CN102061302A - 肠激酶轻链基因的合成及其表达产物的制备方法 - Google Patents

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肠激酶轻链基因的合成及其表达产物的制备方法。本发明是有关采用DNA重组技术生产的牛肠激酶轻链蛋白。该蛋白的编码基因，具有如序列表中序列3所示，并进一步公开了牛肠激酶轻链蛋白的发酵和纯化工艺。利用本发明优化后的发酵与纯化方法，以分泌表达的方式成功地表达出高生物活性的牛肠激酶轻链蛋白蛋白。作为工具蛋白酶用于融合蛋白的特异性切割，尤其适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。

Description

肠激酶轻链基因的合成及其表达产物的制备方法
技术领域：
本发明是有关采用DNA重组技术生产的牛肠激酶轻链蛋白，其关键是肠激酶轻链基因的克隆以及产物的发酵表达与分离纯化。重组表达的肠激酶，作为工具蛋白酶用于融合蛋白的特异性切割，尤其适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
背景技术：
肠激酶(Enterokinase)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种丝氨酸蛋白酶，最早由Schepowalnickow于1899年在Pavlov的实验室发现(The Journal of BiologicalChemistry，Vo1.246，August 25，1971，PP.5031-5039.)。1939年，Kunitz证实了肠激酶是一种胰蛋白酶原激活剂(J Gen Physiol，March 30，1939)。
迄今为止已从人、鼠、猪、牛等身上纯化出天然的肠激酶，其中以牛肠激酶的理化性质研究的最为透彻。牛的肠激酶分子量为150KD，由一条115KD的重链(结构亚基)和一条35KD的轻链(催化亚基)以一个二硫键连接而成，在pH值4.5-9.5、4-45℃范围内特异性水解蛋白底物，主要机理为：重链把轻链附着在肠粘膜刷状缘上并朝向肠腔，轻链基团能特异性识别胰蛋白酶原中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其C端水解肽链，释放出活性胰蛋白酶。1984年，Light A和Fonseca P证实：牛肠激酶轻链仍具有全酶所具有的特异性切割活性(Light A，Fonseca P.The Journal of Biological Chemistry，1984，13195-13198.)。
目前许多具有商业开发价值的药用蛋白质和多肽，如抗骨质疏松药物重组人甲状旁腺素(rhPTH1-34)、肿瘤坏死因子-β、磷脂酶A2、白细胞介素-11等，均采用融合蛋白表达，工艺要求用蛋白酶切割融合蛋白，释放出目的蛋白，这为肠激酶提供了广阔的市场空间。但天然肠激酶来源有限，并且从动物组织提取的肠激酶污染有其他蛋白酶，这给实际应用带来了困难。这就要求用基因工程方法生产高纯度的肠激酶。基因工程方法生产的高纯度肠激酶活性与天然酶相似，但比天然肠激酶切割速率更快。
牛肠激酶轻链EKL有4对分子内二硫键，为保证二硫键的正确折叠，以E.coli作为宿主菌表达EKL通常采用融合DsbA、thioredoxin等方法使得表达的肠激酶有活性。
La Vallie等在E.coli中，融合表达促二硫键形成伴侣蛋白DsbA与EKL。将牛EKL的cDNA序列以编码EK的特异性识别位点的序列与DsbA序列3’端相连，通过自切割加工就可以得到有活性的rEKL(The Journal of Biological Chemistry，1993，268：23311.)。Gasparian等将EKcDNA序列融合在pET32 a Trx下游，在BL21(DE3)中表达得到融合蛋白，但无自切割活性，需要通过蛋白复溶和蛋白复性从包涵体中获得了有活性的重组肠激酶催化亚基(Protein ExprPurif，2003，31：13)。
真核表达系统(酵母、CHO细胞等)能保证较高的二硫键配对正确，对表达蛋白进行翻译后修饰，保证表达产物的生物活性。同时，避免了采用大肠杆菌表达系统引入内毒素的潜在危险。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种肠激酶专用编码基因，它能够通过分泌表达的方式进行大量生产，且具有较高的生物学活性。
包括以下几个步骤：
(1)肠激酶轻链基因的合成：根据Genebank中公开的牛肠激酶轻链EKL核酸序列(AY682203)(序列表序列1，简称SEQ-1)和氨基酸序列(序列表序列2，简称SEQ-2)，选择毕赤酵母偏好的密码子，人工合成牛肠激酶轻链EKL的基因序列3(序列表序列3，简称SEQ-3)。
(2)表达载体的构建：在EKL基因序列SEQ-3的5’端加入Xho I位点，在Xho I位点和EKL基因序列间加入KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，确保EKL蛋白分泌到发酵液中时能够切除α-信号肽，在3’端加入TGA终止密码子以及Not I位点，将DNA片段和pPICZαA载体经Xho I与Not I双酶切、电泳回收、连接，构建表达载体pPICZαA-EKL。
(3)rEKL表达菌株：用Sac I或BstX I线性化pPICZαA-EKL，电转至X-33或GS115感受态中，根据Invitrogen手册进行单克隆的鉴定和高表达菌株的筛选。
(4)rEKL工程菌的发酵：所述编码基因电转至毕赤酵母菌发酵表达的优选方法为：16L发酵罐体系中，30℃，pH4.0-6.0，更优的为pH5.0，在基础培养基中培养16-18h后，按2.5ml/min流加50％甘油约600ml，饥饿0.2～0.3h，菌体湿重为180-200g/L时开始甲醇诱导，优化的诱导pH为4.0-5.0，最优诱导pH为4.0，前12h诱导期内共流加入10-20g甲醇，加用少量山梨醇。稳定诱导期内按2ml/min加入含有1％体积微量金属盐培养基(PTM1)的甲醇诱导60-72h，每12h加入5g大豆蛋白胨或酸水解酪蛋白；所述基础培养基为：甘油40g/L，K2SO4 17.5g/L，MgSO414g/L，KOH 3.2g/L，CaSO4 0.8g/L，PTM1 3ml/L。
(5)rEKL蛋白的表达纯化：发酵上清经PALL CentramateTM超滤系统置换缓冲液，置换溶液为：20-50mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为0-50mM，膜包选择为5K分子量，面积为0.1m2。超滤后的溶液经A液(缓冲液)：20-50mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为0-50mM平衡过的阴离子层析填料(并不仅限于Q FF或Capto Q)，B液：50-100mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为100-500mM，洗脱5-10个柱体积。洗脱溶液经20-50mM Tris-HCl 0-150mM NaCl 0-10mM CaCl2 pH7.5-8.5平衡过的Trypsin Inhibitor agarose(Sigma)或者trypsin-Sepharose 4B(GE)层析柱料，B液：50-200mM HAc-NaAc或甲酸-甲酸钠、1-10mM CaCl2、pH3.0-4.0洗脱5-10个柱体积。成品置换入20mM Tris-HCl(pH7.4)、50mM NaCl、2mM CaCl2缓冲液中，分装保存。
本发明选择毕赤酵母偏好密码子，人工合成了EKL全长基因序列，将该基因构建到毕赤酵母表达载体pPICZαA上进行分泌表达，成功的表达出具有较高生物学活性的rEKL。通过优化发酵过程中的一系列条件，如优化了诱导阶段的pH，前期诱导采用山梨醇与甲醇混加，同时每隔12h加入一定量的酸水解酪蛋白，充当酶解底物，减少rEKL在发酵上清中的降解。通过优化纯化参数与选择最适的介质材料，纯化后rEKL产量达到2×106U/L，一个单位(U)定义为23℃和20mM Tris-HCl(pH7.4)、50mM NaCl、2mM CaCl2缓冲液中，16小时切割50μg融合蛋白所需要的酶量，表达量适合规模化生产。
附图说明
图1：牛肠激酶轻链EKL基因重叠PCR-酶切合成示意图。
图2：牛肠激酶轻链EKL不同诱导时间段发酵上清酶切结果图。泳道1为诱导36h，泳道2为诱导48h，泳道3为诱导60h，泳道4为诱导72h，M为蛋白Marker(Invitrogen)。图3：牛肠激酶轻链EKL纯化SDS-PAGE电泳图。M.蛋白Marker(Invitrogen)；1.发酵上清超滤浓缩后；2.QFF流穿；3.QFF洗脱；4.Trypsin亲和流穿；5.Trypsin亲和洗脱。图4：不同酶量的牛肠激酶轻链rEKL酶切效果图。底物量相同，M.蛋白Marker(Invitrogen)；1.加入1/64U rEKL；2.加入1/32U rEKL；3.加入1/16U rEKL；4.加入1/8U rEKL；5.加入1/4UrEKL；6.加入1/2U rEKL；7.加入1U rEKL。
具体实施方式：
一、重组肠激酶表达载体pPICZαA-EKL的构建
1.重组肠激酶基因的人工合成
根据Genebank中公开的牛肠激酶轻链EKL核酸序列(AY682203)和氨基酸序列，选择毕赤酵母偏好的密码子，人工合成牛肠激酶轻链EKL的全长基因序列(序列表中SEQ-3的核苷酸序列)。
基因序列的全合成采用重叠PCR的方法。利用DNAMAN分析序列SEQ-3的酶切位点，找到2个天然的酶切位点NdeI(CA/TATG)、PstI(CTGCA/G)将其分割为3段，即BS1(183bp)、BS2(240bp)、BS3(282bp)。各大段再设计为数个60-68bp的寡核苷酸片段进行合成，每段寡核苷酸片段相互有18-20bp的重叠碱基。对BS1、BS2、BS3分别设计一对接头引物(引物两端分别带有上述的天然的酶切位点和保护碱基)。BS1与BS2用NdeI酶切后连接，再用PstI酶切与BS3连接得全长基因片段(见图1)。EKL基因序列的5’端带有Xho I位点和KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg对应的密码子AAA AGA，3’端引物加入TGA终止密码子以及Not I位点。
在EKL基因序列SEQ-3的5’端添加限制性内切酶Xho I位点，在Xho I位点和EKL基因序列间加入KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，确保EKL蛋白分泌到发酵液中时能够切除α-信号肽，同时使工程菌表达的EKL具有同牛组织中提取的EKL蛋白具有一样的N-端氨基酸序列。在3’端加入TGA终止密码子以及Not I位点，将DNA片段和pPICZαA载体经Xho I与Not I双酶切、电泳回收、连接，构建表达载体pPICZαA-EKL。
将表达载体pPICZαA-EKL转化至大肠杆菌TOP10F’(购自Invitrogen公司)中，在含有25ng/μl Zeocin抗生素的低盐LB(LLB)平板上进行培养约16h，挑取单菌落，在含有25ng/μlZeocin的LLB液体培养基中培养，利用5’AOX1与3’AOX1引物进行PCR鉴定，再提取质粒，经Xho I与Not I双酶切出含有目的基因大小的片段，鉴定单菌落中为阳性克隆，测序结果与目的基因序列一致。
二、毕赤酵母GS115 Stab或X-33生产rEKL
1.pPICZαA-EKL高表达菌株的筛选
将pPICZαA-EKL用Sac I或BstX I线性化，按照Invitrogen公司EasySelect Pichia ExpressionKit中的方法制备酵母宿主菌感受态，并电转至毕赤酵母宿主菌GS115 Stab或者X-33中，涂布于含有100ng/μl Zeocin抗生素的YPDS平板上，30℃下放置3-4天长出单菌落。挑选大而饱满的单菌落，用5’AOX1与3’AOX1引物进行PCR鉴定。20μlPCR反应体系为：5’AOX1(10μM)与3’AOX1(10μM)引物各0.5μl，dNTP(各2.5Mm)2μl，10*Taq buffer 2μl，TaqDNApolymerase(2.5U/μl)0.5μl，ddH2O 14.5μl。PCR反应程序为：95℃，8min；95℃、1min，55℃、1min，72℃、1min，30个循环；72℃10min。根据Invitrogen手册中，pPICZαA等载体整合到酵母基因组的原理，如果pPICZαA-EKL插入到野生型GS115 Stab或者X-33自身醇氧化酶基因5’AOX1或3’AOX1中，会形成Mut+，即甲醇利用正常表型；如果pPICZαA-EKL替代野生型GS115 Stab或者X-33自身醇氧化酶基因，会形成Muts，即甲醇利用慢表型。2200bp条带为野生型GS115 Stab或者X-33自身醇氧化酶基因的PCR产物，1300bp左右条带为插入的载体的PCR产物，即Mut+有2200bp和1300bp左右的条带，Muts仅有1300bp左右的条带。
对单克隆菌株进行蛋白表达酶活鉴定，是筛选高表达菌株最直接有效地方式。将PCR验证含有pPICZαA-EKL的阳性克隆菌株分别在BMGY(1％Yeast extract，2％peptone，100mMpotassium phosphate，pH 6.0，1.34％YNB，4x10-5％biotin，4x10-5％biotin)30℃过夜培养，接种至含有50ml BMMY培养基的500ml锥形瓶中，OD600约为1-1.2，30℃培养，每隔24小时，补加1％体积的甲醇诱导72小时。EKL发酵上清的测活，诱导不同时间段的发酵液离心过滤后取40ul上清添加40ul Trx-Tα1(1mg/ml)，23℃酶切16小时，如图2所示。
2.EKL的发酵生产
因EKL一级结构中有多个碱性蛋白聚集区，毕赤酵母分泌的rEKL在发酵液上清中易发生降解。我们优化了发酵条件，前期酵母菌生长约16-18h后，流加适量甘油后饥饿0.2～0.3h，改变诱导pH值，以及在诱导过程中添加一些蛋白胨如大豆蛋白胨或酸水解酪蛋白，充当酶解底物，减少上清中rEKL的降解，在诱导前期加入适量山梨醇，有利于酵母分泌rEKL。同时，在流加甲醇的过程中补加1％体积PTM1的甲醇诱导。
具体方法为：以筛选到的含有pPICZαA-EKL酶活为5×105U/L的阳性克隆为例，上16L发酵罐进行发酵。种子液接种量为6％-10％，转接至装有10L基础培养基(甘油40g/L，K2SO417.5g/L，MgSO4 14g/L，KOH 3.2g/L，CaSO4 0.8g/L，PTM1 3ml/L)的16L发酵罐中，30℃，pH4.0-6.0，更优的为pH5.0，发酵16-18h，待溶氧从接近0％上升到70-80％，按2ml/min加入50％甘油约600ml，饥饿30mins，菌体湿重为180-200g/L时开始诱导，优化的诱导pH为4.0-5.0，最优诱导pH为4.0，前12h诱导期内共流加入10-20g山梨醇，稳定诱导期内按2ml/min加入含有1％体积PTM1的甲醇诱导60-72h，每12h加入5g大豆蛋白胨或酸水解酪蛋白充当酶解底物，每隔12h取发酵液测湿重和发酵上清，检测酶活。
三、rEKL的纯化与活性检测
发酵上清经PALL CentramateTM超滤系统置换缓冲液，置换溶液为：20-50mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为0-50mM，膜包选择为5K分子量，面积为0.1m2。超滤后EKL的溶液经A液(缓冲液)：20-50mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为0-50mM平衡过的阴离子层析填料(并不仅限于Q FF或Capto Q)，B液：50-100mMTris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为100-500mM，洗脱5-10个柱体积。洗脱溶液经20-50mM Tris-HCl 0-150mM NaCl 0-10mM CaCl2pH7.5-8.5平衡过的Trypsin Inhibitor(Sigma)或者trypsin-Sepharose 4B(GE)层析柱料，B液：50-200mM HAc-NaAc或甲酸-甲酸钠、1-10mM CaCl2、pH3.0-4.0洗脱5-10个柱体积。成品置换入20mM Tris-HCl(pH7.4)、50mM NaCl、2mM CaCl2缓冲液中。纯化结果如图3所示。
取50μl 1mg/ml Trx-Tα1融合蛋白，分别加入1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64单位(U)的rEKL，23℃，酶切16h，如图4所示。
Figure ISA00000361369800021

Claims (5)

1.根据毕赤酵母密码子偏好性优化的牛肠激酶轻链基因序列，为序列表中序列3。
2.按照权利要求1所述的基因，所用表达载体为pPICZαA，构建表达载体时在5’端加入Xho I位点，在Xho I位点和牛肠激酶轻链基因序列间加入KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，在3’端加入TGA终止密码子以及Not I位点，将DNA片段和pPICZαA载体经Xho I与Not I双酶切、电泳回收、连接、电转至宿主菌。
3.根据权利要求2所述，其特征在于：构建的表达载体宿主菌为毕赤酵母，优选为毕赤酵母GS115stab或者X-33。
4.一种发酵制备牛肠激酶轻链蛋白的方法，其特征在于：所述编码基因电转至毕赤酵母菌发酵表达的优选方法为：16L发酵罐体系中，30℃，pH4.0-6.0，更优的为pH5.0，在基础培养基中培养16-18h后，按2.5ml/min流加50％甘油约600ml，饥饿0.2～0.3h，菌体湿重为180-200g/L时开始诱导，优化的诱导pH为4.0-5.0，最优诱导pH为4.0，前12h诱导期内共流加入10-20g甲醇，稳定诱导期内按2ml/min加入含有1％体积PTM1的甲醇诱导60-72h，每12h加入5g大豆蛋白胨或酸水解酪蛋白；所述基础培养基为：甘油40g/L，K2SO417.5g/L，MgSO4 14g/L，KOH 3.2g/L，CaSO40.8g/L，PTM 13ml/L。
5.一种牛肠激酶轻链蛋白的纯化方法，其特征在于：发酵上清经PALL CentramateTM超滤系统置换缓冲液，置换溶液为：20-50mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为0-50mM，膜包选择为5K分子量，面积为0.1m2；超滤后的溶液经A液(缓冲液)：20-50mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH 7.5-8.5，NaCl浓度为0-50mM平衡过的阴离子层析填料(并不仅限于Q FF或Capto Q)，B液：50-100mM Tris-HCl或者PBS缓冲液pH7.5-8.5，NaCl浓度为100-500mM，洗脱5-10个柱体积；洗脱溶液经20-50mM Tris-HCl0-150mM NaCl 0-10mM CaCl2pH7.5-8.5平衡过的Trypsin Inhibitor agarose(Sigma)或者trypsin-Sepharose 4B(GE)层析柱料，B液：50-200mM HAc-NaAc或甲酸-甲酸钠、1-10mMCaCl2、pH3.0-4.0洗脱5-10个柱体积；成品置换入20mM Tris-HCl(pH7.4)、50mM NaCl、2mM CaCl2缓冲液中，分装保存。
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