KR0133475B1

KR0133475B1 - 폴리펩타이드 전구체의 제조방법

Info

Publication number: KR0133475B1
Application number: KR1019940007018A
Authority: KR
Inventors: 신항철; 장승구; 김대영; 강성종
Original assignee: 김정재; 주식회사한일합섬
Priority date: 1994-04-04
Filing date: 1994-04-04
Publication date: 1998-04-21
Also published as: KR950029356A

Abstract

본 발명은 다음 일반식을 이용한 폴리펩타이드 또는 그 전구체의 효과적인 제조법에 관한 것이다.

A-L-B A: 융합파트너(베타-쉬이트 구조를 이루는 단백질의 전체 또는 부분의 아미노산 서열)

L: 링커(코돈을 맞추기 위해 넣어준 배열)

B: 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 전구체

더욱 상세히는, 본 발명은 특히 종양괴사인자의 전체 또는 일부분과 발현하고자 하는 폴리펩타이드로 구성된 융합단백질을 코우딩하는 유전인자, 유전인자를 포함하는 벡터, 그 벡터로 형질전환된 미생물, 그리고 융합단백질의 제조 및 정제법에 관한 것이다.

Description

폴리펩타이드 전구체의 제조방법

제1도는 플라스미드 pT7-T150 및 pT7-T57의 조립에 관한 개요를 나타낸 것이다.

제2도는 플라스미드 pT150-hPI 및 pT57-hPI의 조립에 관한 개요를 나타낸 것이다.

제3도는 플라스미드 pT150-sCT(Gly) 및 pT57-sCT(Gly)의 조립에 관한 개요를 나타낸 것이다.

제4도는 INF-프로인슐린 융합체를 시아노겐브로미드로 처리한 HPLC크로마토 그램이다. (a),(b),(c)는 각각 T150-hPI, T57-hPI, 그리고 T20-hPI를 시아노겐브로마이드로 처리한 크로마토그램들이다.

제5도는 TNF-칼시토닌(Gly)융합체를 시아노겐브로미드로 처리한 HPLC크로마토 그램이다. (a),(b)는 각각 T150-sCT(Gly), T57-sCT(Gly) 를 시아노겐브로마이드로 처리한 크로마토그램들이다.

A-L-B A : 융합파트너(베타-쉬이트 구조를 이루는 단백질의 전체 또는 부분의 아미노산 서열)

L : 링커(코돈을 맞추기 위해 넣어준 배열)

B : 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 전구체

본 발명은 특히 종양괴사인자의 전체 또는 일부분과 발현하고자 하는 폴리펩타이드로 구성된 융합단백질을 코우딩하는 유전인자, 유전인자를 포함하는 벡터, 그 젝터로 형질전환된 미생물, 그리고 융합단백질의 제조 및 정제법에 관한 것이다.

유전자 재조합 방법(recombinant DNA techniques)은 외부 유전인자를 특정 숙주체(host organism)에 삽입시키는 것을 가능케 했다. 이렇게 형질 전환된 숙주체 새포들은 외부 유전인자가 코우딩하는 단백질 또는 펩타이드를 생산하게 되는데, 이러한 방법을 통해 사람 또는 동물 장기에서 어렵게 얻어지던 여러 단백질들을 미생물을 이용하여 손쉽게 얻을수 있게 되었다. 그러나 미생물, 특히 대장균(E.coli)을 이용하는 경우, 만들고자하는 단백질이 대장균내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 슈율이 상대적으로 낮게 나타나는 경우가 종종 있다. 작은 크기의 폴리펩타이드의 경우 이러한 경향이 특히 심한데(Wetzel,R.Goeddel, D.V.,Peptides 5, 1-64(1983)),이렇게 낮은 수율은 정제과정에도 영향을 미쳐 상업화에 많은 지장을 주게 된다.

이러한 경우, 수율을 높이기 위하여 숙주체에서 안정되게 축적되는 단백질에 융합시킨 융합체(fusion protein)로서 생산하게 된다. 이는 보통 선택된 숙주체에서 풍부하게 생성되는 것으로 알려진 단백질을 코우딩하는 유전인자에 원하는 단백질 또는 펩타이드를 코우딩하는 유전인자를 연결하여 생산할 수 있다. 숙주체에서 풍부하게 생성되는 것으로 알려진 단백질의 예로는 안트라닐레이트 신세타제(anthranylate synthet ase), 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)(Goeddel, D.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 106-110(1979)), 프로테인 에이(protein A)(Kim, J-H. Weaver, R.F., Gene, 68, 315-321(1988)), 글루타치온 에스-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)(Smith, D.B. Johnson, K.S., Gene, 67, 31-40(1988)), 말토오즈 결합 단백질(maltose binding protein) 등이 있다. 이들 융합단백질의 장점은 친화력 칼럼 (affinity column)을 이용하여 융합단백질 정제시 쉽게 정제가 가능한 점인데, 원하는 단백질 또는 펩타이드에 비해 상대적으로 크기가 큰 것이 단범으로 작용하고 있다.

(예 : 글루타치온-에스-틀랜스퍼라제의 분자량은 26kD ; 말토오즈 결합단백질의 분자량은 45kD등). 즉, 만들어 낸 후에는 융합부분(fusion part)을 적당한 단백질 분해효소 또는 시아노겐 브로미드(cyanogen bromide) 등의 화학약품(chemical)으로 잘라낸후 정제과정을 거치게 되는데 융합부분의 크기에 따라 원하는 단백질 또는 펩타이드의 수율이 상대적으로 많이 감소하게 된다.

본 발명에서는 융합단백질이 갖는 단점인 낮은 펩타이드의 수율을, 융합부분의 크기를 기존방법에 비해 월등히 감소시키는 방법을 통해 상당히 증가시켰으며, 베타시이트를 형성하는 단백질의 전체 또는 일부분을 융합파트너로 이용하여 융합단백질을 세포내에서 불용성인 응집체(inclusion body)로 선택적으로 발현시키는 방법을 특징으로 하고 있다. 이들 단백질 응집체는 단백질 분해효소에 안정한 것으로 알려져 있다. 이러한 방법을 통해 만들어진 응집체는 세포파쇄후 저속 원심분리를 통해 쉽게 분리가 가능하며, 이들 응집체는 높은 순도(80%-90%)의 융합단백질을 함유하고 있다. 따라서 융합단백질의 정제를 거치지 않고 다음 단계인 절단단계(cleavage step)로 바로 진행할수 있어 천화력컬럼을 이용하는 경우에 비해 비용을 절감할 수 있다. 좀더 상세히 설명하면 본 발명은 베타시이트구조를 이루고 있으며 대장균내에서 높은 발현율을 보이는 종양괴사인자 또는 뮤테인, 또는 그 일부분을 융합파트너로서 사용하는 것을 특징으로 하고 있다.

종양괴사인자(Tumor Necrosis Fantor 또는 줄여서 TNF라고 함)는 단핵세포와 대식세포등에서 분비되는 사이토카인의 일종으로서 항암작용(Aggarwal, B.B., Dru gs of the Future 891-898(1987)), 항바이러스 작용(Mestan, J. et al., Nature (London(323, 816-819(1986))과 말라리아 감염에 대해 예방효과를 지닌 것으로 알려져 있다(Playfair, J.H. Taverne, J. in Tumor Necrosis Factor and Related Cytotoxins(Ciba Foundation Symposium 131)192-205(Wiley, Chichester)( 1987)). 종양괴사인자는 157개의 아미노산으로 구성되어 있으며 베타시이트구조를 갖는 단백질로서 대장균내로서 대장균내에서 안정적으로 발형되는 것으로 알려져 있다(Eck, M.J. Sprang, s.r. , j.biol. Chem. 264, 17595-17605(1989); Pennica, D.et al., Nature(london)312, 724-729(1984)). 종양괴사인자와 아미노산 서열이 비슷하고, 같은 베타시이트구조를 갖는 림포톡신(Lymphotoxin 또는 줄여서 LT라고 함)도 대장균내에서 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있어 본 발명에서 서술한 목적으로 이용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 아래식[1]에 나타나 있는 종양괴사인자 전체의 아미노산 서열, 또는 아미노말단에서 1개 이상 7개, 바람직하게는 7개의 아미노산이 절단된 폴리펩타이드, 또는 그 일부분의 아미노산 서열을 융합파트너(fusion partner)로 이용하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아래식[1]의 아미노산 서열중 일부가 치환된 형태의, 종양괴사인자 뮤테인을 융합파트너로 이용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 사람종양괴사인자 또는 뮤테인을 코우딩하는 DNA는, 변형하고자 하는 부분을, DNA합성기를 이용, 화학적으로 합성한후 사람종양괴사인자 cDNA를 주형(template)으로 삼아 중합효소연쇄반응(Saiki, R.K. et al., Science 230, 1350-354(1985))을 통해 만들 수 있다. 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다. U937세포주(Clontech에서 구입)로부터 만들어진 사람 단핵세포 cDNA라이브러리로부터 중합효소연쇄반응을 이용하여 종양괴사인자-알파의 DNA를 준비한다.

5'말단에 제한 효소부위와 변형된 염기서열을 포함하는 센스프라이머와 5'말단에 제한효소부위를 갖는 안티센스프라이머를 화학적으로 합성한후 종양괴사인자-알파의 DNA를 주형으로 삼아 중합효소연쇄반응을 통해 종양괴사인자 뮤테인의 DNA, 또는 일부분만을 코우딩하는 DNA를 만든다.

준비된 DNA를 적당한 발현 벡타에 삽입하고, 그 벡터의 DNA의 3'말단쪽에 원하는 단백질 또는 펩타이드를 포우딩하는 DNA를 삽입시킨후, 그 벡타를 적당한 숙주에 도입하여 만들어진 형질 전화체를 배양하여 융합단백질을 생산할 수 있다.

좀더 상세히 설명하면 종양괴사인자 DNA를 lac, trp, tac, pl, T3, T7, SP6, SV40, 1(pL/pR) 등의 적당한 프로모터를 갖는 발현 벡타에 직접 삽입하거나, 또는 이들 프로모터와 리보좀 결합부위를 갖는 DNA를 종양 괴사인자 DNA와 결합한후 pBR322와 같은 플라스미드에 삽입하여 발현 벡타시스템을 구축할 수 있다.

본 발명의 융합단백질을 생산하기 위한 발현 벡타를 적당한 숙주, 예를 들어 이. 콜라이(E.coli)에 코헨등(Cohen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 69, 2110( 1972))의 방법에 의해 도입하여 형질전환체를 만든다. 다음에, 형질 전환체를 적당한 배양조건에서 배양하여 아미노말단에 메티오닌이 결합된 융합단백질을 생산할 수 있다. 배양된 세포들은 라이소자임소화, 동결융해, 초음파 파쇄, 또는 프렌치 프레스(Frech press)등으로 처리한후, 원심분리나 여과를 통해 융합단백질을 함유하는 응집체를 얻는다. 이들 단백질 응집체는 저속 원심분리에 의해 높은 순도로 얻을수 있다. 얻어진 단백질 응집체는 6M Guanidin-HCl등으로 녹인후 아황산분해 (sulfitolysis)를 통해 시스테인의 SH기를 SSO₃로 치환한후 10배의 수용액을 가하거나 투석방법을 통해 침전시킨다. 원심분리를 통해 분리한후 몇번 수용액으로 씻어준후 동결건조시킨다. 말린시료를 시아노겐 브로미드로 처리한후 적당한 용매에 녹여, 이온교환 크로마토그래피, HPLC, 겔 여과, 전기영동 그리고 친화성 크로마토그래피 등의 일반적인 정제방법을 통해 원하는 단백질 또는 펩타이드를 분리해낼수 있다.

(실시예 1) TNF-융합 벡터 플라스미드의 구축(Construction of a family of TNF fusion vector plasmids) U937 세포주로부터 만들어진 사람 단핵세포 cDNA라이브러리(Clontech에서 구입)를 주형으로하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 종양괴사인자-알파의 DNA를 준비하였다. 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

P1: 센스프라이머 : 5'-GCCATACATATGGTCAGATCTCTTCTCGAACC-3'

안티센스프라이머: 3'-TGAAACCCTAGTAACGGGACACTATTCCTAGGTGT-5'

준비된 종양괴사인자DNA를 주형으로 이용하고 치환하고자 하는 염기서열을 포함하는 뮤턴트프라이머(P2)들과 P3프라이머들을 사용하여 일련의 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 뮤턴프라이머들은 다음과 같다.

P2 : 센스프라이머 : 5' -GTGGTGCCAATAGAGGGCCTGTTCCTCATCTAC-3'

안티센스프라이머 : 3'-CACCACGGTTATCTCCCGGACAAGGAGTAGATG-5'

또한 종양괴사인자DNA의 5'말단과 3'말단에 상보적인 P3프라이머들을 사용하였다.

P3:센스프라이머 : 5'-ATACATATGCCGAGTGACAAGCCTGTA-3'

안티센스프라이머 : 3'-ATGAAACCCTAGTAACGGGCCCCTAGGTACA-5'

먼저, P2의 센스프라이머와 P3의 안티센스프라이머를 이용하여 종양괴사인자DNA를 주형으로 삼아 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 두 번째로 P2의 안티센스 프라이머와 P3의 센스프라이머를 이용하여 종양괴사인자를 주형으로 삼아 중합효소연새반응을 실시하였다. 그리고 두 PCR산물을 섞어 어닐링시켰다.

다음으로 5'말단에 NdeI제한효소 부위와 3'말단에 SmaI, BamHI제한효소부위를 갖는 P3프라이머를 이용하여 종양괴사인자 뮤테인의 DNA를 증폭시켰다. 만들어진 PCR산물을 NdeI과 BamHI으로 각각 처리하여 5'말단에 NdeI제한효소부위와 3'말단에 BamHI제한효소부위를 갖도록 NdeI, BamHI으로 소화시켜 준비한 벡터에 앞에서 만들어진 종양괴사인자 뮤테인(T150)의 DNA를 T4리가제로 연결하였다. (플라스미드pT7-T150). 이 과정을 제1도에 나타내었다. T150은 TNF의 아미노산 서열에서, 아미노말단에서 7개의 아미노산이 절단되고, 52번째의 세린이 아이소류신으로, 56번째의 타이로신이 페닐알라닌으로, 그리고 157번째의 로이신이 아르지닌으로 각각 치환된 뮤테인의 아미노산 서열을 코우딩하고 있다.

위에서 만들어진 종양괴사인자 뮤테인 DNA를 주형으로 삼아 P3의 센스 프라이머와 다음의 안티센스프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하였다.

안티센스프라이머 :3'-GACATGGAGTAGATGAGGGCCCCTAGGTACA-5'

만들어진 산물을 NdeI과 BamHI으로 각각 처리하여 5'말단에 NdeI제한효소부위와 3'말단에 BamHI제한효소부위를 갖도록 NdeI, BamHI으로 소화시켜 준비한 벡터에 앞에서 만들어진 종양괴사인자 뮤테인(T57)의 DNA를 T4리가제로 연결하였다.

(플라스미드 pT7-T57). 이과정을 제1도에 나타내었다. T57은 TNF의 아미노산 서열에서, 아미노말단에서 7개의 아미노산이 절단되고, 52번째의 세린이 아이소류신으로, 그리고 61번째 글루타민이 아르지닌으로 치환된 뮤테인의 61번째까지의 아미노산 서열을 코우딩하고 있다.

(실시예 2) TNF-프로인슐린 융합단백질의 제조

(2-A): pT150-hPI 플라스미드의 조립

프로인슐린의 유전자를 조립하기 위해 사용될 올리고뉴클레오타이드프라이머들은 ABIDNA자동합성기(Model 392)를 이용하여 고체상 포스포아미다이트(phosphoramidite)합성법을 체택하여 준비하였다. 합성된 프라이머들의 염기 서열은 아래와 같다.

PR-I : 센스프라이머 : 5'-CGG GGA TCC ATG TTT GTG AAC CAA CAC-3'

안티센스프라이머 : 3'-GCG GCC CTC CGT CTC CTG GAC GTC CAC CCC GTC CAC CTC-3' PR-Ⅱ: 센스프라이머 : 5'-GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC-3'안티센스프라이머 : 3'-TTG ATG ACG TTG ACT ATT CGA AGT CAG-5'

사람프로인슐린 유전자인자는 다음과 같은 과정을 거쳐 사람혈액으로부터 중합효소연쇄반응을 통해 분리하였다. 50μl의 사람혈액을 500μl의 TE완충액과 섞은 후 13000xg로 10초간 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 이러한 과정을 3회 반복하였다. 펠릿을 100μl의 0.5% Tween 20과 100μg/ml proteinase K를 함유하는 PCR-반응 완충액(10mM KCl, 10mM(NH4)2SO4, 20mM Tris-HCl(pH8.8), 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100)과 섞은후 56℃에서 45분, 95℃에서 10분간 가열하여준후 10μl를 취하여 중합효소연쇄반응을 위한 주형으로 사용하였다. 앞서 준비한 PR-I의 센스프라이머와 안티센스프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 B사슬전체와 C사슬의 일부를 포함하는 DNA fragment-1을 준비하였다. 같은 방법으로 앞서 준비한 PR-Ⅱ의 센스프라이머와 안티센스프라이머를 이용하여 C사슬의 일부와 A사슬 전체를 포함하는 DNA fragment-2를 준비하였다. DNA fragment-1과 DNA fragment-2를 섞어 중합효소 연쇄반응을 통해 프로인슐린의 DNA를 준비하였다. 만들어진 프로인슐린 DNA를 BamHI과 HindⅢ로 각각 처리하여 5'말단에 BamHI제한효소부위와 3'말단에 HindⅢ제한효소 부위를 갖는 접착 말단의 이중가닥 DNA를 준비하였다.

pT7-T150플라스미드를 BamHI과 HindⅢ제한효소로 소화시켜 절단한후, 위에서 만들어진 프로인슐린 DNA와 T4리가제로 연결하였다(발현플라스미드 pT150-hPI). 이 과정을 제2도에 나타내었다.

(2-B) : pT57-hPI플라스미드의 조립

(2-A)에서 준비한 프로인슐린DNA를 BamHI과 HindⅢ로 각각 처리하여 5'말단에 BamHI제한효소 부위와 3'말단에 HindⅢ제한효소 부위를 갖는 접착말단의 이중가닥 DNA를 준비하였다. pT7-T57플라스미드를 BamHI과 HindⅢ제한효소로 소화시켜 절단한후, 위에서 만들어진 프로인슐린 DNA와 T4리가제로 연결하였다. (발현플라스미드 pT57-hPI). 이과정을 제2도에 나타내었다.

(2-C) : pT20-hPI 플라스미드의 조립

종양괴사인자의 아미노 말단 8번째부터 12번째의 아미노산 서열과 정제를 용이하게 하기위하여 히스티딘이 10개 포함된 17개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드(T20)를 융합파트너로 이용하였다. 펩타이드의 서열은 다음과 같다.

Pro Ser Asp Lys Pro His His His His His His His His His His Ser Ser

위의 펩타이드를 코우딩하는 염기서열을 포함하고 5'말단에 NdeI제한효소부위와 3'말단에 BamHI제한효소부위를 갖는 DNA를 아래의 프라이머들을 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 준비하였다.

T20-I(센스프라이머) : 5'-TATACATATGCCGAGTGACAAGCCT-3'

T20-Ⅱ(센스프라이머) : 5'-AGTGACAAGCCTCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAG-3'

T20-Ⅲ(안티센스프라이머) : 3'-TAGTAGTGTCGTCGCCTAGGTACA-5'

이 때 프라이머들은 T20-I, T20-Ⅱ그리고 T20-Ⅲ를 10:1:10의 비율로 섞어 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 만들어진 PCR산물을 Ndel과 BamHI으로 각각처리하여, pT57-hPI를 NdeI, BamHI으로 소화시켜 준비한 벡터에 T4라가제로 연결하였다(플라스미드 pT20-hPI).

(2-D) : TNF-프로인슐린 융합단백질의 생산

발현 플라스미드 pT150-hPI, pT57-hPI 및 pT20-hPI로 E.coli XL-1 Blue를 하나한(Hanahan)이 기술한 방법에 의해 각각 형질전환시켰다.(Hanahan,D.(1985) DNA Cloning vol. 1(Ed. D.M.Glover), 109-135, IRS Press). 형질전환후 고체배지에 생기는 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 1ml의 LB배지 (LB/ampicillin)에 접종하였다. 37℃에서 12시간 배양한후 8000xg에서 2분간 원심분리하여 상층액을 버리고 E.coli펜렛에 대하여 알칼리용해 방법을 사용하여 플라스미드를 분리 및 정제하였다. 플라스미드를 50μl의 TE(pH8.0)dp 녹인후, 0.1μg의 플라스미드 용액을 취하여 2μl의 10x원-포랄(One-phor-all)완충액(100mM트리스-아세테이트 100mM아세트산마그네슘, 500mM 아세트산칼륨), 1단위의 NedI, 5단위의 HindⅢ등과 섞은후 증류수를 첨가하여 총 용액의 부피를 10μl가 되도록 맞추었다. 37℃에서 2시간동안 반응시킨후 1%아가로스겔 전기영동으로 DNA절편의 삽입을 확인하였다. DNA절편이 삽입된 것이 확인된 플라스미드를 발현균주인 E.coli BL21(DE3)에 앞서와 동일한 방법으로 형질전환한후 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. pT150-hPI로 형질전환된 E.coli BL21(DE3) 및 pT57-hPI로 형질전환된 E.coli BL21(DE3)을 1994년 3월 19일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다.(E.coli BL21(DE3+pT150-hPI) : 기탁번호 : KCCM-10051 ; E.coli BL21(DE3+pT57-hPI) : 기탁번호 : KCCM-10048).

상기에서 설별한 콜로니를 1ml LB배지에 접종한 후 12시간 이상 배앙하였다.

50ml의 LB(앰피실린포함)로 옮기고 600mm에서 흡광도가 0,1-0.4일 때 IPTG(isopropyl thio galacopyranoside)를 최종농도가 1mM되도록 넣었다. 37%에서 4시간동안 200rpm속도로 진탕한후 8000xg에서 2분간 원심분리하여 E.coli펠렛을 얻었다. 이 펠렛을 5ml의 10mM 인신나트륨(pH7.4)완층액에 현탁시킨후 초음파처리방법으로 세포를 파쇄하였다.

초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4℃에서 6000xg로 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 10배 부피의 4℃의 Triton X100완충액(50mM Tris-HC1 pH 8.0, 10mM EDTA, 0.5%(v/v)Triton X100 100mM NaCl)으로 씻어주고 8000xg에서 5분간 원심불리하여 펠렛회수하였다. 이 과정을 2회 반복하였다.

(2 -E): 프로인슐린의 분리 및 정제

위에서 준비한 펠렛을 6M구아니딘-하이드로클로라이드(Guanidin-HC1)를 포함하는 0.1M Tris-HC1(pH8.0)완충액 1ml에 녹인후 50mg의 소이움 설팡트(sodium sulfite)와 25mg의 소디움 테트라치오네이트(Sodium tetrathionate)를 첨가한후 실온에서 20시간동안 반응시켰다. 반응액을 12000xg에서 30분동안 원심분리한후 상층액만을 취하여 Spectra Por #3투석막(dialysis membrane)에 옮겨 넣어 4℃증류수에 24시간 동안 투석(dialysis)을 시켰다. 이 용액을 10000xg에서 30분동안 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물에 우레아(urea)와 염산을 최종 8M, 0.1M이 되도록 가해 녹인후, 시아노겐 브로미드를 5mg 첨가하여 20시간동안 반응시켰다. 반응액을 히타치(Hitachi)HPLC시스템과 파마시아(Pharmacia)C-18역상(reversp-phase)컬럼을 이용하여 정제하였다.(제4도)

(실시예 3)TNF-칼시토닌(Gly)융합 단백질의 제조

(3-A): pT150-sCT(Gly)플라스미드의 조립

연어 칼리토닌의 전구체로서 글리이신(Gly)이 카르복시 말단에 첨가된 아미노산의 서열을 갖는 펩타이드(sCT(Gly))를 코우딩하는 합성 유전자를 아래와 같은 방법으로 제조하였다. 연러칼시토닌 전구체의 아미노산 서열은 다음과 같다.

H2N-Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu HisLys Leu Gln Thr Tyr Pro Aug Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly-COOH

전체 칼시토닌 유전자를 두분으로 나눠 각각3'-말단에 18개의 서로 상보적인 DNA염기서열을 갖는 아래의 올리고뉴클레오타이드들을 ABIDNA자동합성기를 이용하여 준비하였다.

CT-I : 5'- C ATG TGC TCT AAC CTG AGC ACC TGT GTT CTG GGC AAA CTG TCT CAG GAA CTG CAC AAG TTG CAG ACT-3'

CT-Ⅱ:3'-GAC GTG TTC AAC GTC TGA ATG GGC GCA TGG TTG TGG CCA AGA CCA TGA GGC CCG ATC ATT TTC GAA-5'

동량의 CT-I와 CT-Ⅱ를 섞어 어닐닝시킨후 5'말단에 BamHI제한효소부위와 3'말단에 HindⅢ제한효소 부위를 갖는 아래의 프라이머 CT-Ⅲ를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 칼시토닌(Gly)의 DNA를 준비하였다.

CT-Ⅲ: 센스프라이머 : 5'- C TGA GGA TCC ATG TGC TCT AAC CTG-3'

안티센스프라이머 : 3'-GGC CCG ATC ATT TTC GAA GACT-5'

만들어진 프로인슐린 DNA를 BanHI과 HindⅢ로 각각 처리하여 5'말단에 BamHI제한효소 부위와 3'말단에 HindⅢ효소 부위를 접착말단의 이중가닥 DNA를 준비하였다. pT7-T150플라스미드를 BamHI과 HindⅢ제한효소로 소화시켜 절단한후, 위에서 만들어진 프로 인슐린 DNA와 T4리가제로 연결하였다.(발현플라스미드 pT150-sCT(Gly)). 이과정을 제3도에 나타내었다.

(3-B) : pT57-sCT(Gly)플라스미드의 조립

(3-A)에서 준비한 칼시토닌(Gly)DNA를 BamHI과 HindⅢ로 각각 처리하여 5'말단에 BamHI제한효소 부위와 3'말단에 HindⅢ제한효소 부위를 갖는 접착말단의 이중가닥 DNA를 준비하였다. pT7-T57플라스미드를 BamHI과 HindⅢ제한효소로 소화시켜 절단한후, 위에서 만들어진 칼시토닌(Gly)DNA와 T4리가제로 연결하였다.(발연플라스미드 pT57-sCT(Gly)). 이과정을 제3도에 나타내었다.

(3-C): TNF: 칼시토닌(Gly)융합 단백질의 생산

발현 플라스미드 pT150-sCT(Gly) 및 pT57-sCT(Gly)로 E.coli XL-1 Blue를 하나한(Hanahan)이 기술한 방법에 의해 각각 실시예(2-C)에서와 동일한 방법으로 형질전환시켰다. (Hanahan, D.(1985)DNA Cloning vo1.

1(Ed. D.M. Glover), 109-135, IRS Press). 형질전환후 고체 배지에 생기는 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 1ml의 LB배지(LB/ampicillin)에 접종하였다. 37℃에서 12시간 배양한후 8000xg에서 2분간 원심분리하여 상층액을 버리고 E.coli펠렛에 대하여 알칼리용해 방법을 사용하여 플라스미드를 분리 및 정제하였다. 플라스미드를 50μl TE(pH8.0)에 녹인후, 0.1μg의 플라스미드 용액을 취하여 2μl의 10x원-포랄(One-phor-all)완충액(10mM 트리스-아세테이트, 100mM아세트산마그네슘, 500mM아세트산칼륨), 1단위의 NdeI, 5단위의 HindⅢ등과 섞은후 증류수를 첨가하여 총 용액의 부피를 10μl가 되도록 맞추었다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨후 1%아가로스겔 전기 영동으로 DNA절편의 삽입을 확인하였다. DNA전편이 삽입된 것이 확인된 플라스미드를 발현균주인 E.coli BL21(ED3)에 앞서와 동일한 방법으로 형질전환한후 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. pT150-sCT(Gly)로 형질전환된 E.coli BL21(DE3) 및 pT57-sCT(Gly)로 형질전환된 E.coli BL21(DE3)을 1994년 3월 19일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다.

(E.coli BL21(DE3 + pT150-sCT(Gly)) : 기탁번호 : KCCM-10050; E.coli BL21(DE3+pT57-sCT(Gly)): 기탁번호 KCCM-10049)

상기에서 선별한 콜로니를 1ml LB배지에 접종한후 12시간 이상 배양하였다. 50ml의 LB배지(앰피실린 포함)로 옮기고 600nm에서 흡광도가 0.1-0.4일 때 IPTG( isopropyl thio galactopyranoside)를 최종농도가 1mM되도록 넣었다. 37℃에서 4시간동안 200rpm속도로 진탕한후 8000xg에서 2분간 원심분리하여 E.coli펠렛을 얻었다. 이 펠렛을 5ml의 10mM인산나트륨(pH 7.4)완층액에 현탁시킨후 초음파처리방법으로 세포를 파쇄하였다. 초음파처리를 통해 파쇄된 세포용해액을 4℃에서 15000xg로 30분 동안 원심분리하였다.

상기에서 설별한 콜로니를 1ml LB배지에 접종한후 12시간 이상 배양하였다. 50ml의 LB배지(앰피실린 포함)로 옮기고 600nm에서 흡광도가 0.1-0.4일 때 IPTG( isopropy1 thio galactopyranoside)를 최종농도가 1mM되도록 넣었다. 37℃에서 4시간동안 200rpm속도로 진탕한후 8000xg에서 2분간 원심분리하여 E.coli펠렛을 얻었다. 이 펠렛을 5ml의 10mM인산나트륨(pH7.4)완충액에 현탁시킨후 초음파처리방법으로 세포를 파쇄하였다.

초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4℃에서 6000xg로 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 10배 부피의 4℃의 Triton X100완충액(50mM Tris-HCI, pH8.0, 10mM EDTA, 0.5%(v/v)Triton X100, 100mM NaCl)으로 씻어주고 8000xg에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 회수하였다. 이 과정을 2회반복하였다.

(3-D):칼시토닌(Gly)의 분리 및 정제

위에서 준비한 펠렛을 6M 구아니딘-하이드로클로라이드를 포함하는 0.1M TRIS-hci(Ph8.0)완충액 1ml에 녹인후 50mg의 소디움 설파이트와 25mg의 소디움 테트라치오네이트를 첨가한후 실온에서 20시간동안 반응시켰다.

반응액을 12000xg에서 30분동안 원심분리한후 상층액만을 취하여 Spectra Por#3 투석막(dialysis membrane)에 옮겨 넣어 4℃증류수에서 24시간동안 투석(dialysis)을 시켰다. 이용액을 10000xg에서 30분동안 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물에 우레아(urea)와 염산을 최종 8M 0.1M이 되도록 가해녹인후, 시아노겐 브로미드를 5mg첨가하여 20시간동안 반응시켰다. 반응액을 히타치(Hitachi)HPLC시스템과 파마시아(Pharmacia)C-18역상(reverse-phase)컬럼을 이용하여 정제하였다(제5도).

Claims

폴리팹타이드를 코우딩하는 DNA염기서열을 지닌 형질전환미생물을 배양하여 폴리펩타이드를 제조함에 있어서, 하기식의 아미노산 서열을 지니는 종양괴사인자 전체또는 그 일부를 융합파트너로 이용한 폴리펩타이드의 제조방법.

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Por Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val

Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn

Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro

Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val

Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln

Arg Gly Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr

Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile

Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly

Ile Ile Ala Leu
제1항에 있어서, 발현시키려는 폴리펩타이드가 프로인슐린 또는 프로인슐린의 C-펩타이드 일부가 치환된 유도체임을 특징으로 하는 융합파트너를 이용한 폴리펩타이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 발현시키려는 폴리펩타이드가 칼시토닌 또는 칼시토닌 전구체임을 특징으로 하는 융합 파트너를 이용한 폴리펩타이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 발현시키려는 폴리펩타이드가 메티오닌이 아미노산서열의 아미노 말단에 부가된 폴리펩타이드임을 특징으로 하는 융합 파트너를 이용한 폴리펩타이드의 제조방법.
제1항의 폴리펩타이드를 코우딩하는 cDNA염기 서열.
제5항의 염기서열을 포함하는 벡터.
제6항의 벡터에 의해 형질 전환된 미생물.
제7항에 있어서, 형질 전환된 대장균(E.Coli).