的凝胶过滤层析柱优选Sephadex G-75或Superdex G-75或Sephacryl-100层析柱。

上述分离纯化DSPAα1的方法中：所述对阳离子交换层析分离的样品的浓缩用截留分子量为5KDa的超滤管进行。

上述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法中：所述纯化DSPAα1的提取液能以常规方法真空冷冻干燥制得固体的DSPAα1粉末，可以直接用于制剂的研究和制备。

本发明有四个显著优点：(1)通过对DSPAα1基因序列进行毕赤酵母密码子偏好性优化，使其更适于在毕赤酵母中表达；(2)DSPAα1摇瓶发酵表达量可达到75mg/L，并且通过高密度发酵表达量有进一步提高的潜力；(3)利用毕赤酵母生产DSPAα1的方法成本低、周期短、技术上容易实现，适于工业化生产；(4)由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化后的DSPAα1最终纯度大于97％以上，可以直接用于制剂的研究和制备。

附图说明

图1毕赤酵母表达DSPAα1转化子发酵液SDS-PAGE图。

其中：从左向右：泳道M为蛋白质Marker，泳道1为空白毕赤酵母发酵液，泳道2为诱导表达DSPAα1毕赤酵母菌株。

图2毕赤酵母表达DSPAα1转化子发酵液酶活图。

图3是阳离子纯化时的DSPAα1洗脱图。

图4是DSPAα1经分子筛纯化时的洗脱图。

图5是DSPAα1的SDS-PAGE电泳图。

其中：泳道M为蛋白质Marker，泳道1为DSPAα1。

图6是经TSK分析后的DSPAα1高效液相图。

具体实施方式

以下实施例将进一步说明本发明，但不限制本发明。

实施例1

1、DSPAα1基因及毕赤酵母偏好密码子序列基因合成

合成DSPAα1基因的核苷酸序列或按照毕赤酵母偏好密码子序列优化DSPAα1基因的核苷酸序列。

在不改变DSPAα1氨基酸序列的基础上按照毕赤酵母偏好密码子对DSPAα1全基因序列进行合成，并在DSPAα1 5’端引入XhoI酶切位点和酿酒酵母α因子信号肽Kex2切割信号氨基酸密码子(AAAAGA)，同时在3’端引入EcoRI或NotI酶切位点，合成的毕赤酵母偏好密码子优化DSPAα1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(合成工作由上海生工生物工程技术服务有限公司承担)。

2、重组质粒构建

步骤如下：利用限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切上述1中DSPAα1合成基因和pPIC9表达载体，凝胶回收法纯化1.4kb和8.0kb的目标片段，然后利用T4DNA连接酶对酶切片段进行连接，16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，通过LB平板(含Amp)筛选阳性克隆，随机挑取单克隆，抽提重组质粒(记作pPIC9-DSPAα1)，通过酶切鉴定阳性克隆。

然后利用SphI、EcoRI双酶切重组质粒pPIC9-DSPAα1，凝胶回收6.0kb带，然后连接到相同酶切的pPIC9K载体片段(4.8kb)上，获得重组质粒pPIC9K-DSPAα1，通过酶切鉴定阳性克隆。

3、毕赤酵母菌株转化及平板筛选

利用限制性内切酶HpaI酶切重组质粒pPIC9K-DSPAα1和空白质粒pPIC9K，取5μg～20μg质粒进行电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞。

所用GenepulsterII电转化仪(Bio-Rad laboratories Inc.，Hercules，CA)的参数是：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，放电时间4.0ms。

电击后立即加入1.0mL冰冷的1.0mol/L山梨醇，迅速涂MD平板(His^-)，28—30℃培养，筛选His⁺转化子。

4、毕赤酵母重组菌株发酵筛选

随机选取阳性菌株(同时挑取空白质粒转化菌株作为对照)进行摇瓶发酵初步筛选，筛选方法如下：从MD平板上随机挑取单克隆于YPD培养基中，28℃ 200r/min过夜培养；接5～8％(v/v)菌液到液体BMGY培养基(20mL/150mL三角瓶)中，于28℃ 200r/min培养；待菌体密度生长到OD₆₀₀≈5-15时，4,000r/min离心5min收集菌体，用液体BMMY培养基重悬沉淀，再接种至BMMY培养基(50mL/500mL三角瓶，pH6.0)中，使其OD₆₀₀≈2.0，20℃，220r/min培养，每天补加0.5％甲醇(v/v)，其间以SDS-PAGE检测蛋白质表达量(图1)，并同时检测酶活(图2)、pH、生物量，每一样品平行两份进行检测。

其中：酶活检测方法按照纤溶平板法检测，方法是制作纤维蛋白平板，在平板上打孔径为2mm的孔，孔内分别加入标准品和待测样品，每孔10ul，每稀释度做2孔，37℃湿盒中孵育24h，纵向和横向量取溶圈直径，以标准品溶液的标准曲线定量样品的活性。

结果：通过上述摇瓶发酵筛选，获得了具有高分泌表达DSPAα1的毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-DSPAα1，其生产出的DSPAα1具有天然生物学活性，且摇瓶发酵表达量达到75mg/L，初步达到工业化生产水平，为DSPAα1的进一步生产和开发应用奠定了基础。

5、由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAα1

先用pH为6.0，浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和大孔径(10KDa)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，然后对毕赤酵母重组菌株表达上清液进行浓缩，当浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述磷酸盐缓冲液稀释，之后再继续超滤至1L左右，如此稀释3次，收集浓缩液，备用。

用浓度为20mmol/L，pH为6.0磷酸盐的平衡缓冲液平衡CM sepharose FF(1.6×15cm)层析柱2～3个柱体积，将上述超滤后的浓缩液上柱，进行阳离子交换层析。

具体步骤是：用浓度为20mmol/L，pH为6.0磷酸盐的平衡缓冲液平衡层析柱3个柱体积，换用浓度为20mmol/L，pH为6.8磷酸盐缓冲液冲洗2个柱体积，待基线平稳后接着用20mmol/L，pH为6.8含0.5M NaCl磷酸盐缓冲液，从0-0.5MNaCl线形洗脱10个柱体积，收集洗脱液(见图3)。

对阳离子交换层析所得到的洗脱液样品经截留分子量为5KDa的超滤管一次超滤浓缩到一定体积，以蛋白浓度不超过50mg/ml为准。

选用1.6cm×80cm的Sephadex G-75层析柱进行凝胶过滤层析，先用20mM Tris-HCl、pH7.4、内含0.15M NaCl缓冲液平衡2个柱体积，然后将浓缩后的经阳离子交换层析分离的样品上样，以0.5ml/min的流速洗脱，以波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脱液，即为纯化DSPAα1的提取液(见图4)。

纯化DSPAα1的提取液以常规方法真空冷冻干燥，制得固体的DSPAα1粉末。

6、DSPAα1纯度分析

(1)SDS-PAGE电泳：

将上述得到的DSPAα1进行SDS-PAGE电泳分析。

取凝胶过滤层析所得的DSPAα1的提取液浓缩，不低于10μg上样，进行非还原电泳，考马斯亮蓝染色，经电泳灰度扫描后纯度在95％以上(见图5)。

(2)TSK柱纯度分析：

将上述得到的DSPAα1进行TSK-2000高压液相纯度分析，流动相为0.1M磷酸盐缓冲液含0.1mol/L NaCl，pH7.0。上样量不低于20μg，于波长280nm处检测，按面积归一法计算，纯度在97％以上(见图6)。

实施例2

1、DSPAα1基因及毕赤酵母偏好密码子序列基因合成

步骤同实施例1。

2、重组质粒构建

利用XhoI和NotI双酶切构建的pPIC9K-DSPAα1，回收含DSPAα1片段，并与相同酶切的表达质粒pPICZαA用T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pPICZαA-DSPAα1。

3、毕赤酵母菌株转化及平板筛选

SalI线性化质粒pPICZαA-DSPAα1和空白质粒pPICZαA，取5μg～20μg质粒进行电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞。

所用GenepulsterII电转化仪(Bio-Rad laboratories Inc.，Hercules，CA)的参数是：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，放电时间4.0ms。电击后立即加入1.0mL冰冷的1.0mol/L山梨醇，28-30℃静置温育1～2h，然后涂布YPDS(含100mg/ml Zeocin)平板，28-30℃培养。

4、毕赤酵母重组菌株发酵筛选

随机选取阳性菌株(同时挑取空白质粒转化菌株作为对照)进行摇瓶发酵初步筛选，筛选的培养基是BMGY/BMMY。筛选方法如下：从YPDS平板上随机挑取单克隆于YPD培养基中，具体毕赤酵母重组菌株发酵筛选同实施例1发酵筛选部分。

5、由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAα1

用pH为6.4，浓度为20mmol/L的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲溶液对超滤器和大孔径(10KDa)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.2bar和0.2bar，然后对毕赤酵母重组菌株表达上清液进行浓缩，当浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述磷酸盐缓冲液稀释，之后再继续超滤至1L左右，如此稀释3次，收集浓缩液，备用。

将上述超滤后的浓缩液上样至预先用浓度为20mmol/L，pH为6.4磷酸盐的平衡缓冲液平衡好的SP Sephadex C-50(1.6×10cm)层析柱2个柱体积，进行阳离子交换层析。

具体步骤是：用浓度为20mmol/L，pH为6.4Na₂HPO₄-柠檬酸的平衡缓冲液平衡层析柱3个柱体积，换用浓度为20mmol/L，pH为7.0Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液冲洗2个柱体积，待基线平稳后接着用20mmol/L，pH为7.0Na₂HPO₄-柠檬酸含0.4M NaCl，从0-0.4MNaCl线形洗脱10个柱体积，收集洗脱液。

对阳离子交换层析所得到的洗脱液样品经截留分子量为5KDa的超滤管一次超滤浓缩到一定体积，以蛋白浓度不超过50mg/ml为准。

选用1.6cm×85cm的Superdex G-75层析柱进行凝胶过滤层析，先用20mM NaH₂PO₄-柠檬酸pH 7.0、内含0.2MNaCl缓冲液平衡2个柱体积，然后将浓缩后的经阳离子交换层析分离的样品上样，以1.5ml/min的流速洗脱，在波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脱液，即为纯化DSPAα1的提取液。

纯化DSPAα1的提取液以常规方法真空冷冻干燥，制得固体的DSPAα1粉末。

实施例3

1、DSPAα1基因及毕赤酵母偏好密码子序列基因合成

步骤同实施例1。

2、重组质粒构建

利用XhoI和NotI双酶切构建的pPIC9K-DSPAα1，回收含DSPAα1片段，并与相同酶切的表达质粒pGAPαA用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pGAPαA-DSPAα1。

3、毕赤酵母菌株转化及平板筛选

SalI线性化质粒pGAPαA-DSPAα1和空白质粒pGAPαA，毕赤酵母菌株GS115转化及平板筛选同实施例2平板筛选部分。

4、毕赤酵母重组菌株发酵筛选

随机选取阳性菌株(同时挑取空白质粒转化菌株作为对照)进行摇瓶发酵初步筛选，筛选的培养基是BMG/BMM。筛选方法如下：从YPDS平板上随机挑取单克隆于YPD培养基中，然后进行培养，28℃ 220r/min发酵培养，其间以SDS-PAGE检测蛋白质表达量，并同时检测酶活、pH、生物量，每一样品平行两份进行检测。

其中：酶活检测方法按照纤溶平板法检测，方法是制作纤维蛋白平板，在平板上打孔径为2mm的孔，孔内分别加入标准品和待测样品，每孔10uL，每稀释度做2孔，37℃湿盒中孵育24h，纵向和横向量取溶圈直径，以标准品溶液的标准曲线定量样品的活性。

5、由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAα1

预先用pH为6.6，浓度为20mmol/L的磷酸盐(Na₂HPO₄-KH₂PO₄)缓冲溶液对超滤器和大孔径(10KDa)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，然后对毕赤酵母重组菌株表达上清液进行浓缩，当浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述磷酸盐缓冲液稀释，之后再继续超滤至1L左右，如此稀释3次，收集浓缩液，备用。

用浓度为20mmol/L，pH为6.6磷酸盐的平衡缓冲液平衡SP-650-S(1.6×13cm)层析柱2个柱体积，将超滤后的浓缩液上样至平衡好的阳离子交换层析柱，进行阳离子交换层析。

具体步骤是：用浓度为20mmol/L，pH为6.6磷酸盐缓冲液平衡层析柱3个柱体积，换用浓度为20mmol/L，pH为7.6磷酸盐缓冲液冲洗2个柱体积，待基线平稳后接着用20mmol/L，pH为7.6磷酸盐含0.3M NaCl，从0-0.3MNaCl线形洗脱10个柱体积，收集洗脱液。

对阳离子交换层析所得到的洗脱液样品经截留分子量为5KDa的超滤管一次超滤浓缩到一定体积，以蛋白浓度不超过50mg/ml为准。

选用1.6cm×90cm的Sephacryl-100层析柱进行凝胶过滤层析，预先用20mM磷酸盐pH7.6、含0.1MNaCl缓冲液平衡层析柱2个柱体积，然后将浓缩后的经阳离子交换层析分离的样品上样，以1ml/min的流速洗脱，在波长为280nm处检测洗脱液，洗脱液曲线只有唯一的吸收峰，即为纯化DSPAα1的提取液。

纯化DSPAα1的提取液以常规方法真空冷冻干燥，制得固体的DSPAα1粉末。

本发明中LB平板的配方是(/L)：1％酵母抽提物；0.5％蛋白胨；1％ NaCl。

本发明中MD平板的配方是(/L)：1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；2％ D-葡萄糖。

本发明中YPD培养基的配方是(/L)：1％酵母抽提物；2％蛋白胨；2％ D-葡萄糖。

本发明中YPDS培养基的配方是(/L)：1％酵母抽提物；2％蛋白胨；2％ D-葡萄糖，1M 山梨醇。

本发明中BMGY培养基的配方是(/L)：1％酵母抽提物；2％蛋白胨；100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；1％甘油。

本发明中BMMY培养基的配方是(/L)：1％酵母抽提物；2％蛋白胨；100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；0.5％甲醇。

本发明中BMG培养基的配方是(/L)：100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；1％甘油。

本发明中BMM培养基的配方是(/L)：100mM磷酸缓冲液(pH6.0)；1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB)；4×10^-5％生物素；0.5％甲醇。

序列表

<110>齐鲁制药有限公司

<120>利用酵母表达系统生产DSPAα1的方法

<141>2008-01-11

<160>1

<210>1

<211>1344

<212>DNA

<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)

<222>(1)…(1344)

<400>1

Claims (15)

1.一种利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，步骤包括(1)合成DSPAα1基因的核苷酸序列或按照毕赤酵母偏好密码子序列优化DSPAα1基因的核苷酸序列；(2)双酶切合成的或优化的DSPAα1基因序列，构建重组表达质粒X-DSPAα1；(3)转化毕赤酵母菌株细胞及平板筛选阳性转化子；(4)毕赤酵母重组菌株发酵筛选；(5)由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAα1；其特征是：步骤(1)所述优化的DSPAα1基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；步骤(3)所述转化毕赤酵母菌株细胞的方法采用电击转化或化学转化；步骤(5)所述分离纯化DSPAα1的步骤为：15℃～25℃温度条件下，先将毕赤酵母重组菌株表达上清液用截留分子量10KDa的超滤器超滤，使其浓缩到符合阳离子交换层析柱上样条件，然后将其加样到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换层析柱上进行洗脱，去除杂蛋白和非蛋白杂质，再利用凝胶过滤层析柱进行上样洗脱，去除二聚体和小分子杂质，洗脱中出现唯一的洗脱峰，即为纯化DSPAα1产物。

2.如权利要求1所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：步骤(2)所述重组表达质粒X-DSPAα1是：pPIC9K-DSPAα1、pPIC9-DSPAα1、pPICZαA/B/C-DSPAα1或pGAPZαA/B/C-DSPAα1。

3.如权利要求2所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：所述重组表达质粒X-DSPAα1是pPIC9K-DSPAα1或pPIC9-DSPAα1。

4.如权利要求1所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：步骤(3)所述毕赤酵母菌株是：GS115、X-33、KM71或SMD1168。

5.如权利要求4所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：所述毕赤酵母菌株是GS115。

6.如权利要求1所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：步骤(4)所述毕赤酵母重组菌株发酵筛选的培养基是BMGY/BMMY、BMG/BMM或YPD。

7.如权利要求6所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：所述毕赤酵母重组菌株发酵筛选的培养基是BMGY/BMMY。

8.如权利要求1所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：步骤(5)所述阳离子交换柱的层析介质选自羧基、羧甲基、磺酸基、磺甲基、磺乙基、磺丙基或磷酸基衍生的葡聚糖、硅胶微粒、琼脂糖、聚乙烯醇系、苯乙烯及二苯乙烯、纤维素或者交联的聚丙烯酰胺系列介质。

9.如权利要求1所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：步骤(5)所述阳离子交换层析柱选自CM sepharose FF层析柱或SP Sephadex C-50层析柱或SP-650-S层析柱。

10.如权利要求1所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：步骤(5)所述平衡缓冲液选自pH5.0-8.0的磷酸盐缓冲液或Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液。

11.如权利要求1所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：步骤(5)所述凝胶过滤层析的方法是：将经阳离子交换层析分离、浓缩后的蛋白浓度不超过50mg/ml的样品上样到凝胶过滤层析柱，以pH6.0-7.5，内含0.1-0.2M NaCl的Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液或Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液为洗脱液进行洗脱，以波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线只有唯一的吸收峰，收集峰值洗脱液，即为纯化DSPAα1的提取液。

12.如权利要求11所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：所述凝胶过滤层析柱的层析介质选自交联琼脂糖、交联聚乙烯醇、葡聚糖凝胶、烯丙基葡聚糖与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺聚合凝胶或葡聚糖与高交联琼脂糖的复合凝胶。

13.如权利要求12所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：所述凝胶过滤层析柱的层析介质能分离分子量在3,000～300,000Da的蛋白。

14.如权利要求11所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：所述凝胶过滤层析柱选自Sephadex G-75或Superdex G-75或Sephacryl-100层析柱。

15.如权利要求1所述利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，其特征是：所述纯化DSPAα1的提取液能以常规方法真空冷冻干燥制得固体的DSPAα1粉末。

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