CN101622269A - 蛋白质在大肠杆菌中的表达 - Google Patents

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CN101622269A CN200880006757A CN200880006757A CN101622269A CN 101622269 A CN101622269 A CN 101622269A CN 200880006757 A CN200880006757 A CN 200880006757A CN 200880006757 A CN200880006757 A CN 200880006757A CN 101622269 A CN101622269 A CN 101622269A
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Abstract

提供了质粒，包含编码序列MX1(X2X3)n的肽标签的DNA标签，X1代表K或R；X2代表M、S或T；X3代表K或R；n代表1或更大的整数；以及其中所述DNA可操作性地连接到启动子序列。

Description

蛋白质在大肠杆菌中的表达
发明背景
重组蛋白质表达系统便于蛋白质、多肽和肽的生产，所述蛋白质、多肽和肽被用作生物药物或作为多种应用的药物筛选中的靶。细菌表达系统已经成为优选的备选方法，主要是由于在细菌中有效的和经济的生产，而酵母和杆状病毒提供了可靠的可选择的表达系统。
尽管重组表达系统用于异源蛋白质生产用途广泛，不能依靠现有的方法来以足够的数量生产任何给定的蛋白质并具有足够的同质性以满足下游需求。许多哺乳动物蛋白质在细菌中以低产量表达并具有相当差的溶解度。同时，它们对于细菌细胞是有毒的，特别是如果它们是部分可溶的。许多载体系统被设计来表达目标重组蛋白质，所述目标重组蛋白质作为与短的或更长的N-末端肽标签的融合蛋白。  这些标签的实例有组氨酸标签或麦芽糖结合标签，其对于随后重组蛋白质的纯化是特别有用的。然而仍然存在着对有效的表达系统的需求，特别是对于治疗性蛋白质，这些蛋白质是潜在毒性的并且难以表达。由于蛋白质产量很大程度依赖于转录和翻译起始，这样的系统应当具有N-末端标签，其赋予高产量并赋予具有低溶解性的融合蛋白，因为包涵体一般被宿主好得多地耐受。并且，对于天然蛋白质的生产，导入的标签应当是容易切割的。
发明概述
本发明提供了自我复制的DNA质粒，用于在微生物宿主细胞中N-末端标签化的蛋白质的重组表达，包含DNA标签，所述DNA标签具有编码式[I]的肽标签的核苷酸序列
MX1(X2X3)n
   [I]
其中
X1代表K或R；
X2代表M、S或T；
X3代表K或R；
n代表1或更大的整数；
以及其中所述DNA可操作性地连接到启动子序列。
根据本发明的质粒可以进一步包含核酸序列，所述核酸序列编码按照阅读框与所述DNA标签融合的蛋白质，用于由融合到所述DNA标签的所述核酸所编码的N-末端标签化的蛋白质的重组表达。
本发明提供了包含本发明的DNA质粒的微生物宿主细胞。
在一个实施方式中，本发明提供了标签化的蛋白质，其包含与蛋白质融合的N-末端肽标签，其中所述标签具有根据式I的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了在微生物宿主细胞中重组表达N-末端标签化的蛋白质的方法，包括构建重组质粒的步骤，包括将编码蛋白质的DNA序列按阅读框插入根据本发明的质粒的DNA标签的3’，以及将所述重组质粒导入宿主微生物细胞，并诱导所述N-末端标签化的蛋白质在微生物宿主细胞中表达。
附图的说明
附图1：标签去除以产生成熟的hIL-21的效力和完成通过质谱法确定，如附图1，A和B所示。A栏显示了在标签去除之前的级分的Maldi谱。B栏显示了在标签去除之后的相同级分。
附图2：2A：在MKMK-IL21的DAP/Q-环化酶处理之前的Maldi质谱。具有15948Da的值的单电荷的分子离子，与完整的MKMK-IL21相应。2B：在MKMK-IL21的DAP/Q-环化酶处理之后的Maldi质谱。具有15423Da的值的单电荷的分子离子，与具有N-末端焦谷氨酸残基的IL21相应。没有观察到相应于完整MKMK-IL21的信号。
附图3：3A：在MKSK-IL21的DAP/Q-环化酶处理之前的Maldi质谱。具有15911.6Da的值的单电荷的分子离子，与完整的MKSK-IL21相应。3B：在MKSK-IL21的DAP/Q-环化酶处理之后的Maldi质谱。具有15429Da的值的单电荷的分子离子，与具有N-末端焦谷氨酸残基的IL21相应。没有观察到相应于完整MKSK-IL21的信号。
附图4：4A：在MKTK-IL21的DAP/Q-环化酶处理之前的Maldi质谱。具有15933.6Da的值的单电荷的分子离子，与完整的MKTK-IL21相应。4B：在MKTK-IL21的DAP/Q-环化酶处理之后的Maldi质谱。具有15430.9Da的值的单电荷的分子离子，与具有N-末端焦谷氨酸残基的IL21相应。没有观察到相应于完整MKTK-IL21的信号。
缩写：
氨基酸：丙氨酸(A)；精氨酸(R)；天冬酰胺(N)；天冬氨酸(D)；半胱氨酸(C)；甘氨酸(G)；谷氨酰胺(Q)；谷氨酸(E)；组氨酸(H)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；赖氨酸(K)；甲硫氨酸(M)；苯丙氨酸(F)；脯氨酸(P)；丝氨酸(S)；苏氨酸(T)；色氨酸(W)，酪氨酸(Y)；缬氨酸(V)C-末端：包含一个或更多个氨基酸残基的、蛋白质的羧基(C)-末端部分。
hIL-21：人类白细胞介素-21
N-末端：包含一个或更多个氨基酸残基的、蛋白质的氨基(N)-末端部分。
SDS PAGE：十二烷基(月桂基)硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶
发明描述
本发明提供了适合于异源蛋白质的重组表达的DNA标签、表达载体或质粒，以及用于重组蛋白质表达的方法，其与随后的重组蛋白质的纯化、重组蛋白质的最后加工以按它的天然和活性形式回收蛋白质是相容的。
根据本发明表达的具有N-末端标签的蛋白质具有低溶解度，并将优选地表达到包涵体内，其一般被宿主好得多地耐受。
在一个实施方式中，本发明提供了自我复制的DNA质粒，用于在微生物宿主细胞中N-末端标签化的蛋白质的重组表达，所述质粒包含DNA标签，所述DNA标签具有编码式[I]的肽标签的核苷酸序列
MX1(X2X3)n
   [I]
其中
X1代表K或R；
X2代表M、S或T；
X3代表K或R；
n代表1或更大的整数；
以及其中所述DNA标签可操作性地连接到启动子序列。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在此可互换地使用，应当认为是指由通过肽键连接的至少五个组成氨基酸组成的化合物。组成氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸的组，它们可以是不由遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不由遗传密码编码的天然氨基酸有例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的氨基酸包括通过化学合成制造的氨基酸，即，由遗传密码编码的氨基酸的D-同分异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(a-氨基异丁酸)、Abu(a-氨基丁酸)、Tle(叔-丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸和邻氨基苯甲酸。
如在此使用的，术语“DNA标签”被定义为编码N-末端蛋白质标签的DNA分子，其被添加到编码异源蛋白质的DNA序列上，它在微生物中按阅读框表达产生标签化的蛋白质或融合蛋白质。本发明的DNA标签编码具有至少四个氨基酸并包含如式I定义的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方式中，X1代表K。在一个实施方式中，X1代表R。
在一个实施方式中，X2代表M或S。在一个实施方式中，X2代表M或T。在一个实施方式中，X2代表S或T。在一个实施方式中，X2代表M。在一个实施方式中，X2代表S。在一个实施方式中，X2代表T。
在一个实施方式中，X3代表K。在一个实施方式中，X3代表R。
在一个实施方式中，n是1到10的整数。在一个实施方式中，n是1到9的整数。在一个实施方式中，n是1到8的整数。在一个实施方式中，n是1到7的整数。在一个实施方式中，n是1到6的整数。在一个实施方式中，n是1到5的整数。在一个实施方式中，n是1到4的整数。在一个实施方式中，n是1到3的整数。在一个实施方式中，n是1到2的整数。在一个实施方式中，n是1。在一个实施方式中，n是2。在一个实施方式中，n是3。
如在实施例中说明的，与编码融合到N-末端甲硫氨酸的蛋白质的对照序列相比，包含按阅读框融合到蛋白质的编码序列的、本发明的DNA标签的DNA序列的表达，促成了显著更高水平的蛋白质表达。虽然不希望受理论的限制，相信的是，如果表达的蛋白质以对宿主细胞新陈代谢或生长无毒的形式积累，例如在包涵体中，宿主微生物细胞特别是大肠杆菌(E.coli)细胞中重组蛋白质表达被增强。因而，融合到重组蛋白质的选定的N-末端蛋白质标签可以通过促进它们在包涵体中的积累来增强它们的表达。
许多感兴趣的哺乳动物蛋白质在它们的天然宿主中被分泌，并伴有信号肽地被合成，信号肽在分泌期间被切除。因而分泌的成熟蛋白质的N-末端在大多数情况下以不同于甲硫氨酸的氨基酸开始，甲硫氨酸是大肠杆菌中所有从头合成的蛋白质，包括异源的、细胞内积累的蛋白质的天然的N-末端。为了避免关于N-末端甲硫氨酸的切割的不确定性，添加如所描述的、具有已知的体外切割性质的小的肽标签，在获得感兴趣的成熟蛋白质方面是高度有益的。
本发明提供的DNA标签可以添加到编码蛋白质的DNA序列上，为了它在宿主微生物细胞特别是细菌细胞中的重组表达。DNA标签在很大数量的有用蛋白质在宿主微生物细胞中的重组表达方面具有应用，特别是对于治疗性蛋白质，例如人生长激素、IL-20、IL-21和GLP-1的表达。编码N-末端肽标签的DNA标签按阅读框与编码要表的蛋白质的DNA序列融合，从而在宿主细胞中可获得的表达产物是标签化的或融合蛋白质。如果DNA标签编码超过四个氨基酸的N-末端肽标签，所述肽标签可以通过添加二肽来延长，它的氨基酸组成适合于通过二氨基肽酶，例如，二肽基氨肽酶I来切割它们。表达的标签化的或融合蛋白质可以包含直接融合到要表达的成熟蛋白质的第一氨基酸的肽标签，从而所述肽标签的切割以及二肽的去除将所表达的蛋白质以它的成熟形式释放。如果表达的标签化的或融合蛋白质的肽标签通过氨肽酶被除去，希望的是确保表达的蛋白质的成熟形式的氨基酸序列以一残基开始或前面是所述残基，所述残基可以作为终止点起作用，超过该终止点氨肽酶不能继续。这样，表达的蛋白质的成熟形式被保护免于N-末端蛋白水解切割。可以作为二氨基肽酶的终止点的适合的氨基酸残基可以选自Q、P、R、K。氨基酸残基Q可以用作终止点，凭借它在存在谷氨酸环转移酶的情况下形成焦谷氨酸的能力。如果成熟蛋白质的N-末端氨基酸本身不是可以作为终止点起作用的残基，希望的是通过编码适合的终止残基的密码子延伸DNA标签，其然后融合到编码期望的成熟蛋白质的DNA序列上。要添加到肽标签的末端的优选的终止残基是Q，因为这个残基可以在肽标签的二肽基氨肽酶切割之后用焦谷氨酰氨肽酶从表达的蛋白质的N-末端除去。
当按阅读框融合到要重组表达的蛋白质的编码序列时本发明的DNA标签提供了标签化的蛋白质，其肽标签具有带电极性侧链的优势。在标签化蛋白质中额外的带电残基的存在在随后的纯化步骤中是特别有用的，所述纯化步骤在蛋白质质量电荷的基础上进行区分。
根据本发明的DNA标签可以按阅读框融合到编码hIL-21的DNA序列。在本发明的一个实例中，根据本发明的DNA标签按阅读框融合到编码hIL-21、具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的DNA分子。可以选择其他限制性位点，相应地调整序列处于本领域的技术人员的能力范围之内。
在一个方面，本发明提供了包含编码本发明的肽标签的DNA标签的表达载体或表达质粒。所述DNA标签可以插入载体或质粒的适合的克隆位点的邻近或其中，从而所述标签位于启动子序列的下游并与之可操作地连接。优选的，所述DNA标签侧翼是限制性酶切割位点，其促进编码要重组表达的蛋白质的DNA序列的下游地按阅读框地插入。本领域技术人员将容易识别适合的优选侧翼序列，以促进期望的蛋白质的编码序列的下游按阅读框克隆。与本发明的DNA标签可操作地连接的，本发明的质粒或载体中的启动子序列具有能够指导编码标签化蛋白质的DNA分子在选定的宿主微生物细胞中的转录的核苷酸序列。适合于在细菌中特别是在大肠杆菌中重组蛋白质表达的启动子序列是本领域技术人员公知的，但包括T7、trc、lac和tac启动子的任一种。包含了表达盒的优选的载体是自我复制性的，并具有可选择标记物，例如氨苄西林，所述表达盒包含与本发明的DNA标签可操作地连接的启动子。
在一个实施方式中，本发明的表达载体或表达质粒进一步包含编码要重组表达的蛋白质的DNA序列，其中所述DNA序列克隆到所述DNA标签下游并与所述DNA标签按阅读框地克隆。在一个实例中，克隆到表达质粒中的DNA序列是编码hIL-21的序列，当所述表达质粒被导入适合的宿主细胞中时其能够表达为标签化的蛋白质。在本发明的表达载体或表达质粒中编码hIL-21的DNA序列可以包含SEQ IDNO：4的核苷酸序列。
适合于标签化蛋白质的表达的、要用本发明的表达质粒载体转化的宿主细胞是本领域技术人员公知的。优选的细菌宿主菌株是大肠杆菌B的衍生菌株，例如，蛋白酶缺陷的菌株大肠杆菌BL21(DE3)，其在染色体上带有T7聚合酶基因。
本发明提供了标签化的蛋白质，其包含与蛋白质融合的N-末端肽标签，其中所述标签包含式[I]的氨基酸序列
MX1(X2X3)n
   [I]
其中
X1代表K或R；
X2代表M、S或T；
X3代表K或R；以及
n代表1或更大的整数。
在一个实施方式中，X1代表K。在一个实施方式中，X1代表R。
在一个实施方式中，X2代表M或S。在一个实施方式中，X2代表M或T。在一个实施方式中，X2代表S或T。在一个实施方式中，X2代表M。在一个实施方式中，X2代表S。在一个实施方式中，X2代表T。
在一个实施方式中，X3代表K。在一个实施方式中，X3代表R。
在一个实施方式中，n是1到10的整数。在一个实施方式中，n是1到9的整数。在一个实施方式中，n是1到8的整数。在一个实施方式中，n是1到7的整数。在一个实施方式中，n是1到6的整数。在一个实施方式中，n是1到5的整数。在一个实施方式中，n是1到4的整数。在一个实施方式中，n是1到3的整数。在一个实施方式中，n是1到2的整数。在一个实施方式中，n是1。在一个实施方式中，n是2。在一个实施方式中，n是3。
在一个实施方式中，所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述肽标签不是MKMK、MKTK或MKSK。
根据本发明的标签化蛋白质可以通过本发明的表达质粒或表达载体的重组表达来获得。标签化蛋白质可以经历在此描述的纯化步骤，和/或一个或更多个蛋白水解加工步骤，用于从标签化蛋白质上除去肽标签以提供具有一种或更多种应用的成熟蛋白质。
本发明进一步提供了用于在宿主微生物细胞中标签化蛋白质的重组表达的方法，所述标签化蛋白质由按阅读框融合到编码序列的本发明的DNA标签所编码，从而所述融合的DNA序列编码所述标签化蛋白质，以改善表达的目标蛋白质的产率。因此，所述方法包括构建编码融合蛋白的表达质粒或表达载体的步骤，所述融合蛋白包含融合到蛋白质的N-末端肽，从而所述编码序列由终止密码子来终止。标签化蛋白质的表达由与标签化蛋白质的编码序列可操作地连接的启动子来指导，由此所述启动子是所述宿主细胞的表达系统所识别的启动子。根据本发明的一个实施方式，用于hIL-21的表达的表达载体的构建在实施例1中描述。
本发明的表达载体或表达质粒被转染到宿主微生物细胞、优选的细菌大肠杆菌中，被载体转化的宿主细胞在与宿主细胞的增殖和标签化蛋白质的表达相容的条件下鉴定、分离和培养。
本发明的标签化蛋白质在宿主微生物细胞中的表达优选的是可诱导的。例如，当宿主细胞是大肠杆菌菌株时，表达被lac操纵子调节，表达可以通过添加解除lac启动子抑制的约0.5-1mM的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导。在通过IPTG适合的诱导之后，例如3-4小时，宿主细胞可以被裂解，例如通过超声处理或冻融操作，通过离心将细胞溶胞产物分离成可溶的和不溶的级分。标签化蛋白质，取决于它的溶解度，可以位于可溶级分中，或更优选的位于与细胞团粒一起分级分离的包涵体中。
当标签化蛋白质位于包涵体中时，在它的进一步纯化之前，溶解和重折叠步骤可能是需要的，采用根据本领域公知的方案为标签化蛋白质优化的条件。可以采用各种各样的蛋白质分离和纯化方案来实现需要的纯化程度。测定本发明的纯化的标签化蛋白质和随后衍生的成熟蛋白质的纯度的方法是本领域公知的，在实施例2中进行了例示。
从本发明的标签化蛋白质上除去肽标签可以采用二肽基氨肽酶，如果终止残基是Q，其可以与谷氨酰胺环转移酶组合。标签的除去可以在本发明的重组表达的蛋白质的纯化之前或之后进行。
以下是本发明的实施方式的列表，其不应被看作是限制性的。
实施方式1：自我复制的DNA质粒，用于在微生物宿主细胞中N-末端标签化的蛋白质的重组表达，所述质粒包含DNA标签，所述DNA标签具有编码式[I]的肽标签的核苷酸序列
MX1(X2X3)n
    [I]
其中
X1代表K或R；
X2代表M、S或T；
X3代表K或R；
n代表1或更大的整数；
以及其中所述DNA标签可操作地连接到启动子序列。
实施方式2：根据实施方式1的DNA质粒，其中X1代表K。
实施方式3：根据实施方式1的DNA质粒，其中X1代表R。
实施方式4：根据实施方式1到3的任一项的DNA质粒，其中X2代表M或S。
实施方式5：根据实施方式1到3的任一项的DNA质粒，其中X2代表M或T。
实施方式6：根据实施方式1到3的任一项的DNA质粒，其中X2代表S或T。
实施方式7：根据实施方式1到3的任一项的DNA质粒，其中X2代表M。
实施方式8：根据实施方式1到3的任一项的DNA质粒，其中X2代表S。
实施方式9：根据实施方式1到3的任一项的DNA质粒，其中X2代表T。
实施方式10：根据实施方式1到9的任一项的DNA质粒，其中X3代表K。
实施方式11：根据实施方式1到9的任一项的DNA质粒，其中X3代表R。
实施方式12：根据实施方式1到11的任一项的DNA质粒，其中n是1。
实施方式13：根据实施方式1到11的任一项的DNA质粒，其中n是2。
实施方式14：根据实施方式1到11的任一项的DNA质粒，其中n是3。
实施方式15：根据实施方式1到14的任一项的质粒，进一步包含核酸序列，所述核酸序列编码按阅读框与所述DNA标签融合的蛋白质，用于由融合到所述DNA标签的所述核酸序列编码的N-末端标签化的蛋白质的重组表达。
实施方式16：根据实施方式15的质粒，其中与没有所述肽标签的蛋白质的表达相比，通过使用所述质粒的蛋白质的表达被提高。
实施方式17：根据实施方式15或16的质粒，其中与没有所述肽标签的表达的蛋白质的溶解度相比，通过使用所述质粒表达的蛋白质的溶解度被降低。
实施方式18：根据实施方式15到17的任一项的质粒，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
实施方式19：根据实施方式15到18的任一项的质粒，其中所述编码蛋白质的核酸序列由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。
实施方式20：根据实施方式1到19的任一项的DNA质粒，条件是所述由DNA标签编码的肽标签不是MKMK、MKTK或MKSK。
实施方式21：包含根据实施方式1到20的任一项的质粒的微生物宿主细胞。
实施方式22：根据实施方式21的微生物宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
实施方式23：标签化的蛋白质，其包含与蛋白质融合的N-末端肽标签，其中所述标签包含式[I]的氨基酸序列
MX1(X2X3)n
    [I]
其中
X1代表K或R；
X2代表M、S或T；
X3代表K或R；以及
n代表1或更大的整数。
实施方式24：根据实施方式23的标签化的蛋白质，其中X1代表K。
实施方式25：根据实施方式23的标签化的蛋白质，其中X1代表R。
实施方式26：根据实施方式23到25的任一项的标签化的蛋白质，其中X2代表M或S。
实施方式27：根据实施方式23到25的任一项的标签化的蛋白质，其中X2代表M或T。
实施方式28：根据实施方式23到25的任一项的标签化的蛋白质，其中X2代表S或T。
实施方式29：根据实施方式23到25的任一项的标签化的蛋白质，其中X2代表M。
实施方式30：根据实施方式23到25的任一项的标签化的蛋白质，其中X2代表S。
实施方式31：根据实施方式23到25的任一项的标签化的蛋白质，其中X2代表T。
实施方式32：根据实施方式23到31的任一项的标签化的蛋白质，其中X3代表K。
实施方式33：根据实施方式23到31的任一项的标签化的蛋白质，其中X3代表R。
实施方式34：根据实施方式23到33的任一项的标签化的蛋白质，其中n是1。
实施方式35：根据实施方式23到33的任一项的标签化的蛋白质，其中n是2。
实施方式36：根据实施方式23到33的任一项的标签化的蛋白质，其中n是3。
实施方式37：根据实施方式23到36的任一项的标签化的蛋白质，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
实施方式38：根据实施方式23到37的任一项的标签化的蛋白质，条件是所述肽标签不是MKMK、MKTK或MKSK。
实施方式39：在微生物宿主细胞中重组表达N-末端标签化的蛋白质的方法，包括步骤：
(a)构建重组质粒，包括将编码蛋白质的DNA序列按阅读框插入到根据实施方式1到14的任一项的质粒的DNA标签的3′，和
(b)将所述重组质粒导入宿主微生物细胞中，和
(c)诱导所述N-末端标签化的蛋白质在微生物宿主细胞中的表达。
实施方式40：提高蛋白质在微生物宿主细胞中的重组表达的方法，所述方法包括
(a)构建重组质粒，包括将编码蛋白质的DNA序列按阅读框插入到根据实施方式1到14的任一项的质粒的DNA标签的3′，和
(b)将所述重组质粒导入宿主微生物细胞中，和
(c)诱导所述N-末端标签化的蛋白质在微生物宿主细胞中的表达。
实施方式41：降低微生物宿主细胞中重组表达的蛋白质的溶解度的方法，所述方法包括
(a)构建重组质粒，包括将编码蛋白质的DNA序列按阅读框插入到根据实施方式1到14的任一项的质粒的DNA标签的3′，和
(b)将所述重组质粒导入宿主微生物细胞中，和
(c)诱导所述N-末端标签化的蛋白质在微生物宿主细胞中的表达。
实施方式42：根据实施方式39到41的任一项的方法，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
实施方式43：根据实施方式39到42的任一项的方法，其中编码蛋白质的DNA序列由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。
实施方式44：根据实施方式39到43的任一项的方法，条件是所述由质粒的DNA标签编码的肽标签不是MKMK、MKTK或MKSK。
所有在此引用的参考文献，包括公开物、专利申请和专利，通过完全引用合并在此，并且达到如同每个参考文献被单独地和特意地指明通过引用来合并、以及在此完全阐述的程度(法律所允许的最大程度)，不管在本文其他地方作出的、特定文件的任何单独提供的合并。
在描述本发明的上下文中术语“一”以及“该”和类似对象的使用被认为是覆盖了单数和复数，除非在此另有陈述或上下文明显抵触。例如，用语“该化合物”被理解为是指本发明或特别描述的方面的各种“化合物”，除非另有陈述。
除非另有陈述，在此提供的所有确切数值是相应的近似值的表示(例如，对于特定因素或度量来说提供的所有的确切示范性数值被认为还提供了相应的大略的度量，在合适时由“约”来修饰)。
对于一个元素或复数个元素使用术语如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的本发明任一方面或方面的在此的描述，是意图提供对“由......组成”、“基本上由......组成”或“基本上包含”所述特定元素或复数个元素的本发明的类似方面的支持，除非另有说明或上下文明显地抵触(例如，在此描述的组合物包含特定元素应当被理解为还描述了组合物由该元素组成，除非另有说明或上下文明显地抵触)。
总之，本发明提供了包含编码肽标签的DNA标签的表达载体或表达质粒，所述DNA标签与启动子可操作地连接，所述启动子能够指导所述DNA标签以及与所述DNA标签按阅读框融合的任何蛋白质编码序列在宿主微生物细胞中的表达。采用本发明的表达载体或表达质粒用于按阅读框融合到所述DNA标签的蛋白质编码序列的重组蛋白质表达的特别的优点是，在宿主细胞中的表达水平被显著地增强了。因而，当具有融合在N-末端的本发明的肽标签的蛋白质在微生物宿主细胞例如大肠杆菌中重组表达时，这种标签的存在大多数情况下增强表达，这是由于所述蛋白质的降低的溶解度和对宿主细胞的降低的毒性，并且它进一步满足了有效的重组蛋白质表达所需的许多其他重要的指标。特别是，它容许在标签的适当的切割之后蛋白质以它的成熟形式获得。此外，带电的标签所带来的总蛋白质电荷的改变帮助了蛋白质的纯化。
实施例
实施例1
标签化的人类白细胞介素-21的表达
对于表达和下游加工，为了比较各种小的N-末端标签，选择人类白细胞介素hIL-21作为目标蛋白质。编码蛋白质hIL-21的核酸分子是SEQ ID NO：1(Met hIL-21 Nde1-BamH1核苷酸序列)，其中分子的5′末端和3′末端分别具有Nde1-BamH1的限制性酶位点。
Met hIL-21 Nde1-BamH1核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示的hIL-21蛋白质序列。当在大肠杆菌中表达时，这个蛋白质在N-末端具有额外的甲硫氨酸。hIL21的这个形式被称为Met-hIL21。
一系列构建体根据以下方案来制成：
410碱基对DNA分子，编码hIL-21的成熟形式，相应于Met-hIL-21的氨基酸残基1-133，具有5′和3′末端的Sty1-BamH1位点，在SEQ IDNO：3中示出(hIL-21 sty1-BamH1核苷酸序列)。hIL-21 Sty1-BamH1核苷酸序列，从核苷酸2开始，包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的成熟的hIL-21蛋白质序列。
hIL-21 Sty1-BamH1分子连接到Nde1-BamH1消化的T7表达载体，5.6kb的pET-11c，与一系列连接物的任一种一起，每一个侧翼是5’Nde1位点和3’Sty1相容位点，在表1中列出。
表1
  构建体的名称   标签的氨基酸序列   表达水平   标签的DNA序列＊
  Met hIL-21   (M)   1-2   无标签
  DAP 21   MKMK(SEQ ID No.6)   4   5′T ATG AAA ATG AAA 3′[SEQ ID No：5]AC TTT TAC TTT GTT C
DAP 23   MKSK(SEQ ID No.8) 6   5′T ATG AAA AGC AAA 3′[SEQ ID No：7]AC TTT TCG TTT GTT C
DAP 24   MKTK(SEQ ID No.10) 4   5′T ATG AAA ACC AAA 3′[SEQ ID No：9]AC TTT TGG TTT GTT C
包含含有DNA标签的连接物、所述DNA标签按阅读框连接到DNA分子hIL-21 Sty1-BamH1的T7表达载体pET-11c转化到宿主细胞大肠杆菌B BL21(DE3)中。
用每种T7表达载体转化的宿主细胞菌株在37℃补充有氨苄西林0.2mg/l的LB培养基中生长，来自T7表达载体的重组蛋白质表达用0.5mM IPTG诱导3-4小时。宿主细胞通过离心来收获，裂解，然后离心样品来提供可溶级分和团粒化的包涵体级分。来自每个宿主细胞样品的总细胞提取物、包涵体和可溶细胞级分然后通过SDS PAGE分离，凝胶用Comassie蓝染色来测定标签化hIL-21蛋白质表达的水平，与未标签化的蛋白质Met hIL-21比较。
hIL-21的各种标签化形式的表达水平取决于标签的氨基酸序列，如表1所示，但是在某些情况下它还取决于核苷酸序列，即，mRNA中的二级结构。对密码子进行调整以避免可能遭遇的二级结构难题是本领域的技术人员能力之内的。表1说明了两点：表达水平一般通过添加特定的肽标签来提高，hIL-21的溶解度被降低，从而保护了大肠杆菌宿主细胞免于hIL-21的毒性影响。并且，溶解度降低帮助了hIL-21分配到包涵体中，从而便于它随后的纯化。
实施例2
重组表达的标签化人类白细胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。
利用构建体DAP 17表达的MKHK-hIL-21如WO 04/55168中公开的从包涵体中重折叠，随后采用Sepharose SP柱层析纯化到大约90-95％纯度。相应于MKHK-hIL-21的单个主要多肽条带通过从Sepharose SP柱获得的级分的SDS-PAGE分析检测到，级分的库，如泳道4-10中所示，随后进行二肽基氨肽酶(DAPase)和谷氨酰胺环转移酶(Q环化酶)处理以进行四个氨基酸的N-末端肽标签的受控的去除。肽标签切割的条件是：27.5μM MKHK-IL21、67.5mU DAPase、5.5U Q环化酶、25mM Tris、0.15M NaCl、pH 7.0的水溶液，在环境温度(20-25℃)孵育90分钟，采用Qiagen.com提供的酶。
标签去除以产生成熟的hIL-21的效力和完成通过质谱法确定，如附图1，A和B所示。
A栏显示了在标签去除之前的级分的Maldi光谱。
B栏显示了在标签去除之后的相同级分。
天然hIL21具有15433Da的分子量，而MKHK-IL21具有15975Da的分子量。如在B栏中观察到的，切割和标签去除是大约90％完成的。
实施例3
重组表达的MKMK标签化的人类白细胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。
利用构建体DAP21表达的MKMK-hIL-21如WO200455168中公开的从包涵体中重折叠，随后采用TosoHaas sp 550c柱层析纯化到大约90-95％纯度。相应于MKMK-hIL-21的单个主要多肽条带通过从TosoHaas sp 550c柱获得的级分的SDS-PAGE分析检测到，级分的库随后进行二肽基氨肽酶(DAPase)和谷氨酰胺环转移酶(Q环化酶)处理以进行四个氨基酸的N-末端肽标签的受控的去除。肽标签切割的条件是：2mg/ml MKMK-IL21、在25mM Tris、0.15M NaCl、pH 7.0中800∶1∶32摩尔比的MKMK-IL21∶DAPase∶Q环化酶的水溶液，在环境温度(20-25℃)孵育30分钟，采用Qiagen.com提供的酶。
标签去除以产生成熟的hIL-21的效力和完成通过质谱法确定，如附图2，A和B所示。A栏显示了在标签去除之前的级分的Maldi光谱。B栏显示了在标签去除之后的相同级分。
具有N-末端焦谷氨酸的天然hIL21具有15442Da的分子量，而MKMK-IL21具有15978Da的分子量。如在B栏中观察到的，切割和标签去除是完全的。
实施例4
重组表达的MKSK标签化的人类白细胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。
利用构建体DAP23表达的MKSK-hIL-21如WO200455168中公开的从包涵体中重折叠，随后采用TosoHaas sp 550c柱层析纯化到大约90-95％纯度。相应于MKSK-hIL-21的单个主要多肽条带通过从TosoHaas sp 550c柱获得的级分的SDS-PAGE分析检测到，级分的库随后进行二肽基氨肽酶(DAPase)和谷氨酰胺环转移酶(Q环化酶)处理以进行四个氨基酸的N-末端肽标签的受控的去除。肽标签切割的条件是：2mg/ml MKSK-IL21、在25mM Tris、0.15M NaCl、pH 7.0中800∶1∶32摩尔比的MKSK-IL21∶DAPase∶Q环化酶的水溶液，在环境温度(20-25℃)孵育30分钟，采用Qiagen.com提供的酶。
标签去除以产生成熟的hIL-21的效力和完成通过质谱法确定，如附图3，A和B所示。A栏显示了在标签去除之前的级分的Maldi光谱。B栏显示了在标签去除之后的相同级分。
具有N-末端焦谷氨酸的天然hIL21具有15442Da的分子量，而MKSK-IL21具有15934Da的分子量。如在B栏中观察到的，切割和标签去除是完全的。
实施例5
重组表达的MKTK标签化的人类白细胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。
利用构建体DAP24表达的MKTK-hIL-21如WO 04/55168中公开的从包涵体中重折叠，随后采用TosoHaas sp 550c柱层析纯化到大约90-95％纯度。相应于MKTK-hIL-21的单个主要多肽条带通过从TosoHaas sp 550c柱获得的级分的SDS-PAGE分析检测到，级分的库随后进行二肽基氨肽酶(DAPase)和谷氨酰胺环转移酶(Q环化酶)处理以进行四个氨基酸的N-末端肽标签的受控的去除。肽标签切割的条件是：2mg/ml MKTK-IL21、在25mM Tris、0.15M NaCl、pH 7.0中800∶1∶32摩尔比的MKTK-IL21∶DAPase∶Q环化酶的水溶液，在环境温度(20-25℃)孵育30分钟，采用Qiagen.com提供的酶。
标签去除以产生成熟的hIL-21的效力和完成通过质谱法确定，如附图4，A和B所示。A栏显示了在标签去除之前的级分的Maldi光谱。B栏显示了在标签去除之后的相同级分。
具有N-末端焦谷氨酸的天然hIL21具有15442Da的分子量，而MKTK-IL21具有15948Da的分子量。如在B栏中观察到的，切割和标签去除是完全的。
药理学方法
分析(I)BAF-3分析来测定IL-21活性
BAF-3细胞(来自骨髓的鼠前B淋巴样细胞系)的生长和存活原始是IL-3依赖性的。IL-3活化JAK-2和STAT，其是在刺激时IL-21活化的相同的介体。在人类IL-21受体的转染之后，细胞系被转变成IL-21依赖性细胞系。这个克隆可以用于评估IL-21样品对BAF-3细胞的存活的影响。
BAF-3细胞在饥饿培养基(没有IL-21的培养基)中在37℃、5％CO2中生长24小时。
洗涤细胞并重悬浮在饥饿培养基中，并接种到平板上。10μl的IL-21化合物、不同浓度的人IL-21作为对照添加给细胞，平板在37℃、5％CO2孵育68小时。
Figure A20088000675700221
添加到每个反应孔，然后孵育细胞另外4小时。
Figure A20088000675700222
是氧化还原指示剂，被细胞代谢的天然反应还原，因而提供了活细胞数量的间接的度量。
最后，细胞的代谢活性在荧光平板读取器中测量。样品中的吸光度表示为未用生长激素化合物刺激的细胞或对照的％，从浓度-反应曲线可以计算活性(以50％刺激细胞的化合物的数量)。
在利用IL-21受体的这种分析中测试的，本发明的构建体的生物学活性显示了，来自所有构建体的切割的天然IL-21的效力等同于通过WO200455168中描述的方法产生的Met-IL21。
序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<120>蛋白质在大肠杆菌中的表达
<130>7614.204-WO
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>423
<212>DNA
<213>智人
<400>1
catatgcaag gtcaagatcg ccacatgatt agaatgcgtc aacttataga tattgttgat   60
cagctgaaaa attatgtgaa tgacctggtt ccggaattcc tgccggctcc ggaagatgtt  120
gagaccaact gtgagtggtc cgctttctcc tgtttccaga aagcccagct gaaatccgca  180
aacaccggta acaacgaacg tatcatcaac gtttccatta aaaaactgaa acgtaaaccg  240
ccgtccacca acgcaggtcg tcgtcagaaa caccgtctga cctgcccgtc ctgtgattct  300
tatgagaaaa aaccgccgaa agaattcctg gaacgtttca aatccctgct gcagaaaatg  360
attcaccagc acctgtcctc tcgtacccac ggttccgaag attcctgatg atttggcgga  420
tcc                                                                423
<210>2
<211>133
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1               5                   10                  15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
            20                  25                  30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
        35                  40                  45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
    50                  55                  60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65                  70                  75                  80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
                85                  90                  95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
            100                 105                 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
        115                 120                 125
Gly Ser Glu Asp Ser
    130
<210>3
<211>418
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>hIL-21 Sty1-BamH1核苷酸序列
<400>3
ccaaggtcaa gatcgccaca tgattagaat gcgtcaactt atagatattg ttgatcagct   60
gaaaaattat gtgaatgacc tggttccgga attcctgccg gctccggaag atgttgagac  120
caactgtgag tggtccgctt tctcctgttt ccagaaagcc cagctgaaat ccgcaaacac  180
cggtaacaac gaacgtatca tcaacgtttc cattaaaaaa ctgaaacgta aaccgccgtc  240
caccaacgca ggtcgtcgtc agaaacaccg tctgacctgc ccgtcctgtg attcttatga  300
gaaaaaaccg ccgaaagaat tcctggaacg tttcaaatcc ctgctgcaga aaatgattca  360
ccagcacctg tcctctcgta cccacggttc cgaagattcc tgatgatttg gcggatcc    418
<210>4
<211>405
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>hIL-21 Sty1-BamH1核苷酸序列，从核苷酸2开始
<400>4
Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Gly Cys Cys
1               5                   10                  15
Ala Cys Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala Gly Ala Ala Thr Gly Cys Gly
            20                  25                  30
Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala Thr Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr
        35                  40                  45
Gly Thr Thr Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala
    50                  55                  60
Ala Thr Thr Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr
65                  70                  75                  80
Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Thr Gly
                85                  90                  95
Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Gly Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Ala
        115                 120                 125
Gly Thr Gly Gly Thr Cys Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys
    130                 135                 140
Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Ala Ala
                165                 170                 175
Cys Ala Cys Cys Gly Gly Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Ala
            180                 185                 190
Cys Gly Thr Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr
        195                 200                 205
Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala
    210                 215                 220
Ala Cys Gly Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Cys Cys
225                 230                 235                 240
Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Thr Cys
                245                 250                 255
Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr
            260                 265                 270
Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr
        275                 280                 285
Gly Ala Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala
    290                 295                 300
Ala Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Thr
305                 310                 315                 320
Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala
                325                 330                 335
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala
            340                 345                 350
Thr Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr
        355                 360                 365
Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys Ala Cys
    370                 375                 380
Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Thr
385                 390                 395                 400
Gly Ala Thr Gly Ala
                405
<210>5
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>MKMK
<400>5
tatgaaaatg aaa                                                       13
<210>6
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>由SEQ ID No.5编码
<400>6
Met Lys Met Lys
1
<210>7
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>MKSK
<400>7
tatgaaaagc aaa                                                       13
<210>8
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>由SEQ ID No.7编码
<400>8
Met Lys Ser Lys
1
<210>9
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>MKTK
<400>9
tatgaaaacc aaa                                                       13
<210>10
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>由SEQ ID No.9编码
<400>10
Met Lys Thr Lys
1

Claims (17)

1.自我复制的DNA质粒，用于在微生物宿主细胞中N-末端标签化的蛋白质的重组表达，所述质粒包含DNA标签，所述DNA标签具有编码式[I]的肽标签的核苷酸序列
MX1(X2X3)n
[I]
其中
X1代表K或R；
X2代表M、S或T；
X3代表K或R；
n代表1或更大的整数；
以及其中所述DNA标签可操作性地连接到启动子序列。
2.根据权利要求1的DNA质粒，其中n是1、2或3。
3.根据权利要求1或权利要求2的质粒，进一步包含核酸序列，所述核酸序列编码按阅读框与所述DNA标签融合的蛋白质，用于由融合到所述DNA标签的所述核酸序列编码的N-末端标签化的蛋白质的重组表达。
4.根据权利要求3的质粒，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
5.根据权利要求3或权利要求4的质粒，其中所述编码蛋白质的核酸序列由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。
6.根据权利要求1到5的任一项的DNA质粒，条件是所述由DNA标签编码的肽标签不是MKMK、MKTK或MKSK。
7.包含根据权利要求1到6的任一项的质粒的微生物宿主细胞。
8.标签化的蛋白质，其包含与蛋白质融合的N-末端肽标签，其中所述标签包含式[I]的氨基酸序列
MX1(X2X3)n
[I]
其中
X1代表K或R；
X2代表M、S或T；
X3代表K或R；以及
n代表1或更大的整数。
9.根据权利要求8的标签化的蛋白质，其中n是1、2或3。
10.根据权利要求8或权利要求9的标签化的蛋白质，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
11.根据权利要求8到10的任一项的标签化的蛋白质，条件是所述肽标签不是MKMK、MKTK或MKSK。
12.在微生物宿主细胞中重组表达N-末端标签化的蛋白质的方法，包括步骤：
(a)构建重组质粒，包括将编码蛋白质的DNA序列按阅读框插入到根据权利要求1到2的任一项的质粒的DNA标签的3′，以及
(b)将所述重组质粒导入宿主微生物细胞中，和
(c)诱导所述N-末端标签化的蛋白质在微生物宿主细胞中的表达。
13.提高蛋白质在微生物宿主细胞中的重组表达的方法，所述方法包括
(a)构建重组质粒，包括将编码蛋白质的DNA序列按阅读框插入到根据权利要求1到2的任一项的质粒的DNA标签的3′，和
(b)将所述重组质粒导入宿主微生物细胞中，和
(c)诱导所述N-末端标签化的蛋白质在微生物宿主细胞中的表达。
14.降低微生物宿主细胞中重组表达的蛋白质的溶解度的方法，所述方法包括
(a)构建重组质粒，包括将编码蛋白质的DNA序列按阅读框插入到根据权利要求1到2的任一项的质粒的DNA标签的3′，和
(b)将所述重组质粒导入宿主微生物细胞中，和
(c)诱导所述N-末端标签化的蛋白质在微生物宿主细胞中的表达。
15.根据权利要求12到14的任一项的方法，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
16.根据权利要求12到15的任一项的方法，其中编码蛋白质的DNA序列由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。
17.根据权利要求12到16的任一项的方法，条件是所述由质粒的DNA标签编码的肽标签不是MKMK、MKTK或MKSK。
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