CN107937986A - 一种ffpe dna建库用试剂盒、其用途及建库方法 - Google Patents
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Abstract
一种FFPE DNA建库用试剂盒、其用途及建库方法，所述试剂盒包括特定的接头连接缓冲液、DNA连接酶溶液和接头序列的组合。使用本发明的试剂盒进行FFPE DNA文库构建，能够最大化地提高连接效率和PCR扩增效率，从而降低DNA建库的起始量，减少扩增循环数，使其满足探针捕获的预扩增产物量的需求，降低测序过程中产生的重复，提高数据利用率。
Description
技术领域
本发明涉及核酸文库构建技术领域，具体涉及一种FFPE DNA建库用试剂盒、其用途及建库方法。
背景技术
新一代测序(NGS)是目前常用的有效获取人类癌症基因组信息的高通量测序方法，可以获取点突变、基因拷贝数变异、基因表达、基因融合等各种类型的遗传信息，能够勾画出肿瘤相关的遗传变异全景。目前，NGS已经逐渐渗透到肿瘤病理分子诊断领域，而且患者样本类型不再局限于血液，病理组织也可以作为初始样本进行检测，大大丰富了肿瘤基因诊断的内容。
肿瘤基因检测最常用的标准病理诊断样本是福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)。FFPE样本经过病理医生的诊断，可确保组织样本含有足量的肿瘤细胞用于肿瘤相关基因的检测分析，但福尔马林会导致DNA的片段化和交联，对NGS文库构建及测序的结果有很大的影响。
NGS文库构建方法分为两种，分别是靶向富集扩增和探针杂交捕获。靶向富集扩增方法，根据目标基因序列设计一组引物，通过多重PCR扩增来富集靶点基因，用于NGS测序分析。其优点是初始DNA用量少，相对于探针杂交捕获法用时较短，测序数据生物信息分析较为简单；缺点是PCR扩增有引入等位基因变异的潜在风险，出现假阳性。探针杂交捕获方法是通过生物素标记的一组探针与基因组DNA进行杂交来捕获目标靶序列。其优点是与富集扩增法相比，检测基因拷贝数变化更加可靠；缺点是需要更深的测序深度和更复杂的生物信息分析，且操作流程复杂，消耗时间长，起始DNA用量也较多。
由于靶向富集扩增存在着特异性差，每个扩增反应允许的位点数目少，数据量偏差大等情况，而探针杂交特异性较高，结果可靠等因素，占据着市场的大部分份额。由于FFPE经过福尔马林制备会导致DNA的片段化和交联，妨碍了核酸的提取，抑制脱氧核糖核酸聚合酶、PCR扩增，提取后的DNA经常出现碱基氧化，所以，在文库制备过程中经常存在接头连接效率低，扩增效率非常低而导致文库制备失败的情况发生。
现有技术中针对石蜡样本的捕获情况如图1所示，捕获效率20-60％，均值41.5％，偏差9.4％，偏低；重复(Duplication)10-80％，均值39.4％，偏差18.7％，偏高；数据量和测序深度不成线性，分布杂乱，无规律。以上情况发生的原因在于在建库过程中连接效率低，预扩增(pre-PCR)的效率低，而导致捕获的模板量少，造成捕获效率差，重复高。
发明内容
本发明提供一种FFPE DNA建库用试剂盒、其用途及建库方法，能够最大化地提高连接效率和PCR扩增效率，从而降低DNA建库的起始量，减少扩增循环数，使其满足探针捕获的预扩增产物量的需求，降低测序过程中产生的重复，提高数据利用率。
根据第一方面，一种实施例中提供一种FFPE DNA建库用试剂盒，该试剂盒包括如下组分：
接头连接缓冲液，其包括100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，2mM dATP，500mM NaCl；
DNA连接酶溶液，其包括600000U/ml T4DNA连接酶，10mM Tris-HCl，50mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油；
接头序列1：5′-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：13)；
接头序列2：5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO：14)。
进一步地，上述试剂盒还包括如下组分：
末端修复加A缓冲液，其包括500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，10mMATP，4mM dATP，4mM dCTP，4mM dGTP，4mM dTTP；
末端修复加A酶混合物，其包括3000U/ml T4DNA聚合酶，10000U/ml T4聚核苷酸激酶，100mM KCl，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1％Triton X-100，50％甘油。
进一步地，上述试剂盒还包括如下组分：
DNA扩增预混液，其包括1U/μL DNA聚合酶，5×高保真缓冲液，5×GC缓冲液，10mMdNTPs，以及25mM MgCl2；
引物序列1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO：15)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同；
引物序列2：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：16)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同。
根据第二方面，一种实施例中提供一种FFPE DNA建库用试剂盒，该试剂盒包括如下组分：
DNA连接预混液，其包括300000U/ml T4DNA连接酶，50mM NaCl，0.1mM EDTA，50％甘油，100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，1mM dATP；
接头序列1：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG ATCT(SEQ IDNO：1)；
接头序列2：
5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGT CTTCTGCTTG(SEQ ID NO：2)，其中NNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同。
进一步地，上述试剂盒还包括如下组分：
末端修复加A缓冲液，其包括400mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT；10mMATP，5mM dATP，5mM dCTP，5mM dGTP，5mM dTTP；
末端修复加A酶混合物，其包括4000U/ml T4DNA聚合酶，10000U/ml T4聚核苷酸激酶，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1％Triton X-100，50％甘油。
进一步地，上述试剂盒还包括如下组分：
DNA扩增预混液，其包括1U/μL DNA聚合酶，5×高保真缓冲液，5×GC缓冲液，10mMdNTPs，以及25mM MgCl2；
引物序列1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO：3)；
引物序列2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO：4)。
根据第三方面，一种实施例中提供第一方面或第二方面的试剂盒在FFPE DNA建库中的用途。
根据第四方面，一种实施例中提供一种FFPE DNA建库方法，该方法包括采用第一方面或第二方面的试剂盒进行接头连接的步骤。
进一步地，上述方法包括如下步骤：
(1)末端修复加A反应步骤，该步骤采用如下组分：
末端修复加A缓冲液，其包括500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，10mMATP，4mM dATP，4mM dCTP，4mM dGTP，4mM dTTP；
末端修复加A酶混合物，其包括3000U/ml T4DNA聚合酶，10000U/ml T4聚核苷酸激酶，100mM KCl，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1％Triton X-100，50％甘油；
(2)接头连接步骤，该步骤采用如下组分：
接头连接缓冲液，其包括100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，2mM dATP，500mM NaCl；
DNA连接酶溶液，其包括600000U/ml T4DNA连接酶，10mM Tris-HCl，50mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油；
接头序列1：5′-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：13)；
接头序列2：5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO：14)；
(3)预扩增步骤，该步骤采用如下组分：
DNA扩增预混液，其包括1U/μL DNA聚合酶，5×高保真缓冲液，5×GC缓冲液，10mMdNTPs，以及25mM MgCl2；
引物序列1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO：15)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同；
引物序列2：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：16)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同。
进一步地，上述方法包括如下步骤：
(1)末端修复加A反应步骤，该步骤采用如下组分：
末端修复加A缓冲液，其包括400mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT；10mMATP，5mM dATP，5mM dCTP，5mM dGTP，5mM dTTP；
末端修复加A酶混合物，其包括4000U/ml T4DNA聚合酶，10000U/ml T4聚核苷酸激酶，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1％Triton X-100，50％甘油；
(2)接头连接步骤，该步骤采用如下组分：
DNA连接预混液，其包括300000U/ml T4DNA连接酶，50mM NaCl，0.1mM EDTA，50％甘油，100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，1mM dATP；
接头序列1：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG ATCT(SEQ IDNO：1)；
接头序列2：
5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGT CTTCTGCTTG(SEQ ID NO：2)，其中NNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同；
(3)预扩增步骤，该步骤采用如下组分：
DNA扩增预混液，其包括1U/μL DNA聚合酶，5×高保真缓冲液，5×GC缓冲液，10mMdNTPs，以及25mM MgCl2；
引物序列1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO：3)；
引物序列2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO：4)。
使用本发明的试剂盒进行FFPE DNA文库构建，能够最大化地提高连接效率和PCR扩增效率，从而降低DNA建库的起始量，减少扩增循环数，使其满足探针捕获的预扩增产物量的需求，降低测序过程中产生的重复，提高数据利用率。
附图说明
图1示出了现有技术中针对石蜡样本的捕获情况的数据；
图2示出了本发明一个实施例中针对石蜡样本的捕获情况的数据。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
为解决现有技术中遇到的问题，本发明实施例中配置了多种不同的试剂和接头进行多角度的测试。具体而言，本发明实施例配置如下四种试剂与四种接头序列进行组合实验：
第一种试剂成分如下表1所示：
表1
第二种试剂成分如下表2所示：
表2
第三种试剂成分如下表3所示：
表3
第四种试剂成分如下表4所示：
表4
四种接头序列和对应引物，分别如下所示：
第一种接头序列和对应引物如下：
接头序列1：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG ATCT(SEQ IDNO：1)；
接头序列2：
5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGT CTTCTGCTTG(SEQ ID NO：2)，其中NNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同，分别可以是一段随机碱基序列；
引物1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO：3)；
引物2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO：4)。
第二种接头序列和对应引物如下：
接头序列1：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG ATCT(SEQ IDNO：5)；
接头序列2：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：6)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同，分别可以是一段随机碱基序列；
引物1：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ ID NO：7)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同，分别可以是一段随机碱基序列；
引物2：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ ID NO：8)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同，分别可以是一段随机碱基序列。
第三种接头序列和对应引物如下：
接头序列1：5′-GATCGAAGAGCACACGTCT(SEQ ID NO：9)；
接头序列2：5′-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(SEQ ID NO：10)；
引物1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：11)；
引物2：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：12)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同，分别可以是一段随机碱基序列；
第四种接头序列和对应引物如下：
接头序列1：5′-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：13)；
接头序列2：5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO：14)；
引物1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNCACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：15)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同，分别可以是一段随机碱基序列；
引物1：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：16)，其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同，分别可以是一段随机碱基序列。
本发明实施例中按照表5所示的组合进行了建库测序。
表5
本发明实施例中，从不同试剂与接头匹配的角度去测试，PCR扩增倍数越高，可以判断，接头连接效率越高。
实施例1
本实施例使用第一种试剂组合不同的接头进行建库操作，具体步骤如下：
1、末端修复加A反应，如表6所示：
表6
| 组分 | 用量 |
| 打断的双链DNA片段 | 50μl(无核酸污染的超纯水补齐) |
| 第一种试剂的末端修复加A缓冲液 | 7μl |
| 第一种试剂的末端修复加A酶混合物 | 3μl |
| 总体积 | 60μl |
运行PCR仪：热盖85℃；20℃，30min；65℃，30min；4℃∞。
2、连接
2.1第一种试剂+第三种接头，如表7所示：
表7
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 60μl |
| 第三种接头(15μM) | 5μl |
| 无核酸污染的超纯水 | 5μl |
| 第一种试剂的接头连接缓冲液 | 30μl |
| 第一种试剂的DNA连接酶 | 10μl |
| 总体积 | 110μl |
在20℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化，回融于22μl EB缓冲液后Qubit测定浓度，计算总量。
2.2第一种试剂+第一种接头，如表8所示：
表8
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 60μl |
| 第一种接头(25μM) | 3μl |
| 无核酸污染的超纯水 | 5μl |
| 第一种试剂的接头连接缓冲液 | 30μl |
| 第一种试剂的DNA连接酶 | 10μl |
| 总体积 | 110μl |
在20℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化，回融于22μl EB缓冲液后Qubit测定浓度，计算总量。
2.3第一种试剂+第四种接头，如表9所示：
表9
在20℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化，回融于22μl EB缓冲液后Qubit测定浓度，计算总量。
2.4第一种试剂+第二种接头，如表10所示：
表10
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 60μl |
| 第二种接头(15μM) | 5μl |
| 无核酸污染的超纯水 | 5μl |
| 第一种试剂的接头连接缓冲液 | 30μl |
| 第一种试剂的DNA连接酶 | 10μl |
| 总体积 | 110μl |
在20℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化，回融于22μl EB缓冲液后Qubit测定浓度，计算总量。
3、pre-PCR
3.1第一种试剂+第三种接头+第三种引物，如表11所示：
表11
PCR程序：热盖100℃；95℃45s；98℃5s，60℃30s，72℃30s，7个循环；72℃1min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.2第一种试剂+第一种接头+第一种引物，如表12所示：
表12
| 组分 | 用量 |
| 第2.2步获得的DNA | 20μl+3μl无核酸污染的超纯水 |
| 第一种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第一种引物混合物(每种引物12.5μM) | 2μl(终浓度每种引物0.5μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；95℃2min；98℃30s，65℃30s，72℃60s，7个循环；72℃4min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.3第一种试剂+第四种接头+第四种引物，如表13所示：
表13
| 组分 | 用量 |
| 第2.3步获得的DNA | 20μl |
| 第一种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第四种引物1(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 第四种引物2(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；98℃30s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，7个循环；72℃5min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.4第一种试剂+第二种接头+第二种引物，如表14所示：
表14
| 组分 | 用量 |
| 第2.4步获得的DNA | 20μl |
| 第一种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第二种引物1(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 第二种引物2(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；98℃1min；98℃15s，65℃30s，72℃30s，7个循环；72℃1min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
实施例2
本实施例使用第二种试剂组合不同的接头进行建库操作，具体步骤如下：
1、末端修复加A反应，如表15所示：
表15
| 组分 | 用量 |
| 打断的双链DNA片段 | 32μl(用无核酸污染的超纯水补齐) |
| 第二种试剂的末端修复加A缓冲液 | 15μl |
| 第二种试剂的末端修复加A酶混合物 | 3μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR仪：热盖90℃；22℃，20min；72℃，20min；4℃∞。
2、接头连接
2.1第二种试剂+第三种接头，如表16所示：
表16
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 48.3μl |
| 第二种试剂的连接酶混合物 | 47.5μl |
| 第三种接头(15μM) | 4.2μl |
| 总体积 | 100μl |
在20℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
2.2第二种试剂+第一种接头，如表17所示：
表17
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 50μl |
| 第二种试剂的连接酶混合物 | 47.5μl |
| 第一种接头(25μM) | 2.5μl |
| 总体积 | 100μl |
在20℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
2.3第二种试剂+第四种接头，如表18所示：
表18
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 49.375μl |
| 第二种试剂的连接酶混合物 | 47.5μl |
| 第四种接头(20μM) | 3.125μl |
| 总体积 | 100μl |
在20℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
2.4第二种试剂+第二种接头，如表19所示：
表19
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 48.33μl |
| 第二种试剂的连接酶混合物 | 47.5μl |
| 第二种接头(15μM) | 4.17μl |
| 总体积 | 100μl |
在20℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3、pre-PCR
3.1第二种试剂+第三种接头+第三种引物，如表20所示：
表20
| 组分 | 用量 |
| 第2.1步获得的DNA | 20μl |
| 第二种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第三种引物1(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 第三种引物2(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖100℃；95℃45s；98℃15s，60℃30s，72℃30s，7个循环；72℃1min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.2第二种试剂+第一种接头+第一种引物，如表21所示：
表21
PCR程序：热盖105℃；95℃2min；98℃30s，65℃30s，72℃60s，7个循环；72℃4min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.3第二种试剂+第四种接头+第四种引物，如表22所示：
表22
| 组分 | 用量 |
| 第2.3步获得的DNA | 20μl |
| 第二种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第四种引物1(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 第四种引物2(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；98℃30s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，7个循环；72℃5min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.4第二种试剂+第二种接头+第二种引物，如表23所示：
表23
| 组分 | 用量 |
| 第2.4步获得的DNA | 20μl |
| 第二种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第二种引物1(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 第二种引物2(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；98℃1min；98℃15s，65℃30s，72℃30s，7个循环；72℃1min；4℃保持。
实施例3
本实施例使用第三种试剂组合不同的接头进行建库操作，具体步骤如下：
1、末端修复加A反应，如表24所示：
表24
| 组分 | 用量 |
| 打断的双链DNA片段 | 40μl(用无核酸污染超纯水补齐) |
| 第三种试剂的末端修复加A缓冲液 | 6.5μl |
| 第三种试剂的末端修复加A酶混合物 | 3.5μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR仪：热盖90℃；20℃，30min；65℃，30min；4℃∞。
2、接头连接
2.1第三种试剂+第三种接头，如表25所示：
表25
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 50μl |
| 第三种试剂的连接缓冲液 | 6μl |
| 第三种试剂的连接增强液 | 38μl |
| T4DNA连接酶 | 5μl |
| 第三种接头(15μM) | 1μl |
| 总体积 | 100μl |
在25℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。2.2第三种试剂+第一种接头，如表26所示：
表26
在25℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。2.3第三种试剂+第四种接头，如表27所示：
表27
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 50μl |
| 第三种试剂的连接缓冲液 | 6μl |
| 第三种试剂的连接增强液 | 38μl |
| T4DNA连接酶 | 5μl |
| 第四种接头(20μM) | 0.75μl |
| 总体积 | 100μl |
在25℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。2.4第三种试剂+第二种接头，如表28所示：
表28
在25℃，孵育30min；用1.2倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3、Pre-PCR
3.1第三种试剂+第三种接头+第三种引物，如表29所示：
表29
| 组分 | 用量 |
| 第2.1步获得的DNA | 20μl |
| 第三种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第三种引物1(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 第三种引物2(10μM) | 2.5μl(终浓度0.5μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；98℃30s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，7个循环；72℃5min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.2第三种试剂+第一种接头+第一种引物，如表30所示：
表30
| 组分 | 用量 |
| 第2.2步获得的DNA | 20μl+3μl无核酸污染超纯水 |
| 第三种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第一种引物(12.5μM) | 2μl(终浓度每种0.5μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；98℃2min；98℃30s，65℃30s，72℃60s，7个循环；72℃4min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.3第三种试剂+第四种接头+第四种引物，如表31所示：
表31
| 组分 | 用量 |
| 第2.3步获得的DNA | 5μl |
| 第三种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第四种引物1(10μM) | 10μl(终浓度2μM) |
| 第四种引物2(10μM) | 10μl(终浓度2μM) |
| 总体积 | 50ul |
PCR程序：热盖105℃；98℃30s；98℃15s，65℃30s，72℃60s，7个循环；72℃5min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
3.4第三种试剂+第二种接头+第二种引物，如表32所示：
表32
| 组分 | 用量 |
| 第2.4步获得的DNA | 5μl |
| 第三种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第二种引物1(10μM) | 10μl(终浓度2μM) |
| 第二种引物2(10μM) | 10μl(终浓度2μM) |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；98℃1min；98℃15s，65℃30s，72℃60s，7个循环；72℃1min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
实施例4
本实施例使用第四种试剂组合选定的接头进行建库操作，具体步骤如下：
1、末端修复反应，如表33所示：
表33
| 组分 | 用量 |
| 打断的双链DNA片段 | 42μl |
| 第四种试剂的10X末端修复缓冲液 | 5μl |
| dNTP(25mM) | 0.4μl |
| T4DNA聚合酶 | 1.2μl |
| Klenow片段 | 0.2μl |
| T4多聚核苷酸酶 | 1.2μl |
| 总体积 | 50μl |
在20℃，孵育30min；1.5倍磁珠(75μl)纯化，溶于22μl EB缓冲液中，取19.7μl进行下一步反应。
2、加A反应，如表34所示：
表34
| 组分 | 用量 |
| 第1步获得的DNA | 19.7μl |
| dATP(5mM) | 0.5μl |
| Klenow(3’-5’exo-) | 0.5μl |
| 10×blue缓冲液 | 2.3μl |
| 总体积 | 23μl |
在37℃，孵育30min；1.5倍磁珠纯化，10μl洗脱，用于下一步反应。
3、接头连接，如表35所示：
表35
在20℃，孵育15min；1.5倍磁珠纯化，20μl洗脱。
4、pre-PCR，如表36所示：
表36
| 组分 | 用量 |
| 第3步获得的DNA | 20μl |
| 无核酸污染的超纯水 | 3μl |
| 第四种试剂的DNA扩增预混液(2X) | 25μl |
| 第四种引物1(10μM) | 1μl |
| 第四种引物2(10μM) | 1μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR程序：热盖105℃；98℃30s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，7个循环；72℃5min；4℃保持。
用1倍XP磁珠纯化后Qubit测定浓度，计算总量。
实施例1-4中每一个实验组合的结果，如表37所示。
表37
从以上的表37中可以看出，不同试剂与接头、引物的组合在接头连接效率和PCR扩增效率上有所不同，连接效率和PCR扩增效率直接决定了建库起始量，也决定了PCR扩增循环数，PCR循环数越多，造成的重复越高，数据浪费严重。
本发明的研究结果显示：
第一种试剂与第四种接头、引物的组合；以及第二种试剂与第一种接头、引物的组合是适合FFPE样本的最适合建库条件，满足目前石蜡提取量偏低、质量不完全满足的DNA建库要求，提高了PCR扩增效率。
图2示出了第一种试剂与第四种接头、引物的组合针对石蜡样本的捕获情况的数据。捕获效率55-66％，均值62.1％，偏差6.1％；重复(Duplication)6-70％，均值20.4％，偏差14.7％；数据量和测序深度基本成线性，150×/G。可见，本发明提高了连接效率，提高了预扩增(pre-PCR)的产率，从而固定了捕获的模板量，稳定了捕获效率，降低了重复，测序得到的数据量和深度基本呈现线性。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳裕策生物科技有限公司
<120> 一种FFPE DNA建库用试剂盒、其用途及建库方法
<130> 17I25235
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(39)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacnnnnnna tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnnaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatcgaagag cacacgtct 19
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 12
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tacactcttt ccctacacga cgctcttccg atct 34
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33
<210> 15
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 15
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnncac tctttcccta cacgacgctc 60
ttccgatct 69
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 16
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
Claims (10)
1. 一种FFPE DNA建库用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：
接头连接缓冲液，其包括100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，2mM dATP，500mMNaCl；
DNA连接酶溶液，其包括600000U/ml T4 DNA连接酶，10mM Tris-HCl，50mM NaCl，0.1mMEDTA，1mM DTT，50%甘油；
接头序列1：5´-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO：13）；
接头序列2：5´-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC（SEQ ID NO：14）。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下组分：
末端修复加A缓冲液，其包括500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，10mM ATP，4mMdATP，4mM dCTP，4mM dGTP，4mM dTTP；
末端修复加A酶混合物，其包括3000U/ml T4 DNA聚合酶，10000U/ml T4聚核苷酸激酶，100mM KCl，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1%Triton X-100，50%甘油。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下组分：
DNA扩增预混液，其包括1U/µL DNA聚合酶，5×高保真缓冲液，5×GC缓冲液，10mMdNTPs，以及25mM MgCl2；
引物序列1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO：15），其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同；
引物序列2：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（SEQ IDNO：16），其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同。
4. 一种FFPE DNA建库用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：
DNA连接预混液，其包括300000U/ml T4 DNA连接酶，50mM NaCl，0.1mM EDTA，50%甘油，100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，1mM dATP；
接头序列1：
5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO：1）；
接头序列2：
5´-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG（SEQ IDNO：2），其中NNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下组分：
末端修复加A缓冲液，其包括400mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT；10mM ATP，5mMdATP，5mM dCTP，5mM dGTP，5mM dTTP；
末端修复加A酶混合物，其包括4000U/ml T4 DNA聚合酶，10000U/ml T4聚核苷酸激酶，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1%Triton X-100，50%甘油。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下组分：
DNA扩增预混液，其包括1U/µL DNA聚合酶，5×高保真缓冲液，5×GC缓冲液，10mMdNTPs，以及25mM MgCl2；
引物序列1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC（SEQ ID NO：3）；
引物序列2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT（SEQ ID NO：4）。
7. 权利要求1-6任一项所述的试剂盒在FFPE DNA建库中的用途。
8. 一种FFPE DNA建库方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-6任一项所述的试剂盒进行接头连接的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）末端修复加A反应步骤，该步骤采用如下组分：
末端修复加A缓冲液，其包括500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，10mM ATP，4mMdATP，4mM dCTP，4mM dGTP，4mM dTTP；
末端修复加A酶混合物，其包括3000U/ml T4 DNA聚合酶，10000U/ml T4聚核苷酸激酶，100mM KCl，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1%Triton X-100，50%甘油；
（2）接头连接步骤，该步骤采用如下组分：
接头连接缓冲液，其包括100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，2mM dATP，500mMNaCl；
DNA连接酶溶液，其包括600000U/ml T4 DNA连接酶，10mM Tris-HCl，50mM NaCl，0.1mMEDTA，1mM DTT，50%甘油；
接头序列1：5´-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO：13）；
接头序列2：5´-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC（SEQ ID NO：14）；
（3）预扩增步骤，该步骤采用如下组分：
DNA扩增预混液，其包括1U/µL DNA聚合酶，5×高保真缓冲液，5×GC缓冲液，10mMdNTPs，以及25mM MgCl2；
引物序列1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO：15），其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同；
引物序列2：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（SEQ IDNO：16），其中NNNNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）末端修复加A反应步骤，该步骤采用如下组分：
末端修复加A缓冲液，其包括400mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT；10mM ATP，5mMdATP，5mM dCTP，5mM dGTP，5mM dTTP；
末端修复加A酶混合物，其包括4000U/ml T4 DNA聚合酶，10000U/ml T4聚核苷酸激酶，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1%Triton X-100，50%甘油；
（2）接头连接步骤，该步骤采用如下组分：
DNA连接预混液，其包括300000U/ml T4 DNA连接酶，50mM NaCl，0.1mM EDTA，50%甘油，100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，1mM dATP；
接头序列1：
5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO：1）；
接头序列2：
5´-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG（SEQ IDNO：2），其中NNNNNN表示用于区分样本的标签序列，对不同样本而言该序列彼此不同；
（3）预扩增步骤，该步骤采用如下组分：
DNA扩增预混液，其包括1U/µL DNA聚合酶，5×高保真缓冲液，5×GC缓冲液，10mMdNTPs，以及25mM MgCl2；
引物序列1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC（SEQ ID NO：3）；
引物序列2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT（SEQ ID NO：4）。
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