WO2012037876A1

WO2012037876A1 - Dna标签及其应用

Info

Publication number: WO2012037876A1
Application number: PCT/CN2011/079898
Authority: WO
Inventors: 章文蔚; 龚梅花; 于竞; 张艳艳; 田方; 陈海燕; 周妍; 汪建
Original assignee: 深圳华大基因科技有限公司; 深圳华大基因研究院
Priority date: 2010-09-21
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2012-03-29
Also published as: CN102409045A; CN102409045B; HK1168626A1

Abstract

本发明基于Illumina公司的Solexa测序平台提供的DNA标签文库制备方法，设计了长度为6bp独特的标签序列，将标签嵌入DNA接头中，通过连接DNA接头连接来导入标签序列，成功的建立了DNA标签文库的建库方法，并应用于SolexaDNA测序。

Description

DNA标签及其应用优先权信息

本申请请求 2010 年 9 月 21 日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为 201010299257.3的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，特别是 DNA测序技术领域。具体的，本发明涉及用于 DNA测序的 DNA标签及其应用。更具体的，本发明提供了用于构建 DNA标签文库的 DNA标签、寡核苷酸、 DNA标签文库及其制备方法、确定 DNA样品序列信息的方法、确定多种样品 DNA序列信息的方法以及用于构建 DNA标签文库的试剂盒。背景技术

DNA测序技术，是重要的分子生物学分析方法之一，它不仅为基因表达、基因调控等生物学基础研究提供重要数据，而且也在疾病诊断学、基因治疗等应用研究中起着重要的作用。基于 Solexa DNA测序平台（ Illumina ) , 釆用边合成边测序 ( Sequencing By Synthesis, SBS ) , 具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点 (例口参见 Paired- End sequencing User Guide ;Illumina part#1003880 ； Preparing samples for ChIP sequencing for DNA;Illumina part#l 1257047 Rev. A ； mRNA sequencing sample preparation Guide;Illumina part#l 004898 Rev.D ； Preparing 2-5kb samples for mate pair library sequencing; Illumina part#1005363 Rev.B , 通过参照将其全文并入本文）。

然而，目前对样品 DNA进行测序的方法，仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前 Illumina公司基于 Solexa DNA测序平台推出了 DNA标签（也称为 index )建库方法。如图 1所示，在 DNA标签建库流程中，使用了 3条 PCR引物，通过 PCR导入标签来构建 DNA标签文库 ( Preparing samples for multiplexed Paired-End sequencing; Illumina part#1005361 Rev.B , 通过参照将其全文并入本文）。本申请的发明人发现，上述标签文库制备方法存在着一些缺陷：第一、目前 Illumina公司只提供了 12种长度为 6bp的标签序列，标签的数量较少，随着 Solexa测序通量的增加，不能对大量样本进行混合测序，从而将浪费测序资源和影响到测序通量；第二、上述标签建库方法是通过 PCR反应将标签序列导入到目的片段文库中的，其对目的片段的 PCR扩增过程需要釆用 3条 PCR引物（两条公用 PCR引物和一条 PCR标签引物，如图 1所示），耗时耗材，且 PCR扩增效率不高。第三、上述标签建库方法中所釆用的接头不包含标签序歹 ij , 因此对多种样品 DNA进行建库测序时，各样品的标签文库需要独立构建，即各自分别通过 PCR反应来导入标签序列，接着针对每一个标签文库分别切胶回收，然后将切胶回收所得的各个标签文库进行混合，最后才能将多种样品标签文库的混合物进行测序，不仅费时费力，而且费用较高。

本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。为此，本发明的一个方面，提出了一种能够用于构建 DNA标签文库的 DNA标签（在本文中，有时也简单地称为 "标签" ）。根据本发明的一个方面，本发明提出了一组分离的 DNA标签。根据本发明的一些实施例，这些分离的 DNA标签由 SEQ ID NO: ( 3N-2 ) 所示的核苷酸构成，其中 N=l-67 的任意整数。在本说明书中，这些 DNA标签分别被命名为 DNA Index _ N ,其中 N=l-67 的任意整数，其序列如下表 1所示。利用上述根据本发明实施例的 DNA标签，通过将 DNA标签与样品 DNA或其等同物相连，可以精确地表征 DNA的样品来源。由此，利用上述 DNA标签，可以同时构建多种样品的 DNA标签文库（在本文中，有时也称为 "标签文库" ），从而可以通过将来源于不同样品的 DNA标签文库混合之后进行测序，并且能够基于 DNA标签对 DNA标签文库的 DNA序列进行分类，从而可以获得多种样品的 DNA序列信息，由此可以充分利用高通量的测序技术，例如利用 Solexa测序技术，同时对多种 DNA标签文库进行测序，从而提高 DNA标签文库的测序效率和通量。发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的 DNA标签构建 DNA标签文库，能够精确地对多种 DNA标签文库进行区分，并且所得到的测序数据结果的稳定性和可重复性非常好。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了用于将上述 DNA标签引入样品 DNA或其等同物中的一组分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例的一组分离的寡核苷酸，具有第一链和第二链，并且所述第一链分别由 SEQ ID NO: ( 3N-1 ) 所示的核苷酸构成，所述第二链分别由 SEQ ID NO: ( 3N ) 所示的核苷酸构成，其中，对于相同的寡核苷酸，其第一链和第二链的 N取值相同，并且 N=l-67的整数。根据本发明的实施例，这些寡核苷酸（在本说明书中，有时也称为 "DNA标签接头" 或 "标签接头" ）分别具有如前所述的 #居本发明实施例的 DNA标签，并且具有粘性末端 T, 因而，可以通过连接反应，将相应的 DNA标签引入到 DNA或其等同物中。与 DNA标签的命名方法类似，在本说明书中，与 DNA标签 IndexN相对应的寡核苷酸（ DNA标签接头）被命名为 DNA Index - N adapter, 其中 N=l-67的任意整数，进一步， DNA Index - N adapter 的第一链（在本文中，有时也称为 "正义序列" ）和第二链（在本文中，有时也称为 "正义序列 " ）分别被命名为 DNA Index - NF_adapter和 DNA Index - NR_adapter, 其中 N=l-67的整数，其序列如下表 1所示（表中所示序列方向均是 5， _ 3，方向）。根据本发明的实施例，可以通过将正义序列 DNA Index _ NF_adapter和其相应的反义序列 DNA Index - NR_adapter进行退火处理而形成相应的 DNA标签接头。

DNA标签序列（ DNA Index - N ) 及其相应的 DNA标签接头序列

:/: O 8686/-0i>l£ 9/-8/-siAV

:/: O 8686/-0i>l£ 9/-8/-siAV

:/: O 8686/-0i>l£ 9/-8/-siAV

Index- 59F_adapter

DNA 5-Phos/GGTAGAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index- 59R_adapter ( 177 )

DNA Index-60 TCTCGT ( 178 )

DNA

Index-60F_adapter TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTCGTT ( 179 )

DNA 5-Phos/ACGAGAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index-60R_adapter ( 180 )

DNA Index-61 TGCTTA ( 181 )

DNA

Index- 61 F_adapter TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCTTAT ( 182 )

DNA 5-Phos TAAGCAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index- 61 R_adapter ( 183 )

DNA Index-62 TGGAGA ( 184 )

DNA

Index- 62F_adapter TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGAGAT ( 185 )

DNA 5-Phos TCTCCAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index- 62R_adapter ( 186 )

DNA Index-63 TGGTCT ( 187 )

DNA

Index-63F_adapter TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGTCTT ( 188 )

DNA 5-Phos/AGACCAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index-63R_adapter ( 189 )

DNA Index-64 TGTAAT ( 190 )

DNA

Index- 64F_adapter TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGTAATT ( 191 )

DNA 5-Phos/ATTACAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index- 64R_adapter ( 192 )

DNA Index-65 TTACTG ( 193 )

DNA

Index-65F_adapter TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTACTGT ( 194 )

DNA 5-Phos/CAGTAAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index-65R_adapter ( 195 )

DNA Index-66 TTATAA ( 196 )

DNA

Index-66F_adapter TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTATAAT ( 197 )

DNA 5-Phos TTATAAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index-66R_adapter ( 198 )

DNA Index-67 TTCCAC ( 199 )

DNA

Index-67F_adapter TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCCACT ( 200 )

DNA 5-Phos/GTGGAAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Index-67R_adapter ( 201 )

利用上述根据本发明实施例的寡核苷酸（也可以称为 DNA标签接头），能够有效地将 DNA标签引入到样品的 DNA或其等同物中，由此能够构建具有 DNA标签的 DNA 标签文库。另外，发明人惊奇地发现，当针对相同的样品，釆用具有不同标签的寡核苷酸构建含有各种 DNA标签的 DNA标签文库时，所得到的测序数据结果的稳定性和可重复性非常好。根据本发明的实施例，当釆用 pearson 系数进行数据分析时，利用 Indexl-67 所构建的人全血样本 DNA 标签文库均表现出了至少 0.99 的相关性。关于 pearson系数具体算法的细节可以参见相关文献，例如： t Hoen, P. A., Y. Ariyurek, et al. (2008). "Deep sequencing-based expression analysis shows major advances in robustness, resolution and inter-lab portability over five microarray platforms." Nucleic Acids Res 36(21): el41 , 通过参照将其全文并入本文。重复性越高，则其 pearson系数越接近 1。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种构建 DNA标签文库的方法。根据本发明的实施例，其包括：将 DNA样品随机打断，以便获得随机片段；将所述随机片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的随机片段；在所述经过末端修复的随机片段的 3，末端添加碱基 A, 以便获得具有粘性末端 A的随机片段；将所述具有粘性末端 A的随机片段与 DNA标签接头相连，以便获得连接有 DNA标签接头的连接产物，其中所述 DNA标签接头包含选自上述根据本发明实施例的一组分离的 DNA标签的一种；对所述连接有 DNA标签接头的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物；以及分离回收所述扩增产物，所述扩增产物构成所述 DNA标签文库。利用根据本发明实施例的构建 DNA 标签文库的方法，能够有效地将根据本发明实施例的 DNA标签引入到针对样品 DNA 所构建的 DNA标签文库中。从而可以通过对 DNA标签文库进行测序，获得样品 DNA 的序列信息以及 DNA标签的信息，从而能够对样品 DNA的来源进行区分。另外，发明人惊奇地发现，当针对相同的样品，基于上述方法，釆用具有不同标签的寡核苷酸构建含有各种 DNA标签的 DNA标签文库时，所得到的测序数据结果的稳定性和可重复性非常好。

进一步，本发明还提供了一种 DNA 标签文库，其是由根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法所获得的。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种确定 DNA样品序列信息的方法。根据本发明的实施例，其包括：根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法构建所述 DNA样品的 DNA标签文库；以及对所述 DNA标签文库进行测序，以便确定所述 DNA样品的序列信息。基于该方法，能够有效地获得 DNA标签文库中 DNA样品的序列信息以及 DNA标签的序列信息，从而能够对 DNA样品的来源进行区分。另外，发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的方法确定 DNA样品序列信息，能够有效地减少数据产出偏向性的问题，并且能够精确地对多种 DNA标签文库进行区分。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定多种样品 DNA序列信息的方法。根据本发明的实施例，其包括以下步骤：针对所述多种样品的每一种，分别独立地根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法，建立所述 DNA样品的 DNA标签文库，其中，不同的 DNA样品釆用相互不同并且已知序列的 DNA标签，其中所述多种为 2-67 种；将所述多种样品的 DNA标签文库进行组合，以便获得 DNA标签文库混合物；利用 Solexa测序技术，对所述 DNA标签文库混合物进行测序，以获得所述 DNA样品的序列信息以及所述标签的序列信息；以及基于所述标签的序列信息对所述 DNA样品的序列信息进行分类，以便确定所述多种样品的 DNA序列信息。由此，根据本发明实施例的该方法，可以充分利用高通量的测序技术，例如利用 Solexa测序技术，同时对多种样品的 DNA标签文库进行测序，从而提高 DNA标签文库测序的效率和通量，同时可以提高确定多种样品 DNA序列信息的效率。

根据本发明的再一方面，还提供了一种用于构建 DNA标签文库的试剂盒，根据本发明的实施例，该试剂盒包括： 67 种分离的寡核苷酸，所述分离的寡核苷酸具有第一链和第二链，其中所述第一链分别由 SEQ ID NO: ( 3N-1 ) 所示的核苷酸构成，所述第二链分别由 SEQ ID NO: ( 3N ) 所示的核苷酸构成，其中，对于相同的寡核苷酸，其第一链和第二链的 N取值相同，并且 N=l-67的整数，其中，所述 67种分离的寡核苷酸分别设置在不同的容器中。由此，利用该试剂盒，能够方便地将根据本发明实施例的 DNA标签引入到构建的 DNA标签文库中。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图 1 : 显示了 Illumina公司提供的 DNA标签文库构建方法的流程示意图；图 2: 显示了 #居本发明实施例的 DNA标签文库构建方法的流程示意图；图 3: 显示了根据本发明实施例的构建的 67个 DNA标签文库的电泳结果；以及图 4: 显示了根据本发明实施例的构建的 DNA标签文库使用 Agilent2100检测的结果。

发明详细描述

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语 "第一" 、 "第二" 仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有 "第一"、 "第二" 的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明， "多个" 的含义是两个或两个以上。

DNA标签

根据本申请的一个方面，本发明提出了一些分离的 DNA标签。根据本发明的实施例，这些分离的 DNA标签分别由 SEQ ID NO: ( 3N-2 )所示的核苷酸序列构成，其中 N=l-67的任意整数。在本说明书中，这些 DNA标签分别被命名为 DNA Index _ N, 其中 N=l-67的任意整数，其序列如前面表 1所示，在此不再赘述。

在本发明中所使用术语 "DNA"可以是任何包含脱氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的 DNA。利用根据本发明实施例的 DNA标签，通过将 DNA标签与样品的 DNA或其等同物相连，得到具有标签的 DNA标签文库，通过对 DNA标签文库进行测序，可以获得样品 DNA的序列以及标签的序列，进而基于标签的序列可以精确地表征 DNA的样品来源。由此，利用上述 DNA标签，可以同时构建多种样品的 DNA标签文库，从而可以通过将来源于不同样品的 DNA标签文库进行混合，同时进行测序，基于 DNA标签对样品的 DNA序列进行分类，获得多种样品的 DNA的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用 Solexa测序技术，同时对多种样品的 DNA进行测序，从而提高了通过高通量测序技术的效率和通量，降低了确定 DNA样品序列信息的成本。这里所使用的表述方式 "DNA标签与样品的 DNA或其等同物相连" 应^ 广义理解，其包括 DNA标签可以与样品的 DNA直接相连，以构建 DNA标签文库，也可以与和样品的 DNA具有相同序列的核酸（例如可以是相应的 RNA 序列或 cDNA序列，其与 DNA具有相同的序列）相连。

本申请的发明人发现：在本发明中，为了设计有效的 DNA标签，首先需要考虑标签序列之间的可识别性和识别率的问题。其次，在标签混合量少于 12个样品的情况下，必须考虑到混合后的标签上的每个碱基位点的 GT含量。因为 Solexa测序过程中，碱基 G和 T的激发荧光一样，碱基 A和 C的激发光是一样的，因此必须考虑碱基 "GT" 含量与碱基 "AC" 含量的 "平衡" ，最适碱基 "GT" 含量为 50% , 能保证标签识别率最高和错误率最低。最后，还要考虑数据产出的可重复性和准确性，即为了实现能够有效构建 DNA标签文库并进行测序，所构建的一组 DNA标签需要能够保证结果可靠，可重复性高，也就是针对同样的 DNA样品，可以保证利用该组 DN A标签中的不同标签构建的 DNA标签文库，能够获得一致的测序结果，因而可以确保实验结果可靠且重复性高。另外，还需要同时避免标签序列出现 3或 3 个以上连续的碱基的出现，因为 3 个或 3个以上连续的碱基会增加序列在合成过程中或测序过程中的错误率，同时也要尽量避免 DNA标签接头自身形成发夹结构。

为此，本申请的发明人进行了大量的筛选工作，并且选定了根据本发明实施例的一组分离的 DNA标签，即分别 SEQ ID NO: ( 3N-2 )所示的核苷酸序列。其序列如前面表 1所示，不再赘述。另外，发明人发现这些标签之间的差异至少有 3个碱基，即至少 3个碱基序列不同，并且当标签的 6个碱基中的任意 1个碱基出现测序错误或合成错误，都不影响到标签的最终识别。这些标签可以应用于任何 DNA标签文库的构建。目前尚未有关于这些标签应用于 DNA样品测序的文库构建并通过 Solexa测序的艮道。

根据本发明的一些实施例，所釆用的 DNA标签为长度是 6 bp的核酸序列，并且所述标签之间的差异在 3个碱基以上，所述一组 DNA标签由如下组成：如前面表 1所示 67 个 DNA标签或与其相差 1个碱基的 DNA标签中的至少 5个，或至少 10个，或至少 15个，或至少 20个，至少 25个，或至少 30个，或至少 35个，或至少 40个，或 45个，或至少 50 个，或至少 55个，或至少 60个，或全部 67个。具体地，才艮据本发明的实施例，所述一组 DNA标签优选地至少包括表 1所示的 67个 DNA标签中的 DNA Index - 1 ~ DNA Index - 5 , 或 DNA Index _ 6 ~ DNA Index - 10 , 或 DNA Index _ 11 ~ DNA Index - 15 , 或 DNA Index _ 16 ~ DNA Index - 20 , 或 DNA Index _ 21 ~ DNA Index - 25 , 或 DNA Index _ 26 ~ DNA Index - 30, 或 DNA Index _ 31 ~ DNA Index _ 35 , 或 DNA Index _ 36 ~ DNA Index - 40,或 DNA Index - 41 ~ DNA Index - 45 ,或 DNA Index _ 46 ~ DNA Index - 50,或 DNA Index _ 51 ~ DNA Index - 55 , 或 DNA Index _ 56 ~ DNA Index - 60, 或 DNA Index - 61 ~ DNA Index - 65 ,或 DNA Index _ 63 ~ DNA Index - 67 ,或者他们任何两个或多个的组合。在本发明的一些具体示例中，所述相差 1个碱基包括对表 1所示 67个标签的序列中 1个碱基的取代、添加或缺失。

根据本发明的实施例，本发明还提供了将根据本发明实施例的标签用于 DNA标签文库构建并测序的用途。根据该用途的实施例， DNA标签包含在 DNA标签接头的 3，末端中，从而构成各自相对应的 DNA标签接头，其同时作为 DNA标签文库的 5，接头和 3，接头使用。根据具体的示例，所述 DNA标签插入 DNA标签接头中的 3，末端中，或通过或不通过连接子连接在 DNA接头的 3，末端，优选地不通过连接子连接在 DNA接头的 3，末端。

寡核苷酸以及构建 DNA标签文库

根据本发明的又一方面，本发明提供了一组分离的寡核苷酸，其可以用于将前面所描述的 DNA标签引入到样品的 DNA中，进而构建 DNA标签文库。 #居本发明的实施例，本发明提供了一组分离的寡核苷酸，该组分离的寡核苷酸中的每一种均具有粘性末端 T, 并且这些分离的寡核苷酸具有第一链和第二链，粘性末端 T形成在每一种寡核苷酸的第一链上。其中，根据本发明的实施例，第一链分别由 SEQ ID NO: ( 3N-1 )所示的核苷酸构成，所述第二链分别由 SEQ ID NO: ( 3N ) 所示的核苷酸构成，其中，对于相同的寡核苷酸，其第一链和第二链的 N取值相同，并且 N=l-67的整数。对于相同的寡核苷酸，其第一链和第二链的 N取值相同，即釆用序列表中的相应核苷酸分别作为第一链和第二链时，构成第一链的核苷酸与构成第二链的核苷酸能够形成稳定的具有粘性末端的二聚体，具体地，例如当 N=10时，釆用 SEQ ID NO: 29作为第一链， SEQ ID NO: 30作为第二链。本领域技术人员能够理解，可以通过分别将构成相应寡核苷酸的第一链与第二链进行退火处理，而形成相应的寡核苷酸。根据本发明的实施例，上述寡核苷酸分别具有如前所述的根据本发明实施例的 DNA标签，并且这些寡核苷酸具有粘性末端，因而，可以通过连接反应，将相应的 DNA标签引入到样品的 DNA或其等同物中。具体地，这些寡核苷酸的序列如前面表 1所示，在此不再赘述。

发明人发现，根据本发明的实施例所提供的寡核苷酸序列（DNA标签接头）具有较高的稳定性。该发现主要是根据本发明的一些实施例，通过 Lasergene软件 ( http://www.dnastar.com/ ) 分析测试这些寡核苷酸序列的结构稳定性得来的。使用 Lasergene的 PrimerSelect软件，通过分析两条序列之间形成的能量值可以判断双链体之间的亲和力参数，能量值（kcal/mol) 的绝对值越大表示双链体的结果越稳定。以下是分别对前面表 1所示的 67个 DNA标签接头进行上述的结构稳定性和亲和力分析的结果，结果表明，这些 DNA标签接头形成的结构非常稳定。

下面提供了根据本发明实施例的 DNA 标签接头的二级结果以及最稳定的二聚体结果 ( The most stable dimer overall ) 及其能量值。

DNA Index- 1 接头

•The most stable dimer overall： 19 fop, —35.5 kcal/mol

5 ' TACACT C TCC CTACAC GACGC C TCCGATCTAAC CAAT 3，

3 ' CACTGACIC CAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATTGGT 5 ' DNA Index-2 接头

The most s able dimei- overall：: 19 b _f -3 .0 kcal/mol

5， TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTA&CTTGT 3 '

3 , CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATTCAAC 5 '

DNA Index-3 接头

The most st ble dimer overall： 19 bp, -33.4 kcal/mol 5 ' TAC¾C C TTCC TACAC GACGC C TCCG ATCTAAGAG T 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATTCTCA 5 '

DNA Index-4 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -33.0 kcal/mol

5 ' ACACT CT TCC C AC ACGACGCT CT TCCG ATC TAATAACT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATTATTG 5 '

DNA Index-5 接头

The most stable dimer overall ： 19 bp, - 36.6 kcal/mol 5， 'TCCGATCTACACGCT 3 '

1 M Π 1 i 1 M M 1 !

3 ' CA( AGG GATGT GCG 5 '

DNA Index-6 接头

The most stable dimer overall: 19 b , -3 .6 kcal/mol 5 ' ¹ CCGATC ACC TC T 3

3 ' .AGGCTAGATGGAGA 5 '

DNA Index-7 接头 The most stable dimer overall： IS* bp, -36.9 kcal/mol 5， TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGGAAT 3 '

3 ' C ACTGACC TCAAGTCTGC ACACGAGAAGGC AGATGC CTT 5 *

DNA Index- 8 接头

The most st ble dimer overall： 19 bp, -35.2 kcal mol 5 ' TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGAAGGT 3，

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATC TCC 5 '

DNA Index-9 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, —38.1 kcal mol 5 ' TAG ACT C T TTC C C TACAC CACGCT CT CCGATCTAGC CGTT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGACAAGGCTAGATCGGCA 5 '

DNA Index- 10 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -36- 9 kcal/mol 5， TACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATCTAGCGAGT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTC GCACACGAGAAGGC AGATCCC C 5 ' DNA Index- 11 接头

The most, stable dimer overall： 19 bp, -36.7 kcal/mol

5 ' ACACT CT TTCCC TACAC GACGCT C T TCCGATC T AGGC TGT 3 '

DNA Index- 12 接头

The most stable dimer overall: 19 bp, -36.4 kcal/mol 5¹ TACACTCT TCCCTACACGACGCTCT CCGATC AGTGCC 3 '

3 ^f CACTGACCTC\¾J GTCTGCACACGAGAAGGCTAGATCACGG 5 '

DNA Index- 13 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -32.9 kcal/mol 5 ' TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATAATCT 3，

3 » CAC GACCTCA_¾GTCTGCACACGAGAAGGCTAGATi T AG 5

DNA Index- 14 接头

The most stable dimer overall： kcal/mol 5 3 '

3 ^T CAC GACC CAAGTCTGC AC ACGAGAAGGC AGATACAGT

DNA Index- 15 接头 The most stable dimer overall： 19 b'p, -35.1 kcal/mol 5 ' TACACTCT TCCCTACACGACGC CTTCCGATCTATTCCTT 3 '

3 ' CAC GACC C¾GTCTGCACACGAGAAGGCTAGA AAGGA 5 '

DNA Index- 16 接头

The most stable dimer overall: 19 bp, —34.3 kcal/mol 5 ' TACAC C T TCC C ACAC GACGGT C CCGATC CAACACT 3¹

3¹ CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGC AGAGT GTG 5

DNA Index- 17 接头

The mo s t .s table dime r ove rail: -3 .6 kcal mol 5 ' 3 '

3， C ACTGACC TCAAC4TC GC ACAC GAGAAGGC AGAGTGTTC 5 ' DNA Index- 18 接头

T h e mo s t stable dimer o e rail： 19 bp , - 37 · 2 kc l mo 1

5 ' ACACTCT TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCACGG T 3 '

3， CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGTGCCA 5 '

DNA Index- 19 接头

The roost stable dimer overall： 13 bp, -3 .3 kcal/mol 5 ^T TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCACTCAT 3，

3¹ CAC GACCTCAAGTCTGCACACGACAAGGCTAGAG GAG 5 '

DNA Index-20 接头

The most stable clime r overall： 19 bp, -37.8 kcal mol 5 ' TACAC C TCC CTAC AC GACGC T C TCCCATCTCC AACGT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAG CTGCACACGAGAAGGCTAGAGG TGC 5 '

DNA Index-21 接头

The most s ble dimer overall： 19 bp, -37.3 kcal/mol 5 ' TACAC C TC C C ACAC GACGC C CC GATC CCAGGAT 3 '

3 ' C ACTGACC TCAAGTCTGC AC ACGAGAAGGC TAG AGG CC T 5 '

DNA Index-22 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, - 0.5 kcal/mol 5 ' TACACTCT TCCCTACACGACGCTCTTCCGATC CCGCCTT 3 '

3， CACTGACC CAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGGCGGA 5 ' DNA Index-23 接头

The most stable dimer overall： 19 bp -3 .9 kcal mol

3 ^f CAC GACC CAAG CTGCACACGAGAAGGCTAGAGGAA G 5 DNA Index-24 接头

The most stable dimer overall： -35.6 kcal mol

3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGC AGAGCTTAT 5 ' DNA Index-25 接头

The most stable dimer overall： 13 bp, -39.2 kcal/mol

5 ' TACACTC TTCCCTACACGACGCTC TCCGATCTCGCGTCT 3 '

3， CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGCGCAG 5 '

DNA Index-26 接头

The most stable dimer overall： 1 bp,- -36.9 kcal/mol 5 ' TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGGTAAT 3 '

3

DNA Index-27 接头

The mos , stable diiRer overall: 19 fc'p, -39.2 kcal/mol 5 » ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT CCGATC CGTCGGT 3 '

DNA Index-28 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -34.9 kcal/mol 5 ' ACACTCT TCCCTACACGACGCTC TCCGATC CTAGCTT 3 '

3 ' CACTGACC CAAGTC GCACACGAGAAGGCTAGAGATCGA 5¹

DNA Index-29 接头

The most stable dimer overall： ISf bp, -37.5 kcal/mol 5 ' TACACT C T CC C ACACGACGCT C CCGATC C C CGAT 3 '

3 5

DNA Index-30 接头

The most, stable dimer overall： 19 bp -34.6 kcal/mol 5 ' TACACTCTTTCCCTACACGACGC CTTCCGATCTCTGTTGT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGGTAGAGACAAC 5

DNA Index-31 接头

The roost stable diiRer overall： 33.4 kcal/mol 5^T 3 '

3 5

DNA Index-32 接头 ^赉 Of-xspui VNQ

X out " T · 9 £.— ' g τ ： χ χ PJSAO .Χ θΐπτρ e e^ s -4 s ουι ΘΙΗ；'

3J,DD¥D ¾0 ε 丁 o /"[e。'

9

赉 Δ£-^χ3Ρ¾ VNQ ε

2

^赉 9£-^χ3Ρ¾ VNa

S

fe-xspui vNa

赉 εε-^χ3ρ¾ VNa

8686.0/llOZN3/X3d 9.8.C0/ZT0Z OAV DNA Index-41 接头

"The mo t stable dimer overall： 19 bp, -40.8 kcal mol 5 ' TACACT CT T CC C ACAC GACGCT CT CCGATC GGCGCTT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAG C GCACAC¾GAAGGCTAGACCGCGA 5 " DNA Index-42 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -36. kcal/mol

'

DNA Index-43 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -37.8 kcal/mol 5 ' TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGTTCGT 3 '

3 , CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACCAAGC 5 '

DNA Index-44 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -33.3 kcal/mol 5 ' TACACTC TT CC C TACAC GACGCT CT CCGATC GTAC ATT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACATCTA 5 '

DNA Index-45 接头

The most s able dimer overall： 19 bp_f —34.8 kcal/mol 5 ' TACACTC TTTCC C TACAC GACGCT CT TCCGATC TG ATCCT 3 ' 3¹ CACTGACCTGAAGTCTGCACACGAGAAGGGTAGACATAGG 5 '

DNA Index-46 接头

The most stable dimer overall： I 9 bp, -34.0 kcal/mol. 5¹ TACACT CT TTCC CTACAC GACGCT C T TCCC4ATCTGTC TGTT 3 '

DNA Index-47 接头

The most stable dimer overall： 19 b , —39.3 kcal/mol 5 ' TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG GCGCT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTC GCACACGAGAAGGCTAGACACGCG 5 '

DNA Index-48 接头

The most stable dime ov rall： 19 bp, -39.3 kcal/mol 5 ' TACACTCT CCCTACACGACGCTCT CCGATCTG GGCGT 3 '

3 ^T CACTGACC TCAAGT CTGCACAC GAGAAGGC TAGACAC CGC 5 '

DNA Index-49 接头 The most, stable diirter overall： 19 bp,- -33.7 kcal mol 5 * TACACTC T TCCC TACAC GACGCTC TTCCGATC TG TACAT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGC AGACAATG 5 '

DNA Index-50 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -34.3 kcal/mol 5 ' TACACT CT T CC C AC ACGACGCT CT TCCGATCTGTT GACT 3 '

3 ' CAC GACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACAAC G 5 '

DNA Index-51 接头

The most stable dimer overall：: 19 b , -35.9 kcal/mol 5， TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TCCGATCTTAATCGT 3. '

3 ' CACTGACCTCAAGTC GCACACGAGAAGGC AGAA TAGC 5 '

DNA Index-52 接头

The most stable dimer overall： IS bp, -35.2 kcal/mol 5 ' TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TCCGATCTTAGGAGT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAATCCTC 5 ^f

DNA Index-53 接头

The most stable dimer overal I： 19 bp , -35-2 kcal/mol 5 ' TACACT CT TTCC CT AC¾C GACGC T C T TCCGATCT i GTGCT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAATCACG 5 '

DNA Index-54 接头

The most stable dimer overall： 19 bp, -35. kcal/mol 5 ' TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTATGCTT 3. '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAATACGA 5 '

DNA Index-55 接头

The most stable dimer overall: 19 bp, -34.5 kcal mol 5 ' TACACT CT TC C C TACAC GACGCTC T CCGATC TCAGATT 3 '

3 ' GACTGACC CAAGTCTGCACACGAGAAGGC AGAAGTC A 5 ^r

DNA Index-56 接头

The most stable dimer- overall： 1 bp , -34.8 kcal/mol 5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT CCGATC TCAT CT 3 '

3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAGTAAG 5，

DNA Index-57 接头

The most stable dimer overall: 19 bp, -37.6 kcal/mol

3 , CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAGGTCC 5 ' ^赉 99"^χ3Ρ¾ VNQ D Di DViDSS D DD D DSiOiDWO DO SiDYD ₄ £

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^赉 19-^χ3Ρ¾ VNQ

^赉 09"^χ3Ρ¾ VNQ

^赉 6g-xspui VNa

8686.0/ll0ZN3/X3d 9.8.C0/Zl0Z OAV The most stable dimer overa l l： 19 hp, - 33 . 6 kcal mol 5， ACAC C TTCCCTACAC GACGC C TCC GATC TTA AAT 3 '

3 ' CAC GACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAA¾TATT 5 '

DNA Index-67 接头

The most stable dimer overall： 19 bp , -36 . 1 kcal /mol 3 ' CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAAGGTG 5 ' 根据本发明的一些实施例，本发明提供了一些 DNA标签接头，其中 DNA标签文库的 DNA标签接头在 3，末端包含根据本发明实施例的标签，并且优选地同时用作 5，接头和 3'接头，所述一组 DNA标签接头包括如下或由如下组成：表 1所示 67个 DNA标签接头与其所包含的 DNA标签序列相差 1个碱基的 DNA标签接头中的至少 5个，或至少 10个，或至少 15个，或至少 20个，至少 25个，或至少 30个，或至少 35个，或至少 40个，或 45个，或至少 50个，或至少 55个，或至少 60个，或全部 67个。才艮据本发明的具体示例，所述一组 DNA标签接头优选地至少包括表 1所示的 67个 DNA标签接头中的 DNA Index - 1F/R_adapte ~ DNA Index - 5F/R_adapter, 或 DNA Index - 6F/R_adapte ~ DNA Index - 10F/R_adapter , 或 DNA Index - 11F/R_adapte - DNA Index - 15F/R_adapter , 或 DNA Index - 16F/R_adapte ~ DNA Index - 20F/R_adapter,或 DNA Index - 21F/R_adapte ~ DNA Index - 25F/R_adapter, 或 DNA Index _ 26F/R_adapte ~ DNA Index _ 30F/R_adapter, 或 DNA Index - 31F/R_adapte ~ DNA Index - 35F/R_adapter , 或 DNA Index - 36F/R_adapte ~ DNA Index - 40F/R_adapter, 或 DNA Index - 41F/R_adapte ~ DNA Index - 45F/R_adapter, 或 DNA Index - 46F/R_adapte ~ DNA Index - 50F/R_adapter, 或 DNA Index - 51F/R_adapte ~ DNA Index - 55F/R_adapter,或 DNA Index - 56F/R_adapte ~ DNA Index - 60F/R_adapter, 或 DNA Index _ 61F/R_adapte ~ DNA Index _ 65F/R_adapter, 或 DNA Index - 66F/R_adapte ~ DNA Index - 67F/R_adapter,或者他们任何两个或个的组合。根据具体的示例，相差 1个碱基包括对标签序列中 1个碱基的取代、添加或删除。根据本发明的实施例，还提供了 DNA标签接头用于 DNA标签文库构建并测序的用途，所述 DN A标签接头同时用作 DN A标签文库的 5，接头和 3，接头。由此，根据本发明的实施例，还提供了使用上述 DNA标签接头构建的 DNA标签文库，其中所述 DNA标签接头同时用作 DNA标签文库的 5，接头和 3，接头。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种利用上述寡核苷酸（DNA标签接头）构建 DNA标签文库的方法。具体地，根据本发明的实施例，参考图 2 , 该方法包括：首先，将 DNA样品随机打断，以便获得随机片段。根据本发明的实施例， DNA 样品的来源并不受特别限制。根据本发明的一个实施例， DNA样品为人 DNA样品。更具体的，可以为人基因组 DNA样品。发明人发现，利用根据本发明实施例的方法，能够有效地构建多种常见模式生物的 DNA标签文库。根据本发明的实施例，所得的随机片段的长度为大约 180bp , 由此能够进一步提高构建 DNA标签文库以及后续测序的效率。

其次，将得到的随机片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的随机片段。接着，在经过末端修复的随机片段的 3，末端添加碱基 A, 以便获得具有粘性末端 A的随机片段。根据本发明的实施例，经过末端修复的随机片段具有两条寡核苷酸链，其中，碱基 A即是添加在所述两条寡核苷酸链的 3，末端，且两条寡核苷酸链上都要添加。接下来，将具有粘性末端 A的随机片段与 DNA标签接头相连，以便获得连接有 DNA 标签接头的连接产物。其中， DNA标签接头为选自上述根据本发明实施例的分离的寡核苷酸的一种，即 DNA标签接头包含上述根据本发明实施例的一组分离的 DNA标签的一种。根据本发明的实施例，具有粘性末端 A的随机片段与 DNA标签接头相连，是通过在具有粘性末端 A的随机片段的两条寡核苷酸链的 3，末端均连接 DN A标签接头实现的。上述根据本发明的实施例所得到的 "连接有 DNA标签接头的连接产物" ，含有目的片段、 DNA接头，以及标签。这里所使用的术语 "目的片段" ，其序列与随机片段（DNA ) 的序列相对应。其中，随机片段是指根据本发明的实施例的构建 DNA标签文库的方法中将 DNA样品随机打断之后获得的 DNA片段。该目的片段的序列与随机片段的序列相对应，其含义是指，可以通过目的片段的序列直接推导出随机片段的序列，例如，目的片段的序列可以与随机片段的序列完全相同，也可以是完全互补，甚至是增加或者减少了已知数目的已知碱基，只要能够通过有限的计算获得的 DNA的序列即可。

然后，对所得的连接有 DNA标签接头的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，以及分离回收扩增产物，所回收的扩增产物构成所述 DNA标签文库。根据本发明的实施例，对连接有 DNA标签接头的连接产物进行扩增的方法并不受特别限制。根据本发明的具体示例，可以釆用 PCR反应对所得到文库片段进行扩增。本领域技术人员可以根据文库片段的序列，确定进行 PCR反应的引物。根据本发明的具体示例，当釆用下面的 PCR方案时，能够实现有效地扩增，具体地，利用分别具有如 SEQ ID NO: 202 和 SEQ ID NO: 203 所示核苷酸序列的引物进行 PCR反应。根据本发明的实施例， PCR 反应所得的扩增产物的长度为大约 280-300bp。另外，根据本发明的实施例，分离回收扩增产物的方法也不受特别限制，本领域技术人员可以根据扩增产物的特点选择适当的方法和设备进行分离，例如可以通过电泳并且回收特定长度的目的片段的方法进行回收。

进一步，根据本发明的实施例，本发明提供了一种构建 DNA标签文库的方法，其包括：

1 )提供 n个 DNA样品， n为整数且 1 < n < 67的整数，优选地 n为整数且 2 < n < 67 , 所述 DNA样品来自所有真核和原核 DNA样品，包括但不限于人 DNA样品；

2 )将人基因组 DNA打断，其中打断方法包括但不限于超声波打断方法，优选地使打断后的 DNA条带集中在 180 bp左右；

3 ) 末端修复；

4 ) DNA片段 3，末端加碱基 "A" ；

5 )连接 DNA标签接头，其中优选地每一个标签接头连接到 DNA片段的两端，；

6 ) 将步骤 5 ) 得到的连接产物进行凝胶回收纯化，优选地通过 2 %的琼脂糖胶进行电泳并回收，并将各个 DNA样品的回收产物混合在一起；

7 ) PCR反应，使用步骤 6 ) 的回收产物的混合物作为模板，在适于扩增目的核酸的条件下进行 PCR扩增，将 PCR产物进行胶回收纯化，优选地回收 280 ~ 300bp的目的片段。

根据本发明的实施例，通过上述根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法所构建的 DNA标签文库，其 DNA标签接头包括如下或由如下组成：表 1所示 67个 DNA标签接头与其所包含的 DNA标签序列相差 1个碱基的 DNA标签接头中的至少 5个，或至少 10 个，或至少 15个，或至少 20个，至少 25个，或至少 30个，或至少 35个，或至少 40个，或 45个，或至少 50个，或至少 55个，或至少 60个，或全部 67个。 #居本发明的实施例，上述根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法中，釆用的 DNA标签接头优选地至少包括表 1所示的 67个 DNA标签接头中的 DNA Index - 1F/R_adapte ~ DNA Index - 5F/R_adapter, 或 DNA Index - 6F/R_adapte ~ DNA Index - 10F/R_adapter, 或 DNA Index - 11F/R_adapte ~ DNA Index - 15F/R_adapter , 或 DNA Index - 16F/R_adapte ~ DNA Index - 20F/R_adapter, 或 DNA Index - 21F/R_adapte - DNA Index - 25F/R_adapter, 或 DNA Index - 26F/R_adapte ~ DNA Index - 30F/R_adapter , 或 DNA Index - 31F/R_adapte ~ DNA Index - 35F/R_adapter, 或 DNA Index - 36F/R_adapte ~ DNA Index - 40F/R_adapter, 或 DNA Index - 41F/R_adapte ~ DNA Index - 45F/R_adapter, 或 DNA Index - 46F/R_adapte ~ DNA Index - 50F/R_adapter,或 DNA Index - 51F/R_adapte ~ DNA Index - 55F/R_adapter, 或 DNA Index - 56F/R_adapte - DNA Index - 60F/R_adapter, 或 DNA Index - 61F/R_adapte ~ DNA Index - 65F/R_adapter , 或 DNA Index - 66F/R_adapte - DNA Index - 67F/R_adapter, 或者他们任何两个或多个的组合。根据本发明的实施例，相差 1个碱基包括标签中 1个碱基的取代、添加或删除。根据本发明的实施例，上述根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法的步骤 7 ) PCR反应中使用的引物包括

PE PCR Primers 1.0:

CGATCT; 和

PE PCR Primers 2.0:

CCGATCT。

利用根据本发明实施例的构建 DNA标签文库的方法，能够有效地将根据本发明实施例的 DNA标签引入到针对 DNA样品所构建的 DNA标签文库中。从而可以通过对 DNA标签文库进行测序，获得 DNA样品的序列信息以及 DNA标签的序列信息，从而能够对 DNA样品的来源进行区分。另外，发明人惊奇地发现，当针对相同的样品，基于上述方法，釆用具有不同标签的寡核苷酸构建含有各种 DNA标签的 DNA标签文库时，所得到的测序数据结果的稳定性和可重复性非常好。

另外，根据本发明的实施例，本申请的发明人惊奇地发现，将标签嵌入 DNA接头中，通过连接 DNA标签接头来构建 DNA标签文库，将连接上 DNA标签接头的产物混合在一起，一次 PCR反应就可完成对需要混合的所有标签文库的构建。不仅能提高目前 DNA样品的测序通量，也能提高文库制备的效率和标签的识别率，极大的降低了单个文库的测序费用。

根据本发明的实施例，本发明对 Illumina提供的 DNA接头序列进行优化，在接头中引入标签序列，通过 DNA标签接头的连接将标签序列导入目的文库中。在接头连接后的 PCR反应中，也就无需使用额外的标签 PCR引物，从而精简了引物合成的步骤，降低了 PCR反应的难度，提高了 PCR反应的特异性。目前为止，通过这些 DNA标签接头导入标签的 DNA文库构建方法及其标签序列，并没有相关的报道。根据本发明的实施例，与 Illumina公司的 DNA接头相比，本发明的 DNA标签接头，是优化后的 DNA 标签接头，这些 DNA标签接头提高了接头连接的效率，并提高了标签序列的识别效率及标签的数量。具体情况，可比较参照图 1和图 2, 其中图 1 所示的 Illumina公司的 DNA 标签文库构建方法的流程图，图 2所示的 #居本发明的实施例的 DNA 标签文库构建方法放入流程图。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于构建 DNA标签文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括： 67种分离的寡核苷酸，这 67种分离的寡核苷酸具有第一链和第二链，在所述第一链上形成有粘性末端 T, 并且所述第一链分别由 SEQ ID NO: ( 3N-1 ) 所示的核苷酸构成，所述第二链分别由 SEQ ID NO: ( 3N ) 所示的核苷酸构成，其中，对于相同的寡核苷酸，其第一链和第二链的 N取值相同，并且 N=l-67的整数，其中，这 67种分离的寡核苷酸分别设置在不同的容器中。由此，利用该试剂盒，能够方便地将根据本发明实施例的 DNA标签引入到构建的 DNA标签文库中。当然，本领域技术人员能够理解，试剂盒中还可以包含其他用于构建 DNA标签文库的常规组件，在此不再赘述。

DNA标签文库及测序方法

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种 DNA标签文库，其是根据本发明的构建 DNA标签文库的方法所构建的。该具有标签的 DNA标签文库可以有效地应用于高通量测序技术例如 Solexa技术，从而可以通过获得标签序列，来对所获得的核酸序列信息例如 DNA序列信息来精确地进行样品来源分类。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种确定 DNA样品序列信息的方法。根据本发明的实施例，其包括：根据本发明实施例的构建 DNA 标签文库的方法，构建 DNA标签文库；接着，对所构建的 DNA标签文库进行测序，以确定 DNA样品的序列信息。基于该方法，能够有效地获得 DNA标签文库中 DNA样品的序列信息以及 DNA 标签的序列信息，从而能够对 DNA样品的来源进行区分。另外，发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的方法确定 DNA样品序列信息，能够有效地减少数据产出偏向性的问题，并且能够精确地对多种 DNA标签文库进行区分。根据本发明的实施例，可以釆用任何已知的方法对所构建的 DNA标签文库进行测序，其类型并不受特别限制。根据本发明的一些示例，可以利用 Solexa测序技术对 DNA标签文库进行测序。根据本发明的实施例，可以根据具体情况选择合适的测序引物进行测序。

进一步，可以将上面确定 DNA样品序列信息的方法应用于多种样品。例如，根据本发明的实施例，本发明提供了一种确定多种样品 DNA序列信息的方法。根据本发明的实施例，其包括以下步骤：针对多种样品的每一种，分别独立地根据根据本发明的实施例的构建 DNA标签文库的方法，构建该 DNA样品的 DNA标签文库，其中，不同的 DNA样品釆用相互不同并且已知序列的 DNA标签，这里所使用的术语 "多种"为 2-67 种。将得到的多种样品的 DNA标签文库进行组合，以便获得 DNA标签文库混合物。利用 Solexa测序技术，对所得的 DNA标签文库混合物进行测序，从而获得 DNA样品的序列信息以及标签的序列信息。最后，基于标签的序列信息，对 DNA样品的序列信息进行分类，以便确定所述多种样品 DNA的序列信息。由此，根据本发明实施例的该方法，可以充分利用高通量的测序技术，例如利用 Solexa测序技术，同时对多种样品的 DNA文库进行测序，从而提高 DNA文库测序的效率和通量，同时可以提高确定多种样品 DNA的序列信息的效率。关于测序的方法和釆用的测序引物，前面已经进行了详细描述，此处不再赞述。

需要说明的是，根据本发明实施例的确定 DNA样品序列信息的方法是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以釆购自 Illumina公司。

实施例 1

Paired End DNA寡核苷酸序列：

PE PCR Primers 1.0

CGATCT ( SEQ ID NO: 202 )

PE PCR Primers 2.0

CCGATCT ( SEQ ID NO: 203 ) 实施例 1

1. 方法步骤

1.1 DNA打断

按照 Illumnia公司提供的说明书 ( Preparing samples for multiplexed Paired-End sequencing; illumina part # 1005361 Rev. B , 通过参照并入本文），将人全血基因组 DNA 5微克使用 Covaris打碎仪打断 6分钟（参数设置： Duty cycle(负载比）一20% ； Intensity (强度）—5.0 ； Bursts per second (每秒钟脉冲）一 200 ； Duration (持续时间）一 40 seconds ； Mode (模式 )― Frequency sweeping (频率扫描 ) ； Power (功率 )― 33-34W ； Temperature (温度）_5.5 to 6 °C ) , 使其在琼脂糖电泳中显示的主要条带集中在 180 bp 左右。

1.2 末端修复

按照下列的配比准备反应混合：

打断后的 DNA片段 35 微升

T4 DNA连接酶緩冲液 50微升

dNTPs 混合液 4微升

T4 DNA聚合酶 5微升

Klenow DNA 聚合酶 1微升

T4多聚核苷酸激酶 5微升总体积 100 ^：升

将舒适型恒温混匀器调至 20 °C , 反应 30 min 然后用 QIAquick PCR 纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于 32微升溶解緩冲液。

1.3 DNA片段 3'末端加碱基 "A"

按照下列的配比准备反应混合物：

末端修复后的 DNA 32微升 Klenow酶緩冲液 5微升

dATP(lmM) 10微升

Klenow酶 (3' 到 5'外切酶活性) 3微升总体积 50微升

将舒适型恒温混匀器调至 37 °C , 反应 30min , 然后用 MiniElute PCR 纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于 10微升 Elution Buffer ₀

1.4 连接 DNA标签接头

按照下列的配比准备反应混合物，：

上述步骤得到的 DNA 10微升

T4 DNA 连接酶緩冲液 25 ^敫升

DNA Index-N接头（takara公司合成） 10微升 T4DNA 连接酶 5微升

总体积 50微升

注：对于不同的样品，使用不同的 DNA Index-N接头（ N = 1 ~ 67 ) 。所使用的 DNA Index-N接头可为表 1 中所示任一对 DNA Index - NF _adapter和 DNA Index - NR_adapter退火后形成的 DNA标签接头。

将舒适型恒温混匀器调至 20°C , 反应 15min, 然后用 QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于 30微升溶解緩冲液中。

1.5 连接产物的胶回收纯化

将连接产物于 2%的琼脂糖胶中进行电泳分离；随后将 280~300 bp的目的片段放入 Eppendorf管中。用 QIAquick 胶纯化试剂盒进行胶纯化回收，回收产物溶于 30微升 Elution Buffer。

1.6 PCR反应

PCR反应：按照下列的反应体系准备反应混合物，将试剂放置于水上。

胶回收纯化后的 DNA 10微升

PE PCR Primers 1.0 1微升

PE PCR Primers 2.0 1 敫升

Phusion DNA 聚合酶 25微升

ddH₂0 13微升

总体积 50微升

PCR反应条件

98 °C 30s 个循环

1.7 PCR产物的胶回收纯化

将 PCR 产物于 2%琼脂糖胶中电泳分离，切割回收 280~300bp 的目的片段，用 QIAquick 胶纯化试剂盒进行胶纯化回收，回收产物溶于 30微升洗脱緩冲液。

1.8 DNA制备产物检测

使用 Agilent 2100 Bioanalyzer, 根据生产商说明书的操作方法，检测文库产量（见图 4 ) 。

2. 结果分析

图 3显示了根据本实施例的构建的 67个 DNA标签文库的电泳结果。该图中，分别使用了 D2000和 50bp的 marker, 分别产自天根公司和 NEB公司；箭头所标记的为目的文库片段大小。在图 3 a-c的电泳结果中，自左向右分别为泳道 1至泳道 25。其中， ( a )是 DNA标签接头文库测试 ( index l~index23 ) 电泳检测结果（泳道 1和泳道 25 分别是 D2000 makrer和 50bp marker ^ 泳道 2到泳道 24分别是使用 DNA标签接头 index l~index23构建的文库 ) ； ( b ) 是 DNA标签接头文库测试 ( index23~index44 ) 电泳检测结果（泳道 1和泳道 25分别是 D2000 makrer和 50bp marker ^ 泳道 2到泳道 24分别是使用 DNA标签接头 index23~index44构建的文库，其中泳道 14为试验的阴性对照，即没有样品）；（c ) 是 DNA标签接头文库测试（index45~index67 ) 电泳检测结果（泳道 1和泳道 25分别是 D2000 makrer和 50bp marker ^ 泳道 2到泳道 24分别使用 DNA标签接头 index45~index67构建的文库）。如图 3结果显示，根据本实施例构建的 67个 DNA标签文库数据质量很好。

图 4显示了根据本实施例的构建的 DNA标签文库使用 Agilent2100检测的结果。该图中中，样品名为 Agilent3 , 图中峰从左到右分别代表 Marker, 样品片段大小， Marker。根据图 4结果显示，所测文库片段大小为 284bp , 浓度为 32.64纳克 /微升，文库大小和浓度均合格。

另外， Solexa测序结果统计：标签完全识别即 0错误匹配（ mismatch ) 占 98.43% , 标签测出错误 1个碱基即 1错误匹配的占 0.09% ,其他读取结果（ other reads )占 1.48% , 所以测序结果标签的识别率为 98.5% , 可以满足 Solexa DNA index的测序要求。并且针对相同样品，釆用不同标签进行测序时，数据稳定性和重现性非常好。

工业实用性

本发明的用于构建 DNA标签文库的 DNA标签、寡核苷酸、 DNA标签文库及其制备方法、数字基因表达谱及其建立方法、确定 DNA样品序列信息的方法、确定多种样品 DNA序列信息的方法以及用于构建 DNA标签文库的试剂盒，能够应用于 DNA测序，并且能够有效地提高测序平台，例如 Solexa测序平台的测序通量。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

在本说明书的描述中，参考术语 "一个实施例" 、 "一些实施例" 、 "示意性实施例" 、 "示例" 、 "具体示例" 、或 "一些示例" 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

权利要求书

I. 一组分离的 DNA标签，其由 SEQ ID NO: ( 3N-2 ) 所示的核苷酸构成，其中 N=l-67的任意整数。

2、一组分离的寡核苷酸，所述分离的寡核苷酸具有第一链和第二链，其中所述第一链分别由 SEQ ID NO: ( 3N-1 ) 所示的核苷酸构成，所述第二链分别由 SEQ ID NO: ( 3N )所示的核苷酸构成，其中，对于相同的寡核苷酸，其第一链和第二链的 N取值相同，并且 N=l-67的整数。

3、一种构建 DNA标签文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将 DNA样品随机打断，以便获得随机片段；

将所述随机片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的随机片段；

在所述经过末端修复的随机片段的 3，末端添加碱基 A, 以便获得具有粘性末端 A 的随机片段；

将所述具有粘性末端 A的随机片段与 DNA标签接头相连，以便获得连接有 DNA 标签接头的连接产物，其中所述 DNA标签接头包含选自权利要求 1所述的一组分离的 DNA标签的一种；

对所述连接有 DNA标签接头的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物；以及分离回收所述扩增产物，所述扩增产物构成所述 DNA标签文库。

4、根据权利要求 3所述的构建 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述 DNA样品为人 DNA样品。

5、根据权利要求 4所述的构建 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述 DNA样品为人基因组 DN A样品。

6、根据权利要求 3所述的构建 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述随机片段的长度为大约 180bp。

7、根据权利要求 3所述的构建 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述经过末端修复的随机片段具有两条寡核苷酸链，

其巾，

在所述两条寡核苷酸链的 3，末端均添加碱基 A; 以及

在所述两条寡核苷酸链的 3，末端均连接 DNA标签接头。

8、根据权利要求 3所述的构建 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述 DNA标签接头为选自权利要求 2所述的分离的寡核苷酸的一种。

9、根据权利要求 3所述的构建 DNA标签文库的方法，其特征在于，

所述扩增产物的长度为大约 280-300bp。

10、根据权利要求 3所述的构建 DNA标签文库的方法，其特征在于，

对所述连接有 DNA标签接头的连接产物进行扩增，是通过 PCR反应进行的，所述 PCR反应釆用分别具有如 SEQ ID NO: 202和 SEQ ID NO: 203 所示核苷酸序列的引物。

I I、一种 DNA标签文库，其是通过根据权利要求 3-10任一项所述的方法构建的。

12、一种确定 DNA样品序列信息的方法，其包括下列步骤：

根据权利要求 3-10任一项所述的方法构建所述 DNA样品的 DNA标签文库；以及

对所述 DNA标签文库进行测序，以便确定所述 DNA样品的序列信息。

13、根据权利要求 12所述的确定 DNA样品序列信息的方法，其特征在于，对所述 DNA标签文库进行测序是利用 Solexa测序技术进行的。

14、一种确定多种样品 DNA序列信息的方法，其包括下列步骤：

针对所述多种样品的每一种，分别独立地根据权利要求 3-10任一项所述的方法，建立所述 DNA样品的 DNA标签文库，其中，不同的 DNA样品釆用相互不同并且已知序列的 DNA标签，其中所述多种为 2-67种；

将所述多种样品的 DNA标签文库进行组合，以便获得 DNA标签文库混合物；利用 Solexa测序技术，对所述 DNA标签文库混合物进行测序，以获得所述 DNA 样品的序列信息以及所述标签的序列信息；以及

基于所述标签的序列信息对所述 DNA样品的序列信息进行分类，以便确定所述多种样品的 DNA序列信息。

15、一种用于构建 DNA标签文库的试剂盒，其包括：

67 种分离的寡核苷酸，所述分离的寡核苷酸具有第一链和第二链，其中所述第一链分别由 SEQ ID NO: ( 3N-1 ) 所示的核苷酸构成，所述第二链分别由 SEQ ID NO:

( 3N ) 所示的核苷酸构成，其中，对于相同的寡核苷酸，其第一链和第二链的 N取值相同，并且 N=l-67的整数，

其中，所述 67种分离的寡核苷酸分别设置在不同的容器中。