CN110607296B

CN110607296B - 重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化

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Publication number: CN110607296B
Application number: CN201810626362.XA
Authority: CN
Inventors: 赵致; 王之可; 刘晓
Original assignee: SHANGHAI YAXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI YAXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: CN110607296A

Abstract

本发明涉及重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化。本发明对胰蛋白酶进行改造，在其羧基端引入Cys，获得稳定性以及固定化性能较优的胰蛋白酶，之后，利用优化的固定化方法，获得固定化的胰蛋白酶制剂，其不仅固定化效率高、稳定性好，且保留高的酶活性。

Description

重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化。

背景技术

蛋白酶作为高效的催化剂，被广泛运用于生物、化工等领域。然而生产实践中蛋白酶往往并不适于工业的生产，蛋白酶通常不稳定，而且多为水溶性，易被底物、产物和其他相关成分所抑制，同时工业生产条件较为苛刻，蛋白酶表现出稳定性范围是相对而言。因此提高蛋白酶的催化效率和稳定性是科研人员的重要研究方向。

非水相催化、蛋白酶的定向改造和固定化是提高蛋白酶的催化效率和稳定性的重要手段。蛋白酶固定化研究是较为直接、简单提升蛋白酶的稳定性、克服蛋白酶在反应体系中的稳定性的有效方式。适当的蛋白酶固定化，不仅起到增强蛋白酶稳定性的作用，同时也提高了蛋白酶重复利用效率，可提升蛋白酶的运用价值。

然而，蛋白酶作为一种具有生物活性的多肽，其固定化技术尚存在较多的问题，对于性质不同的酶，目前还无法以相同或相近的方法加以固定化。本发明人在研究过程中，发现常规的方式去对胰蛋白酶进行固定化，效果并不理想，一方面不易于高效地固定化，另一方面酶活性极易于发生改变甚至没有活性。

因此，需要针对胰蛋白酶这一具体的酶，探索不同的反应条件，找到适合于进行固定化的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化。

在本发明的第一方面，提供一种对胰蛋白酶进行固定化的方法，所述方法包括：

(1)在胰蛋白酶羧基端加上Cys(如1‐2个Cys)；

(2)将步骤(1)获得的胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂、三(2‐羧乙基)膦混合；

(3)以活化凝胶为固定化载体，将步骤(2)的混合液与之混合，进行固定化反应；

(4)将经固定化反应的产物在酸性条件下处理，解除胰蛋白酶抑制剂的抑制作用，获得固定化的活性胰蛋白酶。

在一个优选例中，步骤(2)中，胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂的摩尔比为1:1‐10(较佳地1:1‐5；更佳地1:1‐4)，或质量比为1～5:1(较佳地(1.5～3)：1；更佳地2:1)。

在另一优选例中，胰蛋白酶与三(2‐羧乙基)膦的质量比为(5～50):1；较佳地(5～20):1。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的胰蛋白酶抑制剂为：抑肽酶，大豆胰蛋白酶抑制剂。

在另一优选例中，所述活化凝胶为活化的琼脂糖凝胶，更佳地如环氧活化或碘乙酸活化的琼脂糖凝胶。

在另一优选例中，固定化反应时，溶液的pH值为7.0至8.0，较佳地为7.5±0.2。

在另一优选例中，固定化反应时，温度为25～38℃；较佳地为25～35℃。

在另一优选例中，固定化反应时，反应时间为20～50小时；较佳地为25～40小时；更佳地为30～35小时。

在另一优选例中，所述到胰蛋白酶包括：胰蛋白酶变异体；较佳地，所述的变异体中，将其第99位Arg突变为His，并且在其羧基端加上Cys(如1‐2个Cys)。

在本发明的另一方面，提供一种固定化胰蛋白酶制剂，所述的固定化胰蛋白酶制剂，包括：活化凝胶以及与之偶联的胰蛋白酶；所述的胰蛋白酶的羧基端存在Cys，该Cys的巯基与活化凝胶(如活化的琼脂糖凝胶，更佳地如环氧活化或碘乙酸活化的琼脂糖凝胶)的活化基团偶联；较佳地，所述到胰蛋白酶包括：胰蛋白酶变异体；较佳地，所述的变异体中，将其第99位Arg突变为His，并且在其羧基端加上Cys(如1‐2个Cys)。

在一个优选例中，所述的固定化胰蛋白酶制剂由前面任一所述的方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供所述的固定化胰蛋白酶制剂的用途，用于酶解蛋白质或者变性蛋白质，或用于生物医药生产，如胰岛素及其类似物的生产等。

在本发明的另一方面，提供一种用于酶解蛋白质或者变性蛋白质的试剂盒，所述是试剂盒中包含所述的固定化胰蛋白酶制剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、重组胰蛋白酶和突变体的温度稳定性。

(a)重组胰蛋白酶温度稳定性；

(b)突变体mRPT(R99H)温度稳定性。

图2、mRPT(R99H)‐C重组质粒构建。

(a)目的基因的扩增M:Mark，lane1：目的基因PCR产物；

(b)目的基因的双酶切M:Mark，lane2：双酶切产物；

(c)菌落PCR M:Mark，lane1‐6：挑取的不同阳性克隆菌株；

(d)重组质粒线性化M:Mark，lane1：重组质粒线性化。

图3、mRPT(R99H)‐C诱导表达。M:Mark，lane 1：诱导表达上清。

图4、mRPT(R99H)‐C的高密度发酵。

(上)发酵菌体生长曲线。

(下)发酵过程取样SDS‐PAGE鉴定M:Mark，lane1、2、3、4、5、6：发酵诱导12h、24h、36h、48h、60h和72h。

图5、mRPT(R99H)‐C的纯化。

(a)mRPT(R99H)‐C CM‐FF阳离子交换柱纯化M:mark，Lane1：上样穿出，lane2：平衡穿出，lane3‐12：洗脱样液(b)mRPT(R99H)‐C亲和纯化M:Mark,lane1、2、3：洗脱样液。

图6、PT三维结构模型。

(a)PT表面模型红色标记为催化位点，绿色为底物结合位点，蓝色为C‐端。(b)PT表面模型翻转180°。

图7、pH对固定化的影响。

图8、温度对固定化的影响。

图9、酶给剂量对固定化的影响。

图10、固定化时间对固定化的影响。

图11、固定化重复利用效率。

图12、mRPT(R99H)‐C固定化酶重复利用效率结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，开发了优化的适用于胰蛋白酶固定化的方法，基于此获得了固定化的胰蛋白酶制剂，其不仅固定化效率高、稳定性好，且保留高的酶活性。

固定化方法优化

一个合适的固定化方法，不仅可提高蛋白酶的稳定性，同时可减少酶在反应过程中的抑制作用，增加酶蛋白的选择性和特异性。不同固定化方式在固定化的过程中不可避免对蛋白酶的活性造成不同程度的影响，如引起蛋白酶空间构象变化，酶活性中心的掩盖等。维持蛋白酶在固定化空间构象的稳定和酶催化位点的正确构向是酶蛋白固定化的研究重点。相对于非特异性的固定化方式，蛋白酶的定向固定化具有明显优势。

本发明人发现，固定化过程中，以胰蛋白酶抑制剂来抑制胰蛋白酶或其变异体的活性、之后再去除胰蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶或其变异体恢复活性，可防止胰蛋白酶在固定化的过程自降解。作为本发明的优选方式，所述的胰蛋白酶抑制剂为：抑肽酶，大豆胰蛋白酶抑制剂；本发明人发现，抑肽酶的结合起到稳定胰蛋白酶及其突变体的活性的作用，保护固定化过程中胰蛋白酶或其变异体构象的变化对活性造成的影响。而在固定化后，在酸性条件下，抑肽酶可以方便地被去除，使得胰蛋白酶或其变异体可逆性地恢复活性。所述的酸性条件是pH1.5～4(如2.5，3.5等)的酸性条件，较佳地为pH2～3的酸性条件。例如可以利用甘氨酸、柠檬酸、盐酸等可以构成酸性环境的物质来建立所述的酸性条件。在本发明的实施例中，采用了10mM HCl(约pH2)洗涤。

如本文所用，所述的“胰蛋白酶(或突变体)活性”是以酶的活力单位来定义的。酶的一个活力单位(1U)定义为：25℃，pH7.6，反应体系3.2ml(1cm光路)，每分钟酶解N‐乙酰‐L‐酪氨酸乙酯(BAEE)使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位；吸收值增加0.001定义为一个BAEE单位。

本发明人还发现，还原剂TCEP对RPT‐R99H‐C酶活性密切相关。TCEP作为强还原剂，随着浓度升高，对RPT‐R99H‐C的活性影响逐渐增强，可能高浓度TCEP对目的蛋白的分子内的二硫键起到还原破坏作用，从而影响到蛋白酶的活性。因此，为了保证目的蛋白酶活性不受影响，RPT‐R99H‐C和TCEP的质量比可以为(5～50)：1；较为理想为(10～20)：1。

本发明人还研究了固定化反应的较为适合的pH、温度、酶给剂量和时间。

在本发明的优选方式中，pH对固定化选取的范围在pH 6.5至pH 8.0，为‐SH与环氧基反应范围，同时又不引起‐NH₂对环氧基的影响。随着pH的增大，固定化酶酶活逐渐增大。pH在6.5至7.5间，固定化酶的酶活增大趋势较为明显，但在7.5至8.0，固定化酶的活性增长趋势明显降低趋于平稳趋势。

在本发明的优选实施例中，温度在25℃至30℃之间，固定化效率呈现明显增长趋势。但随反应温度持续上升，固定化酶效率逐渐下降。表明30℃为固定化反应的最适温度。

在本发明的优选实施例中，随着反应时间的加长，固定化酶活呈现上升的趋势。于24h后固定化酶活上升趋势开始减缓，在30h后，固定化酶的酶活大小基本趋于平稳趋势，与反应36h后得到的固定化酶的活性相差较小。

综上，应用本发明的固定化方法，可以维持胰蛋白酶在固定化过程中构象稳定和构向正确，降低催化底物产生的位阻效应。蛋白酶的定向固定化是由蛋白酶直接或间接地以特定位点或区域结合至固定化载体上，有效保护了胰蛋白酶的活性位点，提高固定化的效率。

胰蛋白酶及其改造

本发明人发现，天然的胰蛋白酶并不能够直接进行固定化，不能形成有活性的固定化酶。为了克服这一问题，本发明人在其羧基端加上至少一个Cys(如1‐2个)。

本发明人发现，野生型的胰蛋白酶在加上Cys后，能够用于固定化、获得有活性的固定化产物，但是野生型的胰蛋白酶具有一定的热不稳定性。针对这一特点，本发明人对于胰蛋白酶的结构进行了进一步的优化改造，包括对其多肽序列上第99位进行突变，由精氨酸突变为组氨酸。应理解，尽管进行了第99位的特定改造，然而野生型的胰蛋白酶以及其它突变体，只要在其羧基端加上Cys，也可被应用于本发明的固定化方法中。

如本文所用，除非另外说明，所述的“胰蛋白酶的突变体”、“突变型胰蛋白酶”可互换使用，是指对应于野生型胰蛋白酶(如SEQ ID NO:1)，发生以下位置的突变后所构成的蛋白：第99位突变，以及羧基端加上至少一个Cys。

如本文所用，除非另外说明，所述的“胰蛋白酶的变异体”、“胰蛋白酶的突变体”、“突变型胰蛋白酶”可互换使用，是指对野生型的胰蛋白酶的进行突变后的产物。

如本文所用，若需要表示野生型的胰蛋白酶，其将被标示为“野生型胰蛋白酶”、“Pt”、“PT”、“野生型胰蛋白酶”或“野生型Pt”，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

利用定点突变技术，对胰蛋白酶进行第99位的改造，同时在其羧基端引入Cys，获得稳定性以及固定化性能优于野生型的胰蛋白酶突变体，之后，利用

PT的空间三维结构如图6，PT的活性位点和C末端被标注。从PT三维空间结构可看出，PT的C末端主要位于PT的表面，相对于PT的活性位点具有一定的空间距离。通过在C末端引入Cys残基，利用Cys残基位点上的巯基(‐SH)与环氧活化的琼脂糖胶相互作用，达到定向固定化目的。

本发明还提供了编码本发明胰蛋白酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或猪胰蛋白酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

本发明中，猪胰蛋白酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的重组表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。在重组表达mRPT(R99H)‐C时，发明人发现，在利用大肠杆菌进行表达时，获得蛋白包涵体后，较难复性成功，这可能是由于半胱氨酸的二硫键结构导致的；本发明人发现在毕赤酵母中，则可以有效地实现分泌表达。因此，在苯发明的优选实施方式中，采用酵母进行表达mRPT(R99H)‐C。

在本发明人的具体实施例中，利用毕赤酵母的10L高密度发酵大量生产mRPT(R99H)的N端突变体mRPT(R99H)‐C，实现了突变体mRPT(R99H)‐C的大量生产。将突变体mRPT(R99H)‐C发酵液通过CM‐FF阳离子交换柱，获取较纯净的突变体mRPT(R99H)‐C酶原。收集的酶原经Ca²⁺激活，经纯化，最终获得有活性的突变体mRPT(R99H)‐C蛋白样品，比活大小约为4000USP/mg。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、突变体mRPT(R99H)‐C的获得

1、突变体猪胰蛋白酶(mRPT)的构建

获得一种天然的猪胰蛋白酶的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

针对如上的胰蛋白酶天然序列，将该天然序列克隆入pPIC 9k中，在对应于其氨基酸序列第99位的位点进行突变，获得该位从Arg向His的突变，突变的多肽称为mRPT(R99H)，或简称为R99H。带有突变体的载体称为载体pPIC 9k‐mRPT(R99H)。

2、稳定性分析比较

重组胰蛋白酶(野生型)和突变体mRPT(R99H)的温度稳定性结果见图1。在4℃和25℃之间，重组胰蛋白酶(野生型)和突变体mRPT(R99H)的稳定性一致，均保持较好的稳定性，16h温育后酶活残余率均保持90％左右。但随温度的增加，二者的酶活稳定性呈现逐渐下降的趋势。在50℃条件温育16h，重组胰蛋白酶(野生型)的酶活残余率降至70％，而突变体的酶活残余率仍保持在80％以上。当温育温度到达60℃时，重组胰蛋白酶(野生型)和突变体呈现下降的趋势基本相同，温育16h后，RPT的酶活残余率为54％，突变体的酶活残余率分别维持在66％。

结果表明，突变体mRPT(R99H)提升了重组胰蛋白酶的热稳定性。

3、突变体mRPT(R99H)‐C的构建

本发明人发现，野生型或突变体mRPT(R99H)当要进行固定化时，利用氨基固定化的原理进行固定(利用肽链上的赖氨酸的氨基基团)，会使得胰蛋白酶的活性位点被封闭。因此，传统的胰蛋白酶固定化并不理想，需要开发其它的固定化方法。

经过反复研究比较，本发明人在胰蛋白酶的羧基端加上1个半胱氨酸，以期实现不依赖于氨基的固定化。

以前述获得的载体pPIC 9k‐mRPT(R99H)为模板，利用引物(序列为：CCGGAATTCGATGATGATGATAAGATTGTTGG(SEQ ID NO:2)和ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTTAGCAGCAATAGTTT(SEQID NO:3))扩增。PCR扩增产物由0.8％琼脂糖电泳鉴定，结果见图2a。电泳结果显示目的基因大小为700bp左右，与预期大小相符。目的基因的双酶切是由限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ所完成，酶切之后的片段经0.8％琼脂糖电泳鉴定，结果见图2b，目标条带显示的大小为700bp左右，与预期大小相符。

双酶切后得到的目的基因产物在连接酶作用下插入空载质粒pPIC9k中，并转化至E.coli DH5α克隆菌株中进行重组质粒的扩增与鉴定。挑选6个阳性克隆菌株进行菌落PCR，PCR产物结果由0.8％琼脂糖电泳鉴定，鉴定结果参见图2c。结果显示，挑选出的6个阳性菌株经菌落PCR发现在700bp大小处有明显的单一条带，表明6个阳性克隆菌株均成功转化重组质粒。随后对阳性结果菌株进行测序，鉴定蛋白序列完全正确，表明mRPT(R99H)‐C重组质粒构建成功。

将正确的重组质粒通过酶SacⅠ线性化，电泳鉴定结果如图2d，线性化后的质粒在0.8％琼脂糖电泳结果中显示的大小约为1000bp，符合预期大小。而在5000bp处显示的大小是由于酶切不完全导致的，经切胶回收去除。

实施例2、突变体mRPT(R99H)‐C表达鉴定、高密度发酵及纯化

如前述加上半胱氨酸后，有利于实现胰蛋白酶的良好固定化；但是，本发明人在重组表达mRPT(R99H)‐C时发现，在利用大肠杆菌BL21(DE3)进行表达时，获得蛋白包涵体后，很难复性成功，这可能是由于半胱氨酸的二硫键结构导致的。因此，本发明人选择毕赤酵母进行表达。方法如下：

1、表达鉴定

经线性化的重组质粒pPIC9k‐mRPT(R99H)‐C，利用电转方式转化至表达宿主毕赤酵母GS115中。转化的重组菌经不同浓度的G418抗性筛选，获得mRPT(R99H)‐C高表达菌株。

在10L发酵罐中，利用0.5％甲醇诱导表达，收集培养基上清，经15％SDS‐PAGE电泳鉴定，结果见图3。结果显示目的条带在电泳图显示的表观分子量大小在21.0kDa左右，符合预期目的蛋白大小(24.624kDa)。

结果表明，突变体mRPT(R99H)‐C在宿主GS115中得到正确表达并实现分泌表达。

2、高密度发酵

为了大量生产目的突变体mRPT(R99H)‐C，对mRPT(R99H)‐C表达菌株进行10L高密度发酵，发酵结果见图4。

对诱导过程中的发酵液每12h取样，收集发酵液上清，进行15％SDS‐PAGE电泳鉴定，表明发酵表达目的条带mRPT(R99H)‐C在电泳图中显示的表观分子量在21.0kDa左右符合目的蛋白预期大小，与上述摇瓶发酵结果相符。目的蛋白的表达随着诱导时间的增长，mRPT(R99H)‐C酶原在发酵液中液得到了明显的富集。发酵最终菌浓OD600为390，细胞干重为110g/L，目的蛋白表达量约为450mg/L。

3、纯化

收集发酵液上清，通过透析方式去除发酵液中过高的离子浓度和部分色素，同时改变发酵液的缓冲体系至20mM pH 4.5HAc‐NaAc缓冲体系中。mRPT(R99H)‐C的CM‐FF阳离子交换柱纯化结果参见图5a，结果表明，目的条带显示表观分子量大小21.0kDa左右，条带较为单一，纯化效果较为明显。通过CM‐FF柱纯化后获得较纯的目mRPT(R99H)‐C蛋白酶原。

mRPT(R99H)‐C蛋白酶原在Ca²⁺存在条件下于4℃进行激活，激活mRPT(R99H)‐C蛋白样液由纯化获得，纯化经15％SDS‐PAGE电泳鉴定结果参见图5b。结果表明，激活后的mRPT(R99H)‐C蛋白酶样液由纯化后获得较高纯度的蛋白样液，比活约为4000USP/mg。

实施例2、胰蛋白酶固定化方法的优化

在对重组胰蛋白酶进行固定化的操作过程中，本发明人发现，重组胰蛋白酶易于发生自降解，因此需要探索在此过程中抑制其发生降解的试剂或方法。经过反复研究后，本发明人确定了对于避免蛋白降解有用的方法及试剂：通过利用抑肽酶先抑制其酶活性，固定完成后再去除抑肽酶来恢复其酶活性。

1、抑肽酶对重组胰蛋白酶的抑制作用

重组抑肽酶为雅心生物商品化产品(批号：RTI160301)，5.8EPU/mg，21.9mg/ml。酶活单位：能抑制一个胰蛋白酶单位的活力称为一个抑肽酶活力单位(EPU)。胰蛋白酶单位：每秒钟能水解1μmol的N‐苯甲酰‐L‐精氨酸乙酯(BAEE)为一个胰蛋白酶单位(microkatal)。换算后：1EPU RTI可抑制16200BAEE unit的胰蛋白酶活性。按照中国药典和美国药典的规定，1mg抑肽酶的活性不小于3EPU。

重组胰蛋白酶用PBS缓冲液溶解并稀释。采用BAEE方法测定胰蛋白酶活性。

取150μl重组胰蛋白酶，测定活性为4150BAEE unit/ml，150ul总活性为622.5BAEEunit(*0.15)。

计算完全抑制，所需加入重组抑肽酶的体积，622.5/16200＝0.0384EPU，换算为体积为：0.0384/(5.8*21.9)＝0.302μl，将重组抑肽酶稀释10倍后，加入量为3.02μl。

反应5min后，测定胰蛋白酶活性。结果显示无活性。因此可见重组抑肽酶可以完全抑制胰蛋白酶活性。

计算50％抑制所需的加入量为1.51μl。反应5min后，测定胰蛋白酶活性。测定活性：2100BAEE unit/ml。结论：抑制率为49.39％。

因此，1EPU RTI可完全抑制16200BAEE unit的胰蛋白酶活性。若不完全抑制，则抑制率与加入的重组抑肽酶的量成正比。

按照不同质量比例验证抑肽酶对胰蛋白酶的抑制作用。

2、mRPT(R99H)及mRPT(R99H)‐C与环氧活化琼脂糖凝胶的固定化

将mRPT(R99H)及mRPT(R99H)‐C与环氧活化琼脂糖凝胶固定化实验，实验条件如表6。

表6

在24h后，对实验组测活。结果发现，mRPT(R99H)组没有活性。该测定结果说明，氨基不能与环氧基结合，而在mRPT(R99H)的羧基端加上Cys则能够具有活性，说明羧基端加上Cys有利于固定化。

3、还原剂TCEP对mRPT‐R99H‐C的影响

TCEP作为还原剂，此例中，被用于进行酶固定化过程中保护羧基端巯基的作用，本实施例中探讨其对于mRPT‐R99H‐C酶活性的影响，实验条件如表4。

表4

TCEP对mRPT‐R99H‐C酶活性的影响结果如表5；实验结果可知，TCEP作为强还原剂，随着TCEP的浓度升高，对mRPT‐R99H‐C的活性影响逐渐增强，可能TCEP的浓度较高，对目的蛋白的分子内的二硫键起到还原破坏作用，从而影响到蛋白酶的活性，为了保证目的蛋白酶活性不受影响，RPT‐R99H‐C和TCEP的质量比可以为(5～50)：1；较为理想为(10～20)：1，目的蛋白酶的活性残余可达到100％。

表5

实施例3、固定化

用于固定化的活化胶有多种，例如环氧基活化的琼脂糖胶、碘乙酸活化的琼脂糖胶，活化基团在一定条件下均可与Cys的SH进行特异反应。

进行mRPT‐R99H‐C与碘乙酸活化胶的固定化实验。反应体系如表6。

表6

取一定碘乙酸活化的琼脂糖胶，用3倍体积的偶联液清洗2次，按照表6加入含mRPT‐R99H‐C(1mg/mL)体系，在28℃震荡反应1h或12h。用去离子水清洗3次，用10mM HCl洗涤，期间测定固定化酶活性，直至测出固定化酶的活性不变，表示已经洗去胰蛋白酶抑制剂、恢复胰蛋白酶活性。

上述2组实验，在所述条件下，通过碘乙酸配基的琼脂糖固定mRPT‐R99H‐C在1h和12h反应后测得固定化酶活性大小基本相同，在3500BAEE单位/g左右。碘乙酸在8.0和9.0之间可与蛋白质中的巯基反应，从而达到固定化的效果(‐SH+I‐CH2‐COOH→‐S‐CH2‐COOH)；由上述结果可知，反应1h，胶和RPT‐R99H‐C反应已达到完全，效率相对于环氧活化琼脂糖胶固定较大，但两者的酶活大小相差不大。

实施例3、mRPT(R99H)‐C固定化的其它参数探讨

1、固定化酶给剂量的影响

称取湿重约0.2000g环氧活化琼脂糖胶，于0.5M磷酸钠pH缓冲液中，加入不同质量的蛋白酶mRPT(R99H)‐C，按照质量比抑肽酶:胰蛋白酶为1:2加入抑肽酶，0.1mg/ml的TCEP，反应终体积4mL。在25℃恒温震荡箱反应12h。

酶给剂量对固定化效率的影响结果参见图9。由实验结果表明，酶给剂量对于固定化的影响相对较为明显。固定化酶的活性随着酶给剂量的上升逐渐增强，在蛋白酶给剂量与载体胶质量(mg/g)比达到10:1(mg:g)，固定化的酶活显示为最佳的比例。当酶给量增加至比例20:1时，固定化酶活出现下降趋势。因此，合适的蛋白酶给剂量与载体胶质量为5～20mg:1g；较佳地为8～15mg:1g；最佳为10mg:1g。

2、固定化pH的影响

称取湿重约0.2000g环氧活化琼脂糖胶，于不同pH值的磷酸钠缓冲液中，加入1mg/ml蛋白酶mRPT(R99H)‐C，按照质量比抑肽酶:胰蛋白酶为1:2加入抑肽酶，0.1mg/ml的TCEP，反应终体积4mL。在25℃恒温震荡箱反应12h。

pH是影响固定化的参数之一，与蛋白酶的稳定性密切相关，同时不同的pH对固定化效率也有所差异。本发明人发现，pH对固定化选取的范围在pH6.5至pH 8.0，为‐SH与环氧基反应范围，同时又不引起‐NH₂对环氧基的影响。

pH对固定化效率的影响结果见图7。实验结果表明，随着pH的增大，固定化酶酶活逐渐增大。pH在6.5至7.5间，固定化酶酶活增大趋势较为明显，但在7.5至8.0，固定化酶的活性增长趋势明显降低趋于平稳趋势。结果表明，pH在7.5时基本达到相对最佳。

3、固定化温度的影响

称取湿重约0.2000g环氧活化琼脂糖胶，于0.5M磷酸钠pH缓冲液中，加入1mg/ml蛋白酶mRPT(R99H)‐C，按照质量比抑肽酶:胰蛋白酶为1:2加入抑肽酶，0.1mg/ml的TCEP，反应终体积4mL。在不同温度的恒温震荡箱反应12h。

温度是影响固定化酶的重要参数之一，温度过高易导致蛋白酶变性，过低影响反应效率。因此找到适当的反应温度，对固定化效率较为重要。

温度对固定化效率的影响结果参见图8。结果表明，温度在25℃至30℃之间，固定化效率呈现明显增长趋势。但随反应温度持续上升，固定化酶效率逐渐下降。表明30℃为固定化反应的最适温度。

4、固定化时间的影响

称取湿重约0.2000g环氧活化琼脂糖胶，于0.5M磷酸钠pH缓冲液中，加入1mg/ml蛋白酶mRPT(R99H)‐C，按照质量比抑肽酶:胰蛋白酶为1:2加入抑肽酶，0.1mg/ml的TCEP，反应终体积4mL。在25℃恒温震荡箱反应不同时间。

固定化时间对固定化效率的影响结果参见图10。实验结果表明。随着反应时间的加长，固定化酶活呈现上升的趋势。于24h后固定化酶活上升趋势开始减缓，在30h后，固定化酶的酶活大小基本趋于平稳趋势，与反应36h后得到的固定化酶活活性相差较小。由此可见30h反应时间基本达到固定化最大效率。

采用上述方法，最终获得的固定化酶活性达到600USP/g，固定化的装载量达到3.5mg/g。

实施例4、固定化的mRPT(R99H)‐C的稳定性及重复利用情况

1、固定化酶pH稳定性和温度稳定性

固定化酶的pH稳定性选择在pH 3.0至11.0之间，结果如图11a。固定化酶在pH 3.0至7.0之间，固定化酶保持较好的稳定性，在温育4h后酶活残余率仍能维持在90％左右。但随着pH值的增大，固定化酶的稳定呈现明显的下降趋势，在pH值达到11.0时，其酶活残余率仅为初始酶活的75％。这一结果也与游离态mRPT(R99H)的pH稳定性结果基本一致。

固定化酶的温度稳定性结果如图11b，在4℃至37℃之间，固定化酶稳定性相对较好，酶活残余率可达到85％以上。但随着温度的上升，固定化酶的稳定性呈现明显的下降趋势，在60℃温育4h后，酶活残余率维持在60％。固定化酶温度稳定性的结果与游离态的mRPT(R99H)相差不大。

2、固定化酶操作稳定性

固定化酶的重复利用效率是评价固定化酶的一个指标。mRPT(R99H)‐C固定化酶重复利用效率结果参见图12。在经过2次的循环使用，固定化酶活性基本无损失，酶活残余率保持在98％以上。但随着固定化的酶循环使用次数的增加，酶活残余率开始呈现下降趋势，在5次循环后酶活残余率达到80％以上。在重复使用10次后，固定化酶损失较为明显，酶活残余率仅为初始的30％左右。实验结果表明，胰蛋白酶的固定化极大提升了胰蛋白酶在操作中的稳定性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海雅心生物技术有限公司

<120> 重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化

<130> 182481

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 猪(Susscrofa domestica)

<400> 1

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala

100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met

145 150 155 160

Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

210 215 220

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

ccggaattcg atgatgatga taagattgtt gg 32

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

atagtttagc ggccgcttag ttagcagcaa tagttt 36

Claims

1.一种对胰蛋白酶进行固定化的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 基于SEQ ID NO: 1所示的野生型胰蛋白酶，在其羧基端加上Cys，第99位Arg突变为His，获得胰蛋白酶；

(2) 将步骤(1)获得的胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂、三(2-羧乙基)膦混合；胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂的质量比为1～5:1，胰蛋白酶与三(2-羧乙基)膦的质量比(5～50):1，温度25～38℃，反应时间20～50小时；所述的胰蛋白酶抑制剂为抑肽酶；

(3) 以活化凝胶为固定化载体，将步骤(2)的混合液与之混合，进行固定化反应，反应时溶液的pH值为7.0至8.0；

(4) 将经固定化反应的产物在酸性条件下处理，解除胰蛋白酶抑制剂的抑制作用，获得固定化的活性胰蛋白酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，胰蛋白酶与三(2-羧乙基)膦的质量比为(10～20):1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化凝胶为活化的琼脂糖凝胶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为环氧活化或碘乙酸活化的琼脂糖凝胶。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化反应时，溶液的pH值为7.5±0.2。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化反应时，温度为25～35℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化反应时，反应时间为25～40小时。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化反应时，反应时间为30～35小时。

9. 一种固定化胰蛋白酶制剂，其特征在于，所述的固定化胰蛋白酶制剂包括：活化凝胶以及与之偶联的胰蛋白酶；所述胰蛋白酶基于SEQ ID NO: 1所示的野生型胰蛋白酶、羧基端加上Cys且第99位Arg突变为His，该Cys的巯基与活化凝胶的活化基团偶联；所述的固定化胰蛋白酶制剂由权利要求1～8任一所述的方法制备获得。

10.权利要求9所述的固定化胰蛋白酶制剂的用途，其特征在于，用于酶解蛋白质或者变性蛋白质，或用于胰岛素的生产。

11.一种用于酶解蛋白质或者变性蛋白质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求9所述的固定化胰蛋白酶制剂。