CN103539860A - 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白 - Google Patents

一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白(Human follicle-stimulating hormone-Fc fusion protein，简称hFSH-Fc)及其制备方法，该重组hFSH-Fc蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包括hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、柔性肽接头和人IgG2Fc变体，其体内半衰期比现有人促卵泡激素更长，副作用更小。本发明还涉及重组hFSH-Fc融合蛋白组合物在制备治疗和/或预防不孕不育症的药物中的用途。

Description

一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白
技术领域
本发明涉及分子生物学和医药领域。更具体地，本发明涉及一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白体内半衰期显著延长，其疗效优于现有的人促卵泡激素。 
背景技术
目前，世界范围内不孕症率高达15％，成为继癌症和心脑血管疾病之外，严重影响人类健康的第三大疾病。我国不孕症人数占生殖妇女人数10％以上，且其发病率呈明显上升趋势。人促卵泡素(Human follicle-stimulating hormone，简称hFSH)是目前市场常见的用于治疗男女不孕症药物的主要成份，我国目前市场包括人尿来源的FSH药物和重组FSH。 
尿源hFSH存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等问题，欧美等发达国家普遍不接受尿源产品上市和销售。相比而言，重组hFSH在其纯度、抗原性、安全性、无病毒感染等方面具有尿源hFSH无法比拟的优点。hFSH是一种糖基化蛋白，SDS-PAGE检测其分子量为43KD。作为一种治疗药物，保证其生物活性，必要的条件是具有正确的三维结构和糖基化修饰。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多药物已投放市场，如EPO、G-CSF等。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。 
虽然目前已有利用CHO细胞生产的重组药物hFSH上市，但仍然存在如下问题：首先，其半衰期短，临床上为了达到有效的治疗效果，需要频繁给药，给患者带来极大痛苦。例如，当用于排卵时，患者必须每日1-2次肌肉内或皮下注射hFSH，通常需要注射8-12天甚至更长时间。这种治疗方案常伴有不良的副作用，包括对神经、内分泌和免疫系统的刺激和毒副作用，并导致常见的并发症如卵巢过度刺激综合征，表现为卵巢增大、全身毛细血管通透性增加和腹水形成，重者可危及患者生命。其次，目前重组hFSH表达量低，制备过程复杂和生产成本巨大。另外，hFSH是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证hFSH的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。针对现有重组hFSH及同类产品的缺陷，本发明利用优化的分子生物学技术、细胞生产和纯化工艺开发新型的重组hFSH产品，以延长半衰期、保持其生物活性、提高重组hFSH蛋白表达水平，从而增加其药效、降低副作用。 
发明内容
本发明旨在提供一种重组人促卵泡激素融合蛋白(Human follicle-stimulating hormone-Fc fusion protein，简称hFSH-Fc)、其制备方法及应用，以解决现有技术中重组hFSH表达量低、纯化难、体内半衰期短的问题。 
本发明的一个目的是提供一种重组hFSH-Fc融合蛋白，该融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、肽接头(Linker，简称L)和人IgG2Fc变体(vIgG2Fc)，如SEQ ID NO：2所示(hFSHβ-CTP-hFSHα-L-vIgG2Fc氨基酸序列)，上述融合蛋白简述为hFSH-Fc。 
所述的hFSHβ亚基的氨基酸序列去除了常规hFSHβ亚基中的1-18位氨基酸残基，如SEQ ID NO：5所示。 
所述的CTP(carboxy-terminal peptide，羧基端肽)的氨基酸序列来自HCGβ链羧基末端的28-34个氨基酸残基，优选CTP为来自HCGβ链羧基末端的33个氨基酸残基序列，如SEQ ID NO：4所示。 
所述的hFSHα亚基的氨基酸残基序列去除了常规hFSHα亚基中的1-24位氨基酸残基，如SEQ ID NO：3所示。 
所述的肽接头含有2-20个氨基酸残基，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，优选的肽接头氨基酸序列为 
GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。 
所述的人IgG2Fc变体为含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域。 
以下具体介绍本发明的人IgG Fc变体、肽接头和CTP功能： 
IgG Fc变体 
IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天，而Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。 
Fc来自免疫球蛋白的Fc区域，Fc在消灭病原体的免疫防御中具有重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导，通过两种主要机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)的结合，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)中，人IgG2与FcγRs几乎不结合，而和C1q的结合作用很弱。对于人的医疗用途而言，重组融合蛋白的Fc区域必须不能介导不良效应子功能，从而才不会裂解或除去这些细胞。因此，hFSH-Fc的Fc区域必须是非裂解性的，即在结合FcγRs和C1q而触发效应子功能方面，Fc最好是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生hFSH-L-Fc重组二聚化蛋白。为了得到非裂解性的Fc，必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。 
通过分析IgG同种型的氨基酸序列，发现CH2区域氨基末端附近的Fc部分显示在IgG Fc与FcγRs的结合中起作用，而与C1q结合至关重要的部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近。 人IgG2不结合FcγRs，但与C1q存在较弱结合，为了最大化减少Fc与C1q的结合而介导的细胞毒性CDC活性，本发明使用人IgG2Fc变体(vIgG2Fc)：含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如图1)，该Fc变体比天然IgG2Fc表现出最小化的效应子功能，更适于制备重组hFSH-Fc融合蛋白。 
肽接头 
连接肽的长度对重组二聚化蛋白的活性非常重要。已有人报道了促红细胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，与EPO单体相比，含有2个完整的EPO区域(相隔3到7个氨基酸肽接头)的重组二聚化蛋白表现出减弱的活性(参见Qiu H等，J Biol Chem，273：11173-11176，1998)。然而，当这两个EPO区域间的肽接头的长度为17个氨基酸时，二聚体EPO分子的体外和体内生物活性明显提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem，274：24773-24778，1999；美国专利No.6，187,564)。这可能解释为重组二聚化蛋白两部分间增加的连接肽，使该分子的两部分能分别行使其功能(参见Ashkenazi A等，Curr Opin in Immunol，9：195-200，1997)。 
本发明人经过长期而深入的研究，首次设计了一种独特的绞链区肽接头来降低空间位阻效应，可以制得hFSHα链的C端与Fc变体偶联的重组二聚化蛋白，中间有柔软的肽接头。此重组二聚化蛋白不仅不会导致hFSH的功能丧失，反而能够维持、甚至提高hFSH-Fc重组二聚化蛋白的生物活性。优选肽接头的氨基酸残基序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。 
CTP 
糖基化对于蛋白的活性和半衰期有重要作用，蛋白上的糖基化位点有两类，包括O-糖肽链和N-糖肽链。CTP是一段来自HCGβ键羧基末端的28-34个氨基酸残基，有文献报道HCG较hFSH相对长的半衰期，主要来源于此CTP肽段。它含有O-连接的糖基化位点，可以增加蛋白的糖基化水平，提高蛋白的活性和延长蛋白在体内的半衰期。 
本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白具有以下特征：该重组融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、肽接头和人IgG2Fc变体。人IgG2Fc变体具有延长体内半衰期和稳定蛋白的作用，Fc变体是非裂解性的，可最大化减少与FcγRs和C1q结合而触发的效应子功能，有效抑制细胞毒性ADCC和CDC途径，从而降低细胞毒副作用。CTP可提高蛋白活性及延长体内半衰期，其无免疫原性，通过CTP连接hFSH的α链和β链，不仅无副作用，且可以使两条链之间有一定的位阻，有利于其正确折叠而不影响功能。通过柔软的肽接头进行hFSHα链的C端与Fc变体的偶联，能够维持、甚至提高重组hFSH-Fc融合蛋白的生物活性。 
本发明首次将CTP、肽接头和人IgG2Fc变体有序地连接到hFSH中而形成新型的重组hFSH-Fc融合蛋白，该融合蛋白中人IgG2Fc变体、CTP和肽接头的位置排列能维持hFSH正确的空间构型，而不影响其生物活性，并可显著延长半衰期，临床应用时可减少注射频率，降低现有治疗方案中产生的毒副作用。 
本发明另一个目的是提供一种重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，该制备方法包括： 
(1)构建编码重组hFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体； 
(2)重组hFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达； 
(3)高密度细胞培养重组hFSH-Fc融合蛋白； 
(4)重组hFSH-Fc融合蛋白的纯化制备。 
具体来说，构建编码重组hFSH-Fc蛋白的基因表达载体步骤为：采用人工合成方法获得编码重组hFSH-Fc融合蛋白基因进行了密码子优化的核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所示)，插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有hFSH-Fc目的基因表达质粒pCDNA3-hFSH-Fc(图4)。基因的核苷酸序列优化是基于哺乳动物宿主细胞偏爱的密码子来选择设计。 
所述的哺乳动物细胞表达载体可采用市售的但不限于，如：pCDNA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体，优选，pCDNA3。 
重组hFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达步骤为：将含有hFSH-Fc蛋白的表达质粒转染到合适的哺乳动物宿主细胞，筛选获得稳定高表达目的蛋白的细胞株。 
所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NS0和Sp2/0细胞。优选，CHO细胞；更优选，已驯化适应无血清培养基中悬浮生长的DHFR(Dihydrofolate Reductase，二氢叶酸还原酶)缺陷型CHO细胞(简称CHO DHFR-)。 
所述的转染方法包括磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体转染，优选的转染方法是电穿孔转染法。 
所述的筛选方法是先利用筛选标记进行筛选，然后用扩增选择性标记可提高表达量并获得稳定高表达细胞株。筛选标记是本领域内已知的任何一个合适的选择性抗性标记，如ZEO(Zeocin，博来霉素)、G418(氨基糖苷类抗生素)、PUR(puromycin，嘌呤霉素)、HYP(Hygromycin，潮霉素)，优选的抗性基因为ZEO；筛选标记也可为本领域内已知的任何一个荧光标记基因，包括GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)、RFP(Red Fluorescent Protein，红色荧光蛋白)，优选的荧光标记基因为GFP。扩增选择性标记是本领域内已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase，谷氨酰胺合成酶)序列，优选的扩增选择性基因是DHFR。由于CHO-DHFR-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶(DHFR)，无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶(Thymidine)和甘氨酸的培养液中才能得以存活。而通过目的基因与DHFR基因共转染，不仅得到在不合上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于DHFR可被叶酸类似物MTX(Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，在MTX浓度选择压力下，DHFR基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗MTX细胞系；又由于与DHFR基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着DHFR基因的扩增而扩增，可得到大量表达外源蛋白的细胞克隆。 
高密度细胞培养重组hFSH-Fc融合蛋白的步骤为：将上述筛选到的稳定细胞株转入摇瓶或生物反应罐进行大规模培养，特别是，本发明通过对细胞培养条件的优化，获得高表达重组hFSH-Fc融合蛋白的细胞培养液。本发明的细胞培养方法可实现高密度细胞培养、重组蛋白质 量和产量提升、重组蛋白的糖基化程度增加以及唾液酸含量提高。 
所述的细胞培养条件的优化包括降温培养法，具体来说，当细胞密度达到1×107个/mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加。该方法可以提高表达蛋白的活力水平及重组蛋白的累积产量。 
所述的细胞培养条件的优化方法还包括在培养基中加入特殊的添加剂，优选，在基础培养基加入100μM Cu2+，feeding培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。该方法可使重组hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高约20％。 
重组hFSH-Fc融合蛋白的纯化制备步骤为： 
1)Protein A亲和层析：离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联Fc片段的特性，利用亲和Protein A柱层析。 
2)疏水层析柱纯化：采用疏水层析柱，根据重组hFSH-Fc融合蛋白的疏水性不同，进一步去除上述Protein A纯化后目标蛋白中的杂质。 
所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow，Octyl Sepharose4Fast Flow，Phenyl Sepharose6Fast Flow，Butyl-S Sepharose6Fast Flow，Butyl Sepharose4B，Octyl Sepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，Phenyl Sepharose6Fast Flow。 
本发明所公开的重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，表达产量高且因与IgG2Fc变体的偶联，所形成的重组蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。经疏水层析进一步纯化后得到的融合蛋白纯度达到98％以上。此外，本发明所公布的重组hFSH-Fc融合蛋白中α链和β链可正确折叠在一起，避免了α-α二聚体、β-β二聚体的出现，大大简化了纯化步骤，降低了生产成本。 
本发明的还一个目的是提供了一种含有重组hFSH-Fc融合蛋白的药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明所述的重组hFSH-Fc融合蛋白。 
具体来说，所述的药物组合物含有有效量(如0.000001-90wt％；较佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％)的本发明的重组长效hFSH-Fc融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。 
所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：蔗糖、甘露醇、吐温20(Tween20)、蛋氨酸、盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、及其组合物。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。 
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。 
本发明的再一个目的是重组hFSH-Fc融合蛋白在治疗和/或预防人不孕不育症中的应用。 
本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白体内半衰期显著延长，从而改善了药物动力学和药效，与现有hFSH比较，在临床应用上可减少患者注射次数，降低副作用，减轻患者痛苦和经济负担。 
本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白及其制备方法的优点概括如下： 
1、本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白是由CTP、肽接头和人IgG2Fc变体(vIgG2Fc)与hFSH有序偶联形成的新型融合蛋白，维持了hFSH的正确空间构型，可显著延长蛋白的体内半衰期，大大提高hFSH在CHO细胞中的表达量，且其体外和体内活性与现有天然hFSH类似。 
2、二聚化单链hFSH-Fc融合蛋白的α链与β链以共价键正确折叠，避免形成α-α二聚体和β-β二聚体，大大简化了纯化工艺，降低生产成本。 
3、本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白体内半衰期显著延长，其半衰期是现有重组hFSH的4倍以上，在临床应用上可减少患者注射次数，降低现有治疗方案产生的副作用。 
附图说明
图1.显示了人IgG2及其变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。比较这三部分氨基酸序列：氨基酸区域228、234-237和330-331。其变体的氨基酸突变以粗斜体显示。氨基酸残基编号是根据EU编号体系标定。 
图2.显示了重组hFSH-Fc单链及二聚化结构示意图。a)单链hFSH-Fc；b)二聚化的hFSH-Fc。 
图3.显示了在pCDNA3表达载体内HindIII-EcoRI片段的hFSH-Fc的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。重组hFSH-Fc的核苷酸序列包括编码含前导肽(1-18)、hFSHβ链、CTP、成熟hFSHα链、肽接头、IgG2Fc变体(vIgG2Fc)。成熟的重组hFSH-Fc融合蛋白含有成熟hFSHβ链(19-129)、CTP(130-162)、成熟α链(163-254)、肽接头(255-270)和IgG2Fc变体(vIgG2Fc)(271-493)。 
图4.显示了所构建编码hFSH-Fc融合蛋白的真核表达质粒图谱。该表达质粒全长9063bp，含有10个主要基因片断，包括1.CMV启动子；2.目标基因hFSH-Fc；3.IRES；4.Zeocin抗性筛选基因；5.BGH终止子；6.SV40启动子；7.DHFR扩增基因；8.SV40终止子；9.氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin)；10.ColE1复制起点(Ori)。 
图5.显示了在7L生物反应器中重组hFSH-Fc细胞株表达分泌hFSH-Fc蛋白的累积趋势曲线图。 
图6.Western bloting结果显示了重组hFSH-Fc融合蛋白在CHO细胞中的成功表达。非还原胶，Lane1：尿来源的hFSH(约43kDa)；Lane2：本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白(约140kDa)。 
图7.显示了单链和二聚化hFSH-Fc在还原条件和非还原条件下的10％SDS-PAGE电泳图谱。a)非还原胶，二聚化hFSH-Fc(约140kDa)；b)还原型胶，单链hFSH-Fc(约70kDa)。 
图8.显示了本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白、重组hFSH和人尿hFSH在大鼠体内的代谢曲线。 
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 
实施例1.构建编码重组hFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体 
基因序列设计是基于CHO细胞偏爱密码子进行优化，采用人工合成的方法合成经过优化的含有编码hFSH蛋白β链的信号肽及其成熟肽段、CTP和hFSHα链成熟肽段的融合基因，将所合成的756bp DNA片段插入转移载体如pUC57中的EcoRV限制性酶切位点间，获得了hFSH质粒(phFSH)，使用DNA测序方法验证插入序列的正确性。 
分别人工合成含有BamHI(5’端)和EcoRI(3’端)酶切位点的编码柔性肽接头(Linker，简称“L”)和人IgG2Fc变体(vIgG2Fc)片段的融合基因L-vIgG2Fc。将获得的融合基因片段分别插入到转移载体如PUC19的BamHI和EcoRI位点间，得到含Fc变体的质粒pL-vIgG2Fc、。通过DNA测序验证L-vIgG2Fc的基因序列。为制备hFSH-L-Fc融合基因，用限制性内切酶SpeI和BamHI双酶切phFSH质粒，凝胶电泳后胶回收编码hFSH蛋白β链的信号肽及其成熟肽段、CTP和hFSHα链成熟肽段的融合基因片段，经纯化的上述基因片段插入到pL-vIgG2Fc质粒中肽接头的5′-端，T4连接酶连接构成phFSH-L-vIgG2Fc质粒。所构建的融合基因由hFSHβ、CTP、hFSHα、肽接头和Fc变体基因组成，其单链结构如图2a所示，二聚化结构如图2b所示。 
限制性内切酶SpeI/EcoRI双酶切phFSH-L-vIgG2Fc质粒，DNA凝胶纯化得到hFSH-L-vIgG2Fc片段。将纯化好的hFSH-L-Fc片段插入到哺乳动物细胞表达质粒如pCDNA3(Invitrogen)的相应酶切位点间，最终获得含融合基因表达质粒pCDNA3-hFSH-L-vIgG2Fc，简称为pCDNA3-hFSH-Fc质粒，如图4所示。该质粒含哺乳动物细胞高效表达外源基因蛋白所需的启动子CMV；该质粒还含有两种选择性标记基因，从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性，在哺乳动物细胞中可以具有博来霉素(zeocin)抗性。此外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，PCDNA3表达载体所含有的小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在时，能共扩增pFSH-Fc融合基因和DHFR基因。 
用CTP肽段连接hFSH的α链和3链，可便于两条链正确折叠。通过肽接头(较佳地为柔性接头)进行hFSH和Fc片段的偶联可提高蛋白的生物活性，对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少(但不能少于2个)氨基酸的肽接头，当然由1个氨基酸构成的肽接头也在本发明的保护范围内，宜使用含有或由2个或更多选自以下氨基酸构成的肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。本发明实施例的肽接头含有Gly-Ser肽构件，其氨基酸序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。 
实施例2.重组hFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中的稳定表达 
将实施例1构建的表达质粒pCDNA3-hFSH-L-Fc转染入DHFR酶缺陷型CHO宿主细胞 (CHO-DHFR-)，图2b显示了重组二聚化hFSH-Fc融合蛋白的示意图。采用电穿孔法进行转染，使用960μFd电容的Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，将其电场设置为250V，在比色杯内的2～5×107个细胞中加入10μg用PvuI线性化的质粒DNA。在转染两天后，将培养基改成含100μg/mL Zeocin抗性标记基因的生长培养基，获得经抗性初筛的转染子。采用westemblotting的方法，用抗hFSH抗体检测hFSH-Fc的表达。利用DHFR扩增选择性标记基因提高重组二聚化蛋白的表达水平，为此在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的重组二聚化蛋白基因。用极限稀释法亚克隆能在高达10μM/mL MTX培养基中生长的转染子。对亚克隆细胞系的分泌率作进一步分析。筛选分泌水平超过约10(较佳地约20)μg/106(即百万)个细胞/24小时的细胞株，获得稳定高表达重组hFSH-Fc融合蛋白的细胞株。 
实施例3.重组hFSH-Fc融合蛋白的生产和纯化 
将实施例2得到的高产量细胞株，首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养，驯化过程中同时进行培养基的筛选，加入不同的成分观察细胞的生长状态、生长趋势，以及表达产物的活性和唾液酸等生化指标，优选的细胞培养条件为：基础培养基加入100μM Cu2+，feeding培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)，该方法可使重组hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高约20％。驯化成功后，进行细胞扩增，扩增到足够量，进行7L生物反应器监测培养，在细胞密度超过1×107个/mL时开始降温至33℃培养，批次生长周期为20天。用1ml ProteinA柱层析对重组蛋白进行初步纯化，测定重组hFSH-Fc融合蛋白的表达量，结果显示，重组hFSH-L-vIgG2Fc细胞株表达的累积产量为1.87g/L(图5)。 
重组hFSH融合蛋白的纯化包括以下步骤： 
1)Protein A亲和层析：离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联Fc片段的特性，利用亲和层析方法，将上清液加样到磷酸盐缓冲液盐水(PBS)平衡的Protein A柱；待重组融合蛋白结合于ProteinA后，用PBS洗涤该柱，直至OD280值低于0.01，再用20mM pH为4.0的醋酸钠缓冲液洗脱结合的重组FSH-Fc融合蛋白，最后用pH10.0的1M Tris-HCl缓冲液中和活性收集液。纯化的hFSH-Fc蛋白纯度可达到95％以上。 
2)疏水柱层析：用超滤方法将上述protein A活性收集液更换为20mM Tris-HCl-1.5M NaCl(pH8.0)缓冲液，将该样品加样到用20mM Tris-HCl-1.5M NaCl(pH8.0)平衡过的phenyl-6Fast Flow柱，先用相同的平衡液淋洗，再用20mM Tris-HCl-1.35M NaCl(pH8.0)淋洗，最后用20mM Tris-HCl-0.5M NaCl(pH8.0)缓冲液洗脱。 
Western bloting结果显示了重组hFSH-Fc融合蛋白在CHO细胞中的成功表达，如图6所示，在非还原条件下SDS-PAGE胶电泳图谱，人尿来源的hFSH(商业产品)和本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白分别在43kDa和140kDa显示相对应的目标蛋白杂交条带，验证了本发明得到的重组hFSH融合蛋白中含有hFSH蛋白。图7是纯化的hFSH-Fc融合蛋白在还原和非还原条件下的SDS-PAGE胶电泳图谱。结果显示，纯化的hFSH-Fc蛋白纯度可达到98％以上，hFSH-Fc在还原条件下的分子量为非还原条件下分子量的50％。 
实施例4.重组hFSH-Fc融合蛋白的体内外活性测定 
本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白的体外活性(免疫原活性)采用BIOCHECK(美国)公司生产的FSH酶免疫定量检测试剂盒检测，方法参考试剂盒说明书。体内活性采用2010版《英国药典》中的卵巢增重法进行检测。蛋白质含量测定使用LOWRY定量法。取HCG制剂，加0.1％白蛋白磷酸盐缓冲液(pH7.2±0.2)溶液，制成含有70IU/mlHCG的供试品稀释液。根据标准品标示量、重组hFSH、人尿hFSH和重组hFSH-Fc融合蛋白估计效价，用供试品稀释液(pH7.2±0.2)将标准品、重组hFSH、人尿hFSH和重组hFSH-Fc融合蛋白配制成含FSH1.67IU/ml剂量的溶液。选用19～28日龄，年龄相差不得超过3日，体重相差不得超过10克的Wistar雌鼠，分为标准品、重组hFSH(商业产品)组、人尿hFSH组和重组hFSH-Fc组，每组6只动物。大鼠颈后皮下注射，每天注射两次，每次注射体积为0.2ml，连续注射三天，每天在相同时间给药。最后一次注射给药24小时后，按照给药顺序采用脱臼法处死动物，取卵巢，剥离吸干表面水分后称重，记录器官重量。根据标准品卵巢增重采用量反应平行线法计算重组hFSH、人尿hFSH和重组hFSH-Fc的活性。测得重组hFSH-Fc融合蛋白、重组hFSH和人尿hFSH的体外活性分别为10105、9928和9321IU/ml，其体内活性分别为10230、8190和9051IU/ml，结果表明，本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白具有体内外生物学活性。 
实施例5.重组hFSH-Fc融合蛋白的药代动力学测定 
分为重组hFSH-vIgG2Fc、人尿hFSH和重组hFSH给药组，每组选用体重200-250g的雄性wistar大鼠5只，分别按15IU/kg给予皮下注射。重组hFSH组和人尿hFSH组在给药后1、2、3、4、6、8、12、36、56h取血，重组hFSH-Fc组在给药后1、2、4、8、12、24、56、120、176、200、264、340h取血，3000rpm离心5min后，吸取血清，-20℃保存。采用ELISA试剂盒(BIOCHECK，美国)测定各时间点血浆中FSH免疫活性。使用PKSolver2.0软件，通过统计矩法计算各组主要药代动力学参数。各组药代动力学曲线如图8所示，半衰期结果如表1。结果显示，重组hFSH和人尿hFSH在大鼠体内的消除半衰期分别为11.35±1.0h和12.7±2.8h，而等剂量本发明重组hFSH-Fc融合蛋白的消除半衰期为47.24±13.92h，是重组hFSH和人尿FSH的4倍以上。 
表1本发明重组hFSH-Fc的半衰期 
Figure BSA0000096971600000091
实施例6.重组hFSH-Fc融合蛋白对雌性大鼠的促超排卵作用 
健康雌性SD大鼠90只，体重200-250g，在实验环境下正常饲喂养检疫观察7天以上。随机分成4组：阴性对照组、重组hFSH-vIgG2Fc给药组、重组hFSH给药组、人尿hFSH给药组， 每组15只大鼠，各组大鼠体重分布相似。首先通过阴道涂片法观察动物发情周期一个周期。之后，重组hFSH-vIgG2Fc给药组按45IU/kg剂量于发情间期第一天皮下注射给药1次；重组hFSH组和人尿hFSH组按总剂量45IU/kg于发情间期第一天开始连续给药3天(15IU/kg/天)，阴性对照组给等量生理盐水。所有组别于第4日(发情前期)皮下注射HCG(10IU/只)。第5日(发情期)对大鼠进行麻醉后，进行卵巢分离，并称重，对分离的卵巢用Bouin氏液固定，石蜡包埋，对固定的卵巢每隔6μm做连续切片，显微镜下进行组织学观察，并记录卵泡数。 
各组大鼠卵泡数的计数结果见表2，结果表明，与阴性对照比较，本发明重组hFSH-Fc融合蛋白、重组FSH和人尿hFSH均对雌性大鼠有显著促超排卵作用(P＜0.01)，本发明重组hFSH-Fc融合蛋白仅给药一次，而重组hFSH和人尿hFSH需给药三次才能达到同等疗效。 
表2重组hFSH-Fc融合蛋白对雌性大鼠的促排卵作用 
Figure BSA0000096971600000101
注：t检验，与阴性对照组组比较，ap＜0.01。 
实施例7.重组hFSH-Fc融合蛋白对雄激素致不排卵雌性大鼠的治疗作用 
取同日出生的9日龄SD雌性幼年大鼠75只，其中15只为正常对照组：由颈背部一次性皮下注射中性茶油0.05ml；剩余60只为造模动物组：每只均由颈背部一次性皮下注射丙酸睾酮1.25mg。第70日龄阴道开口，连续阴道涂片两个动情周期(一个动情周期为5天，共10天)。正常对照组动物连续阴道涂片应呈现典型动情周期(动情前期、动情期、动情后期、动情间期)，将动情周期不典型者剔除；而造模动物组动物的阴道上皮细胞应无动情周期变化，呈持续性角化，提示无排卵大鼠模型制作成功，将未成功者剔除。第81日龄后，取正常对照组大鼠13只，按10ml/kg/天皮下注射给予蒸馏水，将上述无排卵大鼠模型动物，按体重分层后随机分为4组：模型阴性对照组、重组hFSH-vlgG2Fc给药组、重组FSH给药组和人尿hFSH给药组。模型阴性对照组大鼠按10ml/kg/天皮下注射给予蒸馏水；重组hFSH-vlgG2Fc组按45IU/kg/次给予皮下注射，每3天给药1次，连续15天共给药5次；重组hFSH组和人尿hFSH组按7.5IU/kg/次给予皮下注射，每天给药2次，连续15天共给药30次。给药结束后，各组大鼠均连续阴道涂片两个动情周期，以判断大鼠排卵情况。阴道涂片检查排卵后，各组大鼠于动情周 期前，先称重再腹腔注射乌拉坦麻醉，选取左侧的卵巢和子宫组织标本置10％中性甲醛中固定，进行卵巢和子宫病理形态学观察，卵巢的定量观察指标为各级卵泡总数、黄体数；子宫观察指标则为内膜厚度。 
表3显示了各组大鼠动情周期情况结果，表4显示了各组大鼠卵巢和子宫病理形态学结果，结果表明，与阴性对照组比较，本发明重组hFSH-Fc融合蛋白、重组hFSH和和人尿hFSH对不排卵雌性大鼠均有显著促动情恢复作用，大卵泡数和黄体数也比阴性对照组明显更高(P＜0.01)，但本发明重组hFSH-Fc融合蛋白只给药5次，而重组hFSH和和人尿hFSH需给药30次才能达到同等药效。结果说明，本发明重组hFSH-Fc融合蛋白、重组hFSH和和人尿hFSH对雄激素致不排卵雌性大鼠不孕症均有显著治疗作用，但本发明重组hFSH-Fc融合蛋白的给药次数明显少于重组hFSH和人尿hFSH。 
表3重组hFSH-Fc融合蛋白对不排卵雌性大鼠的促动情恢复情况 
Figure BSA0000096971600000111
注：X2检验，与模型阴性对照组组比较，ap＜0.01。 
表4重组hFSH-Fc融合蛋白对不排卵雌性大鼠卵巢和子宫病理形态学的影响 
Figure BSA0000096971600000112
注：t检验，与模型阴性对照组比较，ap＜0.01。 
实施例8.重组hFSH-Fc融合蛋白对大鼠卵巢刺激的影响 
将40只22日龄雌性Wistar大鼠随机分成分为正常对照组、重组hFSH-vIgG2Fc给药组、人尿hFSH对照组和重组hFSH对照组，每组10只。重组hFSH-vIgG2Fc给药组、人尿hFSH和重组hFSH给药组的大鼠在22日龄起每只按照10IU剂量皮下注射相应药物连续4天，26日龄 所有给药组均皮下注射HCG30IU/只；正常对照组从22-26日龄每日皮下注射等体积生理盐水。所有组均在第28日龄经尾静脉注射1％Evans Blue(EB，Sigma)染料0.1ml，30min后脱颈法处死大鼠，切开腹腔观察有无腹水。无腹水或少量腹水者向腹腔灌注5ml生理盐水，灌注液收集10ml试管中，均稀释至10ml，再加入0.05ml0.1M NaOH溶液，以3000r/min的速度在室温下离心10min，用分光光度计在波长600nm处行比色测定，记录OD值。最后取下两侧卵巢立即用电子天平称重。观察指标为：1、腹腔毛细血管通透性：根据标准浓度及其OD值绘制标准曲线，算出腹腔冲洗液EB含量。2、腹水评分：1分：无腹水；2分：少量腹水存在；3分：中量腹水存在；4分：腹水明显存在；5分：大量腹水存在或腹水从腹部切口溢出。3、卵巢重量。根据Golan的卵巢过度刺激综合征诊断标准，卵巢体积增大、腹腔毛细血管通透性增加和腹水均出现方可诊断为卵巢过度刺激综合征。 
连续4天注射同等剂量的重组hFSH-vIgG2Fc、重组hFSH和人尿hFSH，表5的结果表明，重组hFSH-vIgG2Fc的腹腔EB含量及腹水评分和对照组比较无显著性差别，只有卵巢重量增加，重组hFSH-vIgG2Fc未引发卵巢过度刺激综合征，而人尿hFSH组和重组hFSH组的腹水评分、腹腔EB含量及卵巢重量都明显高于对照组和重组hFSH-vIgG2Fc，人尿hFSH和重组hFSH引发了卵巢过度刺激综合征。结果提示，注射相同剂量的重组hFSH-Fc、重组hFSH和人尿hFSH，重组hFSH-Fc相对重组hFSH和人尿FSH副作用更小，临床应用更安全。 
表5各组腹水评分、腹腔液中EB含量和卵巢重量比较 
Figure BSA0000096971600000121
注：t检验，与正常对照组比较，ap＜0.01；与重组hFSH-vIgG2Fc组相比；bp＜0.01，cp＜0.05。 
Figure ISA0000096971620000011
Figure ISA0000096971620000021
Figure ISA0000096971620000031
Figure ISA0000096971620000041

Claims (10)

1.一种重组hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、肽接头和人IgG2Fc变体。 
2.根据权利要求1所述的重组hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的hFSHβ亚基的氨基酸序列是去除了常规hFSHβ亚基中的1-18位氨基酸残基之后的hFSHβSEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；其中所述的CTP的氨基酸序列是来自HCGβ链羧基末端的28-34个氨基酸残基，优选CTP为来自HCGβ链羧基末端的33个氨基酸残基序列，如SEQ ID NO：4所示；其中所述的hFSHα亚基的氨基酸残基序列是去除了常规hFSHα亚基中的1-24位氨基酸残基之后的hFSHαSEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；其中所述的肽接头含有2-20个氨基酸，所述肽接头存在于hFSHα亚基和人IgG2Fc变体之间，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸，优选序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。 
3.根据权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的人IgG2Fc变体为含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域。 
4.根据权利要求1所述的重组hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 
5.编码根据权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQ ID NO：1所示。 
6.一种权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其步骤包括： 
1)构建编码重组hFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体： 
采用人工合成方法获得编码hFSH-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有hFSH-Fc融合蛋白基因的表达质粒； 
2)重组hFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达： 
将含有hFSH-Fc融合蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达hFSH-Fc蛋白的细胞株； 
3)高密度细胞培养重组hFSH-Fc融合蛋白： 
将上述筛选到的稳定细胞株转入摇瓶或细胞反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到1×107个/mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加； 
4)重组hFSH-Fc融合蛋白的纯化制备： 
a)Protein A亲和层析：离心，收集上清，根据本发明融合蛋白偶联Fc片段的特性，利用亲和Protein A柱层析； 
b)疏水层析柱纯化：经疏水层析纯化进一步去除上述Protein A纯化后目标蛋白中的杂质； 
所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow，Octyl Sepharose4Fast Flow，Phenyl Sepharose6Fast Flow，Butyl-S Sepharose6Fast Flow，Butyl Sepharose4B，Octyl Sepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，Phenyl Sepharose6Fast Flow。 
7.根据权利要求6所述的重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其中步骤1)中所述的基因表达载体为pCDNA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT或pCMV-DHFR，优选，pCDNA3；其中步骤2)中所述的细胞转染方法包括电穿孔转染方法、磷酸钙转染、脂质体转染和原生质融合，优选，电穿孔转染方法；所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO，HEK293、BHK、NS0和Sp2/0细胞，优选，CHO细胞，更优选，DHFR酶缺陷型CHO悬浮细胞(CHO DHFR-)。 
8.根据权利要求6所述的重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其中步骤3)中还包括在培养基中加入添加剂，优选，在基础培养基加入100μM Cu2+，feeding培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。 
9.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1-8任意一项权利要求所述的重组hFSH-Fc融合蛋白。 
10.权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白在制备治疗不孕不育症药物中的应用。 
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015062349A1 (zh) * 2013-11-01 2015-05-07 广州优联康医药科技有限公司 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白
WO2015062350A1 (zh) * 2013-11-01 2015-05-07 广州联康医药科技有限公司 一种长效重组促卵泡激素及其应用
WO2018032785A1 (zh) 2016-08-19 2018-02-22 安源医药科技（上海）有限公司 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法与用途
WO2019051954A1 (zh) * 2017-09-15 2019-03-21 北京伟杰信生物科技有限公司 长效重组猪fsh融合蛋白及其制备方法与应用
CN113336831A (zh) * 2020-07-24 2021-09-03 上海延立药业有限公司 一种用于开发新冠病毒疫苗的长效重组糖蛋白
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CN114807231A (zh) * 2022-06-28 2022-07-29 鲁东大学 鱼类促卵泡激素体细胞基因转移载体及其构建方法和应用
US11471513B2 (en) 2016-08-19 2022-10-18 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Highly glycosylated human blood-clotting factor VIII fusion protein, and manufacturing method and application of same
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676096B (zh) * 2018-05-22 2022-03-29 北京伟杰信生物科技有限公司 重组猪fsh-ctp融合蛋白及其制备方法与应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1131952A (zh) * 1994-08-12 1996-09-25 华盛顿大学 糖蛋白激素四成员家族的单链形式
CN1309567A (zh) * 1998-07-23 2001-08-22 伊莱利利公司 Fsh和fsh变体制剂,产品和方法
CN1847265A (zh) * 2005-04-15 2006-10-18 上海市计划生育科学研究所 人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽多聚体及用途
CN101087805A (zh) * 2004-11-09 2007-12-12 阿雷斯贸易股份有限公司 Fsh的纯化方法
CN101720332A (zh) * 2007-06-28 2010-06-02 拜奥吉耐里克斯股份公司 生产促卵泡激素的细胞克隆
CN102448979A (zh) * 2009-04-01 2012-05-09 拜奥吉耐里克斯股份公司 纯化重组促卵泡激素的方法
CN102786589A (zh) * 2012-07-30 2012-11-21 南昌市万华生化药业有限公司 重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株
CN103059125A (zh) * 2012-12-27 2013-04-24 浙江海正药业股份有限公司 重组人促卵泡激素的纯化方法
CN103159860A (zh) * 2013-04-07 2013-06-19 旭华（上海）生物研发中心有限公司 重组组织型纤溶酶原激活剂及其制备方法与用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0461200T3 (da) * 1989-02-21 1997-03-10 Univ Washington Modificerede former af reproduktionshormoner
US6238890B1 (en) * 1994-02-18 2001-05-29 Washington University Single chain forms of the glycoprotein hormone quartet
US6797493B2 (en) * 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
US7081446B2 (en) * 2002-01-31 2006-07-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Long-acting follicle stimulating hormone analogues and uses thereof
WO2005058953A2 (en) 2003-12-12 2005-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ogh fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1711610A2 (en) * 2004-01-28 2006-10-18 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. HETERODIMERIC FOLLICLE STIMULATING HORMONE-Fc (FSH-Fc) FUSION PROTEINS FOR THE TREATMENT OF INFERTILITY
CN103539860B (zh) * 2013-11-01 2014-12-03 广州优联康医药科技有限公司 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白
CN103539862B (zh) 2013-11-01 2015-04-01 广州联康生物科技有限公司 一种长效重组促卵泡激素及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1131952A (zh) * 1994-08-12 1996-09-25 华盛顿大学 糖蛋白激素四成员家族的单链形式
CN1309567A (zh) * 1998-07-23 2001-08-22 伊莱利利公司 Fsh和fsh变体制剂,产品和方法
CN101087805A (zh) * 2004-11-09 2007-12-12 阿雷斯贸易股份有限公司 Fsh的纯化方法
CN1847265A (zh) * 2005-04-15 2006-10-18 上海市计划生育科学研究所 人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽多聚体及用途
CN101720332A (zh) * 2007-06-28 2010-06-02 拜奥吉耐里克斯股份公司 生产促卵泡激素的细胞克隆
CN102448979A (zh) * 2009-04-01 2012-05-09 拜奥吉耐里克斯股份公司 纯化重组促卵泡激素的方法
CN102786589A (zh) * 2012-07-30 2012-11-21 南昌市万华生化药业有限公司 重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株
CN103059125A (zh) * 2012-12-27 2013-04-24 浙江海正药业股份有限公司 重组人促卵泡激素的纯化方法
CN103159860A (zh) * 2013-04-07 2013-06-19 旭华（上海）生物研发中心有限公司 重组组织型纤溶酶原激活剂及其制备方法与用途

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015062350A1 (zh) * 2013-11-01 2015-05-07 广州联康医药科技有限公司 一种长效重组促卵泡激素及其应用
US10519212B2 (en) 2013-11-01 2019-12-31 Guangzhou Vbio Pharma Co., Ltd. Long-acting recombinant follicle-stimulating hormone and use thereof
WO2015062349A1 (zh) * 2013-11-01 2015-05-07 广州优联康医药科技有限公司 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白
US11472863B2 (en) 2016-08-19 2022-10-18 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Human coagulation factor IX (FIX) fusion protein, preparation method therefor, and use thereof
WO2018032785A1 (zh) 2016-08-19 2018-02-22 安源医药科技（上海）有限公司 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法与用途
WO2018032786A1 (zh) * 2016-08-19 2018-02-22 安源医药科技（上海）有限公司 人凝血因子ix融合蛋白及其制备方法与用途
CN107759696A (zh) * 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
CN107759697A (zh) * 2016-08-19 2018-03-06 安源生物科技(上海)有限公司 制备融合蛋白的方法
US11833212B2 (en) 2016-08-19 2023-12-05 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
US11471513B2 (en) 2016-08-19 2022-10-18 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Highly glycosylated human blood-clotting factor VIII fusion protein, and manufacturing method and application of same
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
AU2017431494B2 (en) * 2017-09-15 2021-04-15 Beijing Vjt Bio Co., Ltd. Long-acting recombinant porcine fsh fusion protein, and preparation method and application thereof
US11299527B2 (en) 2017-09-15 2022-04-12 Beijing Vjt Bio Co., Ltd. Long-acting recombinant porcine FSH fusion protein and preparation method and application thereof
WO2019051954A1 (zh) * 2017-09-15 2019-03-21 北京伟杰信生物科技有限公司 长效重组猪fsh融合蛋白及其制备方法与应用
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
CN113336831A (zh) * 2020-07-24 2021-09-03 上海延立药业有限公司 一种用于开发新冠病毒疫苗的长效重组糖蛋白
CN114807231A (zh) * 2022-06-28 2022-07-29 鲁东大学 鱼类促卵泡激素体细胞基因转移载体及其构建方法和应用

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