CN102786589A - 重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株 - Google Patents
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Abstract
一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因，其碱基序列如序列表中序列2所示，以及所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，并有所述重组菌发酵得到重组人促卵泡成熟素rFSH；本发明还提供了所述蛋白的编码基因以及含有所述编码基因的工程菌（重组巴斯德毕赤酵母）；本发明的方法生产的重组人促卵泡成熟素rFSH具有长效、稳定等优点，适于用作人和动物的促排卵激素使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株。
背景技术
促性腺激素FSH是脑垂体分泌的糖蛋白激素，其分子由一个alpha亚基和beta亚基组成，编码alpha和beta亚基的基因不在同一条染色体上，成熟分子必须在体内翻译之后经历一系列后加工，包括每个亚基的正确折叠、两个亚基结合形成正确的异构二聚体，然后，再经过糖基化获得生物活性。因此，模拟自然过程开发用基因工程生产这FSH技术，难度相当大。正是由于这个原因，目前市场上销售的FSH主要依靠从组织中提取。人类绒毛膜促性腺激素（hCG）具有有一定的FSH活性，其beta亚基在羧基端有一个羧基端肽序列（CTP），使hCG分子其在血液中的清除率明显降低，延长它的生理作用时间，所以hCG具有长效作用。
促性腺激素的基本生理功能是维持卵巢和睾丸的结构和功能，动物实验证明，摘除脑垂体的绵羊性腺萎缩，母羊卵子发育和排卵活动完全停止。但是，注射促性腺激素可以逆转这种生理反应，而且逆转反应的强度随着注射促性腺激素的剂量而增加，高水平的促性腺激素可以诱导超数排卵。注射外源性促性腺激素通常用于提高人和家畜的繁殖性能，在人类辅助生殖和家畜胚胎工程中，通过促性腺激素注射增加排卵数，是必不可少的技术措施。但是，由于脑垂体的来源十分有限，商业上常用的促性腺激素制剂，主要是羊和猪脑垂体的提取物（FSH）、怀孕母马血液提取物（eCG）、孕妇（hCG）和老年妇女（hMG）尿中的提取物。通过提取获得的促性腺激素有许多缺点，纯度和生理效价均不稳定，生产过程也难控制，常常有被病原体污染的危险。用重组DNA技术生产的促性腺激素，可以克服组织提取产品存在的诸多缺点。但是，通过培养基因工程细胞生产促性腺激素，产量通常比生产其它医用蛋白质低，主要技术困难是促性腺激素分子由两个亚基组成，必须在细胞中同时表达两个基因，并同时提纯alpha和beta两种蛋白分子，然后在体外重构杂合二聚体。在这个过程中，细胞生产的亚基分子损失严重，原因是形成正确杂合二聚体的效果很差，即使在最佳的条件下，二聚体的正确组装率也只有25%（Bedows et al. 1992, Ruddon et al. 1996）。
由于促性腺激素的市场在不断扩大，国际上已加强了对这类产品的研究，期望开发出更先进的生产方法。从技术发展趋势来看，最有希望用来大规模生产基因工程促性腺激素的技术是制作单链FSH，即把alpha亚基和beta亚基串联成一个基因，并在细胞中一起表达。若使用hCG的羧基端CTP氨基酸序列将alpha亚基和beta亚基的氨基酸序列串联在一起，FSH有可能单链融合蛋白能变成了长效分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株。
本发明所提供的重组人促卵泡成熟素和黄体生成素的基因，命名为rFSH，其基因工程菌命名为X33/rFSH。
X33/rFSH已于2012年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No.6181。
本发明是这样来实现的，一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因，其碱基序列如序列表中序列2所示，以及所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，并有所述重组菌发酵得到重组人促卵泡成熟素rFSH；所述基因的重组表达载体为在载体pPICZαA的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒；所述重组菌为将权利要求3所述重组质粒导入毕赤酵母X-33得到的重组菌；所述重组菌为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）x33/ rFSH CGMCC No.6181。
本发明的方法生产的重组人促卵泡成熟素rFSH具有长效、稳定等优点，适于用作人和动物的促排卵激素使用。
附图说明
图1为本发明基因序列串联示意图。
图2为本发明重组人促卵泡成熟素rFSH表达载体构建流程图。
图3 为本发明重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得，
实施例1、rFSH基因的核苷酸序列设计与重叠PCR扩增
根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性，对GenBank报道的人FSH和hCG的CTP基因序列进行优化设计，用高使用频率的密码子替换低使用频率的密码子。将优化好的基因序列按图1进行串联；
根据优化设计的重组基因rFSH序列设计引物，用重叠PCR的方法进行全基因合成，在基因的5’和3’末端引入EcoRI和XbaI酶切位点。
实施例2、重组表达质粒的构建与筛选
用限制性内切酶EcoRI和XbaI对重叠PCR产物酶切，酶切体系如表1所示。酶切后的基因片段与毕赤酵母表达载体pPICZaA连接，连接体系如表2所示。16oC连接10小时以上，用CaCl2法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布含Zeocin（25ug/mL）的平板,37oC培养过夜，带菌落生长清晰后，在同样的平板培养基上划线培养。菌落PCR法鉴定重组菌。提取阳性菌落的质粒，测序。重组表达质粒命名为pPIC-rFSH；
表1：重叠PCR产物酶切体系
| 组 分 | 体 积（ul） |
| PCR 产物 | 20 |
| 10x缓冲液 | 10 |
| EcoRI | 4 |
| XbaI | 4 |
| 灭菌超纯水 | 62 |
表2：连接体系
| 组 分 | 体 积（ul） |
| 酶切PCR产物 | 10 |
| T4 DNA连接酶 | 1 |
| 10x缓冲液 | 2 |
| pPICZαA/EcoRI+XbaI | 1 |
| 灭菌超纯水 | 6 |
实施例3、重组毕赤酵母的构建与筛选
将pPIC-rFSH 10ug分别用限制性内切酶SacI单酶切，体系如表3所示。酶切后用DNA纯化柱纯化。制备毕赤酵母x33感受态细胞，用线性化的DNA进行电击转化，转化条件为：2000 v、5 ms。转化后的酵母菌用1M山梨醇悬浮后，在30oC缓慢摇动培养3 h。涂布含zeocin（100ug/mL）的YPD平板培养基，30oC倒置培养2-3天，待菌落生长清晰后，在同样的平板培养基上划线培养。将菌接种10 mL YPD液体培养基于30oC、250rpm振荡培养24 h，5000rpm离心收集菌体，用酵母菌总DNA提取试剂盒提取基因组DNA。PCR鉴定外源基因是否整合。
实施例4、重组毕赤酵母摇瓶培养、外源蛋白诱导表达
经过PCR鉴定为阳性重组菌的菌株接种20 mL缓冲型甘油复合培养基（BMGY），30oC、250rpm振荡培养24 h,5000rpm离心收集菌体，重新悬浮于20 mL缓冲型甲醇复合培养基（BMMY），继续同样条件培养，每隔24h向其中添加终浓度为0.5%的甲醇，连续培养72 h，离心，弃菌体，留上清液，12% SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。重组菌株x33/rFSH已于2012年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No.6181。
实施例5、重组蛋白的纯化
摇瓶发酵液5000rpm离心后弃菌体，上清液用35-75%硫酸铵沉淀3 hr以上，10000rmp离心20min,收获沉淀,用50mM 磷酸缓冲液（pH8.0）溶解。上sephadex G-50凝胶层析柱，用50 mM 磷酸缓冲液（pH8.0,含300mM NaCl）洗脱，流速1mL/min，用蛋白质定量试剂盒（Pierce公司，BCA试剂盒）定量。将有蛋白的管合并。在4oC用50mM 磷酸缓冲液（pH8.0）透析12h。
序列表1：
氨基酸序列
1 AsnSerCysGluLeuThrAsnIleThrIleAlaIleGluLysGluGluCysArgPheCys
21 IleSerIleAsnThrThrTrpCysAlaGlyTyrCysTyrThrArgAspLeuValTyrLys
41 AspProAlaArgProLysIleGlnLysThrCysThrPheLysGluLeuValTyrGluThr
61 ValArgValProGlyCysAlaHisHisAlaAspSerLeuTyrThrTyrProValAlaThr
81 GlnCysHisCysGlyLysCysAspSerAspSerThrAspCysThrValArgGlyLeuGly
101 ProSerTyrCysSerPheGlyGluMETLysGluLeuThrCysAspAspProArgPheGln
121 AlaSerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGly
141 ProSerAspThrProIleLeuProGlnGlyGlyGlyGlyGlyGlyAlaProAspValGln
161 AspCysProGluCysThrLeuGlnGluAsnProPhePheSerGlnProGlyAlaProIle
181 LeuGlnCysMETGlyCysCysPheSerArgAlaTyrProThrProLeuArgSerLysLys
201 ThrMETLeuValGlnLysAsnValThrSerGluSerThrCysCysValAlaLysSerTyr
221 AsnArgValThrValMETGlyGlyPheLysValGluAsnHisThrAlaCysHisCysSer
241 ThrCysTyrTyrHisLysSer
序列表2
核苷酸序列
1 AATTCTTGTGAGTTGACTAACATCACTATTGCAATTGAGAAAGAAGAATGTCGTTTCTGC
61 ATTTCTATCAACACTACTTGGTGTGCTGGATACTGTTACACTAGAGATTTGGTTTACAAA
121 GATCCAGCTAGACCAAAGATCCAGAAAACTTGTACTTTCAAGGAATTGGTTTACGAAACT
181 GTGAGAGTTCCAGGATGTGCTCATCATGCTGATTCTTTGTATACTTACCCAGTTGCTACT
241 CAGTGTCATTGTGGAAAGTGTGATTCTGATTCTACTGATTGTACTGTTAGAGGATTGGGA
301 CCATCTTACTGTTCTTTCGGTGAAATGAAAGAATTGACTTGTGATGATCCAAGATTCCAG
361 GCTTCTTCATCTTCCAAGGCTCCACCACCATCTTTGCCATCTCCATCTAGGTTGCCAGGA
421 CCATCTGATACTCCAATCCTCCCACAAGGAGGTGGAGGTGGAGGTGCTCCAGATGTTCAG
481 GATTGTCCAGAATGTACTTTGCAGGAAAACCCATTCTTCTCTCAGCCAGGAGCCCCAATT
541 CTTCAGTGTATGGGATGTTGTTTCTCTAGGGCTTACCCAACTCCATTGAGATCAAAGAAG
601 ACTATGTTGGTTCAAAAGAACGTTACTTCTGAGTCTACTTGTTGTGTTGCTAAGTCTTAC
661 AACAGAGTCACTGTTATGGGAGGATTCAAAGTTGAGAACCATACTGCTTGTCACTGTTCT
721 ACTTGTTACTATCATAAGTCTTAA
Claims (4)
1.一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因，其碱基序列如序列表中序列2所示，以及所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，并有所述重组菌发酵得到重组人促卵泡成熟素rFSH。
2.如权利要求1所述的一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于所述基因的重组表达载体为在载体pPICZαA的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒。
3.如权利要求1所述的一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于所述重组菌为将权利要求3所述重组质粒导入毕赤酵母X-33得到的重组菌。
4.如权利要求1或3所述的一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于所述重组菌为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）x33/ rFSH CGMCC No.6181。
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