CN1188522C - 一种血栓靶向性溶栓蛋白表达质粒及其构建 - Google Patents

一种血栓靶向性溶栓蛋白表达质粒及其构建 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种编码膜联蛋白32的基因和编码单链尿激酶144～411位氨基酸的基因的融合基因anx32-scuPA；所述融合基因的热诱导性表达质粒pJM-anx32-scuPA，长度为6.8Kb的环形双链；以及该质粒转化大肠杆菌菌株K802制备的工程菌K802(pJM-anx32-scuPA)。本发明所提供的融合基因可表达膜联蛋白32(膜联蛋白32)和单链尿激酶的144～411位氨基酸(scu-PA(144～411))的融合蛋白。该融合蛋白具有抗凝和溶解血栓的双重功能，不仅溶栓效率高，而且不会引起出血等副作用。

Description

一种血栓靶向性溶栓蛋白表达质粒及其构建
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及用基因工程方法制备血栓靶向性溶栓蛋白表达质粒。
背景技术
血栓症，如急性心肌梗塞(AMI)、静脉血栓栓塞等是一类严重危及人类健康及生命的心血管疾病。在西方国家，因血栓引起的死亡已占人口总死亡率的首位。在我国，随着经济发展和人口趋向老龄化，血栓症患者日益增多，对抗血栓药物的需求也越来越大。目前临床上常用的溶栓药物主要为纤溶酶原激活剂，如链激酶(SK)、尿激酶(UK)、单链尿激酶(scu-PA)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等，这些药物虽然都具有较强的溶栓效果，但均存在许多缺点：(1)出血：由于这些药物不仅激活纤维蛋白凝块中的纤溶酶原，同时也激活血浆中的纤溶酶原，使血浆中纤溶酶活性增高。血浆纤溶酶水解凝血因子VII等，从而使凝血因子减少而引起出血。(2)体内半衰期短，治疗用量大。(3)再梗死：纤溶系统被激活后可活化血小板，使纤维蛋白原和VonWillebrand因子聚集于血小板GpIIb/IIIa受体，促使血栓形成。因此溶栓后短时间内容易再次形成血栓，使治疗失败。
低分子量单链尿激酶(scu-PA(144～411))是单链尿激酶(scu-PA)的衍生物，由scu-PA的144～411位氨基酸残基组成，其溶栓性质和scu-PA类似，出血副作用较小，但缺乏对纤维蛋白的特异亲和力，因而溶栓的效率不高，临床的应用受到限制。
因此，开发新型的效力更强、溶栓专一性更好、并能有效预防再栓塞的溶栓制剂是目前抗血栓药物研究的热点。
发明内容
本发明者曾从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆到的一个新基因——膜联蛋白32(Anx 32)基因(孙树汉等，囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆，中国寄生虫学与寄生虫杂志，1997，15(1)：15-20)。该基因编码347个氨基酸的蛋白质，分子量38KDa。在钙离子存在的情况下，膜联蛋白32可以高亲和性、特异性地与酸性磷脂结合。血液凝固过程可以分为三个阶段：(1)血小板活化阶段。血小板磷脂膜的不对称性发生改变，原来居于质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)暴露。(2)血小板表面反应阶段。从凝血因子X到凝血酶的形成，此系列反应均需在血小板膜的表面进行。(3)纤维蛋白形成阶段。凝血酶使纤维蛋白原转变成为纤维蛋白。由于膜联蛋白32可以高亲和性地结合活化血小板的膜磷脂，因而可以竞争性抑制凝血因子的激活，起到抗凝血的作用。
在此基础上，本发明人进行了膜联蛋白32与scu-PA(144～411)融合表达研究，完成了本发明。
本发明提供一种融合基因anx32-scuPA，所述融合基因包含序列表中序列1所示的编码膜联蛋白32的基因和序列3所示的编码单链尿激酶144～411位氨基酸的基因的融合物。
本发明还提供一种热诱导型表达质粒pJM-anx32-scuPA，所述表达质粒为长度6.8Kb的环形双链，克隆有编码膜联蛋白32和单链尿激酶144～411位氨基酸的基因序列，并含有PRPL启动子。
本发明进一步提供一种工程菌K802(pJM-anx32-scuPA)，为大肠杆菌K802JLF1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M201020。
本发明的融合基因anx32-scuPA是通过如下步骤进行制备的：将序列1所示编码膜联蛋白32的基因和序列3所示编码单链尿激酶144～411位氨基酸的基因分别用PCR方法扩增；然后采用重叠区延伸法连接。
本发明的表达质粒pJM-anx32-scuPA的构建，系将融合基因anx32-scuPA用EcoR I、Sal I双酶切，然后与用EcoR I、Sal I双酶切的载体pJM连接。
本发明人构建的膜联蛋白32和scu-PA(144～411)的融合表达质粒能融合表达膜联蛋白32与scu-PA(144～411)，表达产物能保留各自的生物学活性，从而可得到一种具有抗凝和溶栓双重功能的新型溶栓药物。前已述及，现有溶栓药物主要通过活化纤溶酶来溶解血栓，而血小板对纤溶酶的作用不敏感，因而这些药物对富含血小板的血栓治疗效果较差。而膜联蛋白32除了本身具有的抗凝血功能外，因其特异性结合活化的血小板，所以可将scu-PA(144～411)靶向性地结合在血栓部位，从而可以大大提高对富含血小板的动脉血栓的治疗效果。
另外，本发明采用热诱导型表达载体，可降低大规模培养时的成本，以利于规模化生产。因膜联蛋白32和单链尿激酶的生物学活性不受是否糖基化的影响，所以本发明可采用原核表达系统，根据需要也可采用酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统。
附图说明
图1重叠区延伸法构建质粒pJM-anx32-scuPA示意图
图2质粒pJM-anx32-scuPA酶切电泳图
其中： 泳道1：DNA标记
       泳道2：PCR#1扩增的anx32基因
       泳道3：PCR#2扩增的低分子量单链尿激酶基因
       泳道4：质粒pJM-anx32-scuPA经EcoR I和Sal I双酶切
图3融合蛋白ANX32-SCUPA的表达和纯化
其中： 泳道1：未诱导的菌体蛋白
泳道2：诱导后1小时菌体蛋白
泳道3：诱导后2小时菌体蛋白
泳道4：诱导后3小时菌体蛋白
泳道5：菌体超声后上清液(几乎无目的蛋白)
泳道6：菌体超声后沉淀(有大量目的蛋白)
泳道7：纯化后目的蛋白
泳道8：蛋白分子量标准
泳道9：Western印迹法表明纯化蛋白为含单链尿激酶的融合蛋白
具体实施方式
本发明中所用的含有anx32全长基因的质粒pUC19-anx32由本教研室保存(参见孙树汉等，囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆，中国寄生虫学与寄生虫杂志，1997，15(1)：15-20)；低分子量单链尿激酶(scu-PA(144～411))基因参照人尿激酶原cDNA序列(该序列可以在基因数据库(Genbank)得到，序列号：M15476)，其中部分氨基酸改成了大肠秆菌偏爱的密码子，由上海生工公司人工合成，具体改动方法参照文献(马忠等：人尿激酶原(pro-urokinase)基因在大肠杆菌的高效表达，生物化学和生物物理学报，1995，27(1)：17-22)；热诱导型表达载体pJM源自质粒pJLA-503，由M.kreg博士惠赠(参见M.kreg et al.Inducible expression vectors incorporating theEscherichia coli atpe translational initiation region，Gene，52(1987)279-283)；质粒扩增所用的宿主菌为DH10B，蛋白表达所用的宿主菌为K802(以上两种菌株均购自GIBCO公司)。
实施例1融合基因anx32-scu-PA(144～411)的获得
见图1，将编码膜联蛋白32的基因和编码单链尿激酶144～411位氨基酸的基因分别用PCR方法扩增；然后采用重叠区延伸法连接，得到融合基因anx32-scu-PA(144～411)。具体步骤如下：
(1)用引物a和引物b扩增膜联蛋白32基因的全部编码基因。其中引物a为5’TG  GAATTC ATGGCCTACTGTCGCTCCC3’，该引物与anx32编码序列的5’端一致，同时引入EcoR I限制性内切酶位点。引物b为：5’GCCACACTGAAATTTTAA/TGCAGGGCCGATGAG3’，其中5’端18bp与单链尿激酶编码序列的5’端一致，后面的15bp与anx32基因的3’端互补。采用高保真pfu DNA聚合酶进行PCR反应，其中dNTP浓度为20μM，Mg2+浓度为1.5mM，变性、退火、延伸的温度分别为94℃、55℃、72℃，时间分别为45秒、4秒和1分钟，共进行30个循环。
(2)用引物c和d扩增低分子量单链尿激酶(scu-PA(144～411))的编码序列片段。引物c为：5’CTCATCGGCCCTGCA/TTAAAATTTCAGTGTGGC3’，该引物的5’端15bp与anx32的3’端一致，后面18bp与低分子量单链尿激酶编码序列的5’端的序列一致。引物d为：5’TT GTCGAC GCA GAG GGC CAG GCC3’，该引物与低分子量单链尿激酶编码序列的3’端序列互补。同时引入Sal I限制性内切酶位点。PCR反应程序同(1)，共进行30个循环。
(3)利用重叠区延伸法获得编码膜联蛋白32和低分子量单链尿激酶的融合基因。上述两步PCR反应得到的产物分别利用1.0％琼脂糖电泳分离，然后作凝胶回收。回收后的产物94℃变性5分钟，将两次PCR的产物混台后于50℃退火。因为引物b和c具有重叠的部分，因而退火后可以使anx32基因的单链和scu-PA(144～411)的单链配对。添加DNA聚合酶、MgCl2、10×PCR缓冲液、dNTP后，进行PCR扩增。利用这种方法，使两个基因连接成一个融合基因anx32-scu-PA(144～411)。为保证高保真的扩增，整个PCR程序均采用TaKaRa公司的pfu DNA聚合酶，50μl反应体系，变性、退火、延伸的温度分别为94℃、50℃、72℃，时间分别为45秒、45秒和1分钟，共进行20个循环(具体方法参见《靶向新基因的分子克隆策略-理论与方法》，军事医学科学出版社，1999出版)。
实施例2表达质粒pJM-anx32-scuPA的构建
利用引物a和d对上述方法扩增得到的融合基因anx32-scu-PA(144～411)进行测序，测序反应由上海基康公司完成。经测序正确后，用EcoR I、Sal I双酶切，与用EcoR I、Sal I双酶切的载体pJM连接。酶切和连接反应的限制性内切酶和T4连接酶均购自TaKaRa公司，反应采用酶说明书所推荐的体系进行。本发明所利用的热诱导型表达载体pJM全长4.9Kb(千碱基对)，含有噬菌体PRPL启动子、热诱导基因CI1857、质粒复制起点(ori)和氨苄抗性基因(APr)。
具体反应过程如下：利用EcoRI、Sal I对上述PCR产物及载体进行双酶切，反应采用高盐(H)缓冲体系，37℃酶切3小时。然后经1.0％琼脂糖电泳分离后，作凝胶回收。酶切片段和载体按照5∶1的摩尔比混合，加入相应的连接缓冲溶液和T4连接酶，16℃连接12小时。
实施例3工程菌的制备
将上述连接后的产物转化大肠杆菌菌株K802，得到工程菌K802(pJM-anx32-scuPA)。
具体步骤为：先将宿主菌K802于50mlLB培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠，pH7.0)中，37℃振荡培养至OD600为0.4时，在4℃下，以4000rpm的转速离心，收集宿主菌；去除上清液后，用1～2ml冰预冷的100mmol/L的氯化钙溶液重悬，即得感受态细菌。将100ng上述构建的质粒与感受态细菌于冰浴中冷却30分钟，42℃热休克90秒，然后再于冰浴中冷却10分钟。加入0.8ml的LB，于37℃培养1小时后，取0.2ml转化产物涂布于含有相应抗生素的LB琼脂平板上，37℃培养12-15小时后，即获得单克隆的含有重组质粒的宿主菌。抽提宿主菌的质粒，用EcoR I、Sal I双酶切能够切出一条1.8Kb的条带，该宿主菌即为阳性重组子(附图2)。含有质粒pJM-anx32-scuPA的大肠杆菌菌株K802为工程菌K802(pJM-anx32-scuPA)。
实施例4  融合蛋白ANX32-SCUPA的表达和纯化
见附图3，工程菌K802(pJM-anx32-scuPA)通过温度诱导的方式，可以表达膜联蛋白32和低分子量单链尿激酶的融合蛋白ANX32-SCUPA(泳道2，3，4)，表达蛋白大部分以包含体的形式存在(泳道5，6)，表达量可以占到菌体蛋白的20％以上。蛋白纯化后，10％SDS-PAGE电泳，经考马氏亮蓝染色，显示为单一条带，分子量为68kDa(泳道7)。
(1)融合蛋白诱导表达
分别挑取上述工程菌的单菌落至100ml含氨苄50mg/L的LB培养基中，28℃振摇培养过夜。次日，取100ml菌液接种至含氨苄50mg/L的1L LB培养基中，继续在28℃振荡培养，至细菌生长到对数期(分光光度计检测，波长为600nm处吸光值为A600＝0.4-0.5)时，将培养液置于70℃热水浴中快速升温至42℃，再于42℃振荡培养5～7小时，最终A600可增至1.2左右。
(2)包含体的分离和粗蛋白的制备
将诱导表达后的菌液7700g离心10分钟，以收集菌体。按照每克湿重的菌体沉淀3ml的比例加入缓冲溶液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，pH8.0)悬浮沉淀。加入溶菌酶至终浓度1mg/mL，0℃冰浴15分钟：然后超声破菌，超声功率100W，30秒/次，显微镜检查菌体破碎情况。当菌体基本破碎后停止超声。超声液10000g离心15分钟，弃去上清液。沉淀用9倍体积的洗涤液(50mM Tris-HCl，10mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton X-100，pH8.0)洗涤两次。
通过上述方法制备的包含体加入5ml裂解液(8M尿素，0.5M NH4Cl，500mM Tris-HCl，pH8.5)，室温振荡4小时。然后7700g离心将不溶的部分除去。利用这种方法可以制备含量约70％的粗蛋白。
(3)融合蛋白纯化
粗蛋白进一步经Sephacryl S-400凝胶层析柱(Pharmacia公司)纯化。平衡和洗脱液均为5M尿素，0.5 NH4Cl，50mM Tris-HCl，pH8.0，0.5mM EDTA，10mM DTT。SDS-PAGE分析，收集含有目的蛋白的洗脱液，-20℃保存。
上述样品透析12小时，透析液为10倍体积的5M尿素，0.5 NH4Cl，50mMTris-HCl，pH8.5。尿激酶原含有12对二硫键，因此在透析过程中应注意去除透析液中氧气。先将透析液超声除气10分钟，然后通入N25分钟，最后用parafilm膜将透析的三角烧瓶密封。
透析后的样品逐滴加入100倍体积的缓冲液，含2M尿素，0.5 NH4Cl，50mM Tris-HCl，0.6mM EDTA，1.25mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，pH8.5。4℃轻轻搅动24小时，然后再加入0.5mM氧化型谷胱甘肽，继续搅动24小时。最后，样品在12倍体积的缓冲溶液10mM Tris-HCl，pH8.0中透析12小时。透析后的样品利用超滤膜浓缩。
上述样品再用弱阴离子交换柱(层析介质为二乙胺基乙基琼脂糖，DEAESepharose Fast Flow，Pharmacia公司)进行离子交换层析。层析柱用50mMTris·HCl，pH8.0平衡。洗脱盐浓度从0～1mol/LNaCl进行等浓度梯度洗脱，流速为1ml/分钟。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定重组蛋白所在的峰值，发现在盐浓度为0.4M时重组蛋白被洗脱下来。收集峰值洗脱液，经10％SDS-PAGE电泳分离，考马氏亮蓝染色显示为68kDa的单一蛋白条带，说明已得到纯的重组蛋白ANX32-SCUPA。
利用Western印迹法检测重组蛋白的表达。具体方法为：表达的重组蛋白10％SDS-PAGE分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，电流为0.65mA/cm2，时间为2小时。加入TBST缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.05％Tween-20，pH8.3)洗三次。加入TBST+5％的脱脂奶粉，37℃振摇1小时。然后弃去封闭液，以1∶50的比例加入抗单链尿激酶的抗体，37℃振摇1小时。弃去上述液体，TBST洗涤三次，加入二抗，37℃振摇30分钟。用TBST洗涤三次，加入二氨基联苯胺显色液显色，结果为一条单一的条带(附图3，泳道9)。以上方法可参见卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》，第二版，400-403页。
采用考马斯亮兰染色法(Bradford法)测定纯化蛋白浓度，计算回收率。将所得蛋白冷冻干燥后分装，置-20℃保存。
                         序列表
(1)序列1
a)   序列特征
     长度：1044bp
     类型：核酸
     链数：双链
     基因库No.AF147955
     几何结构：线形
b)   分子类型：DNA
c)   来源：猪囊尾蚴
d)   序列描述：SEQ ID No：膜联蛋白32
1    atggcctact gtcgctccct ggttcatcta tatgccccca atggagagaa gtacaaaccg
61   actattaccc caacacccgg gttctcaccg accgctgatg ctgagcactt gaagcgtgca
121  atgcgaggac ttggcacgaa tgaacgtgcg atcattgaca ttcttggaaa ccgaacttca
181  gccgaaagaa tggccattcg tgacgcctat ccgtcgattt ccagcaagac cctgcacgat
241  gctctaacca gcgagctgag tggcaagttc cggaggttcg ccttgttgct aatccaatca
301  ccgtggcagg tgatggcaga ggctctttac gacgccatga agggggctgg cactaaggaa
361  cgcgtactca atgaaattat tgccgggtgt tcaaaggatg acatccctca gttgaaaaaa
421  gcttttgaag aagtgagcgg aggagaaacc cttgatgatg cgatcaaggg ggacacgagt
481  ggcgactacc gcgaggccct tctgctagcg ctcgccggtc aggctgatga accacaggcg
541  atgcaactca aaaacctaac accctccact ctcagtcagg ttgtgaatcc cggccttgct
601  gaaacggatg cgaaggagct gtacgcctgc ggtgaggggc gcccgggcac agcagagagt
661  cgtttcatgc gtcctatcgt caatcgctca ttccttcaat taaacgcaac gaatgaggct
721  tacaatcggg cctacggtca cccgttgatt gatgcaataa agaaggagac gtcgagagac
781  cttgaggact ttctcataac tagagttcgc tacgccactg atcgcgccag tctgtttgcc
841  gaactccttc actttgccat gagaggagct ggcaccaagg actccacttt gcaacgtgtt
901  cttgccttga gggctgatac tgatctagga agcatcaagg agaagtatgc ggagctctat
961  ggtgaaacct tggaagcggc aatcaagggt gatacttctg gtgactatga ggctctctgc
1021 ttgaaactca tcggccctgc ataa
(2)序列2
序列1编码的氨基酸序列：
MAYCRSLVHLYAPNGEKYKPTITPTPGFSPTADAEHLKRAMRGLGTNERAIIDILGNRTSAERMAI
RDAYPSISSKTLHDALTSELSGKFRRFALLLIQSPWQVMAEALYDAMKGAGTKERVLNEIIAGCSK
DDIPQLKKAFEEVSGGETLDDAIKGDTSGDYREALLLALAGQADEPQAMQLKNLTPSTLSQVVNPG
LAETDAKELYACGEGRPGTAESRFMRPIVNRSFLQLNATNEAYNRAYGHPLIDAIKKETSRDLEDF
LITRVRYATDRASLFAELLHFAMRGAGTKDSTLQRVLALRADTDLGSIKEKYAELYGETLEAAIKG
DTSGDYEALCLKLIGPA
(3)序列3
a)序列特征
  长度：801bp
  类型：核酸
  链数：双链
  基因库No.M15476
  几何结构：线形
b)分子类型：DNA
c)来源：人工合成
d)序列描述：SEQ ID No：scu-PA(144～411)
1   aagaattaaa atttcagtgt ggccaaaaga ctctgaggcc ccgctttaag attattgggg
61  gagaattcac caccatcgag aaccagccct ggtttgcggc catctacagg aggcaccggg
121 ggggctctgt cacctacgtg tgtggaggca gcctcatcag cccttgctgg gtgatcagcg
181 ccacacactg cttcattgat tacccaaaga aggaggacta catcgtctac ctgggtcgct
241 caaggcttaa ctccaacacg caaggggaga tgaagtttga ggtggaaaac ctcatcctac
301 acaaggacta cagcgctgac acgcttgctc accacaacga cattgccttg ctgaagatcc
361 gttccaagga gggcaggtgt gcgcagccat cccggactat acagaccatc tgcctgccct
421 atgtataaag cgatccccag tttggcacaa gctgtgagat cactggcttt ggaaaagaga
481 attctaccga ctatctctat ccggagcagc tgaaaatgac tgttgtgaag ctgatttccc
541 accgggagtg tcagcagccc cactactacg gctctgaagt caccaccaaa atgctatgtg
601 ctgctgaccc ccaatggaaa acagattcct gccagggaga ctcaggggga cccctcgtct
661 gttccctcca aggccgcatg actttgactg gaattgtgag ctggggccgt ggatgtgccc
721 tgaaggacaa gccaggcgtc tacacgagag tctcacactt cttaccctgg atccgcagtc
781 acaccaagga agagaatggc c
(4)序列4
序列3编码的氨基酸序列：
LKFQCGQKTLRPRFKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDY
PKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTI
QTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLC
AADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEEN
GLAL

Claims (3)

1.融合基因anx32-scuPA，所述融合基因包含序列1所示编码膜联蛋白32的基因和序列3所示编码单链尿激酶144～411位氨基酸的基因的融合物：
序列1：
1    atggcctact gtcgctccct ggttcatcta tatgccccca atggagagaa gtacaaaccg
61   actattaccc caacacccgg gttctcaccg accgctgatg ctgagcactt gaagcgtgca
121  atgcgaggac ttggcacgaa tgaacgtgcg atcattgaca ttcttggaaa ccgaacttca
181  gccgaaagaa tggccattcg tgacgcctat ccgtcgattt ccagcaagac cctgcacgat
241  gctctaacca gcgagctgag tggcaagttc cggaggttcg ccttgttgct aatccaatca
301  ccgtggcagg tgatggcaga ggctctttac gacgccatga agggggctgg cactaaggaa
361  cgcgtactca atgaaattat tgccgggtgt tcaaaggatg acatccctca gttgaaaaaa
421  gcttttgaag aagtgagcgg aggagaaacc cttgatgatg cgatcaaggg ggacacgagt
481  ggcgactacc gcgaggccct tctgctagcg ctcgccggtc aggctgatga accacaggcg
541  atgcaactca aaaacctaac accctccact ctcagtcagg ttgtgaatcc cggccttgct
601  gaaacggatg cgaaggagct gtacgcctgc ggtgaggggc gcccgggcac agcagagagt
661  cgtttcatgc gtcctatcgt caatcgctca ttccttcaat taaacgcaac gaatgaggct
721  tacaatcggg cctacggtca cccgttgatt gatgcaataa agaaggagac gtcgagagac
781  cttgaggact ttctcataac tagagttcgc tacgccactg atcgcgccag tctgtttgcc
841  gaactccttc actttgccat gagaggagct ggcaccaagg actccacttt gcaacgtgtt
901  cttgccttga gggctgatac tgatctagga agcatcaagg agaagtatgc ggagctctat
961  ggtgaaacct tggaagcggc aatcaagggt gatacttctg gtgactatga ggctctctgc
1021 ttgaaactca tcggccctgc ataa
序列3：
1    aagaattaaa atttcagtgt ggccaaaaga ctctgaggcc ccgctttaag attattgggg
61   gagaattcac caccatcgag aaccagccct ggtttgcggc catctacagg aggcaccggg
121  ggggctctgt cacctacgtg tgtggaggca gcctcatcag cccttgctgg gtgatcagcg
181  ccacacactg cttcattgat tacccaaaga aggaggacta catcgtctac ctgggtcgct
241  caaggcttaa ctccaacacg caaggggaga tgaagtttga ggtggaaaac ctcatcctac
301  acaaggacta cagcgctgac acgcttgctc accacaacga cattgccttg ctgaagatcc
361  gttccaagga gggcaggtgt gcgcagccat cccggactat acagaccatc tgcctgccct
421  atgtataaag cgatccccag tttggcacaa gctgtgagat cactggcttt ggaaaagaga
481  attctaccga ctatctctat ccggagcagc tgaaaatgac tgttgtgaag ctgatttccc
541  accgggagtg tcagcagccc cactactacg gctctgaagt caccaccaaa atgctatgtg
601  ctgctgaccc ccaatggaaa acagattcct gccagggaga ctcaggggga cccctcgtct
661  gttccctcca aggccgcatg actttgactg gaattgtgag ctggggccgt ggatgtgccc
721  tgaaggacaa gccaggcgtc tacacgagag tctcacactt cttaccctgg atccgcagtc
781  acaccaagga agagaatggc c。
2.融合基因anx32-scuPA的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将如下编码膜联蛋白32的基因
1    atggcctact gtcgctccct ggttcatcta tatgccccca atggagagaa gtacaaaccg
61   actattaccc caacacccgg gttctcaccg accgctgatg ctgagcactt gaagcgtgca
121  atgcgaggac ttggcacgaa tgaacgtgcg atcattgaca ttcttggaaa ccgaacttca
181  gccgaaagaa tggccattcg tgacgcctat ccgtcgattt ccagcaagac cctgcacgat
241  gctctaacca gcgagctgag tggcaagttc cggaggttcg ccttgttgct aatccaatca
301  ccgtggcagg tgatggcaga ggctctttac gacgccatga agggggctgg cactaaggaa
361  cgcgtactca atgaaattat tgccgggtgt tcaaaggatg acatccctca gttgaaaaaa
421  gcttttgaag aagtgagcgg aggagaaacc cttgatgatg cgatcaaggg ggacacgagt
481  ggcgactacc gcgaggccct tctgctagcg ctcgccggtc aggctgatga accacaggcg
541  atgcaactca aaaacctaac accctccact ctcagtcagg ttgtgaatcc cggccttgct
601  gaaacggatg cgaaggagct gtacgcctgc ggtgaggggc gcccgggcac agcagagagt
661  cgtttcatgc gtcctatcgt caatcgctca ttccttcaat taaacgcaac gaatgaggct
721  tacaatcggg cctacggtca cccgttgatt gatgcaataa agaaggagac gtcgagagac
781  cttgaggact ttctcataac tagagttcgc tacgccactg atcgcgccag tctgtttgcc
841  gaactccttc actttgccat gagaggagct ggcaccaagg actccacttt gcaacgtgtt
901  cttgccttga gggctgatac tgatctagga agcatcaagg agaagtatgc ggagctctat
961  ggtgaaacct tggaagcggc aatcaagggt gatacttctg gtgactatga ggctctctgc
1021 ttgaaactca tcggccctgc ataa
和编码单链尿激酶144～411位氨基酸的基因
1    aagaattaaa atttcagtgt ggccaaaaga ctctgaggcc ccgctttaag attattgggg
61   gagaattcac caccatcgag aaccagccct ggtttgcggc catctacagg aggcaccggg
121  ggggctctgt cacctacgtg tgtggaggca gcctcatcag cccttgctgg gtgatcagcg
181  ccacacactg cttcattgat tacccaaaga aggaggacta catcgtctac ctgggtcgct
241  caaggcttaa ctccaacacg caaggggaga tgaagtttga ggtggaaaac ctcatcctac
301  acaaggacta cagcgctgac acgcttgctc accacaacga cattgccttg ctgaagatcc
361  gttccaagga gggcaggtgt gcgcagccat cccggactat acagaccatc tgcctgccct
421  atgtataaag cgatccccag tttggcacaa gctgtgagat cactggcttt ggaaaagaga
481  attctaccga ctatctctat ccggagcagc tgaaaatgac tgttgtgaag ctgatttccc
541  accgggagtg tcagcagccc cactactacg gctctgaagt caccaccaaa atgctatgtg
601  ctgctgaccc ccaatggaaa acagattcct gccagggaga ctcaggggga cccctcgtct
661  gttccctcca aggccgcatg actttgactg gaattgtgag ctggggccgt ggatgtgccc
721  tgaaggacaa gccaggcgtc tacacgagag tctcacactt cttaccctgg atccgcagtc
781  acaccaagga agagaatggc c
分别用PCR方法扩增；然后采用重叠区延伸法连接。
3.一种表达载体，它包含权利要求1所述的融合基因，并含有PRPL启动子。
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