CN101967469B - 一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用。公开了一种生产重组胰蛋白酶的方法，所述方法包括：(1)重组表达融合蛋白，所述的融合蛋白序列从N端到C端依次包括：40-200个氨基酸序列、胰蛋白酶原序列，所述融合蛋白为可溶性表达；和(2)切除融合蛋白N端的40-200个氨基酸序列以及前导序列，获得重组胰蛋白酶。采用本发明的方法实现了胰蛋白酶的可溶性表达，可获得具有高活性、高稳定性的胰蛋白酶。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用。
背景技术
胰蛋白酶(Trypsin，EC3.4.21.4)在胰脏中以作为酶的前体胰蛋白酶原的形式被合成，并作为胰液的成分而分泌，受肠激酶的酶解或胰蛋白酶的自身激活成为活性胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在蛋白质测序中是重要的工具酶。
正是由于胰蛋白酶是活性强的肽链内切酶，可水解任何暴露在蛋白表面的赖氨酸和精氨酸残基的羧基端形成的肽键，包括其自身，所以一般的胰蛋白酶在pH3以上不稳定，会自身水解。
单独表达胰蛋白酶不能获得有效表达，因为微量的活性胰蛋白酶的存在就可对表达宿主细胞产生毒性，有人以胰蛋白酶原的形式表达，胰蛋白酶原相对于胰蛋白酶，其N端仅多了7个氨基酸，胰蛋白酶原具有少量的活性，所以仍然很难表达，即使表达，也是不溶性的包涵体形式，包涵体的复性率很低。所以，目前为止，报道的重组胰蛋白酶的收率均很低。
因此，本领域迫切需要研究开发新的重组胰蛋白酶生产技术，以期获得收率高、稳定性高的重组胰蛋白酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产方法，所述方法实现了重组胰蛋白酶的可溶性表达和激活。
本发明的另一目的在于提供利用所述的方法生产获得的重组胰蛋白酶。
在本发明的第一方面，提供一种生产重组胰蛋白酶的方法，所述方法包括：
(1)重组表达融合蛋白，所述的融合蛋白序列从N端到C端依次包括：40-200个氨基酸序列、胰蛋白酶原序列；和
(2)切除融合蛋白N端的40-200个(较佳地为90-200个，更佳地为100-170个)氨基酸序列以及前导序列，获得重组胰蛋白酶。
在一个优选例中，步骤(1)中，所述的40-200个氨基酸序列中包括选自下组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。
在另一优选例中，所述的40-200个氨基酸序列中，不含有2个或2个以上半胱氨酸，或者2个或2个以上半胱氨酸之间间隔较少的氨基酸。优选2个或2个以上半胱氨酸之间间隔的氨基酸少于10个，更优选少于6个，更优选少于3个，最优地所述氨基酸序列中不含有半胱氨酸。
在另一优选例中，所述的40-200个氨基酸序列中含有酸性氨基酸，特别是天冬氨酸D。较佳地，天冬氨酸D数目占氨基酸总数的5％以上，更佳地为7％以上。
在另一优选例中，所述的40-200个氨基酸序列中含有尽量少的碱性氨基酸，特别是碱性氨基酸精氨酸R。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的40-200个氨基酸序列是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。更优选地，所述的40-200个氨基酸序列是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，步骤(2)中，用肠激酶或胰蛋白酶处理(1)获得的融合蛋白，从而切除融合蛋白N端的40-200个氨基酸序列以及前导序列。
在另一优选例中，用胰蛋白酶处理(1)获得的融合蛋白的温度是：0-25℃(较佳的为2-20℃，更佳地为2-10℃，最佳的为4±1℃)。
在另一优选例中，步骤(1)中，采用大肠杆菌重组表达融合蛋白。
在另一优选例中，在步骤(1)和步骤(2)之间，还包括步骤：纯化重组表达获得的融合蛋白。
在另一优选例中，采用离子交换层析法纯化所述的融合蛋白，用CaCl2溶液洗脱。
在另一优选例中，用0～0.5M CaCl2溶液梯度洗脱。
在另一优选例中，还包括步骤(3)，利用5±1％(w/v)的山梨醇作为保护剂，冻干处理所获得的重组胰蛋白酶。优选利用5％(w/v)的山梨醇作为保护剂。
在本发明的另一方面，提供一种分离的融合蛋白，所述的融合蛋白序列从N端到C端依次包括：40-200个氨基酸序列、胰蛋白酶原序列。
在本发明的另一方面，提供一种分离的核酸，所述的核酸编码所述的融合蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体含有编码所述融合蛋白的核酸。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的细胞，所述的细胞含有所述的表达载体；或其基因组中整合有编码所述融合蛋白的核酸。
在本发明的另一方面，提供所述的融合蛋白或其编码核酸的用途，用于生产重组胰蛋白酶。
在另一优选例中，所述的重组胰蛋白酶稳定性强。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、重组胰蛋白酶的可溶性表达。其中，泳道1，1mM IPTG诱导30min的电泳结果；泳道2，1mM IPTG诱导4h的电泳结果；泳道3，对细胞超声破碎后分离的上清的电泳结果。
图2、重组胰蛋白酶的纯化，SDS-PAGE检测纯化结果。其中，泳道1，上样穿出液；泳道2，平衡液；泳道3，峰1；泳道4，峰2；泳道5，峰3；泳道6，0.5M CaCl2洗脱液。
图3、酶解4℃，25小时后获得的酶解液的电泳鉴定结果。其中，泳道1是纯化后的酶液(融合蛋白)的电泳结果；泳道2是对应图2泳道3酶解后的电泳结果；泳道3是酶解后的酶解液的电泳结果。
图4、重组胰蛋白酶应用于重组羧肽酶原B的激活(羧肽酶B∶胰蛋白酶比例为100∶1(w∶w))。其中，泳道1为酶解前的羧肽酶原B的复性液，泳道2，4，6，8，10为重组胰蛋白酶酶解0.5h，1h，2h，3h，4.5h和7h后的电泳结果；泳道3，5，7，9，11为猪胰蛋白酶酶解0.5h，1h，2h，3h，4.5h和7h后的电泳结果。
具体实施方式
为了解决现有技术中难以重组表达胰蛋白酶或表达效率不高的技术缺陷，本发明人经过深入的研究，出乎意料地找到一种生产高稳定性的重组胰蛋白酶的方法。本发明人采用一种分子内分子伴侣实现了重组胰蛋白酶在大肠杆菌中的可溶性表达，该可溶性表达的重组胰蛋白酶在纯化激活后获得了具有很高的酶活性的胰蛋白酶，该法实现了胰蛋白酶的重组可溶性生产，且生产的重组胰蛋白酶表现出高的稳定性。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸和多肽如果与天然状态一起存在的其他物质分开，则为分离纯化的。
如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
融合蛋白
为了解决活性胰蛋白酶表达对宿主毒性而使得宿主菌不能正常生长，或者解决酶原形式表达后形成包涵体形式，从而得到可溶性表达产物，本发明人在胰蛋白酶原的N端增加一段序列，其不仅能够在和胰蛋白酶共同表达时掩盖胰蛋白酶的活性，使胰蛋白酶高表达，同时可实现了胰蛋白酶的可溶性表达，可溶性表达的融合蛋白经纯化后，激活可获得活性重组胰蛋白酶。
因此，本发明提供一种分离的融合蛋白，所述的融合蛋白序列从N端到C端依次包括：40-200个氨基酸序列、胰蛋白酶原序列。
任何适合的氨基酸序列均可用于与重组胰蛋白酶原连接，用于制备所述的融合蛋白，只要其具有适当的长度和合适的氨基酸。
所述的氨基酸序列通常由40-200个氨基酸组成，所述的氨基酸优选的是非强酸性的和非强碱性的氨基酸。更优选地，所述的氨基酸选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸。
作为本发明的优选方式，所述的40-200个氨基酸序列中含有足够多的酸性氨基酸，特别是天冬氨酸D。较佳地，天冬氨酸D数目占氨基酸总数的5％以上，更佳地为7％以上。足够多的天冬氨酸有利于掩盖胰蛋白酶的活性。
作为本发明的优选方式，所述的40-200个氨基酸序列中含有尽量少的碱性氨基酸，特别是碱性氨基酸精氨酸R。
所述的胰蛋白酶是一种本领域熟知的蛋白。胰蛋白酶原是胰蛋白酶的前体形式，例如可参见GenBank登录号M27602.1所示的氨基酸序列(其中第1-16位为信号肽，第17-23位为前导肽)，受肠激酶酶解或胰蛋白酶自身酶解可被激活成具有活性的胰蛋白酶。
通过在胰蛋白酶原N端添加适量的氨基酸，可以调节胰蛋白酶的折叠聚合性质，在表达时掩盖胰蛋白酶的活性，从而对宿主细胞无毒性作用，或使其不易于被细胞内的其它成分所降解。
另一方面，本发明还提供了编码所述的融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。
在获得了编码本发明融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的融合蛋白。
因此，本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册(Elsevier最新版)中所描述的。可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成蛋白表达载体。在本发明的一种实施方式中，所述的载体为原核载体。
此外，含有编码所述融合蛋白的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。在本发明中，所述的“重组细胞”通常是原核细胞。常用的原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；优选的可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。
获得的转化子可以用常规方法培养，以表达所述的融合蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
可利用所述融合蛋白的物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。优选地，采用离子交换层析的方法进行分离纯化，并用CaCl2浓度梯度洗脱代替传统的NaCl梯度洗脱。利用CaCl2进行洗脱比NaCl洗脱可使得获得的胰蛋白酶更稳定。优选的CaCl2洗脱的浓度范围为0～0.5M。
生产重组胰蛋白酶的方法
本发明还提供一种生产重组胰蛋白酶的方法，所述方法包括：(1)重组表达融合蛋白，所述的融合蛋白序列从N端到C端依次包括：40-200个氨基酸序列、胰蛋白酶原序列；和(2)切除融合蛋白N端的40-200个氨基酸序列以及前导序列，获得重组胰蛋白酶。
本发明的方法的特点是：先在胰蛋白酶原的N端添加40-200个氨基酸的序列，在重组表达获得融合蛋白后，将位于N端的40-200个氨基酸以及胰蛋白酶原的前导肽(7个氨基酸，序列为PFDDDDK(SEQ ID NO：8))切除，得到高活性的胰蛋白酶。切除步骤可在重组表达获得融合蛋白后即刻进行；当然，也可保存所获得的融合蛋白，在需要使用活性的胰蛋白酶时再进行切除。
基于胰蛋白酶原来切除前导肽，以获得活性胰蛋白酶的方法是本领域技术人员熟知的，通常采用一些适合的蛋白内切酶。优选地，采用肠激酶或胰蛋白酶处理所述的融合蛋白，从而切除融合蛋白N端的40-200个氨基酸序列以及前导序列。
肠激酶(Enterokinase，EK)是一种识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO：9)序列的蛋白酶，专一性地在Lys的C端水解多肽。通常，肠激酶的适用温度和PH值较宽，如温度可在4-45℃，pH范围可在4-10。
利用胰蛋白酶处理所述的融合蛋白也可切除前导序列，基于自身激活作用，其能够识别Lys和Arg，在它们的羧基端切开。
获得的重组胰蛋白酶可通过冻干的方法保存，采用的冻干保护基优选的为5％的山梨醇，其保护效果良好，还有促进酶活的效果。
本发明的主要优点在于：
(1)采用本发明的方法，可实现重组胰蛋白酶的可溶性生产，克服了以往表达过程中其难以可溶性表达而包涵体表达复性率低的技术难题，大大提高了表达的收率。
(2)采用本发明的方法，生产的重组胰蛋白酶表现出高的稳定性，液体状态下放置2个月活性稳定。解决了胰蛋白酶液体因自身降解不稳定的问题。该重组胰蛋白酶可用于重组胰岛素、重组羧肽酶B、蛋白测序等方面。
(3)本发明的方法获得的重组胰蛋白酶具有和提取的胰蛋白酶相同的活性，可替代提取的胰蛋白酶用于蛋白或多肽的生产中，经无菌过滤后可替代提取胰蛋白酶用于细胞培养。
(4)本发明的方法获得的重组胰蛋白酶在较宽的PH范围内均稳定，一般的胰蛋白酶在PH3条件下才稳定，而本发明获得的重组胰蛋白酶在中性PH或弱碱性条件下也是稳定的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、融合蛋白(N端159个氨基酸+人胰蛋白酶原)的可溶性表达
在人胰蛋白酶原(GenBank：M27602.1，第17-247位(即不包括前导肽之前的信号肽))的N端添加由159个氨基酸组成的多肽，其序列为(SEQ ID NO：1)：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEI
ADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATK
VGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVRGSGMKET
AAAKFERQHMDSPDLGTENLYFQS
其中，含有天冬氨酸(D)12个。
设计以下引物：
正向：aaggatccAAAATCGTGGGTGGTTAC(SEQ ID NO：6)；
反向：ccAAGCTTTTAAGAGTTAGCAGCGA(SEQ ID NO：7)；
以人胰腺cDNA文库为模板，用前述引物进行PCR扩增获得人胰蛋白酶原的编码序列。
前述获得的序列用HindIII/BamHI酶切后插入到pET32a表达载体(购自Invitrogen)的相应位点中，在对应胰蛋白酶原N端的编码序列之前插入前述159个氨基酸的编码序列，获得用于表达的融合蛋白的编码序列。测序鉴定获得正确插入的重组表达载体。将该重组表达载体常规方法转化大肠杆菌DH5α(BL21(DE3))，获得转化子。
挑取转化平板上的单克隆菌落，接种至30mL LB培养液中(含100μg/mLAmp)，置于37℃摇床过夜培养(10～12h)后，以2％接种量转入二级瓶中，继续培养。菌密度至OD600 0.5～0.6时，于37℃和12℃下分别加入终浓度0.5mmol/L IPTG诱导4小时，10000rpm离心收集菌体，弃上清，菌体超声破碎，离心后获得含有前导序列-胰蛋白酶原融合蛋白的上清。
蛋白表达情况见图1，其中，泳道1为1mM IPTG诱导30min的电泳结果；泳道2为1mM IPTG诱导4h的电泳结果；泳道3为对细胞超声破碎后分离的上清的电泳结果。
实施例2、实施例1获得的融合蛋白的纯化
将前述诱导表达后的菌体超声破碎后收集的上清作为上样液，以纯化重组融合蛋白。
用2×15cm层析柱，离子交换柱事先用20mM Tris-HCl，pH8.0的缓冲液平衡，然后上清液上样，用相同的缓冲液平衡至基线平稳后，用含0-1M NaCl或0～0.5M CaCl2梯度洗脱，分部收集，测定每管的OD280和酶活，把有酶活的收集液合并，测总酶活和总蛋白含量。合并酶活高的收集管，即得纯化的活性重组胰蛋白酶。
收集的纯化液采用SDS-PAGE检测纯化结果，见图2。其中，泳道1为上样穿出液；泳道2为平衡液；泳道3为峰1；泳道4为峰2；泳道5为峰3；泳道6为0.5M CaCl2洗脱液。从分子量可知，融合重组蛋白集中在峰4洗脱液中。
经鉴定，纯化后可得到较纯化前纯度提高2-3倍的融合蛋白。
实施例3、激活条件
利用猪胰腺胰蛋白酶(购自Sigma公司)对前述纯化获得的融合蛋白进行酶解激活，以获得有活性的重组胰蛋白酶。其中，加入的猪胰腺胰蛋白酶的量为：猪胰腺胰蛋白酶∶融合蛋白(w∶w)＝1∶1000。激活后，获得去除了N端融合的氨基酸以及位于N端的7个氨基酸的活性的重组胰蛋白酶。
酶解条件如表1。
图3为酶解4℃，25小时后获得的酶解液的电泳鉴定结果。其中，泳道1是纯化后的酶液(融合蛋白)的电泳结果；泳道2是对应图2泳道3酶解后的电泳结果；泳道3是酶解后的酶解液的电泳结果。
酶解后测定重组胰蛋白酶的活性。测定的方法如下：测活采用BAEE法(底物BAEE购自Sigma)，具体方法根据Sigma规定的测定胰蛋白酶的方法。
NaCl洗脱后的样品的激活结果如表1，可见在4℃下酶解25小时可获得活性很高的胰蛋白酶，高温不利于酶的激活。
CaCl2洗脱后的样品的激活结果如表2，可见CaCl2洗脱后的样品在4℃下酶解25小时可获得活性很高的胰蛋白酶，高温不利于酶的激活。
比较表1和表2，可知，CaCl2对重组融合蛋白酶的激活有很好的作用，激活作用可提高9倍。
表1NaCl洗脱后的样品的激活
表2CaCl2洗脱后的样品的激活
实施例4、胰蛋白酶的稳定性
将前述激活后的胰蛋白酶在4℃、PH8条件下分别放置不同的时间，观察胰蛋白酶的酶活性变化，以确定其稳定性，以猪胰腺蛋白酶为对照。结果见表3。
表3
可见，重组胰蛋白酶溶液在4℃放置稳定，2月内活性不降低。相比猪胰腺胰蛋白酶，放置1天活性开始损失，放置2天活性损失50％，3天内基本全部失活。并且，本发明获得的重组胰蛋白酶在被激活后自身不再发生酶解。
实施例5、重组胰蛋白酶对重组羧肽酶原B的激活
重组羧肽酶原B的重组表达方法如下：根据文献(Su-Xia Li，Yu-Jian Zhang，Li-Ping Tian，Qin-Sheng Yuan，Yi Gong.Cloning，Expression of A NewProcarboxypeptidase B Gene in Escherichia coli and Purification of RecombinationCarboxypeptidase B.Protein and Peptide Letters.2003(10)：6，1-10)提供的方法制备，复性后的复性液。
重组胰蛋白酶可应用于重组羧肽酶原B的激活。
在前述得到的重组羧肽酶原B复性液中，按照1U/ml，分别加入重组胰蛋白酶和猪胰蛋白酶，猪胰蛋白酶购自Sigma公司，分别于加入胰蛋白酶后0.5h，1h，2h，3h，4.5h和7h取样测定羧肽酶B的活性，同时留样电泳。
羧肽酶B活性的测定的方法如下：以马尿酰-L-精氨酸(Sigma)为底物，或根据Sigma规定的测定羧肽酶B的方法。
结果见图4，其中，泳道1为酶解前的羧肽酶原B的复性液，泳道2，4，6，8，10为重组胰蛋白酶酶解0.5h，1h，2h，3h，4.5h和7h后的电泳结果；泳道3，5，7，9，11为猪胰蛋白酶酶解0.5h，1h，2h，3h，4.5h和7h后的电泳结果。
表4为前述制备的重组胰蛋白酶(Htry)和猪胰蛋白酶(Ptry)用于重组羧肽酶原B激活的比较，由表4的结果可知，无论任何时间点，重组胰蛋白酶的激活所得的羧肽酶B的活性总是高于猪胰蛋白酶激活所得，总体可提高羧肽酶B的收率20％。这是由重组胰蛋白酶具备高活性以及高纯度，其不含任何其它蛋白酶活性。
表4重组胰蛋白酶和猪胰蛋白酶用于重组羧肽酶原B激活的比较
| 时间(h) | 0 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 4.5 | 5.5 | 7 | 24 |
| Ptry酶解后复性液酶活(U/ml) | 0 | 0.2 | 0.32 | 0.77 | 1.59 | 1.76 | 1.92 | 3.84 | 4.17 | 3.33 | 4.34 |
| Htry酶解后复性液酶活(U/ml) | 0 | 0.24 | 0.36 | 0.91 | 1.67 | 2.09 | 2.42 | 4.67 | 4.17 | 4.51 | 5.18 |
可见，本发明获得的重组胰蛋白酶可很好地激活重组羧肽酶原B，得到具有活性的羧肽酶B，比相应酶活的猪胰蛋白酶提高羧肽酶B的收率20％，这是由重组胰蛋白酶的高活性以及高纯度所贡献，其不含任何其它蛋白酶活性。
实施例6、N端氨基酸序列不同的融合蛋白
1、融合蛋白2(N端27个氨基酸+人胰蛋白酶原)
设计如下用于制备融合蛋白的氨基酸序列：
27个氨基酸序列的N-端序列(SEQ ID NO：2)：
MKETAAAKFE RQHMDSPDLG TLVPRGS
根据常规方法，将上述氨基酸序列连接于胰蛋白酶原的N端，形成融合蛋白2。
采用与实施例1和实施例2相同的方法对上述融合蛋白进行表达和纯化。
融合蛋白2几乎全部以包涵体形式表达，即使优化表达条件，如降低温度等亦不能使其可溶性表达。
2、融合蛋白3(N端109个氨基酸+人胰蛋白酶原)
设计如下用于制备融合蛋白的氨基酸序列：
109个氨基酸序列的N-端序列(SEQ ID NO：3)：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA
其中，含有的天冬氨酸数目为11个。
根据常规方法，将上述氨基酸序列连接于胰蛋白酶原的N端，形成融合蛋白3。
采用与实施例1和实施例2相同的方法对上述融合蛋白进行表达和纯化(CaCl2洗脱)，利用猪胰腺胰蛋白酶对获得的融合蛋白3进行激活，以获得重组胰蛋白酶。
3、融合蛋白4(N端109个氨基酸+人胰蛋白酶原)
设计如下用于制备融合蛋白的氨基酸序列：
109aa个氨基酸序列的N-端序列(SEQ ID NO：4)：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWSGPSKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA
该序列与SEQ ID NO：3的序列的不同在于其中半胱氨酸C突变为丝氨酸S。
根据常规方法，将上述氨基酸序列连接于胰蛋白酶原的N端，形成融合蛋白4。
采用与实施例1和实施例2相同的方法对上述融合蛋白进行表达和纯化(CaCl2洗脱)，利用猪胰腺胰蛋白酶对获得的融合蛋白3进行激活，以获得重组胰蛋白酶。
4、融合蛋白5(N端44个氨基酸+人胰蛋白酶原)
设计如下用于制备融合蛋白的氨基酸序列：
44个氨基酸序列的N-端序列(SEQ ID NO：5)：
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKA
根据常规方法，将上述氨基酸序列连接于胰蛋白酶原的N端，形成融合蛋白5。
采用与实施例1和实施例2相同的方法对上述融合蛋白进行表达和纯化(CaCl2洗脱)，利用猪胰腺胰蛋白酶对获得的融合蛋白3进行激活，以获得重组胰蛋白酶。
5、上述含不同前导序列的胰蛋白酶原经表达、纯化、激活后的酶活
如前述实施例3方法测定上述含不同前导序列的胰蛋白酶原经表达、纯化(CaCl2洗脱)、激活后的酶活。测定条件为：CaCl2洗脱后的样品在4℃下酶解25小时，测定重组胰蛋白酶的活性。
结果如表5。可见实施例1的融合蛋白以及融合蛋白3、4具有很高的酶活性。并且，SEQ ID NO：4的序列中相对于SEQ ID NO：3，半胱氨酸C突变为丝氨酸S，这有利于显著提高所获得的重组胰蛋白酶的酶活性。
表5
| 激活后的最高酶活(U/mg) | |
| 实施例1的融合蛋白 | 1050 |
| 融合蛋白3 | 1150 |
| 融合蛋白4 | 1500 |
| 融合蛋白5 | 45 |
| 融合蛋白2 | 0 |
实施例7、冻干过程中保护剂的作用
对前述获得的重组胰蛋白酶(实施例1-3的方法获得)进行冻干处理，具体方法为样品进行超滤浓缩，然后加入相应浓度的保护剂后，冻干。
结果如表6所示，可见5％(w/v)的山梨醇对酶活的保护效果最好，还有促进酶活的效果。表6中“山”表示山梨醇，“海”表示海藻糖，“甘”表示甘露糖，其中的百分比是重量/体积比(w/v)。
表6冻干过程中保护剂的作用
| 未加 | 山梨醇2％ | 山梨醇5％ | 甘露糖2％ | 甘露糖5％ | 海藻糖2％ | 海藻糖5％ | 山+海2％ | 甘+海2％ | 山+甘2％ | |
| 冻干前 | 2600 | 2400 | 2000 | 2500 | 2300 | 2400 | 2400 | 2200 | 2800 | 2000 |
| 冻干后 | 400 | 1500 | 2700 | 1300 | 1800 | 1300 | 2400 | 2000 | 2400 | 2100 |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海雅心生物技术有限公司
<120>一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用
<130>092935
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>159
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>多肽
<400>1
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Arg
115 120 125
Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His
130 135 140
Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
145 150 155
<210>2
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<212>PRT
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<221>MISC_FEATURE
<223>多肽
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Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
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Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala
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<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
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Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala
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<221>misc_feature
<223>引物
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<400>7
ccaagctttt aagagttagc agcga 25
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<213>智人(Homo Sapiens)
<400>8
Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>多肽
<400>9
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
Claims (9)
1.一种生产重组胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)重组表达融合蛋白，所述的融合蛋白序列从N端到C端依次包括：40-200个氨基酸序列、胰蛋白酶原序列；其中，所述的40-200个氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；和
(2)切除融合蛋白N端的所述的40-200个氨基酸序列以及前导序列，获得重组胰蛋白酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的40-200个氨基酸序列中包括选自下组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，用肠激酶或胰蛋白酶处理(1)获得的融合蛋白，从而切除融合蛋白N端的所述的40-200个氨基酸序列以及前导序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用大肠杆菌重组表达融合蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)之间，还包括步骤：纯化重组表达获得的融合蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，采用离子交换层析法纯化所述的融合蛋白，用CaCl2溶液洗脱。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(3)，利用5±1％(w/v)的山梨醇作为保护剂，冻干处理所获得的重组胰蛋白酶。
8.一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白序列从N端到C端依次包括：40-200个氨基酸序列、胰蛋白酶原序列；其中，所述的40-200个氨基酸序列是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
9.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求8所述的融合蛋白。
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