WO2012037880A1

WO2012037880A1 - Dna标签及其应用

Info

Publication number: WO2012037880A1
Application number: PCT/CN2011/079902
Authority: WO
Inventors: 章文蔚; 于竞; 龚梅花; 张艳艳; 田方; 陈海燕; 周妍; 刘涛; 王俊
Original assignee: 深圳华大基因科技有限公司; 深圳华大基因研究院
Priority date: 2010-09-21
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2012-03-29
Also published as: HK1168627A1; CN102409049B; CN102409049A

Description

DNA标签及其应用优先权信息

本申请请求 2010 年 9 月 21 日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为 201010299305.9的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，特别是 DNA测序技术领域。具体的，本发明涉及用于 DNA测序的 DNA标签及其应用。更具体的，本发明提供了用于构建 DNA标签文库的 DNA标签、 PCR标签引物、 DNA标签文库及其制备方法、确定 DNA样品序列信息的方法、确定多种 DNA样品序列信息的方法以及用于构建 DNA标签文库的试剂盒。背景技术

DNA测序技术，是重要的分子生物学分析方法之一，它不仅为基因表达、基因调控等生物学基础研究提供重要数据，而且也在疾病诊断学、基因治疗等应用研究中起着重要的作用。基于 Solexa DNA测序平台（ Illumina ) , 釆用边合成边测序 ( Sequencing By Synthesis, SBS ) , 具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点 (例口参见 Paired- End sequencing User Guide ;Illumina part#1003880 ； Preparing samples for ChIP sequencing for DNA;Illumina part#l 1257047 Rev. A ； mRNA sequencing sample preparation Guide;Illumina part#l 004898 Rev.D ； Preparing 2-5kb samples for mate pair library sequencing; Illumina part#1005363 Rev.B , 通过参照将其全文并入本文）。

然而，目前对样品 DNA进行测序的方法，仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前 Illumina公司基于 Solexa DNA测序平台推出了 DNA标签（也称为 index )建库方法。如图 1所示，在 DNA标签建库流程中，使用了 3条 PCR引物，通过 PCR导入标签来构建 DNA标签文库 ( Preparing samples for multiplexed Paired-End sequencing; Illumina part#1005361 Rev.B , 通过参照将其全文并入本文）。本申请的发明人发现，上述标签文库制备方法存在着一些缺陷：第一、目前 Illumina公司只提供了 12种长度为 6bp的标签序列，标签的数量较少，随着 Solexa测序通量的增加，不能对大量样本进行混合测序，从而将浪费测序资源和影响到测序通量；第二、上述标签建库方法是通过 PCR反应将标签序列导入到目的片段文库中的，其对目的片段的 PCR扩增过程需要釆用 3条 PCR引物（两条公用 PCR引物和一条 PCR标签引物，如图 1所示），耗时耗材，费用较高，且 PCR扩增效率不高。

本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。为此，本发明的一个方面，提出了一种能够用于构建 DNA标签文库的 DNA标签（在本文中，有时也简单地称为 "标签" ）。根据本发明的一个方面，本发明提出了一组分离的 DNA标签。根据本发明的一些实施例，这些分离的 DNA标签分别由 SEQ ID NO: 1-161所示的核苷酸构成。在本说明书中，这些 DNA标签分别被命名为 DNA IndexN, 其中 N=l-161的任意整数，其序列如下表 1所示。其中，表 1中 DNA IndexN的序列对应序列表中 SEQ ID NO: N所示的核苷酸序列， N=l-161的任意整数，例如 Index 1的序列（CATTGCTT ) , 与序列表中 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列（ CATTGCTT )相同，即对应； Index55的序列（ TACAGGCC ) , 与序列表中 SEQ ID NO: 55所示的核苷酸序列（TACAGGCC )对应。 Indexl58的序列 ( TTGGCGCC ) , 与序列表中 SEQ ID NO: 158所示的核苷酸序列（ TTGGCGCC )对应。 DNA标签（ IndexN ) 序列

Index41 CAACTAAG Index95 TCGTAAGC Index 149 TGCTAGTG

Index42 ATAGGAAG Index96 CCGTCACG Indexl50 CCGAGCTC

Index43 ACTACAAG Index97 GCGAAGTA Indexl51 CGGATTAG

Index44 GATGGTTC Index98 GGACTGCG Index 152 CGGACGGA

Index45 CCACATTC Index99 GAGCATTG Index 153 GACTGAGG

Index46 TCTTGGTC Index 100 TCGCCGTG Index 154 GTGTGTTA

Index47 CGAGGATC IndexlOl CAGCGGCG Index 155 CTCGTCCG

Index48 AGTCCATC Index 102 AAGGATGC Index 156 TGGAGAGG

Index49 CACTAATC Index 103 GCAATGGC Indexl57 TGGAATTC

Index50 TAAGGCGC Index 104 GTATTCTC Indexl58 TTGGCGCC

Index51 AATAGAGC Index 105 GTCATTAC Indexl59 GCCTTAAT

Index52 ACTGTTCC Index 106 ATCCAAGC Index 160 AAGCGATT

Index53 CTTCCTCC Index 107 GGTATACT Indexl61 AACCGCAA

Index54 GCGACTCC Indexl08 TTGCGTGC 利用上述根据本发明实施例的 DNA标签，通过将 DNA标签与样品 DNA或其等同物相连，可以精确地表征 DNA的样品来源。由此，利用上述 DNA标签，可以同时构建多种样品的 DNA标签文库（在本文中，有时也称为 "标签文库" ），从而可以通过将来源于不同样品的 DNA标签文库混合之后进行测序，并且能够基于 DNA标签对 DNA 标签文库的 DNA序列进行分类，从而可以获得多种样品的 DNA序列信息，由此可以充分利用高通量的测序技术，例如利用 Solexa测序技术，同时对多种 DNA标签文库进行测序，从而提高 DNA标签文库的测序效率和通量。发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的 DNA标签构建 DNA标签文库，能够精确地对多种 DNA标签文库进行区分，并且所得到的测序数据结果的稳定性和可重复性非常好。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了用于将上述 DNA标签引入样品 DNA或其等同物中的一组分离的 PCR标签引物。根据本发明的实施例的一组分离的 PCR标签引物，分别由 SEQ ID NO: 161-323所示的核苷酸构成。 #居本发明的实施例，这些 P CR标签引物（在本说明书中，有时也称为 "DNA PCR标签引物" ）分别具有如前所述的根据本发明实施例的 DNA标签，通过釆用 PCR标签引物的 PCR反应，可以将 PC R标签引物引入样品的 DNA或其等同物中，从而就将相应的 DNA标签引入到 DNA或其等同物中。与 DNA标签的命名方法类似，在本说明书中，与 DNA标签 DNA Index N相对应的 PCR标签引物被命名为 DNA PCR IndexN Primer, 其中 N=l-161的任意整数，其序列如下表 2所示（表中所示序列方向均是 5， _ 3，方向）。其中，表 2中的 DN A PCR IndexN Primer的序列分别对应序列表中 SEQ ID NO: ( N+161 )所示的核苷酸序列， N=l-161的任意整数，例如 DNA PCR Indexl Primer的序列（ CAAGCAGAAGA 与序歹 'J表中 SEQ ID NO: 162所示^;核苦酸序歹' J ( CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA

PCR Index27 Primer 的序列 ( CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGTGAATGTGAC TGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ) , 与序歹 'J表中 SEQ ID NO: 188所示的核

GTGTGCTCTTCCGATCT )对应。 Index 140 的序歹 'J ( CAAGCAGAAGACGGCATACGAG

ID NO: 301 所示的核苷酸序歹' J ( CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTTACAGT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT )对应。 PCR标签引物（ DNA PCR IndexN Primer ) 序列

DNA PCR Index22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCTTATTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCATAGTGACTG

DNA PCR Index23

GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTAGAATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAACATTAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTAACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGTGAATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATATGATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATTAAGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index30 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCATATCCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index31 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCATCAAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index32 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCGATCTTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index33 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCGGTTAAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index34 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGACTTAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index35 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGCGAATAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index36 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGCTTCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index37 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTACTGGAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index38 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGACAAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index39 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGCGCTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index40 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCACAGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index41 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTAGTTGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index42 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTCCTATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index43 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTGTAGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT DNA PCR Index44 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAACCATCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index45 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAATGTGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index46 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACCAAGAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index47 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCCTCGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index48 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATGGACTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index49 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATTAGTGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index50 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCCTTAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index51 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCTATTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index52 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACAGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index53 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAGGAAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index54 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAGTCGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index55 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCTGTAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index56 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCTTAACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index57 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGTAATTAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index58 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGTGTTATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index59 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCCTACGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index60 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGAGAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index61 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGTAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index62 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTTAACCTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index63 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTTGCAACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index64 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAATTGAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index65 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGACTTGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT DNA PCR Index66 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGGTTGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index67 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTATGGTAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index68 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTATGTGTCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index69 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTATTATCTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index70 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCACCGCGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index71 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCATAGTAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index72 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCAACAAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index73 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCACTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index74 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGGCGATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index75 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTATAAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index76 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCATGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR IndexW CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGAGGTGAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index78 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCAAGGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index79 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGAGTATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index80 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTCGAACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index81 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTATGATGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index82 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCATGTGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index83 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCCTCATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index84 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGGAGGAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index85 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGTCTAAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index86 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGGACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index87 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATAGATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT DNA PCR Index88 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACAGTAAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index89 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCGCGTGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index90 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGGATAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index91 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTATTCCTAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index92 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCACGTTCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index93 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGTGCGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index94 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACGCAATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index95 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTTACGAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index96 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGACGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index97 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACTTCGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index98 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGCAGTCCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Index99 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAATGCTCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR IndexlOO CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACGGCGAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR IndexlOl CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGCCGCTGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl02 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCATCCTTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl03 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCATTGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl04 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGAATACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl05 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAATGACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl06 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTTGGATGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl07 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTATACCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl08 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCACGCAAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl09 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCGTCGGAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT DNA PCR IndexllO CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGCCTGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexlll CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCTGGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexll2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCAGTGTGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR IndexlB CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGAGGCCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexll4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCGCGCCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexll5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGTGGCGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexll6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGCATGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR IndexlH CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGTTGCCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexll8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGATACCGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexll9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCCGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGCTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTCTGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCTGCGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCAGCTCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCCATCAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGATTCAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTGTCAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGACCACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCCACGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGAAGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl30 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTACATGTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl31 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTAGCCGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT DNA PCR Indexl32 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGGATCGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl33 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCGTCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl34 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGCCAGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl35 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACGTCTTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl36 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGAGAGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl37 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACACGCTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl38 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACAACGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl39 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTAGCAAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl40 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTTACAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl41 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTAACACAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl42 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGCTATCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl43 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTGTTAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl44 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAACTACTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl45 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGCAGACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl46 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTACTCCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl47 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGCGCAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl48 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTATAGGCAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl49 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTAGCAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl50 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGCTCGGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl51 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAATCCGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl52 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGTCCGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl53 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCAGTCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT DNA PCR Indexl54 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAACACACGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl55 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGACGAGGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl56 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCCAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl57 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAATTCCAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl58 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCGCCAAGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl59 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTAAGGCGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl60 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATCGCTTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

DNA PCR Indexl61 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGCGGTTGTGACTG Primer GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

利用上述根据本发明实施例的 PCR标签引物，能够有效地将 DNA标签引入到样品的 DNA或其等同物中，由此能够构建具有 DNA标签的 DNA标签文库。另外，发明人惊奇地发现，当针对相同的样品，釆用具有不同标签的 PCR标签引物构建含有各种 DNA 标签的 DNA标签文库时，所得到的测序数据结果的稳定性和可重复性非常好。根据本发明的实施例，当釆用 pearson系数进行数据分析时，利用 DNA Indexl-161所构建的人全血样本 DNA标签文库均表现出了至少 0.99的相关性。关于 pearson系数具体算法的细节可以参见相关文献，例如： t Hoen, P. A., Y. Ariyurek, et al. (2008). "Deep sequencing-based expression analysis shows major advances in robustness, resolution and inter-lab portability over five micro array platforms." Nucleic Acids Res 36(21): el41 , 通过参照将其全文并入本文。重复性越高，则其 pearson系数越接近 1。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种制备 DNA标签文库的方法。根据本发明的实施例，包括以下步骤：将 DNA样品片段化，以获得特定长度的 DNA片段；将所述 DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的 DNA片段；在所述经过末端修复的 DNA片段的两条寡核苷酸链的 3，末端分别添加碱基 A , 以便获得具有粘性末端 A的 DNA片段；在所述具有粘性末端 A的 DNA片段两端分别连接 DNA接头，以便获得连接产物；将所述连接产物进行 PCR反应，以便获得 PCR扩增产物，其中所述 PCR反应釆用 PCR标签引物，其中所述 PCR标签引物包含选自根据本发明实施例的一组分离的 DNA标签中的一种，所述 PCR扩增产物包含目的片段、 DNA接头以及 DNA标签，其中所述目的片段的序列与所述 DNA片段的序列相对应；以及分离回收所述 PCR扩增产物，所述 PCR扩增产物构成所述 DNA标签文库。利用根据本发明实施例的制备 DNA标签文库的方法，能够有效地将根据本发明实施例的 DNA标签引入到针对样品 DNA所构建的 DNA 标签文库中。从而可以通过对 DNA标签文库进行测序，获得样品 DNA的序列信息以及 DNA标签的信息，从而能够对样品 DNA的来源进行区分。另外，发明人惊奇地发现，当针对相同的样品，基于上述方法，釆用具有不同标签的 PCR标签引物构建含有各种 DN A标签的 DN A标签文库时，所得到的测序数据结果的稳定性和可重复性非常好。

进一步，本发明还提供了一种 DNA 标签文库，其是由根据本发明实施例的制备 DNA标签文库的方法所获得的。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种确定 DNA样品序列信息的方法。根据本发明的实施例，其包括下列步骤：根据本发明实施例的制备 DNA标签文库的方法建立所述 DNA样品的 DNA标签文库；以及对所述 DNA标签文库进行测序，以确定所述 DNA样品的序列信息。基于该方法，能够有效地获得 DNA标签文库中 DNA样品的序列信息以及 DNA标签的序列信息，从而能够对 DNA样品的来源进行区分。另外，发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的方法确定 DNA样品序列信息，能够有效地减少数据产出偏向性的问题，并且能够精确地对多种 DNA标签文库进行区分。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定多种 DNA样品序列信息的方法。根据本发明的实施例，其包括以下步骤：针对所述多种样品的每一种，分别独立地根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法，建立所述 DNA样品的 DNA标签文库，其中，不同的 DNA样品釆用相互不同并且已知序列的 DNA标签，其中所述多种为 2-161 种；将所述多种样品的 DNA标签文库进行组合，以便获得 DNA标签文库混合物；利用 Solexa测序技术，对所述 DNA标签文库混合物进行测序，以获得所述 DNA样品的序列信息以及所述标签的序列信息；以及基于所述标签的序列信息对所述 DNA样品的序列信息进行分类，以便确定所述多种样品的 DNA序列信息。由此，根据本发明实施例的该方法，可以充分利用高通量的测序技术，例如利用 Solexa测序技术，同时对多种样品的 DNA标签文库进行测序，从而提高 DNA标签文库测序的效率和通量，同时可以提高确定多种 DNA样品序列信息的效率。

根据本发明的再一方面，还提供了一种用于构建 DNA标签文库的试剂盒，根据本发明的实施例，该试剂盒包括： 161种分离的 PCR标签引物，所述 PCR标签引物分别由 SEQ ID NO: 162-322所示的核苷酸构成，其中，所述 161种分离的 PCR标签引物分别设置在不同的容器中。由此，利用该试剂盒，能够方便地将根据本发明实施例的 DNA标签引入到构建的 DNA标签文库中。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图 1 : 显示了 Illumina公司提供的 DNA标签文库构建方法的流程示意图；图 2: 显示了根据本发明实施例的 DNA标签文库构建方法的流程示意图；图 3: 显示了由根据本发明实施例的 DNA 标签的 Solexa测序数据统计得到的其 1 个错误匹配 /0个错误匹配（ lmismatch/Omismatch ) 的比例。

发明详细描述

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语 "第一" 、 "第二" 仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有 "第一"、 "第二" 的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明， "多个" 的含义是两个或两个以上。

DNA标签

根据本申请的一个方面，本发明提出了一些分离的 DNA标签。根据本发明的实施例，这些分离的 DNA标签分别由 SEQ ID NO: 1-161所示的核苷酸序列构成。在本说明书中，这些 DNA标签分别被命名为 DNA IndexN, 其中 N=l-161的任意整数，其序列如前面表 1所示，在此不再赞述。

在本发明中所使用术语 "DNA" 可以是任何包含脱氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的 DNA。利用根据本发明实施例的 DN A标签，通过将 DNA标签与样品的 DNA或其等同物相连，得到具有标签的 DNA标签文库，通过对 DNA标签文库进行测序，可以获得样品 DNA的序列以及标签的序列，进而基于标签的序列可以精确地表征 DNA的样品来源。由此，利用上述 DNA标签，可以同时构建多种样品的 DNA标签文库，从而可以通过将来源于不同样品的 DNA标签文库进行混合，同时进行测序，基于 DNA标签对样品的 DNA序列进行分类，获得多种样品的 DNA的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用 Solexa测序技术，同时对多种样品的 DNA进行测序，从而提高了通过高通量测序技术的效率和通量，降低了确定 DNA样品序列信息的成本。这里所使用的表述方式 "DNA标签与样品的 DNA或其等同物相连" 应^ 广义理解，其包括 DNA标签可以与样品的 DNA直接相连，以构建 DNA标签文库，也可以与和样品的 DNA具有相同序列的核酸（例如可以是相应的 RNA 序列或 cDNA序列，其与 DNA具有相同的序列）相连。

本申请的发明人发现：在本发明中，为了设计有效的 DNA标签，首先需要考虑标签序列之间的可识别性和识别率的问题。其次，在标签混合量少于 12个样品的情况下，必须考虑到混合后的标签上的每个碱基位点的 GT含量。因为 Solexa测序过程中，碱基 G和 T的激发荧光一样，碱基 A和 C的激发光是一样的，因此必须考虑碱基 "GT" 含量与碱基 "AC" 含量的 "平衡" ，最适碱基 "GT" 含量为 50% , 能保证标签识别率最高和错误率最低。最后，还要考虑数据产出的可重复性和准确性，即为了实现能够有效构建 DNA标签文库并进行测序，所构建的一组 DNA标签需要能够保证结果可靠，可重复性高，也就是针对同样的 DNA样品，可以保证利用该组 DN A标签中的不同标签构建的 DNA标签文库，能够获得一致的测序结果，因而可以确保实验结果可靠且重复性高。另外，还需要同时避免标签序列出现 3或 3 个以上连续的碱基的出现，因为 3 个或 3个以上连续的碱基会增加序列在合成过程中或测序过程中的错误率，同时也要考虑到 PCR标签引物自身形成的发夹结构和自身的二级结构。

为此，本申请的发明人进行了大量的筛选工作，并且选定了根据本发明实施例的一组分离的 DNA标签，分别由 SEQ ID NO: 1-161所示的核苷酸序列构成。其序列如前面表 1所示，不再赘述。另外，发明人发现这些标签之间的差异至少有 4个碱基，即至少 4个碱基序列不同，并且当标签的 8个碱基中的任意 1个碱基出现测序错误或合成错误，都不影响到标签的最终识别。这些标签可以应用于任何 DNA标签文库的构建。目前尚未有关于这些标签应用于 DNA样品测序的文库构建并通过 Solexa测序的艮道。

根据本发明的一些实施例，所釆用的 DNA标签为长度是 8bp的核酸序列，并且所述标签之间的差异在 4个碱基以上，所述一组 DNA标签包括如下或由如下组成：表 1所示的 161个 DNA标签或与之相差 1个碱基的 DNA标签中的至少 10个，或至少 20个，或至少 30个，或至少 40个，至少 50个，或至少 60个，或至少 70个，或至少 80个，或 90个，或至少 100个，或至少 110个，或至少 120个，或至少 130个，或至少 140个，或至少 150个，或全部 161个。具体地，根据本发明的实施例，所述一组 DNA标签优选地至少包括表 1所示的 161个 DNA标签的 DNA Indexl ~ DNA IndexlO, 或 DNA Indexl l ~ DNA Index20 , 或 DNA Index21 - DNA Index30 , 或 DNA Index31 ~ DNA Index40, 或 DNA Index41 ~ DNA Index50 , 或 DNA Index51 - DNA Index60 , 或 DNA Index61 - DNA Index70 , 或 DNA Index71 ~ DNA Index80 , 或 DNA Index 81 ~ DNA Index90 , 或 DNA Index91 ~ DNA Index 100 ,或 DNA IndexlOl ~ DNA Indexl 10,或 DNA Indexl 11 ~ DNA Index 120 ,或 DNA Index 121 ~ DNA Index 130, 或 DNA Index 131 ~ DNA Index 140 , 或 DNA Index 141 ~ DNA Indexl50 , 或 DNA Indexl 51 - DNA Indexl61 , 或者他们任何两个或多个的组合。在本发明的一些具体示例中，所述相差 1个碱基包括对表 1所示 161个 DNA标签的序列中 1个碱基的取代、添加或缺失。

根据本发明的实施例，本发明还提供了将根据本发明实施例的 DNA标签用于 DNA 标签文库构建并测序的用途，其中 DNA标签文库的 PCR标签引物包含根据本发明实施例的 DNA标签，从而构成各自相对应的 PCR标签引物。才艮据该用途的实施例， DNA标签插入 PCR标签引物中。

PCR标签引物以及构建 DNA标签文库

根据本发明的又一方面，本发明提供了一组分离的 PCR标签引物，其可以用于将前面所描述的 DNA标签引入到样品的 DNA中，进而构建 DNA标签文库。 #居本发明的实施例，该组分离的 PCR标签引物分别由 SEQ ID NO: 162-322所示的核苷酸构成。根据本发明的实施例，上述 PCR标签引物分别具有如前所述的根据本发明实施例的 DNA标签，通过釆用 PCR标签引物的 PCR反应，可以将 PCR标签引物引入样品的 DNA或其等同物中，从而将相应的 DNA标签引入到 DNA或其等同物中。具体地，这些 PCR标签引物的序列如前面表 2所示，在此不再赘述。

发明人发现，根据本发明的实施例所提供的 PCR 标签引物（DNA PCR IndexN Primer ) 具有较高的稳定性。该发现主要是根据本发明的一些实施例得来的，具体地，根据本发明的实施例，使用 Lasergene的 PrimerSelect软件预测并分析了根据本发明实施例的 161个 PCR标签引物各自形成的发夹结构、自身延长二聚体结构、自身二聚体结构。进一步，如下表 3所示，发明人提供了对 DNA PCR标签引物进行上述预测的结果。其中， [ST_Hairpin] Score表示发夹得分； [AD_Self_Extend_Dimer] Score表示自身延长二聚体得分； [ST_Self_Dimer] Score表示自身二聚体得分。

表 3 各 DNA PCR \ 签引物形成的发夹结构和自身的二级结构的预测得分

[ST_Hairpin] [AD_Self_Extend_ [ST_Self_Dimer] 名称

Score Dimer] Score Score

DNA PCR Index 1 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 2 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 3primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 4 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 5 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 6 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 7 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 8 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 9 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index lOprimer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 11 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 12 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 13 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 14 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 15 primer 1.49 1.34 3.43

DNA PCR Index 16 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 17 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 18 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 19 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 20 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 21 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 22 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 23 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 24 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 25 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 26 primer 1.49 1.52 3.43 DNA PCR Index 27 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 28 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 29 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 30 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 31 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 32 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 33 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 34 primer 1.49 3.28 3.43

DNA PCR Index 35 primer 1.49 3.28 3.43

DNA PCR Index 36 primer 1.49 3.28 3.43

DNA PCR Index 37 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 38 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 39 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 40 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 42 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 43 primer 1.49 1.52 3.43

DNA PCR Index 44 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 45 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 46 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 47 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 48 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 49 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 50 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 51 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 52 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 53 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 54primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 55primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 56 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 57 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 58 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 59 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 60 primer 1.49 1.76 3.43

DNA PCR Index 61 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 62 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 63 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 64 primer 1.49 0.64 3.43

DNA PCR Index 65 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 66 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 67 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 68 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 69 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 70 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 71 primer 1.49 0.59 3.43 DNA PCR Index 72 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 73 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 74 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 75 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 76 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 77 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 78 primer 1.49 0.71 3.43

DNA PCR Index 79 primer 1.49 2.97 3.43

DNA PCR Index 80 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 81 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 82 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 83 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 84 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 85 primer 1.49 0.59 3.43

DNA PCR Index 86 primer 1.51 0.59 3.43

DNA PCR Index 87 primer 1.56 3.13 3.43

DNA PCR Index 88 primer 1.57 0.59 3.43

DNA PCR Index 89 primer 1.57 1.52 3.43

DNA PCR Index 90 primer 1.58 0.59 3.43

DNA PCR Index 91 primer 1.69 0.59 3.43

DNA PCR Index 92 primer 1.75 0.59 3.43

DNA PCR Index 93 primer 1.82 1.52 3.43

DNA PCR Index 94 primer 1.87 0.59 3.43

DNA PCR Index 95 primer 1.99 0.59 3.43

DNA PCR Index 96 primer 2.06 3.28 3.43

DNA PCR Index 97 primer 2.13 0.59 3.43

DNA PCR Index 98 primer 2.14 3.28 3.43

DNA PCR Index 99 primer 2.20 1.52 3.43

DNA PCR Index 100 primer 2.23 1.52 3.43

DNA PCR Index 101 primer 2.30 3.28 3.43

DNA PCR Index 102 primer 2.31 0.59 3.43

DNA PCR Index 103 primer 2.31 0.59 3.43

DNA PCR Index 104 primer 2.34 0.18 3.43

DNA PCR Index 105primer 2.51 0.59 3.43

DNA PCR Index 106 primer 2.53 0.59 3.43

DNA PCR Index 107 primer 2.58 0.59 3.43

DNA PCR Index 108 primer 2.59 0.59 3.43

DNA PCR Index 109 primer 2.68 1.52 3.43

DNA PCR Index 110 primer 2.73 0.59 3.43

DNA PCR Index 111 primer 2.89 0.59 3.43

DNA PCR Index 112 primer 3.12 1.52 3.43

DNA PCR Index 113 primer 3.16 0.59 3.43

DNA PCR Index 114 primer 3.16 0.59 3.43

DNA PCR Index 115 primer 3.67 1.34 3.43 DNA PCR Index 116 primer 4.25 0.59 3.43

DNA PCR Index 117 primer 4.65 1.52 3.43

DNA PCR Index 118 primer 1.71 0.59 3.47

DNA PCR Index 119 primer 3.93 0.59 3.47

DNA PCR Index 120 primer 2.86 0.59 3.54

DNA PCR Index 121 primer 3.51 1.52 3.57

DNA PCR Index 122 primer 2.45 0.59 3.64

DNA PCR Index 123 primer 2.20 0.59 3.75

DNA PCR Index 124 primer 1.49 0.59 3.76

DNA PCR Index 125 primer 1.49 0.59 3.76

DNA PCR Index 126 primer 1.49 0.59 3.76

DNA PCR Index 127 primer 2.13 0.59 3.79

DNA PCR Index 128 primer 2.99 1.52 3.83

DNA PCR Index 129 primer 2.62 0.59 3.90

DNA PCR Index 130 primer 2.86 0.59 3.99

DNA PCR Index 131 primer 2.66 0.59 4.03

DNA PCR Index 132 primer 2.23 1.52 4.04

DNA PCR Index 133 primer 1.49 0.59 4.07

DNA PCR Index 134 primer 1.49 1.95 4.18

DNA PCR Index 135 primer 6.59 0.59 4.19

DNA PCR Index 136 primer 1.61 1.67 4.28

DNA PCR Index 137 primer 1.84 0.59 4.49

DNA PCR Index 138 primer 2.06 0.59 4.55

DNA PCR Index 139 primer 1.49 3.28 4.62

DNA PCR Index 140 primer 1.49 1.95 4.75

DNA PCR Index 141 primer 1.49 0.59 4.75

DNA PCR Index 142 primer 2.90 4.81 4.81

DNA PCR Index 143 primer 2.90 4.81 4.81

DNA PCR Index 144 primer 1.49 0.59 4.96

DNA PCR Index 145 primer 4.04 2.05 5.09

DNA PCR Index 146 primer 2.16 0.59 5.23

DNA PCR Index 147 primer 2.49 0.59 5.33

DNA PCR Index 148 primer 2.49 0.59 5.33

DNA PCR Index 149 primer 1.87 1.52 5.33

DNA PCR Index 150 primer 2.15 2.03 5.43

DNA PCR Index 151 primer 1.71 1.52 5.52

DNA PCR Index 152 primer 2.61 0.59 5.52

DNA PCR Index 153 primer 1.49 1.52 6.10

DNA PCR Index 154 primer 4.68 0.59 6.18

DNA PCR Index 155 primer 7.00 8.34 8.34

DNA PCR Index 156 primer 1.49 1.52 10.57

DNA PCR Index 157 primer 1.49 0.59 12.46

DNA PCR Index 158 primer 3.11 0.59 3.43

DNA PCR Index 159 primer 1.49 0.59 3.43

根据本发明的一些实施例，本发明提供了一些 DNA PCR标签引物，其在 3'末端包含前面所述根据本发明实施例的的 DNA标签。根据本发明的实施例，这些 PCR标签引物包括如下或由如下组成：表 2所示 161个 PCR标签引物序列或与其所包含的 DN A标签序列相差 1个碱基的 PCR标签引物序列中的至少 10个，或至少 20个，或至少 30个，或至少 40 个，至少 50个，或至少 60个，或至少 70个，或至少 80个，或 90个，或至少 100个，或至少 110个，或至少 120个，或至少 130个，或至少 140个，或至少 150个，或全部 161个。才艮据本发明的具体示例，这些 PCR标签引物序列优选地至少包括表 2所示的 161个 PCR标签引物序列中的 DNA PCR index 1 primer ~ DNA PCR index 10 primer, 或 DNA PCR index 11 primer - DNA PCR index20 primer, 或 DNA PCR index21 primer - DNA PCR index30 primer, 或 DNA PCR index31 primer - DNA PCR index40 primer, 或 DNA PCR index41 primer - DNA PCR index50 primer, 或 DNA PCR index51 primer - DNA PCR index60 primer, 或 DNA PCR index61 primer - DNA PCR index70 primer, 或 DNA PCR index71 primer - DNA PCR index80 primer, 或 DNA PCR index81 primer - DNA PCR index90 primer, 或 DNA PCR index91 primer ~ DNA PCR index 100 primer, 或 DNA PCR indexlOl primer ~ DNA PCR indexl lO primer, 或 DNA PCR index 111 primer ~ DNA PCR index 120 primer,或 DNA PCR indexl21 primer ~ DNA PCR indexl30 primer,或 DNA PCR indexl31 primer ~ DNA PCR index 140 primer, 或 DNA PCR indexl41 primer ~ DNA PCR index 150 primer, 或 DNA PCR indexl51 primer ~ DNA PCR indexl61 primer, 或者他们任何两个或多个的组合。根据具体的示例，相差 1个碱基包括对标签序列中 1个碱基的取代、添加或删除。根据本发明的实施例，还提供了 PCR标签引物用于 DNA标签文库构建并测序的用途。由此，根据本发明的实施例，还提供了使用上述 PCR标签引物构建的 DNA标签文库。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种利用上述 PCR标签引物构建 DNA标签文库的方法。具体地，根据本发明的实施例，参考图 2, 该方法包括：

首先，将 DNA样品片段化，以获得特定长度的 DNA片段。根据本发明的实施例， DN A样品的来源并不受特别限制，可以来源于所有真核和原核生物。根据本发明的一个实施例， DNA样品来自于人 DNA样品，更具体的，可以为人基因组 DNA样品。根据本发明的实施例，利用 Covaris打碎仪将 DNA样品片段化，所得 DNA片段的长度为约 200bp。

其次，将 DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的 DNA片段。

接着，在经过末端修复的 DNA片段的两条寡核苷酸链的 3，末端分别添加碱基 A, 以便获得具有粘性末端 A的 DNA片段。

接下来，在具有粘性末端 A的 DN A片段两端分别连接 DN A接头，以便获得连接产物。根据本发明的实施例， DNA接头由 SEQ ID NO: 323和 SEQ ID NO: 324所示的核苷酸序列构成。根据本发明的实施例，在进入下一步骤前，还可以将连接产物通过 2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离回收。

然后，将连接产物进行 PCR反应，以便获得 PCR扩增产物。根据本发明的实施例， PCR反应釆用 PCR标签引物，此 PCR标签引物为选自根据本发明实施例的一组分离的 PCR标签引物的一种，其包含选自根据本发明实施例的一组分离的 DNA标签中的一种。根据本发明的实施例， PCR反应的另一条引物具有 SEQ ID NO: 325所示核苷酸序列，在本说明书中称为 PE PCR Primers 1.0。具体地，根据本发明的一些具体示例，优选地釆用 PE PCR Primers 1.0作为上游序列， PCR标签引物作为下游序列进行 PCR反应。根据本发明的实施例， PCR扩增产物包含目的片段、 DNA接头以及 DNA标签，其中目的片段的序列与 DNA片段的序列相对应。在这里，目的片段的序列与 DNA片段的序列相对应，其含义是指，可以通过目的片段的序列直接推导出 DNA片段的序列，例如，目的片段的序列可以与 DNA片段的序列完全相同，也可以是完全互补，甚至是增加或者减少了已知数目的已知碱基，只要能够通过有限的计算获得的 DNA的序列即可。 #居本发明的实施例， PCR扩增产物的长度为约 280-300bp。

最后，分离回收所得的 PCR扩增产物，这些 PCR扩增产物构成所述 DNA标签文库。根据本发明的实施例，分离回收 PCR扩增产物的方法不受特别限制，本领域技术人员可以根据 PCR扩增产物的特点选择适当的方法和设备进行分离。根据本发明的一个具体示例，利用 2%的琼脂糖凝胶电泳分离回收所得的 PCR扩增产物。

进一步，根据本发明的实施例，本发明提供了一种构建 DNA标签文库的方法，其包括：

1 ) 提供 n个 DNA样品， n为整数且 1 < n < 161的整数，优选地 n为整数且 2 < n < 161 , 所述 DNA样品来自所有真核和原核 DNA样品，包括但不限于人 DNA样品；

2 ) 将基因组 DNA 打断，其中打断方法包括但不限于超声波打断方法，优选地使打断后的 DNA条带集中在 200bp左右；

3 ) 末端修复；

4 ) DNA片段 3，末端加碱基 "A" ；

5 ) 连接 DNA接头；

6 )将步骤 5 )得到的连接产物进行凝胶回收纯化，优选地通过 2 %的琼脂糖胶进行电泳并回收，并将各个 DNA样品的回收产物混合在一起；

7 ) PCR反应，使用步骤 6 ) 的回收产物的混合物作为模板，在适于扩增目的核酸的条件下进行 PCR扩增，将 PCR产物进行胶回收纯化，优选地回收 280 ~ 300bp的目的片段。

根据本发明的一些具体示例，上述根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法的步骤 7 ) PCR反应中使用的引物如下：

上游引物是 PE PCR Primers 1.0:

GATCT;

下游引物是包括如下或由如下组成的 DNA PCR标签引物：表 2所示 161个 DNA PCR 标签引物或与其所包含的 DNA标签序列相差 1个碱基的 DNA PCR标签引物中的至少 10 个，或至少 20个，或至少 30个，或至少 40个，至少 50个，或至少 60个，或至少 70个，或至少 80个，或 90个，或至少 100个，或至少 110个，或至少 120个，或至少 130个，或至少 140个，或至少 150个，或全部 161个。上述根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法中，釆用的 DNA PCR标签引物优选地至少包括表 2所示的 161个 DNA PCR标签引物中的 DNA PCR index 1 primer - DNA PCR index 10 primer, 或 DNA PCR index 11 primer - DNA PCR index20 primer, 或 DNA PCR index21 primer ~ DNA PCR index30 primer, 或 DNA PCR index31 primer - DNA PCR index40 primer, 或 DNA PCR index41 primer - DNA PCR index50 primer, 或 DNA PCR index51 primer ~ DNA PCR index60 primer, 或 DNA PCR index61 primer - DNA PCR index70 primer, 或 DNA PCR index71 primer - DNA PCR index80 primer, 或 DNA PCR index81 primer ~ DNA PCR index90 primer, 或 DNA PCR index91 primer ~ DNA PCR index 100 primer, 或 DNA PCR indexlOl primer ~ DNA PCR indexl lO primer, 或 DNA PCR index 111 primer ~ DNA PCR index 120 primer, 或 DNA PCR index 121 primer - DNA PCR index 130 primer , 或 DNA PCR indexl31 primer ~ DNA PCR index 140 primer, 或 DNA PCR indexl41 primer ~ DNA PCR index 150 primer, 或 DNA PCR indexl51 primer ~ DNA PCR indexl61 primer, 或者他们任何两个或多个的组合。根据本发明的实施例，相差 1个碱基包括标签中 1个碱基的取代、添加或删除。根据本发明的实施例，其中上述根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法的步骤 5 ) 中使用的 DNA接头是 PE index Adapters:

5， Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

5， TAC ACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT。

利用根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法，能够有效地将根据本发明实施例的 DNA标签引入到针对 DNA样品所构建的 DNA标签文库中。从而可以通过对 DNA标签文库进行测序，获得 DNA样品的序列信息以及 DNA标签的序列信息，从而能够对 DNA样品的来源进行区分。另外，发明人惊奇地发现，当针对相同的样品，基于上述方法，釆用具有不同标签的 PCR标签引物构建含有各种 DNA标签的 DNA标签文库时，所得到的测序数据结果的稳定性和可重复性非常好。

根据本发明的实施例，本发明对 Illumina提供的 DNA标签文库构建方法进行了优化，将 Illumina公司提供的通过 3条 PCR引物（两条公用引物和一条 PCR标签引物）导入标签的建库方法优化为仅通过两条 PCR引物（一条 PE PCR Primers 1.0和一条 PCR 标签引物）即能导入标签，这样就降低了 PCR反应的难度，提高了 PCR扩增的特异性，也就提高了 PCR扩增反应的效率，同时本发明还提高了标签序列的识别效率，从而提高了 DNA标签文库的构建效率，降低了文库构建的费用。另一方面，根据本发明实施例提供的构建 DNA标签文库的方法，因为提高了标签的数量（ 161种），所以可以同时针对多种（ 2-161种）DNA样品构建 DNA标签文库进而进行混合测序，相对于 Illumina 公司的只能最多针对 12种 DNA样品构建 DNA标签文库进而进行混合测序，有了明显的改进，从而能够节省测序资源，充分的利用高通量测序平台。具体情况，可比较参照图 1和图 2, 其中图 1所示的 Illumina公司的 DNA 标签文库构建方法的流程图，图 2 所示的根据本发明的实施例的 DNA 标签文库构建方法的流程图。目前为止，通过这些 PCR标签引物导入标签的 DNA文库构建方法及其标签序列，并没有相关的报道。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于构建 DNA标签文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括： 161种分离的 PCR标签引物，这些 PCR标签引物分别由 SEQ ID NO: 162-322所示的核苷酸构成，其中，这 161种分离的 PCR标签引物分别设置在不同的容器中。由此，利用该试剂盒，能够方便地将根据本发明实施例的 DNA标签引入到构建的 DNA标签文库中。当然，本领域技术人员能够理解，试剂盒中还可以包含其他用于构建 DNA标签文库的常规组件，在此不再赘述。

DNA标签文库及测序方法

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种 DNA标签文库，其是根据本发明的构建 DNA标签文库的方法所构建的。该具有标签的 DNA标签文库可以有效地应用于高通量测序技术例如 Solexa技术，从而可以通过获得标签序列，来对所获得的核酸序列信息例如 DNA序列信息来精确地进行样品来源分类。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种确定 DNA样品序列信息的方法。根据本发明的实施例，其包括：根据本发明实施例的构建 DNA 标签文库的方法，构建 DNA标签文库；接着，对所构建的 DNA标签文库进行测序，以确定 DNA样品的序列信息。基于该方法，能够有效地获得 DNA标签文库中 DNA样品的序列信息以及 DNA 标签的序列信息，从而能够对 DNA样品的来源进行区分。另外，发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的方法确定 DNA样品序列信息，能够有效地减少数据产出偏向性的问题，并且能够精确地对多种 DNA标签文库进行区分。根据本发明的实施例，可以釆用任何已知的方法对所构建的 DNA标签文库进行测序，其类型并不受特别限制。根据本发明的一些示例，可以利用 Solexa测序技术对 DNA标签文库进行测序。根据本发明的实施例，可以根据具体情况选择合适的测序引物进行测序。

进一步，可以将上面确定 DNA样品序列信息的方法应用于多种样品。例如，根据本发明的实施例，本发明提供了一种确定多种 DNA样品序列信息的方法。根据本发明的实施例，其包括以下步骤：针对多种样品的每一种，分别独立地根据根据本发明的实施例的构建 DNA标签文库的方法，构建该 DNA样品的 DNA标签文库，其中，不同的 DNA样品釆用相互不同并且已知序列的 DNA标签，这里所使用的术语"多种"为 2-161 种。将得到的多种样品的 DNA标签文库进行组合，以便获得 DNA标签文库混合物。利用 Solexa测序技术，对所得的 DNA标签文库混合物进行测序，从而获得 DNA样品的序列信息以及标签的序列信息。最后，基于标签的序列信息，对 DNA样品的序列信息进行分类，以便确定所述多种 DNA样品的序列信息。由此，根据本发明实施例的该方法，可以充分利用高通量的测序技术，例如利用 Solexa测序技术，同时对多种样品的 DNA文库进行测序，从而提高 DNA文库测序的效率和通量，同时可以提高确定多种 DNA样品的序列信息的效率。关于测序的方法和釆用的测序引物，前面已经进行了详细描述，此处不再赞述。

需要说明的是，根据本发明实施例的确定 DNA样品序列信息的方法是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以釆购自 Illumina公司。

实施例 1:

Paired End DNA PCR标签引物序列：

PE index Adapters

5， Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

5， TAC ACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCG ATCT

GATCT

实施例 1:

1.1 DNA片段化

将人全血基因组 DNA 5微克使用 Covaris打碎仪打断 6分钟（参数设置： Duty cycle (负载比）一 20% ； Intensity (强度 )—5.0 ； Bursts per second (每秒钟脉冲 )—200 ； Duration (持续时间 )― 40 seconds ； Mode (模式）一 Frequency sweeping (频率扫描）； Power (功率）一 33-34W ； Temperature (温度）一 5.5 to 6°C ) , 使其在琼脂糖电泳中显示的主要条带集中在 200 bp 左右（Preparing samples for multiplexed Paired-End sequencing; Illumina part#1005361 Rev.B , 通过参照将其全文并入本文）。

1.2 末端修复

按照下列的配比准备反应混合：

DNA模板 35微升

T4 DNA 连接酶緩冲液 50微升

dNTPs 混合液 4微升 T4 DNA聚合酶 5微升

Klenow DNA聚合酶 1微升

T4多聚核苷酸激酶 5微升

总体积 10C敫升

将舒适型恒温混匀器调至 20 °C , 反应 30 , 然后用 QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于 32微升 EB solution。

1.3 DNA片段 3'末端力口 "A "碱基

按照下列的配比准备反应混合物：

末端修复后的 DNA 32微升

Klenow酶緩冲液 5微升

dATP(lmM) 10微升

Klenow 酶 (3'到 5'外切酶活性) 3微升

总体积 50微升

将舒适型恒温混匀器调至 37 °C , 反应 30min, 然后用 MiniElute PCR纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于 1(敫升 EB solution。

1.4 连接 DNA接头

按照下列的配比准备反应混合物：

DNA 10微升

T4 DNA 连接酶緩冲液 25^敫升

PE index Adapters 10微升

T4 DNA 连接酶 5微升

总体积 50微升

将舒适型恒温混匀器调至 20°C , 反应 15min, 然后用 QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于 3(敫升 EB solution

1.5 连接产物的胶回收纯化

将连接产物于 2%的琼脂糖胶中进行电泳分离；随后将目的片段条带切胶转移至 Eppendorf管中。用 QIAquick胶纯化试剂盒进行胶纯化回收，回收产物溶于 20微升 EB solution。

1.6 PCR反应导入标签接头

PCR反应：按照下列的反应体系准备反应混合物，将试剂放置于水上。

胶回收纯化后的 DNA 1(M敫升

Phusion DNA聚合酶 25微升

PE PCR Primers 1.0 1微升

DNA PCR标签 I物 1微升

ddH₂0 13 微升总体积 50微升

注：对于每一个 DNA样品，所使用的 DNA PCR标签引物可为表 4中所示 DNA PCR 标签引物（ DNA PCR indexN primer ) 中的任意一种接头（表 4) ,

PCR反应条件

98 °C 30s

15个循环

1.7 PCR产物的胶回收纯化

将 PCR产物于 2%琼脂糖胶中电泳分离，切割回收目的片段，用 QIAquick胶纯化试剂盒进行胶纯化回收，回收产物溶于 30微升 Elution Buffer。

1.8 DNA制备产物检测

1 ) 使用 Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库产量。

2 ) 使用 QPCR定量检测文库产量。

图 3 : 显示了由根据本发明实施例的 DNA 标签的 Solexa测序数据统计得到的其 1 个错误匹配 /0个错误匹配（ lmismatch/Omismatch )的比例。将根据本发明实施例的 161 种 DNA 标签进行 Solexa测序，由测序数据进行统计，分析其是否合格，结果如图 3 所示。其中， 1错误匹配 ( mismatch ) /0错误匹配的比例均控制在 5%以下，大部分控制在 3%以下，通过 Solexa 测序共得到 24362092 条序列，其中标签完全配对的序列 ( Omismatch ) 有 23099149条序列 , 标签测序出现 1个错误碱基的有 460238 条序列 , 即可以识别的标签的比例为 96.7%。表明根据本发明实施例的 161种 DNA 标签均合格，即可以满足 solexa DNA标签建库需求。

工业实用性

本发明的用于构建 DNA标签文库的 DNA标签、 PCR标签引物、 DNA标签文库及其制备方法、确定 DNA样品序列信息的方法、确定多种 DNA样品序列信息的方法以及用于构建 DNA标签文库的试剂盒，能够应用于 DNA测序，并且能够有效地提高测序平台，例如 Solexa测序平台的测序通量。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

在本说明书的描述中，参考术语 "一个实施例" 、 "一些实施例" 、 "示意性实施例" 、 "示例" 、 "具体示例" 、或 "一些示例" 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

权利要求书

1、一组分离的 DNA标签，其分别由 SEQ ID NO: 1-161所示的核苷酸构成。

2、一组分离的 PCR标签引物，其分别由 SEQ ID NO: 162-322所示的核苷酸构成。

3、一种制备 DNA标签文库的方法，其特征于，包括以下步骤：

将 DNA样品片段化，以获得特定长度的 DNA片段；

将所述 DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的 DNA片段；

在所述经过末端修复的 DNA片段的两条寡核苷酸链的 3 '末端分别添加碱基 A , 以便获得具有粘性末端 A的 DNA片段；

在所述具有粘性末端 A的 DNA片段两端分别连接 DNA接头，以便获得连接产物；将所述连接产物进行 PCR反应，以便获得 PCR扩增产物，其中所述 PCR反应釆用 PCR 标签引物，其中所述 PCR标签引物包含选自权利要求 1所述一组分离的 DNA标签中的一种，所述 PCR扩增产物包含目的片段、 DNA接头以及 DNA标签，其中所述目的片段的序列与所述 DNA片段的序列相对应；以及

分离回收所述 PCR扩增产物，所述 PCR扩增产物构成所述 DNA标签文库。

4、根据权利要求 3所述的制备 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述 DNA样品来自于人 DNA样品。

5、根据权利要求 3所述的制备 DNA标签文库的方法，其特征在于，

利用 Covaris打碎仪将 DNA样品片段化。

6、根据权利要求 3所述的制备 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述 DNA片段的长度为约 200bp。

7、根据权利要求 3所述的制备 DNA标签文库的方法，其特征在于，

在将所述连接产物进行 PCR反应之前，还包括分离回收所述连接产物的步骤。

8、根据权利要求 3所述的制备 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述 PCR标签引物为选自根据权利要求 2所述的一组分离的 PCR标签引物的一种。

9、根据权利要求 8所述的制备 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述 PCR反应进一步釆用具有 SEQ ID NO: 325所示核苷酸序列的引物。

10、根据权利要求 3所述的制备 DNA标签文库的方法，其特征在于，

利用 2%的琼脂糖凝胶电泳分离回收所述连接产物及 PCR扩增产物。

11、根据权利要求 3所述的制备 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述 PCR扩增产物的长度为约 280-300bp。

12、一种 DNA标签文库，其是根据权利要求 3-11任一项所述的方法建立的。

13、一种确定 DNA样品序列信息的方法，其包括以下步骤：

根据权利要求 3-1 1任一项所述的方法，建立所述 DNA样品的 DNA标签文库；以及

对所述 DNA标签文库进行测序，以确定所述 DNA样品的序列信息。

14、根据权利要求 13所述的确定 DNA样品序列信息的方法，其特征在于，对所述 DNA标签文库进行测序是利用 Solexa测序技术进行的。

15、一种确定多种 DNA样品序列信息的方法，其包括下列步骤：

针对所述多种样品的每一种，分别独立地根据权利要求 3-11任一项所述的方法，建立所述 DNA样品的 DNA标签文库，其中，不同的 DNA样品釆用相互不同并且已知序列的 DNA标签，其中所述多种为 2-161种；

将所述多种样品的 DNA标签文库进行组合，以便获得 DNA标签文库混合物；利用 Solexa测序技术，对所述 DNA标签文库混合物进行测序，以获得所述 DNA 样品的序列信息以及所述标签的序列信息；以及

基于所述标签的序列信息对所述 DNA样品的序列信息进行分类，以便确定所述多种样品的 DNA序列信息。

16、一种用于构建 DNA标签文库的试剂盒，其包括：

161种分离的 PCR标签引物，所述 PCR标签引物分别由 SEQ ID NO: 162-322所示的核苷酸构成，

其中，所述 161种分离的 PCR标签引物分别设置在不同的容器中。