DE60117754T2

DE60117754T2 - Verfahren zur herstellung von rekombinantem trypsin

Info

Publication number: DE60117754T2
Application number: DE60117754T
Authority: DE
Inventors: Diethard Mattanovich; Hermann Katinger; Hubertus Hohenblum; Stefan Naschberger; Robert Weik
Original assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Current assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2001-01-24
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-01-25
Also published as: DE60117754D1; EP1250442A2; ATE319837T1; WO2001055429A2; EP1250442B1; AU2001240540A1; WO2001055429A3

Description

GEBIET DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Biotechnologie und bezieht sich auf Verfahren für die Herstellung von rekombinantem Trypsinogen bzw. Trypsin.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Protease Trypsin wird in der Biotechnologie für verschiedene Zwecke verwendet, zum Beispiel um anhaftende Zellen von Oberflächen zu lösen, virale Infektionen während der Virenproduktion zu verstärken oder Fusionsproteine zu verarbeiten. Die Verwendung von Trypsin, das aus tierischen Geweben und insbesondere aus Rinder- und Schweinegeweben hergestellt wird, ist heute noch verbreitet. Da der allgemeine Wunsch und die allgemeine Tendenz bestehen, aus tierischen Rohstoffen extrahiertes Material, zum Beispiel Proteine, durch gleichwertige Materialien zu ersetzen, die mit rekombinanter Technologie hergestellt werden, besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung rekombinanten Trypsins in hoher Reinheit und in grossen Mengen zur Verfügung zu stellen.
Dem Fachmann ist bekannt, dass die proteolytische Aktivität von Trypsin zwei wichtige Hinternisse für dessen rekombinante Erzeugung darstellt:
Die Trypsinaktivität schädigt die Wirtszellen ernsthaft. Daher liefert die direkte Erzeugung aktiven Trypsins sehr niedrige Expressionsniveaus (L. Yee und H. W. Blanch, 1992, Biotechnol. Bioeng. 41, 781–790). Um dieses Problem zu umgehen, kann statt des reifen Trypsins der inaktive Vorläufer Trypsinogen exprimiert werden.
Trypsinogen ist aber für eine Verdauung durch Trypsin und andere Proteasen empfänglich (J. P. Abita und Mitautoren, 1969, European J. Biochem. 8, 314–324), was zu seiner Spaltung zu aktivem Trypsin führt. Weiter ist dem Fachmann be kannt, dass Trypsin auf sich selbst wirken und seine eigene Spaltung autokatalysieren kann, um schliesslich desaktiviert zu werden.
In diesem Zusammenhang wird in der WO 97/00316 berichtet, dass die rekombinante Herstellung von Trypsinogen durch einen Fadenpilz entweder wegen der Automaturation oder wegen einer Maturation durch von der Wirtszelle erzeugte Proteasen zumindest etwas reifes Trypsin liefert, selbst wenn das Trypsinogen von der Wirtszelle ins Medium ausgeschieden wird.
In der EP 597 681 wird über Verfahren zur Konstruktion geeigneter Vektoren für eine rekombinante Herstellung von Trypsin oder Trypsinogen in einem E. coli-Expressionssystem berichtet. Dort wird auch gelehrt, dass die Umwandlung von Trypsinogen in Trypsin durch Enteropeptidase bewerkstelligt wird.
Die EP 597 681 sagt nichts über die Kultivierung der erfolgreich transformierten E. coli-Zellen auf einem anderen Medium als einem festen Agarmedium aus und liefert daher keine Hinweise auf Vorteile oder Nachteile dieses prokaryontischen Expressionssystems. Andererseits liefern die in WO 97/00316 offenbarten Verfahren angeblich ein um ein Mehrfaches höheres Trypsinniveau als die bei anderen mikrobiellen Systemen in Erscheinung tretenden, ohne aber eine Grundlage für einen solchen Vergleich zu liefern. Die WO 97/00316 lehrt ferner, dass die Expression von Trypsinen und insbesondere von Säugertrypsinen in der Technik nur mit extrem niedrigen Niveaus gelingt.
Das Vorhandensein zweier Proteinarten (zum Beispiel Trypsinogen und Trypsin) in einem bakteriellen oder eukaryontischen Zellkulturmedium führt vermutlich zu Komplikationen bei der Produktgewinnung und -reinigung, weil beide Proteine geerntet und gereinigt werden müssen. Ausserdem wird im Falle einer mikrobiellen Trypsinogenausscheidung die Reifung von Trypsinogen zu Trypsin durch das gleichzeitige Vorliegen von Trypsin beschleunigt, was dann zumindest zu einer teilweisen Desaktivierung von Trypsin als des erwünschten Endprodukts führen kann. Schlimmer noch können dadurch zusätzlich die Wirtszellen geschädigt werden, was zu einer Verringerung der Biomasse und Produktausbeute und zu einer höheren Belastung mit unerwünschter Verunreinigung durch Wirtszellenbestandteile führt.
In der WO 00/17332 wird über ein Verfahren zur Herstellung von Trypsinogen mittels eines modifizierten Trypsinogenanalogen berichtet, das während der Inkubation autokatalytisch nicht gespalten werden kann. Das Verfahren verlangt den Zusatz einer Diaminopeptidase zur Aktivierung des Trypsinogens zu Trypsin nach Abtrennung des Trypsinanalogen aus dem Zellkulturmedium.
Andererseits wird in der WO 99/10503 über ein Verfahren zur Herstellung von Trypsinogen berichtet, bei dem in das Trypsinogenmolekül eine synthetische autokatalytische Spaltstelle eingeführt wird, die nicht natürlich vorkommt und die die natürlich vorkommende Selbstspaltungsstelle ersetzt. Es wird dort ausdrücklich gewünscht, dass das Zymogen, d.h. das Trypsinogen, wenigstens zu einem geringen Grade autokatalytisch aktiv ist. Die das Zymogen erzeugenden Wirtszellen werden durch die proteolytische Aktivität des Zymogens nicht geschädigt, weil sich das Zymogen intrazellulär in Gestalt von inaktiven Proteinaggregaten, d.h. Einschlusskörpern ansammelt.
Allen bisher erwähnten Verfahren ist gemein, dass sie entweder einen Schritt verlangen, in dem das Trypsinogenmolekül modifiziert wird, um seine autokatalytische Aktivität zu erhöhen oder im Gegenteil eine unerwünschte Auswirkung auf die produzierenden Zellen zu verhindern, oder einen Schritt verlangen, bei dem eine Proteinase hinzugefügt wird, um das Zymogen, d.h. Trypsinogen, zum aktiven Enzym, d.h. Trypsin, zu aktivieren, was dann natürlich weiter die Entfernung der Proteinase aus dem Endprodukt erfordert, sofern die hinzugefügte Proteinase nicht Trypsin selbst ist.
Daher besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein einfaches, aber sehr leistungsfähiges Verfahren zur Verfügung zu stellen, das für die Erzeugung von Trypsin durch rekombinante Technologie ohne die aus Prozessen des Standes der Technik bekannten Nachteile geeignet ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel wird gemäss der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Trypsin bzw. Trypsinogen erreicht, bei dem keine unbeabsichtigte Trypsinaktivität oder Aktivierung von Trypsinogen zu Trypsin auftritt.
In einer Ausführungsform wird ein Trypsinogen-Gen (zum Beispiel menschliches Trypsinogen 1) so in Hefeexpressionsvektoren eingefügt, dass eine Sequenz einbezogen wird, die ein Sekretions-Leaderpeptid kodiert (zum Beispiel pPICZαB für die Hefe Pichia pastoris), und die rekombinanten Vektoren werden in geeignete Wirtszellen eingeführt.
Die Zellen werden für Expression kultiviert, und das rekombinante Trypsinogen findet sich dann im Überstand der Kultur, woraus es isoliert, gereinigt und zu Trypsin aktiviert wird. Es wurde gefunden, dass diese Prozedur allen anderen Expressionssystemen für Trypsinogen, die uns bislang bekannt geworden oder geprüft worden sind, überlegen ist, indem sie die folgenden wichtigen Vorteile offenbarte:

– das Expressionsniveau war hoch;
– das in das Nährmedium ausgeschiedene Trypsinogenprotein war korrekt gefaltet und konnte direkt zu Trypsin aktiviert werden;
– während des Herstellungsprozesses trat keine unbeabsichtigte Aktivierung zu Trypsin auf.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Trypsinogen-Gen in einen Expressionsvektor ohne Sekretions-Leadersequenz eingefügt, so dass sich das Produkt innerhalb der Wirtszelle ansammelt. Das Trypsinogen bildet unlösliche Aggregate, die durch Aufbrechen der Zellen freigesetzt und durch Zentrifugieren, Filtrieren oder andere Methoden geerntet werden können. Um das rekombinante Protein zu solubilisieren, wird eine geeignete Prozedur für das Denaturieren und Umfalten angewendet, vorzugsweise mit einem kontinuierlichen Verfahren, wie hierunter beschrieben.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Systeme zur Herstellung von rekombinantem Trypsin oder Trypsinogen.
In einer Ausführungsform wird ein Gen für Trypsinogen so in Hefe eingeführt, dass das Genprodukt in den Kulturüberstand ausgeschieden wird. Die Hefe kann eine methylotrophe Hefe (z.B. Pichia pastoris, P. methanolica oder Hansenula polymorpha), Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis oder eine andere Hefe sein. Das Expressionssystem umfasst einen Promotor (z.B. Alkoholoxidase, Alkoholdehydrogenase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase oder andere), einen Sekretionsleader (z.B. den Hefe-α-Faktor Hefephosphatase, Säuger- oder pflanzlichen Ursprungs, aus Trypsinogen oder anderen), einen Transkriptionsterminator (z. B. Alkoholoxidase, Alkoholdehydrogenase oder andere) sowie einen selektiven Marker (z.B. ein Aminosäuresynthesegen oder ein antibiotisches Widerstandsgen). Das rekombinante Gen und ein oder mehrere der oben beschriebenen, zusätzlichen Elemente werden z.B. durch Elektroporation, Behandlung mit Lithiumacetat oder Lithiumchlorid, Herstellung von Sphäroplasten und Behandlung mit Calciumsalzen oder anderen geeigneten Methoden in die Hefezelle eingeführt. Die Hefen werden dann unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression von Trypsinogen geeignet sind, und das Produkt wird mit dem Kulturüberstand geerntet.
Das Produkt kann aus dem Kulturüberstand mit einem starken Kationentauscherharz weiter gereinigt werden. In den meisten fachbekannten Prozeduren wird der Kulturüberstand ausgetauscht und zum Beispiel durch Crossflowfiltration, Dialyse usw. in einen Puffer niedriger Leitfähigkeit umgewandelt, ehe er auf eine Gelchromatographiesäule geladen wird. Wenn der Kulturüberstand in einen Natriumacetat/Essigsäure-Puffer umgewandelt wird, haften aber nur kleine Mengen des darin enthaltenen Trypsinogens am Kationentauscherharz und werden daran gebunden. Daher wird hier ein neues Verfahren vorgeschlagen, bei dem Ca²⁺-Ionen zu der Lösung, die das erwünschte Produkt (z.B. Trypsinogen, modifiziertes Trypsinogen oder ein Trypsinogen-Homologes) enthält, zugegeben werden, ehe die Lösung auf die Gelchromatographiesäule aufgegeben wird. Das gelingt durch den Zusatz eines löslichen Calciumsalzes wie zum Beispiel CaCl₂ zu der benannten Lösung in einer effektiven Konzentration von etwa 0,5 bis 400, bevorzugt 1 bis 300, am stärksten bevorzugt 5 bis 20 mmol pro Liter (1 mM). Durch diese Prozedur kann die Trypsinogenbindungskapazität des Harzes um einen Faktor von mindestens drei, typisch um einen Faktor von drei bis sechs erhöht werden. Die untere Grenze der Ca²⁺-Konzentration in der Zulauflösung wird primär von der Fähigkeit des Trypsinogens bestimmt, zu Trypsin aktiviert zu werden, und diese Fähigkeit schwindet, wenn die Zulauflösung einen Mangel an Ca²⁺ hat. Unter den bevorzugten Bedingungen der Prozeduren in der vorliegenden Erfindung (siehe Beispiel 5) wurde gefunden, dass die minimale Ca²⁺-Konzentration in der Zulauflösung und bevorzugt auch in den Wasch- und Elutionspufferlösungen ungefähr 1 mM beträgt.
Die Obergrenze wird grundsätzlich durch den Grad der Leitfähigkeit der Zulauflösung bestimmt. Es wurde gefunden, dass der Vorteil einer erhöhten Affinität des (Ca²⁺)- beladenen Trypsinogens für eine Bindung an das Chromatographieharz allmählich schwindet, wenn die Leitfähigkeit (wegen der Zugabe von Calciumsalz) ein bestimmtes Niveau überschreitet. Unter den bevorzugten Bedingungen der Prozeduren in der vorliegenden Erfindung (siehe Beispiel 5) sollte die maximale Ca²⁺-Konzentration 300 mM nicht übersteigen. Für die meisten Anwendungen wird eine CaCl₂-Konzentration von 5 bis 20 mM optimal sein.
So verbessert das vorliegende Reinigungsverfahren die Gesamtwirtschaftlichkeit und das Preis-Leistungs-Verhältnis bekannter hochentwickelter Reinigungsprozesse wegen einer mindestens dreifachen Erhöhung der Bindungskapazität der Säule (was bedeutet, das mindestens die dreifache Menge an Trypsinogen je Volumen des Harzes gebunden wird) und ausserdem wegen einer signifikanten Erhöhung der Gewinnung von aktivierbarem Trypsinogen.
Die besten Ergebnisse gemäss vorliegender Erfindung wurden in einer Prozedur erhalten, bei der der geerntete Kulturüberstand nach Entfernung der Feststoffe und Zugabe einer wirksamen Menge von CaCl₂ direkt, also ohne einen Pufferaustauschschritt, auf die Säule geladen wurde und bei der jeder Wasch- und Elutionspuffer eine wirksame Menge an CaCl₂ enthielt. Während Ca²⁺ in der Zulauflösung die Bindung an das Kationentauscherharz verbessern, erleichtern Ca²⁺ in den Wasch- und Elutionspuffern die nachfolgende Aktivierung von Trypsinogen zu Trypsin.
Die Verfahren zur Herstellung von Trypsin oder Trypsinogen, die bisher im Fach beschrieben worden sind, liefern entweder sehr geringe Mengen des Produkts oder verursachen zumindest eine teilweise Spaltung von Trypsinogen während der Kultivierung. Dies ist aber mit dem hierin beschriebenen Hefeverfahren nicht der Fall, wodurch dieses Verfahren den bislang bekannten Prozessen der Trypsinproduktion überlegen ist.
Damit die hierin beschriebene Erfindung in vollerem Umfang verstanden wird, werden die folgenden Beispiele vorgelegt. Die Beispiele dienen der Veranschaulichung und dürfen nicht als die Erfindung in irgendeiner Beziehung einschränkend interpretiert werden. Insbesondere versteht es sich, dass die Prozeduren der vorliegenden Erfindung, obwohl in den nachfolgenden Beispielen hauptsächlich am Beispiel von rekombinantem menschlichem Trypsinogen 1 und dem ihm entsprechenden Trypsin dargelegt, ohne einen erfinderischen Beitrag auch auf andere menschliche Trypsinogene und die entsprechenden Trypsine wie auch auf Trypsinogene und die entsprechenden Trypsine nicht-menschlichen Ursprungs anwendbar sind, darunter auf Rinder- und Schweine-Trypsinogene und Trypsine. Weiter versteht es sich, dass die vorliegende Erfindung auch Abänderungen der ausdrücklich offenbarten Ausführungsformen in dem Masse einschliesst, wie es ein normal sachkundiger Fachmann in Betracht ziehen würde.
Beispiel 1: Expression menschlichen Trypsinogens 1 in der Hefe Pichia pastoris
Das Gen für menschliches Trypsinogen 1 (Gene 41, 305–310, 1986; Swissprot Locus TRY1_HUMAN, Accession-Nr. P07477; für die Sequenz siehe Tabelle 1) wurde in den Vektor pPICZαB (Invitrogen) eingefügt, der zuvor mit Sfil verdaut worden war.
Tabelle 1: Nucleotidsequenz des menschlichen Trypsinogens 1, beginnend bei der Propeptidsequenz (SEQ ID No 1)
Tabelle 2: PCR-Primer für Klonen in pPICZαB
Die entsprechenden Sfil-Plätze wurden durch PCR an das Trypsinogen-Gen angefügt (für die Primersequenzen siehe Tabelle 2). Das rekombinante Plasmid wurde durch Elektroporation in die Stämme GS115 bzw. X33 von P. pastoris transformiert. Positive Hefeklone wurden über den Widerstand gegenüber Zeocin ausgewählt. Mehrere Klone wurden in 250-ml-Schüttelflaschen mit Schikanen kultiviert. Als Kulturmedien wurde entweder gepuffertes Minimalmedium (100 mM Kaliumphosphat, pH 6,0; 1,34 % YNB; 4 × 10^–5 % Biotin; 1 % Glycerin oder 0,5 % Methanol) oder gepuffertes Komplexmedium (1 % Hefeextrakt; 2 % Pepton; 100 mM Kaliumphosphat, pH 6,0; 1,34 % YNB; 4 × 10^–5 % Biotin; 1 % Glycerin oder 0,5 % Methanol) verwendet. Um die rekombinante Genexpression zu induzieren, wurden die Zellen zentrifugiert und in frischem Medium, das Methanol statt Glycerin enthielt, erneut suspendiert. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren vom Überstand entfernt, und das rekombinante Trypsinogen wurde im Überstand durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese nachgewiesen. Diese Prozedur ermöglichte die Auswahl von stark überproduzierenden Klonen. Eine Aktivierung von Trypsinogen wurde in diesen Kulturen nicht beobachtet.
Alternativ wurde das Gen für menschliches Trypsinogen 1 (für die Sequenz siehe Tabelle 1) in den Vektor pHILS1 (Invitrogen) eingefügt, der vorher mit XhoI und BamHI verdaut worden war. Die entsprechenden XhoI- und BamHI-Plätze wurden durch PCR an das Trypsinogen-Gen angefügt (für die Primersequenzen siehe Tabelle 3). Das rekombinante Plasmid wurde mit dem Protoplasten-Transformationsverfahren in den Stamm GS115 von P. pastoris transformiert. Positive Hefeklone wurden durch Wachstum auf Minimalplatten ohne Histidin ausgewählt. Kultivierung und Analyse folgten den oben beschriebenen Prozeduren.
Tabelle 3: PCR-Primer für Klonen in pHILS1
Beide Verfahren ergaben eine Ausscheidung von korrekt gefaltetem Trypsinogen in das Kulturmedium. Ein Umfalten war nicht erforderlich, was diesen auf Hefe beruhenden Prozess für die Herstellung von Trypsinogen verhältnismässig einfach und für eine Produktion im industriellen Massstab gut geeignet macht, obwohl eine Optimierung der Kulturbedingungen nützlich sein kann, um die Produktausbeute weiter zu verbessern. Die Ausbeute an ausgeschiedenem Trypsinogen war in den vorliegenden Versuchen geringer als im E. coli-System (zum Beispiel maximal nur etwa 10 % der mit E. coli erzielten Ausbeute) und lag typischerweise bei wenigstens 10 mg/Liter in der Schüttelflaschenkultur bei einer Biomassekonzentration von etwa 10 g/Liter (berechnet als Trockenmasse pro Liter des Kulturmediums) und bei wenigstens 30 mg/Liter in einem gerührten Fermentergefäss im Labormassstab bei einer Biomassekonzentration von etwa 30 g/Liter (berechnet als Trockenmasse). Da der vorliegende Prozess noch Raum für eine Optimierung hat, wird erwartet, dass eine Biomassekonzentration von bis zu 100 g/Liter (wie in der Literatur für verschiedene P. pastoris-Fermentationsprozesse angeführt) und eine entsprechende Trypsinogenkonzentration von etwa 0,1 g/Liter im Kulturüberstand allein durch Veränderung einiger Parameter im Nährmedium und in den Kulturbedingungen gut erreicht werden könnte.
Wenn man in Betracht zieht, dass in unseren Versuchen der Kulturüberstand nur sehr wenige andere Proteine enthielt, was die Abtrennung und Reinigung beträchtlich erleichtert (nur ein oder zwei Reinigungsschritte sind erforderlich), und dass ferner keine Denaturierungs- oder Renaturierungsschritte erforderlich waren (weil das ausgeschiedene Protein bereits korrekt gefaltet war), war die schlussendliche Produktgesamtausbeute, die mit dem Hefeverfahren erzielt werden kann, nicht so weit von der mit dem E. coli-Verfahren erzielten entfernt.
Es wird auch betont, das unter den vorerwähnten Expressions- und Kulturbedingungen das ausgeschiedene Trypsinogen während mehrerer Tage der Kultivierung im Kulturmedium stabil blieb. Eine autokatalytische Aktivierung zu Trypsin wurde nicht beobachtet (wahrscheinlich wegen des sauren pH-Wertes in der Zellkultursuspension, der im Bereich von pH 2 bis pH 7,5 lag, was für eine autokatalytische Umwandlung von Trypsinogen bei weitem nicht optimal ist), ebenso wenig eine negative Auswirkung auf die Lebensfähigkeit der Zelle. Daher wird angenommen, dass ein beträchtlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung über die derzeitige neueste Technologie dadurch erreicht wird, dass verschiedene unerwünschte Vorkommnisse bei den Prozeduren vermieden werden, darunter (aber nicht ausschliesslich) eine unkontrollierte Trypsinbildung, eine Hemmung des Zellenwachstums, eine Beschleunigung der Zellenlysis, Trypsin-Autoverdauung, Verunreinigung des Überstands durch Zellbestandteile von lysierten Zellen, zusätzliche Reinigungsschritte, Produktverunreinigung, Produktverluste usw.
Beispiel 2: Reinigung von Trypsinogen aus Hefekulturüberständen
Der Kulturüberstand wurde abgekühlt und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde verworfen, und der Überstand wurde ein weiteres Mal zentrifugiert. Der pH des Überstandes wurde mit Essigsäure auf 4,0 eingestellt, und 10 mM CaCl₂ wurden hinzugefügt. Der Überstand wurde direkt auf ein Harz TosoHaas Toyopearl SP550C (ein starker Kationentauscher) geladen, und zwar bei einer Fliessgeschwindigkeit von 100 cm/h entweder bei Raumtemperatur oder bei 4 °C. Die Säule wurde mit 50 mM NaAc/HAc + 200 mM NaCl + 10 mM CaCl₂ gewaschen. Das Protein wird mit 50 mM NaAc/HAc + 400 mM NaCl + 10 mM CaCl₂ eluiert. Die aus der Aktivität von Trypsin bestimmte Ausbeute der Trypsinogengewinnung beträgt etwa 87 %.
Beispiel 3: Virusbehandlung durch rekombinant erzeugtes menschliches Trypsin 1
Rekombinantes menschliches Trypsin 1, das sowohl aus E. coli als auch aus P. pastoris, wie oben beschrieben, hergestellt worden war, wurde für die Behandlung von Influenzaviren verwendet, um die Infektivität des Virus in der Zellkultur zu induzieren. Verschiedene Stämme von Influenzaviren wurden in Vero/SF-Zellen verglichen. Die Wirkung das rekombinanten menschlichen Trypsins wurde mit Schweine-Trypsin, Rinder-Trypsin und Rinder-Chymotrypsin verglichen.
Prozedur: Nach Enfernen des Kulturüberstandes wurden die Zellen pro Loch mit 50 μl der Virusverdünnung (1 : 1000, MOI etwa 0,01) infiziert. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden pro Loch 500 μl eines Mediums hinzugefügt, das zweifache Verdünnungen verschiedener Proteasen enthielt. Die Trypsine unterschiedlichen Ursprungs wurden auf die gleiche volumetrische Aktivität standardisiert, die mit TAME (p-Toluolsulfonyl-t-arginin-Methylester) als Substrat gemessen wurde. Typische Trypsinkonzentrationen waren: 0,03–1 TAME-Einheiten je ml der schlussendlichen Lösung. Eine TAME-Einheit ist als die Menge Trypsin definiert, die 1 μmol p-Toluolsulfonyl-L-arginin-Methylester pro Minute hydrolysiert.
Rekombinantes menschliches Trypsin und Schweine-Trypsin gaben identische Ergebnisse, beide waren dem Rinder-Trypsin und dem Chymotrypsin überlegen.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Trysinogen oder Trypsin, bei dem transformierte Wirtszellen, die ein Trypsinogen-Gen exprimieren, in einem geeigneten Zellkulturnährmedium unter Bedingungen inkubiert werden, die eine Zellvermehrung und eine gleichzeitige oder nachfolgende Expression des Trypsinogen-Gens ermöglichen, sowie intrazellulär oder extrazellulär angesammeltes Trypsinogen aus der Zellsuspension abgetrennt und gegebenenfalls das abgetrennte Trypsinogen weiter verarbeitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren eine Inkubation der transformierten Wirtszellen bei einem sauren pH-Wert bei oder grösser pH 2 umfasst, wobei die transformierten Wirtszellen Hefezellen sind, die mit einem Expressionsvektor transformiert worden sind, der ein natürlich vorkommendes Trypsinogen-Gen enthält, und wobei nach der Inkubation, während der im Medium keine Trypsinogenaktivierung oder Trypsinaktivität mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nachweisbar ist, eine Abtrennung der Zellen aus dem Medium und Gewinnung eines feststofffreien Überstandes, der das korrekt gefaltete Trypsinogen enthält, erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor aus der Gruppe pPICZ und pHILS1 ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor eine Sekretions-Leadersequenz für die Sekretion von exprimiertem Trypsinogen enthält.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Trypsinogen-Gen, das eine Vorwärtsprimer-Sequenz gemäss SEQ ID No. 2 und eine Rückwärtsprimer-Sequenz gemäss SEQ ID No. 3 enthält, in den Vektor pPICZαB eingefügt wird, oder dass ein Trypsinogen-Gen, das eine Vorwärtsprimer-Sequenz gemäss SEQ ID No. 4 und eine Rückwärtsprimer-Sequenz gemäss SEQ ID No. 5 enthält, in den Vektor pHILS 1 eingefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die transformierten Wirtszellen in Gegenwart von Methanol inkubiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein proteinfreies Medium als Nährmedium verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ein Minimalmedium ist, das Hefe-Stickstoff-Basis (YNB) als einzige Stickstoffquelle enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der feststofffreie Überstand, der das korrekt gefaltete Trypsinogen enthält, direkt, d.h. ohne einen Umfalt- oder einen Pufferaustauschschritt, der Reinigung durch Chromatographie, bevorzugt Kationenaustausch-Chromatographie, unterworfen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ca²⁺-Quelle zum Überstand hinzugefügt wird, bevor dieser der Chromatographie unterworfen wird, um die Trypsinogenbindung an ein Chromatographieharz zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ca²⁺-Quelle in einer Konzentration hinzugefügt wird, die wirksam ist, um die Trypsinogenbindung an das Harz um einen Faktor von zumindest drei, bevorzugt um einen Faktor von drei bis sechs zu erhöhen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefe aus der Gruppe Pichia, Saccharomyces, Hansenula und Kluyveromyces ausgewählt ist und bevorzugt P. pastoris ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welches ausserdem einen Schritt der autokatalytischen Aktivierung des Trypsinogens zu Trypsin ohne einen Zusatz von Trypsin oder einer anderen Proteinase umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor Rinder-, Schweine- oder menschliches Trypsinogen und bevorzugt natürlich vorkommendes menschliches Trypsinogen-1 kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Ca²⁺ in einer Konzentration hinzugefügt wird, die von 0,5 bis 500, bevorzugt von 1 bis 300 und stärker bevorzugt von 5 bis 20 mmol je Liter reicht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie die Verwendung von Wasch- und/oder Elutionspuffern umfasst und Ca²⁺ für eine unbeschränkte Aktivierung des Trypsinogens zu Trypsin zu jedem Wasch- und/oder Elutionspuffer hinzugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Ca²⁺ in einer Konzentration von mindestens 0,5 mM, bevorzugt von mindestens 1 mM hinzugefügt wird.