CN1125084C

CN1125084C - 一种血栓靶向性溶栓融合蛋白

Info

Publication number: CN1125084C
Application number: CN 99113524
Authority: CN
Inventors: 吴祥甫; 孙建新; 杨冠珍
Original assignee: Shanghai Institute of Biochemistry
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 1999-03-12
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2003-10-22
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: CN1247195A

Abstract

本发明涉及以对活化血小板具有高亲和力的Annexin V为载体构建血栓靶向性溶栓融合蛋白是Annexin V与低分子量尿激酶融合基因在昆虫细胞中的活性表达产物。将Annexin V与scu-PA-32K融合基因插入Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统的供体质粒中，将重组供体质粒转化钙细胞HB10B，并经蓝白斑筛选获取重组Bacmid，以脂质体法转染Sf21细胞而获得重组病毒BacUKAV。昆虫细胞Tn-5B1-4表达的Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白不仅对活化血小板具有高亲和力，而且具有尿激酶的纤溶活性，为双功能蛋白。

Description

一种血栓靶向性溶栓融合蛋白

本发明涉及DNA重组，尤其是关于一种Annexin V与低分子量尿激酶融合蛋白，该融合蛋白具有血栓靶向性溶栓作用。

溶栓治疗已成功的用于临床血栓性疾病如急性心肌梗塞的治疗。目前临床应用的溶栓药物主要有尿激酶、链激酶和组织型纤溶酶原激活物等，但是它们在临床应用过程中存在一定的局限性，如一些病人的血栓对纤溶药物的裂解有抵抗性、血栓溶解后血栓的再形成及纤溶药物引起的系统性出血等副作用等。因此，目前人们主要致力于提高溶栓药物的效率及安全性的研究，其中包括以血栓特异的单克隆抗体为载体构建血栓靶向性的溶栓药物的研究。所用的单克隆抗体主要有抗纤维蛋白单克隆抗体、抗血小板特异抗原如糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体等(Bode C.et al.，1991，Circulation，84：805；Runge MS.et al.，Pro Natl Acad Sci USA，88：10337)。这些血栓靶向性的溶栓药物虽然在体内提高了溶栓效率，但是由于所用的单克隆抗体多为鼠源性的，具有免疫原性，因而临床应用具有一定的局限性。寻找新型的载体发展血栓靶向性的溶栓药物就显得十分重要。

Annexin V是Annexin蛋白家族中含量最丰富的一种钙结合蛋白。它对磷脂酰丝氨酸(PS)有高亲和力。通常情况下，细胞膜两侧磷脂的分布是不均一的，PS主要分布于膜的内侧(Op den Kamp JA.，1979，Ann RevBiochem，48：47)。但是在某些特殊情况下如血小板活化时，PS就暴露于膜的外侧，因此Annexin V对活化血小板具有高亲和力。每个活化血小板表面约有20万个Annexin V的结合位点，大约是抗血小板糖蛋白IIb/IIia单克隆抗体结合位点的10倍(Shattil SJ.et al.，1985，J Biol Chem，260：11107)。动物实验表明，同位素标记的Annexin V静脉注射后主要聚集于主动脉血栓部位(Tait J.F.，et al.1994，Thromb Res.，75：491)；^99mTc标记的Annexin V可用于心内血栓的显像(Stratton J.R.，et al.1995，Circulation.，92：3113)。由于Annexin V对血栓具有靶向性，因此可以其为载体发展血栓靶向性的溶栓药物。以Annexin V为载体发展的靶向溶栓药物至少具有两方面的优点：一是Annexin V本身具有抗凝活性，可预防血栓溶解后血栓的再形成；二是Annexin V为人体蛋白，不具有免疫原性；

低分子量尿激酶(scu-PA-32K)是单链尿激酶(scu-PA)的一种衍生物，由scu-PA的144-411位氨基酸残基组成，具有与scu-PA相似的溶栓性质，引起系统出血副作用小，即有一定的溶栓选择性。近年来，国外已有人用化学法获取了Annexin V与尿激酶B链的偶联产物(Tanaka.J.etal.，1996，Biochemistry.，35：922)，但化学法存在操作繁琐、产物不均一等缺点。若能用基因融合的方法构建Annexin V与scu-PA-32K的融合蛋白，此蛋白分子将具有血栓靶向性的溶栓活性，对临床提高疗效、降低出血副作用具有重要意义。

杆状病毒表达系统是近年来发展起来的一种新型真核表达系统。利用该系统可在昆虫细胞及虫体中高效表达外源基因，同时该系统还具有较完善的翻译后加工体系，如二硫键配对、糖基化修饰等，因此在基因工程药物生产中较细菌、酵母、哺乳动物细胞等体系更具潜在的优势(Karl M.etal.，1994，Insect Cell Biotechnology，CRC press)。Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统是1993年由Luckow等人发展的一种高效、快速的昆虫杆状病毒表达系统(Luckow V.A.et al.，1993，J Virol.，67：4566)。他们利用细菌的Tn7转座子，构建了杆状病毒的穿梭载体Bacmid，它是一种既可在大肠杆菌中复制又可在昆虫细胞中复制的重组杆状病毒，原来的多角体蛋白基因被卡那霉素抗性基因、LacZ基因、Tn7转座子的靶位点miniaatTn7和复制子mini-F所代替，由于有mini-F的存在，Bacmid可以在细菌中低拷贝复制。同时，又在pBluescript的基础上构建了供体质粒，供体质粒含有Tn7的左右两臂，两臂之间有Ph启动子和polylinker区，还含有庆大霉素的抗性基因供转位后的筛选。用供体质粒DNA转化已带有Bacmid和辅助质粒(Tet+)的感受态细胞，辅助质粒提供反式作用发生转座，将外源基因转到Bacmid的attTn7位置，并使LacZ基因失活，在含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的平板上进行蓝白斑筛选含有外源基因的重组Bacmid，转染昆虫细胞即得重组病毒，与重组病毒的空斑法筛选相比，其快速有效，可在短时间内获得重组病毒。

本发明的目的是提供一种血栓靶向性溶栓融合蛋白，是通过基因工程方法构建以水蛭素12肽为连接肽的Annexin V与scu-PA-32K(低分子量尿激酶)的融合基因，重组入Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统的供体质粒中，在粉蚊夜蛾细胞Tn-5B1-4中表达Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白，该融合蛋白具有血栓靶向性的溶栓作用。

本发明提供一种血栓靶向性溶栓融合蛋白。首先是通过PCR拼接的方法构建以水蛭素12肽为连接肽的Annexin V与scu-PA-32K的融合基因。为了使Annexin V与低分子量尿激酶融合蛋白各自能保持正确的空间结构，本发明以具有抗凝活性的水蛭素12肽作为连接肽，根据低分子量尿激酶及水蛭素12肽的核苷酸序列，设计了一对引物P1和P2：

P1：5’GGCCATGGAATTAAAATTTCAGTGTGGCAAAAGAC3’

P2：5’GGCTCGAGTAAATATTCTTCTGGAATTTCTTCGAAATCGCCGAGGGCCAGGCCATTCTC3’

P1为低分子量尿激酶N端的核苷酸序列，并引进NcoI酶切位点；P2为低分子量尿激酶C末端及水蛭素12肽核苷酸序列的互补序列，并引进XhoI酶切位点。以含有尿激酶原cDNA质粒pUC-PUK(1-411)为模板，以P1、P2为引物PCR扩增低分子量尿激酶与水蛭素融合基因。根据Annexin V的核苷酸序列，设计一对引物P3和P4：

P3：5’GGCTCGAGATGGCACAGGTTCTCAGAGG 3’

P4：5’GAAAGCTTTTAGTCATCTTCTCCACAGAGC 3’。以含有Annexin V cDNA的质粒pSK-ANV为模板，以P3、P4为引物，扩增Annexin V的cDNA，在5’及3’端分别引进XhoI及HindIH位点。PCR扩增结果见图1，泳道1为DNA分子量参照，泳道2为Annexin V cDNA的PCR产物，在其5’及3’端分别引入XhoI及HindIII位点，泳道3为scu-PA-32K及其C端连接水蛭素基因的PCR产物，在其5’及3’端分别引入NcoI及XhoI位点，PCR产物经测序证明序列完全正确，连接在scu-PA-32K C末端的水蛭素12肽的核苷酸序列(GGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATCTCGAG)见图2，证明水蛭素12肽的基因已成功拼接于scu-PA-32K的C末端。NcoI及XhoI双酶切的拼接水蛭素12肽的scu-PA-32K片段与XhoI及HindIII双酶切的Annexin V片段连接获得Annexin V与scu-PA-32K的融合基因，序列见图3，在其两端分别引进了NcoI及HindIII位点。

本发明还构建了含有Annexin V与scu-PA-32K的融合基因的Bac toBac昆虫杆状病毒表达系统的重组供体质粒pFastBacHTUKAV及在昆虫细胞中高效表达Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白的重组病毒BacUKAV。将经NcoI/HindIII双酶切的Annexin V与scu-PA-32K的融合基因片断与经NcoI-HindIII双酶切消化的供体质粒pFastBacHTa连接，构建了含有Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白基因的重组供体质粒pFastBacHTUKAV(图4)。将重组供体质粒pFastBacHTUKAV转化钙细胞HB10B，在含有Blue-gal及IPTG的平板上(卡那霉素50μg/ml，四环素10μg/ml，庆大霉素50μg/ml)，经两轮筛选后，挑取一个白色克隆接种于3ml的LB培养基中。培养24小时后，提取重组Bacmid。以Lipofectin法共转染Sf21细胞。三天后收集含有重组病毒的共转染上清，其病毒滴度约为2×10⁷pfu/ml。重组病毒BacUKAV以PCR方法鉴定，分别以scu-PA-32K和Annexin V的两对引物进行PCR反应，可扩增出840bp及980bp的DNA片段，与相应供体质粒扩增出的DNA片段相一致，证明本发明获得的重组病毒BacUKAV的确含有scu-PA-32K和Annexin V基因(图5)。

重组病毒BacUKAV感染粉蚊夜蛾细胞Tn-5B1-4获得Annexin V-scu-PA-32K的融合蛋白。重组病毒上清分别以MOI＝10感染昆虫细胞Sf21及Tn-5B1-4，72小时后收集细胞，用于SDS-PAGE及Western blot分析，结果见图6和图7。图6的结果表明，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在Tn细胞中得到高效表达，表达量占细胞总蛋白的20％左右，其分子量为70kD，与计算的分子量相一致，而Sf21细胞的表达量较低，SDS-PAGE图谱上未见明显的表达条带。Western blot分析表明，Tn-5B1-4细胞中的表达蛋白与抗尿激酶单克隆抗体及抗Annexin V的多抗有特异的免疫反应，说明表达蛋白为低分子量尿激酶与Annexin V的融合蛋白。

本发明还利用Ni-NTA亲和层析对昆虫细胞表达的Annexin V-scu-PA-32K的融合蛋白进行了纯化。由于在融合蛋白的N端融合了6Xhis，所以可用Ni-NTA亲和层析来纯化目的蛋白。重组病毒感染昆虫细胞72小时后收集细胞，以液氮中反复冻溶裂解细胞，15000rpm离心20分钟，收集上清，直接上以结合缓冲液平衡的Ni-NTA树脂，流速为10ml/hr，分别以6倍及4倍柱体积的结合缓冲液及洗涤缓冲液洗去杂蛋白，最后以6倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱6Xhis的融合蛋白，纯化的融合蛋白的纯度达90％以上(图8)。

本发明所提供的Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白不仅具有低分子量尿激酶的纤溶活性，而且具有Annexin V的抗凝活性及对活化血小板具有高亲和力。血纤维蛋白平板实验表明，表达产物具有明显的纤溶活性，这种纤溶活性可被抗尿激酶单抗所中和，说明表达产物具有与天然尿激酶相同的纤溶活性，Tn细胞中尿激酶的表达量为7600IU/10⁶细胞。抗凝实验研究表明(图9)，表达的重组蛋白的部分凝血酶原时间(APTT)较对照组明显延长，说明表达产物具有明显的抗凝活性。膜结合特异性研究表明，随着竞争物浓度升高，血小板结合的¹²⁵I-Annexin V比例逐渐下降，且Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白与Annexin V下降趋势基本一致，说明Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白对活化的血小板的亲和力与Annexin V相当(图10)。

经体外实验证实，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白具有明显的抗凝活性且能与活化的血小板特异结合，有可能成为一种新型血栓靶向性溶栓药物。同样思路还可获得多种溶栓药物如链激酶、组织纤溶酶原激活物、葡激酶、纤维蛋白降解产物与Annexin V融合的多种靶向性溶栓重组蛋白，有望成为一类新型血栓靶向性溶栓药物。

综上所述，本发明的优点如下：通过基因工程方法构建了Annexin V与scu-PA-32K融合基因，并实现其在昆虫细胞中的高效表达。Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白不但能与活化的血小板特异结合，且具有明显的抗凝、纤溶活性，可预防血栓溶解后血栓的再形成，有望成为一种新型血栓靶向性溶栓药物；本发明通过昆虫杆状病毒表达系统实现了Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在昆虫细胞中的高效表达，表达量远远高于其它表达系统中尿激酶的表达量，使得通过基因工程方法生产这种融合蛋白的成本远远低于化学偶联法，这有利于此种融合蛋白的工业化大量生产。

附图说明：

图1.低分子量尿激酶及Annexin V cDNA的PCR扩增图谱

1，DNA分子量参照；2，Annexin V cDNA的PCR产物；3，低分子量尿激酶的PCR产物。

图2.连接在scu-PA-32K C末端的水蛭素12肽的核苷酸序列

GGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATCTCGAG。

图3.Annexin V与scu-PA-32K的融合基因的核苷酸序列。

图4.重组供体质粒pFastBacHTUKAV的结构图谱。

图5.重组病毒BacUKAV的PCR鉴定结果

1，DNA分子量参照；2，BacUKAV为模板，Annexin V正反向引物进行PCR扩增；3，pFastBacHTUKAV为模板，Annexin V正反向引物进行PCR扩增；4，BacUKAV为模板，scu-PA-32K正反向引物进行PCR扩增；5，pFastBacHTUKAV为模板，scu-PA-32K正反向引物进行PCR扩增；6，BacPAK6为模板，Annexin V正反向引物进行PCR扩增；7，BacPAK6为模板，scu-PA-32K正反向引物进行PCR扩增。

图6.被重组病毒BacUKAV感染的Tn-5B1-4细胞表达产物的SDS-PAGE分析

1，蛋白分子量参照；2，感染BacPAK6的细胞总蛋白；3，感染BacUKAV的细胞总蛋白。

图7.被重组病毒BacUKAV感染的Tn-5B1-4细胞表达产物的Westernblot分析

1，蛋白分子量参照；2，蛋白质印迹条带。

图8.亲和层析纯化的表达产物的SDS-PAGE分析

1，蛋白分子量参照；2，纯化的融合蛋白。

图9.表达产物的抗凝活性分析

1，PBS；2，感染BacPAK6的细胞裂解液；3，感染BacUKAV的细胞裂解液；4，重组Annexin V蛋白。

图10.Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白对活化血小板膜亲和力的测定

1，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白；2，Annexin V蛋白。

本发明通过以下实施例进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1.构建Annexin V-scu-PA-32K融合基因

在100μl的PCR反应总体积中，以10ng含有尿激酶原cDNA质粒pUC-PUK(1-411)(本发明人实验室提供)为模板，加10μM的P1、P2引物各2μl，10mM dNTP(生工公司)2μl，15mM MgCl₂ 10μl，10XPCR缓冲液10μl，Taq酶(生工公司)4个单位，补加双蒸水至100μl。PCR条件为：94℃1min，55℃1.5min，72℃1.5min，共35个循环，最后一个循环72℃延伸10min，PCR结果见图1(泳道3)，在PCR产物5’及3’端分别引入NcoI及XhoI位点。PCR产物经低熔点胶纯化后，克隆进pSK(+)的EcoRV位点，构建质粒pSK-UKL，测序证明PCR扩增的低分子量尿激酶cDNA序列正确，水蛭素12肽成功拼接于低分子量尿激酶的C末端(图2)。同样方法，以10ng含有Annexin V cDNA的质粒pSK-ANV(本发明人实验室提供)为模板，以P3、P4为引物，同样PCR条件扩增Annexin V的cDNA，结果见图1(泳道2)，在PCR产物5’及3’端分别引进XhoI及HindIII位点。PCR产物克隆进pSK(+)的EcoRV位点，构建质粒pSK-ANV2，经测序证明其核苷酸序列完全正确。NcoI及XhoI双酶切的拼接水蛭素12肽基因的scu-PA-32K片段与XhoI及HindIII双酶切的Annexin V片段连接获得Annexin V与scu-PA-32K的融合基因，其序列见图3，在其两端分别引进了NcoI及HindIII位点。

实施例2.重组供体质粒pFastBacHTUKAV的构建

取3μg质粒pSK-UKL，NcoI-XhoI双酶切后，低熔点胶分离、回收scu-PA-32K基因片段；取3μg质粒pSK-ANV2，XhoI-HindIII双酶切后，低熔点胶分离、回收Annexin V基因片段。将两个基因片断与经NcoI-HindIII双酶切消化的质粒pFastBacHTa(购自Gibcol，BRL公司)连接，转化、酶切鉴定后获得含有Annexin V-scu-PA-32k融合蛋白基因的供体质粒pFastBacHTUKAV(图4)。

实施例3.表达Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白的重组病毒BacUKAV的获取

取20ng重组供体质粒pBacFast UKAV转化钙细胞HB10B，在含有Blue-gal及IPTG的平板上(卡那霉素50μg/ml，四环素10μg/ml，庆大霉素50μg/ml)，经两轮蓝白斑筛选后，挑取一个白色克隆接种于3ml的LB培养基中。培养24小时后，提取重组Bacmid。以Lipofectin法共转染Sf21细胞。三天后收集含有重组病毒的共转染上清，其病毒滴度约为2×10⁷pfu/ml。共转染上清用于提取病毒DNA，分别以scu-PA-32k和Annexin V的两对引物，进行PCR反应，PCR条件同前，PCR鉴定结果证实，可扩增出840bp及980bp的DNA片断，与相应供体质粒扩增出的DNA片断相一致(图5)。

实施例4.Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在粉蚊夜蛾细胞Tn-5B1-4中的表达

重组病毒上清分别以MOI＝10感染昆虫细胞Sf21及Tn-5B1-4，72小时后收集细胞，用于SDS-PAGE及Western blot分析，结果见图6和图7。图6的结果表明，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在Tn细胞中得到高效表达，表达量占细胞总蛋白的20％左右，其分子量为70kD，与计算的分子量相一致，而Sf21细胞的表达量较低，SDS-PAGE图谱上未见明显的表达条带。Western blot分析表明，Tn-5B1-4细胞中的表达蛋白与抗尿激酶单克隆抗体及抗人Annexin V的多抗有特异的免疫反应，说明表达蛋白为低分子量尿激酶与Annexin V的融合蛋白。

实施例5.昆虫细胞表达的Annexin V-scu-PA-32K的融合蛋白Ni-NTA亲和层析纯化

由于在融合蛋白的N端融合了6Xhis，所以可用Ni-NTA亲和层析来纯化目的蛋白。重组病毒感染昆虫细胞72小时后收集细胞，以液氮中反复冻溶裂解细胞，15000rpm离心20分钟，收集上清，直接上以结合缓冲液平衡的Ni-NTA树脂，流速为10ml/hr，分别以6倍及4倍柱体积的结合缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，5mmol/L咪唑，pH7.9)及洗涤缓冲液(20mmol/LTris-HCl，20mmol/L咪唑，pH7.9)洗去杂蛋白，最后以6倍柱体积的洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L咪唑，pH7.9)洗脱6Xhis的融合蛋白，纯化的融合蛋白的纯度达90％以上(图8)。

实施例6.昆虫细胞表达的Annexin V-scu-PA-32K的融合蛋白的生物活性鉴定

昆虫细胞表达的Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白不仅具有低分子量尿激酶的纤溶活性，而且具有Annexin V的抗凝活性及对活化血小板具有高亲和力。血纤维蛋白平板实验测定纤溶活性参照文献(Ploug T.et al.，1957，Biochem Biophys Acta，27：278)方法稍加修改进行，用0.1mol/L的PBS，pH7.4配制1.4％的琼脂糖，水浴煮沸，取5ml与5ml37℃预热的人纤维蛋白原(2mg/ml)及0.2ml的42℃预热的凝血酶(50U/ml)混合，倾入40孔的酶联板盖上，凝后打孔加入10μl的待测样品，在湿盒中37℃孵育6至18小时，溶解圈直径与每孔UK的量的对数呈线性关系。实验结果表明表达产物具有明显的纤溶活性，这种纤溶活性可被抗尿激酶单抗所中和，说明表达产物具有与天然尿激酶相同的纤溶活性，Tn细胞中尿激酶的表达量为7600IU/10⁶细胞。抗凝实验采用APTT法，取100μl的活化部分凝血活酶试剂，加入100μl的待测样品，37℃预温3min，加入100μl的参比血浆，测定反应物凝固时间。实验表明(图9)，表达产物具有明显的抗凝活性。膜结合特异性的分析采用的反应体系为10mmol/L Na-HEPES(pH7.4)，136mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl₂，2.7mmol/L KCl，2mmol/L MgCl₂，1mmol/L NaH₂PO₄，5mmol/L glucose，5mg/ml BSA，凝血酶活化的血小板5X10⁷/ml，5nmol/L ¹²⁵I-Annexin V，加入不同浓度的Annexin V及表达产物，离心收集血小板及上清，分别测定其放射活性，计算结合百分比。膜结合特异性研究表明，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白对活化的血小板的亲和力与Annexin V相当(图10)。这些结果表明，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在体内对以活化血小板为主要成分的主动脉血栓具有靶向溶栓作用。

Claims

1.一种血栓靶向性溶栓融合蛋白，其具有下面的氨基酸序列：Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile1 5 10 15Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala

20 25 30Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly

35 40 45Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile

50 55 60Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg65 70 75 80Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu

85 90 95Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp

100 105 110Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro

115 120 125Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro

130 135 140Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser145 150 155 160Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu

165 170 175Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val

180 185 190Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser

195 200 205Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg

210 215 220Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys225 230 235 240Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile

245 250 255Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu Gly Asp Phe Glu

260 265 270Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Met Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr

275 280 285Leu Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu

290 295 300Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr305 310 315 320Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala

325 330 335Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu

340 345 350Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser

355 360 365Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly

370 375 380Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu385 390 395 400Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser

405 410 415Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met

420 425 430Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp

435 440 445Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu

450 455 460Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr465 470 475 480Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile

485 490vv 495Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn

500 505 510Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro

515 520 525Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr

530 535 540Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp545 550 555 560Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu

565 570 575Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu

580 585 590Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp

595 600

2.编码权利要求1的血栓靶向性溶栓融合蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2的核苷酸序列，所述的核苷酸序列是：

tta aaa ttt cag tgt ggc caa aag act ctg agg ccc cgc ttt aag att 48

att ggg gga gaa ttc acc acc atc gag aac cag ccc tgg ttt gcg gcc 96

atc tac agg agg cac cgg ggg ggc tct gtc acc tac gtg tgt gga ggc 144

agc ctc atc agc cct tgc tgg gtg atc agc gcc aca cac tgc ttc att 192

gat tac cca aag aag gag gac tac atc gtc tac ctg ggt cgc tca agg 240

ctt aac tcc aac acg caa ggg gag atg aag ttt gag gtg gaa aac ctc 288

atc cta cac aag gac tac agc gct gac acg ctt gct cac cac aac gac 336

att gcc ttg ctg aag atc cgt tcc aag gag ggc agg tgt gcg cag cca 384

tcc cgg act ata cag acc atc tgc ctg ccc tcg atg tat aac gat ccc 432

cag ttt ggc aca agc tgt gag atc act ggc ttt gga aaa gag aat tct 480

acc gac tat ctc tat ccg gag cag ctg aag atg act gtt gtg aag ctg 528

att tcc cac cgg gag tgt cag cag ccc cac tac tac ggc tct gaa gtc 576

acc acc aaa atg ctg tgt gct gct gac cca cag tgg aaa aca gat tcc 624

tgc cag gga gac tca ggg gga ccc ctc gtc tgt tcc ctc caa ggc cgc 672

atg act ttg act gga att gtg agc tgg ggc cgt gga tgt gcc ctg aag 720

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4.如权利要求1所述的血栓靶向性溶栓融合蛋白的制备方法，其特征在于通过基因工程方法首先构建Annexin V与低分子量尿激酶scu-PA-32K的融合基因，将该融合基因插入Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTa中得到重组供体质粒pFastBacHTUKAV，再将该重组供体质粒转化获得重组病毒BacUKAV，BacUKAV感染昆虫细胞表达获得Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的重组病毒BacUKAV是将重组供体质粒pBacFastHTUKAV转化钙细胞HB10B后，获取重组Bacmid，并以脂质体法转染Sf21细胞后而得到。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于重组病毒BacUKAV感染粉蚊夜蛾细胞Tn-5B1-4表达获得Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白。