CN101214372A - 一种体内诱导出针对TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体内诱导出针对TNF－α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法，方法采用人工合成mTNF－TT830－844，mTNF－HEL46－61，mTNF－PADRE基因片段，将该片段插入pBV220载体中构建mTNF－TT830－844，mTNF－HEL46－61，mTNF－PADRE蛋白基因；含有目的基因mTNF－TT830－844，mTNF－HEL46－61，mTNF－PADRE的原核表达载体的构建及重组蛋白表达，经表达产物的鉴定、重组蛋白的纯化，将mTNF－TT830－844、mTNF－HEL46－61、mTNF－PADRE蛋白免疫小鼠后产生的抗血清与小鼠TNF－α的结合作用，该抗血清在体外可以中和小鼠TNF－α对L929细胞的杀伤；比较这三种分子诱导针对mTNF－α自身抗体的滴度，筛选出mTNF－PADRE蛋白；将筛选的mTNF－PADRE蛋白，通过免疫小鼠可突破小鼠的免疫限制，产生高滴度抗小鼠TNF－α自身抗体，其对应的重组人TNF－PADRE融合蛋白能在人体内产生抗人TNF－α自身抗体，即可得到TNF－α分子的自身抗体的蛋白疫苗。

Description

一种体内诱导出针对TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化、动物免疫实验、诱导抗血清的体外活性检测以及恶病质治疗、急性肺损伤治疗、类风湿性关节炎治疗实验等技术领域，进一步涉及一种在体内能够诱导出针对TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法。

背景技术

1.TNF-α分子及抗TNF-α治疗的相关研究

1.1 TNF-α分子

1975年Carswll等发现，卡介苗和细菌内毒素感染的小鼠血清中有一种高活性的肿瘤细胞毒因子，该物质可使肿瘤发生出血性坏死，但对正常组织细胞无杀伤活性，将其命名为肿瘤坏死因子。经研究表明TNF-α是一种由单核/巨噬细胞分泌产生的多功能细胞因子。人TNF-α基因位于第6号染色体，基因长4kb，由4个外显子和3个内含子组成，与MHC基因密切连锁，其前体由232个氨基酸组成，含有76个氨基酸的信号肽。小鼠TNF基因位于17号染色体，也由4个外显子和3个内含子组成，其前体由235个氨基酸组成。人和小鼠TNF前体有79％的同源性，切除信号肽后形成的成熟型人TNF-α由157个氨基酸组成，分子量约为17KD，较小鼠成熟型TNF在73位多一个组氨酸残基。人和小鼠的成熟型TNF分子中相同位置上有两个半胱氨酸(人69、101位；鼠69、100位)，可以形成分子内二硫键。从产生人TNF-α的细胞株培养上清中分离纯化的TNF-α在非还原的条件下分子量大小不等，在还原条件下分子量为17KD，与根据成熟型TNF氨基酸顺序推算的分子量理论值一致。这可能是因为TNF-α以不同程度的聚合体形式存在的原因。目前已证实TNF活性形式是由3个17KD的亚基组成的三聚体。

TNF-α是一种多功能的细胞因子。它除了能在体内、外杀伤肿瘤细胞外，还具有诱导炎症反应、抗病毒感染、调节机体免疫、促进细胞增殖和活化等多种功能。TNF-α对肿瘤具有直接抑制和细胞溶解作用，但不同肿瘤株对TNF-α的敏感性不同。TNF-α抗肿瘤的机制不完全清楚，目前的研究结果表明TNF-α抗肿瘤的机制主要有：

(1)通过与肿瘤细胞TNF的表面受体结合而发挥细胞毒作用。目前已知的TNF受体有两种，TNFR I和TNFRII，均为跨膜糖蛋白。TNFR I通过其胞浆区的约80个氨基酸残基的死亡区(DD)介导肿瘤细胞的凋亡。

(2)通过对血管内皮细胞的作用，诱导凝血因子的表达，增加纤溶酶原抑制剂的分泌，从而促进血管内凝血及血栓的形成，造成肿瘤组织的局部流血阻断而发生坏死。

(3)通过介导杀瘤效应细胞的作用和诱导肿瘤局部的炎症反应，促进杀瘤效应细胞的作用。在抗病毒方面，TNF-α可以选择性的杀伤病毒感染的细胞，并对不同的病毒感染具有不同的作用。如对VSV、HSV等病毒具有抑制作用，但是对HIV具有促进作用。另外，TNF-α是重要的炎症因子，一方面它可以刺激内皮细胞表达MHC I类抗原和多种黏附分子的表达，促进IL-1、IL-6的表达，刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎症介质。另一方面TNF-α可促进中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞黏附在内皮细胞上，从而参与炎症反应。TNF-α还能够促进T细胞和B细胞增值，促进B细胞产生抗体；活化单核细胞和巨噬细胞，提高其杀伤活性；上调巨噬细胞MHC II类分子，提高其抗原呈递能力；提高巨噬细胞的吞噬能力增强ADCC作用。

TNF-α还可以促进细胞增殖和分化，可以诱导骨髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，促进T细胞、B细胞的增殖，并对某些肿瘤细胞具有生长因子样的作用，并协同EGF、PDGF和胰岛素的促增殖作用，促进EGF受体的表达。

1.2抗TNF-α治疗

虽然TNF-α自体内具有多种生物学活性，但是研究发现，TNF-α在体内持续、高水平的表达时在多种疾病中发挥重要的作用，如：恶液质、胰岛素抵抗、感染性休克、炎症反应、自身免疫性疾病、移植抗宿主病等。TNF-α的这些负面作用也使其成为药物研究的重要靶点，研制TNF-α拮抗药物为治疗TNF-α水平增高相关疾病提供了一条好的途径。

传统的用于治疗体内TNF-α的过量表达相关疾病的药物主要有：非甾类抗炎药(NSAIDS)，缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)，皮质甾类、免疫抑制剂和止痛剂。但是这些药物有的具有长期毒性，并且一些患者对此类药物的治疗不敏感。近年来，一些治疗此类疾病的新药相继问世。主要有：氨甲喋呤、来氟米特和一些生物制剂。氨甲喋呤是一种叶酸类似物，其作用与免疫抑制和抗炎活性有关，但具有肝毒性。来氟米特是Aventis公司开发的一种治疗类风湿关节炎的药物，是一种免疫抑制剂，但在近年的临床用药中发现，该药也具有肝毒性，并且与出生缺陷有关。生物制剂主要是TNF-α拮抗药物，经临床治疗研究发现TNF-α拮抗药物对此类疾病有较好的疗效，并且具有较小的副作用。

目前，TNF-α拮抗药物有infliximab、etanercept、adalimumab、CDP571和CDP870。其中infliximab、etanercept和adalimumab药物已通过FDA批准。Enbrel，属名Etanercept，是美国Immunex和Wyeth-Ayerst Laboratories公司研制的基因重组sTNFR75与人IgGFc段的融合蛋白，可同时抑制TNF-α和TNF-β，1998年11月被FDA批准用于治疗青少年类风湿关节炎和腰肌炎，是第一个用于临床上的基因工程可溶性受体和抗TNF-α药物。Remicade，属名Infliximab，是Johnson&Johnson公司研制的一种对人TNF-α具有中和活性的人鼠嵌和抗体，该抗体可变区为小鼠蛋白，而恒定区则为人的蛋白序列，因此，其抗原性较小。Remicade可特异性结合可溶性及膜结合型TNF-α，从而抑制TNF-α引起的免疫及炎症反应，1999年11月该抗体被FDA批准用来治疗类风湿关节炎，后又被FDA批准用来治疗Crohn病，是第二个用于临床上的基因工程抗TNF-α药物。Adalimumab是Abbott公司研制的一种具有TNF-α特异中和活性的重组的完全的人IgG1单克隆抗体，比Remicade具有更小的抗原性，2002年12月被FDA批准用来治疗类风湿关节炎，很快又被FDA批准用来治疗Crohn病，成为第三个用于临床上的基因工程抗TNF-α药物。近年来，临床研究表明抗TNF-α在临床治疗类风湿关节炎取得了较好的疗效。2002年美国风湿病学会发布的类风湿性关节炎治疗最新指南指出，早期RA患者和使用DMARDS治疗无效的患者对etanercept有效。使用足量氨甲喋呤不能控制的进行性活动性的RA患者，etanercept和infliximab联合使用有效，目前推荐单独使用infliximab或与氨甲喋呤联合治疗。  Bang等]进行了对照实验，研究了Adalimumab对类风湿性关节炎的治疗效果，结果发现，Adalimumab和氨甲喋呤联合用药或单独使用Adalimumab比安慰剂和氨甲喋呤联合用药或采用标准的治疗类风湿性关节炎的方法有更高的ACR20、ACR50和ACR70，使用Adalimumab可以明显延缓关节损伤的进程，并且具有起效快、药效持续时间长、耐受性好的优点。

TNF-α拮抗药物治疗除了可用于类风湿性关节炎的治疗外，也可应用于其他TNF-α水平增高相关疾病的治疗，如，恶病质、克隆病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、自身免疫性皮肤病、移植抗宿主病、非感染性色素层炎和巩膜炎等炎症和自身免疫性疾病。

虽然，在临床上TNF-α单克隆抗体和可溶性受体具有较好的疗效，但是，这些药物存在有用药量大、需长期反复使用、易引起超敏反应的缺陷。除此之外，昂贵的药费也是阻碍此类药物广泛应用的原因。据统计，临床上每位接受Enbel治疗的病人平均年花费为1.5万美元，接受Humiral或Remicade治疗的病人平均年花费为9万美元，如此昂贵的药费即使在发达国家也是难以负担的。

2.治疗性疫苗

2.1研究进展

近年来，针对人类自身蛋白的单克隆抗体在治疗急、慢性疾病的过程中显示出了良好的效果。但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了单克隆抗体的广泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对人类自身蛋白的主动免疫疫苗，既用主动免疫的治疗方式替代被动免疫，成为蛋白药物的发展方向。目前，治疗性疫苗的研究已成为一个热点，涉及很多疾病，如：慢性病毒感染、过敏、肿瘤、阿尔海默茨病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。

治疗性疫苗使人的免疫系统发生有利于患者的反应。大部分的疫苗可以分为两大类：一类是诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体；另一类是诱导机体发生细胞免疫反应，产生细胞毒性T细胞(CTLs)。后一类治疗性疫苗主要用于肿瘤和病毒感染性疾病的治疗。

绝大多数的预防性疫苗都是通过诱导抗体的产生来保护机体的，这就证明通过诱导抗体来治疗感染性疾病是一种有效的治疗方法。与预防性疫苗相比，治疗性疫苗的发展就要缓慢的多，直到近几年治疗性疫苗才看到成功的希望。同时，单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功预示着能够在体内诱导抗体产生的治疗性疫苗有着广阔的发展前景。实际上，已经有动物试验表明诱导出一定水平的内源性特异性抗体来治疗疾病是可能的，如：阻断TNF-α以治疗炎症性疾病。

人源化的抗TNF-α单克隆抗体已经被证明在治疗类风湿性关节炎和Crohn’s病(节断性回肠炎)方面十分有效。目前已经有几种TNF-α的阻断剂上市，包括两种单克隆抗体(infliximab，adalimumab)和一种受体阻断剂(etanercept)，它们正在帮助成千上万的病人减轻痛苦，而且年收入达到20亿美元。所以阻断过量表达的TNF-α能够达到治疗疾病的效果。在动物试验中已经证实通过主动免疫可以特异性诱导出TNF-α的中和性抗体，而且诱导的抗体滴度足以治疗动物关节炎模型。

其他的动物试验表明，可以通过诱导体内产生高滴度抗体来治疗以下疾病：针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压；针对IL-9的疫苗可以治疗病原体引起的嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对N-methyl-D-aspartate receptor-1(NMDAR1)的疫苗可以治疗中风。另外，针对一些性激素如人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotro-pin HCG)的免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素(GnRH)的疫苗可以用于治疗晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。

那么，治疗性疫苗的研究中存在哪些问题呢？最近在针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗的研制过程所发生的情况似乎对这个问题做了回答。阿尔海默茨病是一种看起来非常适合用治疗性疫苗进行治疗的疾病，这种病的发病过程长达数年甚至数十年。如果能用治疗性疫苗诱导出持续时间较长的抗体的话，那么无疑是一种理想的治疗方法，尤其是这种病人经常忘记吃药。

阿尔海默茨病的特征是大脑中斑块的沉积，这种斑块中含有Aβ-肽，这种Aβ-肽是从淀粉样蛋白的前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)衍生来的。在编码APP的基因发生突变导致Aβ-肽的生成增加的人群中，阿尔海默茨病在早年就开始发生了。表达这种突变的APP的转基因小鼠大脑内有大量的斑块沉积，这种斑块与阿尔海默茨病病人脑中发现的斑块相似。用Aβ-肽加上强免疫佐剂来免疫这种转基因小鼠会使小鼠脑中的斑块减少，小鼠的精神表现明显好转。随后，一种针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗开始了临床试验，在临床I期试验证明其有良好的耐受性后，包括300多名病人的临床II期紧跟着开始了，但是没有想到的是6％的试验对象由于产生无菌性脑炎而被迫停止试验。随后研究证实，这种副作用与抗体的滴度没有关系，实际上，一名没有产生抗体反应的受试病人也得了无菌性脑炎。另外，在一名病人的大脑中发现有大量的淋巴细胞浸润。这些研究结果与一种假说相一致，那就是在病人中发现的副作用是由于Aβ-肽特异性的T淋巴细胞引起的，而不是由于抗体引起的。这就要求能够研制出不引起T淋巴细胞介导的自身免疫的第二代疫苗。那么，这种针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗的效果如何呢？在前面提到的临床II期试验中，在诱导出抗Aβ-肽抗体的病人中有一部分认知力的减弱确实推迟了，有一些病人甚至在接受治疗的这一年中意识状态有了好转。如果在疫苗设计时能够解决其安全性问题，那么在不久的将来，针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗就会出现。

另一类稍有不同的疫苗对安全性的要求更低一些，那就是针对上瘾药物的疫苗。在动物试验中针对可卡因和尼古丁的疫苗降低了这些药物在大脑中的水平，消除了它们的成瘾症状，试验动物在接受了免疫后对药物不再依赖。在临床I期试验中，可卡因疫苗被证明有良好的耐受性，并且可以诱导出良好的抗体反应，现在，人们正在翘首以待它的有效性结果。

2.2诱导自身抗体的理论研究

针对自身蛋白的治疗性疫苗是如何诱导自身免疫系统产生针对自身蛋白的抗体呢？要产生足够高的滴度的特异性抗体以治疗相关疾病，治疗性疫苗必须克服三个障碍：T细胞耐受、B细胞耐受、在没有佐剂和抗原长效制剂的情况下诱导出抗体。众所周知，人体免疫系统主要是对外来入侵者发动攻击的，而对机体本身是不攻击的，这可能是由于机体具有能够识别“非我”与“自我”的能力。免疫系统的这种特性通常被称为耐受或无反应性。耐受发生在B细胞和T细胞水平。一般来说，T细胞耐受更严格一些。对许多抗原来说，在发生T细胞耐受的同时，正常的B细胞株却在体内存在。实际上，有三种机制导致了免疫耐受：细胞株剔除，即特异性的淋巴细胞从淋巴细胞群中被彻底剔除；免疫无能，即特异性的淋巴细胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴细胞存在，但是由于没有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。对T细胞来说，诱导耐受和无能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但诱导耐受也可以在外周进行。B细胞耐受主要在骨髓中诱导，但也可在外周诱导。通常，对于普遍表达的丰富抗原的免疫耐受更容易阐明。

在针对外来抗原的免疫反应中，T细胞和B细胞互相配合才能有效地产生抗体：当受到外来抗原免疫时，特异性的B细胞结合抗原，产生起始的激活信号。另外，B细胞内吞抗原，在其表面呈现抗原肽和MHC II类分子的复合物。通常，B细胞不能激活TH细胞。要激活TH细胞，树突状细胞是必不可少的，树突状细胞摄取抗原，并在其细胞表面呈递抗原肽和MHC II类分子的复合物，激活TH细胞。激活后的TH细胞识别B细胞表面呈现的抗原肽和MHC II类分子的复合物，引起B细胞增殖、抗体的产生以及抗体类别的转换。如果因为免疫耐受而缺乏TH细胞的协同作用，那么就不会产生抗体。在针对自身蛋白的疫苗的设计过程中，如果将自身抗原与外源蛋白或多肽载体融合或偶联在一起，就有可能绕过TH细胞耐受：自身抗原特异性的B细胞就能够摄取该自身抗原以及与其相连的载体蛋白，并在其表面呈现载体肽与MHC II类分子的复合物，由于TH细胞对载体蛋白没有免疫耐受，所以能够被激活，从而协同自抗原特异性的B细胞产生针对自身抗原的特异性抗体。

与T细胞耐受相比，B细胞耐受要宽松得多。实际上，在许多情况下，自身特异性B细胞在体内以正常的频率出现，如果受到抗原和TH细胞的共同作用就会被激活。所以对许多可溶性自身蛋白来讲，体内存在其特异性B细胞株，尤其当这种蛋白不是非常富余表达的时候更是这样。对于这类蛋白或多肽，将其与载体蛋白相连，绕过T细胞耐受，就有可能产生有效的疫苗。实际上，利用这种策略，针对多种自身激素的抗体反应已经被诱导出来了。

3、TNF-α自体疫苗的研究进展

目前，TNF-α疫苗研究主要集中在筛选TNF-α抗原表位、融合蛋白疫苗和DNA疫苗几个方面。Sioud等用人TNF纯化类风湿关节炎病人的抗血清，得到具有TNF-α中和活性的TNF-α自身抗体，用此抗体筛选噬菌体随机九肽库，用筛选得到的噬菌体颗粒免疫小鼠，诱发了鼠抗人TNF-α抗体，研究表明重组噬菌体可作为疫苗研究的有效工具。Dalum等用T辅助细胞表位和TNF-α融合表达的蛋白免疫二型胶原诱导的关节炎小鼠模型，结果小鼠的症状得到了缓解，为类风湿关节炎和慢性感染疾病的治疗开辟了一条新途径。Blank等用编码TNF-α的DNA免疫抗磷脂综合症的小鼠，在小鼠体内诱发了抗TNF-α抗体，这些抗体可以阻滞TNF-α引起的内皮细胞活性，抑制了单核细胞对活化的内皮细胞的黏附，与对照组相比可以明显的改善抗磷脂综合症小鼠的症状。Waterston等比较了TNF-α单克隆抗体和TNF-α自体疫苗在治疗肿瘤转移的效果，结果表明两者在小鼠体内都可成功的减少肺肿瘤的转移。近来Waterston等通过一期临床试验评估了TNF-α自体疫苗的免疫原性和安全性，不幸的是尽管疫苗诱发的血清抗体可以识别变性的人TNF-α分子，但是却不能中和天然状态的人TNF-α分子，分析原因可能是因为抗原的纯化过程中是抗原变性的原因。

以上研究表明，虽然TNF-α自体疫苗也是一种治疗TNF-α表达过高相关疾病的好方法，但是，筛选有效的T细胞辅助表位，适合的表位插入位置以及适合纯化方法都成为TNF-α自体疫苗研究的关键性问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种筛选出一种人TNF-α自体疫苗分子，使之在体内诱导出针对人TNF-α分子的特异性抗体的治疗性疫苗，为TNF-α表达过高的相关疾病提供一种新的治疗药物。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

首先对小鼠TNF-α基因系列截短，将其克隆入pGEX-4T-1原核表达载体，转化大肠杆菌。在大肠杆菌中获得高效表达，菌体蛋白走SDS-PAGE后，切胶免疫小鼠，通过对诱导的抗体滴度的分析结合计算机辅助设计确定T辅助表位的插入位置为小鼠TNF126位至140位氨基酸序列，相应人TNF127位至141位氨基酸。

利用人工合成的方法用编码TT830-844(QYIKANSKFIGITEL)、HEL46-61(NTDGSTDYGILQINSR)和PADRE(AKFVAAWTLKA)氨基酸的基因序列替换编码小鼠TNF-α126位至140位氨基酸序列的核酸，从而获得mTNF-TT，mTNF-HEL，mTNF-PADRE基因片段，将其插入pBV220原核表达载体，转化大肠杆菌。在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到mTNF-TT，mTNF-HEL，mTNF-PADRE蛋白。

本发明构建出的三种TNF-α融合蛋白疫苗，用该蛋白进行免疫后，在小鼠体内可产生高滴度的抗mTNF-α自身抗体，并且该抗体的血清能够在体外中和mTNF-α对L929细胞的杀伤作用。比较这三种分子诱导针对mTNF-α自身抗体的滴度，筛选出mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。用mTNF-PADRE重组蛋白免疫小鼠可以减轻mTNF-α诱导的恶病质小鼠，LPS诱导的急性肺损伤小鼠的以及二型胶原诱导的类风湿性关节炎的症状。

将构建好的pBV220-mTNF-TT，pBV220-mTNF-HEL，pBV220-mTNF-PADRE质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中获得高效表达。

表达产物经裂菌、溶解包涵体、凝胶柱纯化，蛋白纯度可达95％以上。纯化后的mTNF-TT，mTNF-HEL，mTNF-PADRE蛋白在体外能够与小鼠TNF-α多克隆抗体结合，并且失去了小鼠TNF-α的生物活性。用纯化的mTNF-TT，mTNF-HEL，mTNF-PADRE蛋白免疫小鼠，比较抗血清，mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。在小鼠体内经mTNF-PADRE蛋白免疫后，能够减轻mTNF-α诱导的恶病质小鼠，LPS诱导的急性肺损伤小鼠的以及二型胶原诱导的类风湿性关节炎的症状。

本发明中的mTNF-TT，mTNF-HEL，mTNF-PADRE蛋白的制备方是：人工合成mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE基因片段，将该片段插入pBV220载体中构建mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE蛋白基因；含有目的基因mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE的原核表达载体的构建及重组蛋白表达；表达产物的鉴定；重组蛋白的纯化；mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE蛋白免疫小鼠后产生的抗血清与小鼠TNF-α的结合作用；该抗血清在体外可以中和小鼠TNF-α对L929细胞的杀伤；比较这三种分子诱导针对mTNF-α自身抗体的滴度，筛选出mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。

本发明筛选的重组小鼠mTNF-PADRE蛋白，通过免疫小鼠可以突破小鼠的免疫限制，产生高滴度抗小鼠TNF-α自身抗体，其对应的重组人TNF-PADRE融合蛋白从而有可能在人体内产生抗人TNF-α自身抗体，为TNF-α表达过高的相关疾病的免疫治疗提供一种新的蛋白质药物。

该自体疫苗的应用目的在于以TNF-α为靶点筛选获得一种能够促使体内产生针对TNF-α分子的中和抗体的自体疫苗，从而研究应用主动免疫的方法进行TNF-α表达过高的相关疾病的免疫治疗。进而减少单抗副作用，减轻病患负担。

附图说明

图1是GST融合小鼠TNFα系列截短体表达质粒酶切鉴定结果，图中的标号为：1、DL2000，2、pGEX-4T-1-mTNFα1-39 EcoR I和Sal I酶切鉴定结果，3、pGEX-4T-1-mTNFα1-67EcoR I和Sal I酶切鉴定结果，4、pGEX-4T-1-mTNFα1-122 EcoR I和Sal I酶切鉴定结果，5、pGEX-4T-1-mTNFα1-149 EcoR I和Sal I酶切鉴定结果，6、pGEX-4T-1-mTNFαEcoR I和Sal I酶切鉴定结果，7、pGEX4T-1 EcoR I和Sal I酶切结果。

图2是GST融合小鼠TNFα系列截短体IPTG诱导表达结果图中的标号为：1、蛋白分子量标准，2、pGEX-4T-1-mTNFα/DH5αIPTG诱导，3、pGEX-4T-1-mTNFα1-149/DH5αIPTG诱导，4、pGEX-4T-1-mTNFα1-122/DH5αIPTG诱导，5、pGEX-4T-1-mTNFα1-67/DH5αIPTG诱导，6、pGEX-4T-1-mTNFα1-39/DH5αIPTG诱导，7、pGEX-4T-1-mTNFα/DH5α未诱导。

图3是GST融合小鼠TNFα系列截短体的Western Blot鉴定结果；图中的标号为：1、蛋白分子量标准，2、pGEX-4T-1-mTNFα/DH5αIPTG诱导，3、pGEX-4T-1-mTNFα1-149/DH5αIPTG诱导，4、pGEX-4T-1-mTNFα1-122/DH5αIPTG诱导，5、pGEX-4T-1-mTNFα1-67/DH5αIPTG诱导，6、pGEX-4T-1-mTNFα1-39/DH5αIPTG诱导，7、pGEX-4T-1-mTNFα/DH5α未诱导。

图4是mTNFα及GST融合小鼠TNFα系列截短体的切胶定量，图中的标号为，1、蛋白分子量标准，2、GST-mTNFα，3、GST-mTNFα1-149，4、GST-mTNFα1-122，5、GST-mTNFα1-67，6、GST-mTNFα1-39，7、mTNFα。

图5是mTNFα及GST融合小鼠TNFα系列截短体免疫抗血清的鉴定。

图6是小鼠和人TNF-α抗原表位预测结果。其中(A)是小鼠TNF-α抗原表位预测结果，(B)是人TNF-α抗原表位预测结果；

图7是pBV220-mTNF-TT、pBV220-mTNF-HEL、pBV220-mTNF-PADRE表达载体质粒酶切图。A pBV220-TNF-TT酶切鉴定结果：1、DL2000，2、pBV220-mTNF-TT EcoRI和Pst I酶切结果，3、pBV220 EcoRI和Pst I酶切结果；B pBV220-mTNF-HEL和pBV220-mTNF-PADRE酶切鉴定结果：1、DL2000，2、pBV220-mTNF-HEL EcoRI和Sal I酶切鉴定结果，3、pBV220-mTNF-PADREEcoR I和Sal I酶切鉴定结果，4、pBV220 EcoR I和Sal I酶切结果。

图8是pBV220-mTNF-TT/DH5α，pBV220-mTNF-HEL/DH5α和pBV220-mTNF-PADRE/DH5α诱导表达结果。图中的的标号为1、蛋白分子量标准，2、pBV220-mTNF-TT/DH5α未诱导，3、pBV220-mTNF-TT/DH5α诱导，4、pBV220-mTNF-HEL/DH5α诱导，5、pBV220-mTNF-PADRE/DH5α诱导。

图9是mTNF-TT、mTNF-HEL、mTNF-PADRE的纯化结果，图中的标号为：A1mTNF-TT过凝胶柱层析图。B1 mTNF-TT过凝胶柱SDS-PAGE结果：1、蛋白分子量标准，2、上柱前，3、峰1，4、峰2(目的蛋白峰)，5、mTNF-TT复性后；A2 mTNF-HEL过凝胶柱层析图。B2 mTNF-HEL过凝胶柱SDS-PAGE结果：1、蛋白分子量标准，2、上柱前，3、峰1，4、峰2，5、峰3(目的蛋白峰)，6、mTNF-HEL复性后；A3 mTNF-PADRE过凝胶柱层析图。 B3 mTNF-PADRE过凝胶柱SDS-PAGE结果：1、蛋白分子量标准，2、上柱前，3、峰1，4、峰2(目的蛋白峰)，5、mTNF-PADRE复性后。^*为目的蛋白峰。

图10是mTNF-TT、mTNF-HEL、mTNF-PADRE、mTNF纯化蛋白的Western-blot鉴定，其中，1、蛋白分子量标准，2、pBV220-mTNF-TT/DH5α未诱导，3、mTNF-TT纯化蛋白，4、mTNF-HEL纯化蛋白，5、mTNF-PADRE纯化蛋白，6、mTNF纯化蛋白。

图11是mTNF-TT、mTNF-HEL、mTNF-PADRE的生物活性鉴定；

图12是mTNF-TT、mTNF-HEL和mTNF-PADRE诱导的抗血清比较，A结合活性比较：在1000倍和10,000倍稀释时，mTNF-PADRE组P＜0.05vs.mTNF-TT组，P＜0.01vs.mTNF-HEL组；B中和活性比较：在2倍和4倍稀释时，mTNF-PADRE组p＜0.05vs.mTNF-TT组，p＜0.01vs.mTNF-HEL组。

图13是mTNF-PADRE自体疫苗分子对恶病质小鼠疾病模型的治疗，其中，A、体重比较：^*P＜0.05，^**P＜0.02，^***P＜0.01；B、生存率比较：mTNF-PADRE组P＜0.05vs生理盐水组。

图14是mTNF-PADRE自体疫苗分子对内毒素休克小鼠疾病模型的生存期的影响，其中，生存率比较：mTNF-PADRE组P＜0.05vs生理盐水组，mTNF-PADRE plus with adiuvant组P＞0.05vs生理盐水组。

图15是mTNF-PADRE自体疫苗分子对二型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠发病率和小鼠发病肢数影响，其中，A。二型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠发病率，B、二型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠小鼠发病肢数；

图16是mTNF-PADRE对CIA小鼠关节炎后足足厚的影响(^*P＜0.05)。

图17是mTNF-PADRE自体疫苗分子对二型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠关节评分的影响。

图18是小鼠膝关节和踝关节病理检测。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

具体实施方式

依照本发明的技术方案制备的人TNF治疗性自体疫苗，首先筛选TNF分子的外源T辅助表位插入位置，利用小鼠TNF-α系列截短体构建与GST融合表达的系列融合蛋白，切胶免疫小鼠，通过对诱导的抗体滴度的分析结合计算机辅助设计确定T辅助表位的插入位置为小鼠TNF126位至140位氨基酸，相应人TNF的127-141位氨基酸；然后筛选适合的外源T辅助表位，用编码TT830-844(QYIKANSKFIGITEL)，HEL46-61(NTDGSTDYGILQINSR)和PADRE(AKFVAAWTLKA)氨基酸的核酸序列替换小鼠TNF-α126位至140位氨基酸的核酸序列，从而获得mTNF-TT、mTNF-HEL、mTNF-PADRE融合蛋白，纯化后免疫小鼠，比较这三种分子诱导针对mTNF-α自身抗体的滴度和体外中和mTNF-α活性的能力，筛选出mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。用mTNF-PADRE重组蛋白免疫小鼠不仅可以减少mTNF-α诱导的恶病质小鼠体重的减轻，同时还可以延长mTNF-α诱导的恶病质小鼠的生存期；延长LPS诱导的急性肺损伤小鼠的生存期；减轻二型胶原诱导的类风湿性关节炎的症状。其对应的重组人TNF-PADRE融合蛋白从而有可能在人体内产生抗人TNF-α自身抗体，为TNF-α表达过高的相关疾病的免疫治疗提供一种新的蛋白质药物。

实现本发明疫苗的筛选，疫苗构建和纯化，免疫动物，抗体检定以及动物实验工作，按以下步骤完成：

1.疫苗的制备和筛选

1.1疫苗表位插入位置的筛选

1.1.1 GST-mTNF系列截短体表达载体的构建：

依照小鼠TNF-α的氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子设计小鼠TNF-α的基因序列，交上海生工生物技术有限公司全基因合成，合成的基因克隆入pUC57中构建含有小鼠TNF-α的克隆载体pUC57-mTNF-α。设计引物对克隆载体pUC57-mTNF-α进行PCR获得上游含有EcoR1酶切位点，下游含有Sal1酶切位点和终止密码子的小鼠TNF-α的全长基因和系列小鼠TNF-α截短体基因，截短从小鼠TNF-α的C端开始，截短位置为149位，122位，67位和39位氨基酸，克隆入载体pGEX-4T-1中。构建pGEX-4T-1-mTNF-α，pGEX-4T-1-mTNF-α149，pGEX-4T-1-mTNF-α122，pGEX-4T-1-mTNF-α67和pGEX-4T-1-mTNF-α39融合蛋白表达载体。构建的质粒载体分别转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段(图1)，进行测序。工程菌命名为pGEX-4T-1-mTNF-α/DH5α，pGEX-4T-1-mTNF-α149/DH5α，pGEX-4T-1-mTNF-α122/DH5α，pGEX-4T-1-mTNF-α67/DH5α和pGEX-4T-1-mTNF-α39/DH5α。

全长小鼠TNF-α的基因序列为：

CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAG

CAGCTGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGG

TGCCAGCCGATGGCTTGTACCTTGTGTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGTCAAGGCTGCCCAGACTACGTGCTCCT

CACCCACACCGTCAGCCGCTTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTGAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCTTGC

CCTAAGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGG

AGAAGGGTGACCAACTCAGCGCTGAGGTCAATCTGCCGAAGTACTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTACTT

TGGCGTTATTGCTCTG

1.1.2重组蛋白表达

挑取工程菌单菌落接种于5mLLB培养液(含Amp100mg/L)中，37℃摇床培养过夜，次日以1∶100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在37℃摇床培养3h至对数生长中期(OD₆₀₀为0.4～0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4h。离心收集菌体。

1.1.3表达产物的鉴定

1.1.3.1SDS-PAGE鉴定

取少许菌体蛋白加入30μL水和30μL 2×载样缓冲液，混匀。沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取10μL上清加样于15％分离胶6％浓缩胶，电压160V约1h，用0.5％考马斯亮兰R-250振荡染色2-3h，脱色直至背景清晰后制备干胶保存(图2)。

1.1.3.2免疫印迹反应

SDS-PAGE结束后，按Bio-Rad产品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜(NC膜)靠近阳极一侧，置转移缓冲液中(25mmol/L Tris、192mmol/L Glycine、20％甲醇)，100V恒压1h，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含0.02mol/L pH7.4 TBS、0.4％Tween20)室温洗3次，浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中37℃，1h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加入羊抗小鼠TNF-α多克隆抗体，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入兔抗羊IgG-AP二抗，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸馏水冲洗终止反应(图3)。

1.1.4融合蛋白抗原的制备

用已知量的人血清白蛋白作为对照，走SDS-PAGE对以上系列融合蛋白进行定量分析(图4)，对目的蛋白条带进行切胶，充分研磨后，稀释至相同浓度免疫BALB/C小鼠。

1.1.5动物免疫

1.1.5.1 BALB/C小鼠分组与免疫方案

分组：将35只雄性BALB/C小鼠分成7组，分别为GST切胶对照组，天然mTNF组，GST-mTNF组，GST-mTNF149组，GST-mTNF122组，GST-mTNF67组，GST-mTNF39组。在第4次免疫后10天摘眼球采血，测定血清中抗mTNF抗体效价。

免疫方案：背部皮下多点注射；融合蛋白30μg/只；溶液总体积为200μL/只，分别隔周注射。

1.1.5.2抗血清ELISA鉴定

在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗mTNF抗体效价。ELISA实验方法如下：

所需溶液的配制：

a.包被缓冲液：碳酸盐缓冲液取Na₂CO₃：0.32g(终浓度0.015mol/L)，NaHCO₃：0.59g(终浓度0.035mol/L)，纯水定容至200mL(pH9.6)，有效期：两周。

b.洗涤液：含0.5％Tween-20的PBS(pH7.4)。

c.封闭液：含1％BSA的洗涤液。

d.稀释液：含0.5％BSA的洗涤液。

e.底物缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O：1.84g，柠檬酸：0.51g纯水定容至100mL(pH5.0)。

f.底物显色液：OPD：8mg，3％H₂O₂：30μL。

h.终止液：H₂SO₄：1mol/L。

操作方法：

包被：取96孔ELISA板，小鼠TNF-a蛋白溶解于包被缓释液中(0.5μg/mL)，按100μL/孔加入孔板中。4℃包被过夜。

然后倒掉包被缓释液加入封闭液，室温封闭2h；

弃去封闭液，用洗涤液洗6次，每次2min；

分别加入倍比稀释的小鼠人抗B7-H1单抗(500μg/mL)和抗血清，100μL/孔，室温孵育1h；

弃去单抗和抗血清，用洗涤液洗6次，每次3min；

加入底物显色液，100μL/孔，室温，显色10min-20min；

加入终止液，50μL/孔，终止反应；

酶标仪读数，测定每孔在490nm的吸光值。

实验结果如图5所示，随着小鼠TNF-α从C端的逐步截短，诱发的抗血清对小鼠TNF-α的抗体滴度逐步增加，截短至67位截短体时抗体滴度为最高，继续截短抗体滴度下降，说明TNF-α的N端有诱导自身抗体的重要表位。

1.1.6计算机辅助设计预测TNF-α抗原表位

用Kolaskar和Tongaonkar方法对小鼠和人TNF-α的抗原表位进行预测，结果如图6所示，人和小鼠的TNF-α在10-21，32-38，111-125，146-153氨基酸序列处具有共同的抗原表位。

1.1.7疫苗表位插入位置的选择

结合以上实验结果，为了插入的外源T辅助表位不破坏TNF-α本身的抗原表位，我们选择小鼠TNF-α126-140位氨基酸为外源表位插入位置，经同源比对对应人TNF-α的外源T辅助表位插入位置为人TNF-α127-141位氨基酸。

1.2插入的抗原表位的筛选

1.2.1小鼠TNF-TT，TNF-HEL和TNF-PADRE的构建

用编码TT，HEL，PADRE氨基酸的基因分别替换编码小鼠TNF-α126-140位氨基酸的基因，从EcoR I和Sal酶切位点克隆入pBV220表达载体，构建了pBV220-mTNF-TT，pBV220-mTNF-HEL和pBV220-mTNF-PADRE表达载体，序列中EcoR I至BglII酶切位点为小鼠TNF 1-125位氨基酸的基因序列，Bgl II至Nde I酶切位点为TT，HEL或PADRE氨基酸的基因序列，Nde I至Sal I酶切位点为小鼠TNF-α140-156氨基酸的基因序列，Bgl II和Nde I酶切位点用于克隆时表位的置换。构建的质粒载体分别转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段(图7)，进行测序。工程菌命名为pBV220-mTNF-TT/DH5α，pBV220-mTNF-HEL/DH5α和pBV220-mTNF-PADRE/DH5α。

全长小鼠TNF-TT的基因序列(划线部分为TT表位的核酸序列，加粗部分分别为BglII和Nde I酶切位点)

CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGC

TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGGTGCC

AGCCGATGGCTTGTACCTTGTGTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGTCAAGGCTGCCCAGACTACGTGCTCCTCACC

CACACCGTCAGCCGCTTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTGAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCTTGCCCTA

AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC

TCAGTACATCAAAGCTAACTCCAAATTCATCGGTATCACTGAACTTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAG

GTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG

全长小鼠TNF-HEL的基因序列为(划线部分为HEL表位的核酸序列，加粗部分分别为Bgl II和Nde I酶切位点)

CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGC

TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGGTGCC

AGCCGATGGCTTGTACCTTGTGTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGTCAAGGCTGCCCAGACTACGTGCTCCTCACC

CACACCGTCAGCCGCTTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTGAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCTTGCCCTA

AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC

TAACACTGACGGTTCCACCGATTACGGCATTCTGCAGATCAACTCCCGCCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGT

CAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG

全长小鼠TNF-PADRE的基因序列为(划线部分为PADRE表位的核酸序列，加粗部分分别为Bgl II和Nde I酶切位点)

CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGC

TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGGTGCC

AGCCGATGGCTTGTACCTTGTGTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGTCAAGGCTGCCCAGACTACGTGCTCCTCACC

CACACCGTCAGCCGCTTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTGAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCTTGCCCTA

AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC

TGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTAC

TTTGGCGTTATTGCTCTG

1.2.2重组蛋白表达

挑取工程菌单菌落接种于5mLLB培养液(含Amp100mg/L)中，30℃摇床培养过夜，次日以1∶100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在30℃摇床培养3h至对数生长中期(OD₆₀₀为0.4～0.6)，42℃升温诱导培养4h。离心收集菌体。SDS-PAGE检测表达结果(图8)，在预期位置由新生条带产生。

1.2.3重组蛋白的纯化

10克菌体蛋白悬浮于100ml裂菌缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl)。在冰浴中超声15min(工作5sec，间隔10sec，功率300w)，12,000rpm离心30min收集沉淀。收集的裂菌沉淀用100ml饱含体洗涤液(4M Urea，1％Triton X-100，5mM EDTA，5mMβ-mercaptoethanol，50mM Tris-HCl pH8.5)洗涤两次，每次洗涤30min，12,000rpm离心30min收集沉淀。

洗涤后的沉淀用包涵体溶解液(20mMβ-mercaptoethanol，7M guanidinehydrochloride)溶解过夜，12,000rpm离心30min收集上清。1ml的TNF-TT包涵体溶解上清以0.3ml/min的流速过Sephacryl-100层析柱(2.4×70cm)，TNF-PADRE和TNF-HEL包涵体溶解上清以0.5ml/min的流速过Sephacryl-300层析柱(2.4×100cm)，流动相均为50mM Tris-HCl，pH8.5，8M urea，100mM NaCl。收集目的峰，对复性液(10mMTris-HCl，pH8.5，1/1000(v/v)β-mercaptoethanol，1/105(v/v)0.5M CuSO4)透析8hor复性，之后对双蒸水透析过夜。Lowry法测定蛋白浓度。纯化结果如图9所示。

1.2.4重组蛋白的鉴定

1.2.4.1免疫原性及纯度的鉴定：

纯化的蛋白样品经15％SDS-PAGE，然后从凝胶电转移至硝酸纤维膜，BSA封闭后，用一抗(山羊抗小鼠TNF多克隆抗体)结合1hor，二抗(兔抗山羊IgG-AP)结合30min，最后用AP底物室温避光显色5min，蒸馏水冲洗终止反应。结果显示mTNF-TT，mTNF-HEL，mTNF-PADRE可以特异的和山羊抗小鼠TNF多克隆抗体结合(图10)。

纯化得到的TNF-TT、TNF-HEL、TNF-PADRE进行纯度鉴定。色谱柱为排阻色谱柱(7.5mm×300mm G2000SW column(TOSOH))，流动相液为PBS，流速为0.5ml/min，检测波长为280nm。结果如图所示，纯度均大于95％。

1.2.4.2细胞毒性试验：将生长状态良好的小鼠L929细胞调至106/ml的细胞悬液，96孔培养板中每孔加入100μl细胞悬液，50ml/l CO2、37℃培养过夜，弃上清，每孔加入系列稀释的复性后的TNF-TT，5％CO2、37℃培养16h，弃上清，每孔加入30μL的浓度为500μg/mL结晶紫染色3-5分钟，用流水小心冲去结晶紫，摔干残余水分，每孔加入脱色液100μL，酶标仪570nm处测定吸光值。小鼠的TNF作为阳性对照，纯化的GST蛋白作为阴性对照。结果显示TNF-TT、TNF-HEL、TNF-PADRE均无TNF的细胞毒性(图11)。

1.2.4动物免疫

1.2.4.1 BALB/C小鼠分组与免疫方案

分组：将25只雄性BALB/C小鼠分成5组，分别为佐剂组，小鼠TNF组，小鼠TNF-TT组，小鼠TNF-HEL组和小鼠TNF-PADRE组。在第4次免疫后10天摘眼球采血，测定血清中mTNF抗体效价。免疫方案：背部皮下多点注射；30μg抗原/只；第1次使用完全佐剂，第2、3次和第4次使用不完全佐剂，佐剂溶液总体积为200μL/只，分别隔周注射。

1.2.4.2抗血清ELISA鉴定

在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗mTNF抗体效价。ELISA实验方法如1.1.5.2所示。

实验结果如图12所示，小鼠TNF-PADRE可以诱发最高的抗小鼠TNF抗体。与对照组，小鼠TNF组，小鼠TNF-TT组，小鼠TNF-HEL组比较p＜0.01。

1.2.4.3抗血清中和活性鉴定

在第4次免疫后10天采血获得的抗血清，通过对天然小鼠TNF对L929细胞杀伤的阻断实验测定比较抗血清的中和活性。

所需溶液的配制：a.完全培养基1：10％FCS-DMEM培养液。b.完全培养基2：3％FCS-DMEM培养液。c.0.05％的结晶紫溶液：50mg结晶紫用20ml无水乙醇溶解后，加水定容至100ml，室温保存。d.脱色液：50ml水加入50ml无水乙醇和0.1ml乙酸混匀即可。

操作方法：

1.用完全培养基1将小鼠L929细胞调至1×10⁵/ml，100μl/孔加入96孔细胞培养板，5％C₂O、37℃培养过夜。

2.用完全培养基2系列稀释抗血清，1∶1与20U/ml的小鼠TNF混合，5％ C₂O、37℃孵育2h。

3.弃去96孔板中细胞培养上清，100μl/孔加入孵育后的抗血清和小鼠TNF混合液，5％C₂O、37℃继续孵育16h。

4.弃去96孔板细胞培养上清，30μl/孔加入0.05％结晶紫染色3-5分钟，流水小心冲去结晶紫，甩干培养孔残余水份，100μl/孔加入脱色液，酶标仪570nm测定光密度值。

实验结果如图12所示，小鼠TNF-PADRE诱发最高的抗小鼠TNF中和抗体，与对照组、小鼠TNF组，小鼠TNF-TT组和小鼠TNF-HEL组比较p＜0.01。

抗血清鉴定表明PADRE具有最好的辅助TNF诱导自身抗体的能力。筛选出TNF-PADRE为TNF自体疫苗的候选分子。

2、TNF-PADRE对小鼠TNF诱导的恶病质模型的治疗

2.1分组并免疫小鼠

BALB/c小鼠，雄性，共30只，体重18-20克，按体重随机分两组，每10只一组，组间体重统计学无差异。A组：TNF-PADRE组，抗原溶解于生理盐水中，50μg/只，200。B组：生理盐水组。免疫方案：前三次背部皮下多点免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液体积为200μl/只，分别隔周注射。

2.2模型的诱导

免疫的小鼠按体重每组各取5只，体重27-28克，组间体重无统计学差异，每天腹腔注射小鼠TNF 1×10⁵IU/只，每天称量小鼠体重。

免疫的小鼠按体重每组各取10只，体重27-30克，组间体重无统计学差异，每天腹腔注射小鼠TNF 2×10⁵IU/只，统计小鼠的生存期。

实验结果如图13所示，与对照相比TNF-PADRE可以减轻TNF诱导的恶病质小鼠模型的症状。

3、TNF-PADRE对LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型的治疗

3.1分组并免疫小鼠

BALB/c小鼠，雄性，共20只，体重18-20克，按体重随机分两组，每10只一组，组间体重统计学无差异。A组：TNF-PADRE组，抗原溶解于生理盐水中，50μg/只，200。B组：生理盐水组。免疫方案：前三次背部皮下多点免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液体积为200μl/只，分别隔周注射。

3.2模型的诱导

免疫的小鼠按体重每组各取10只，体重组间体重无统计学差异，腹腔注射LPS600μg/只，统计小鼠的生存期。

实验结果如图14所示，与对照相比TNF-PADRE可以延长LPS诱导的恶病质小鼠模型的症状。

4 TNF-PADRE对二型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型的治疗

4.1诱导剂的制备：

将II型胶原溶于0.1M醋酸制成4mg/mL的溶液，与等体积的完全弗氏佐剂(弗氏不完全佐剂加入终浓度2mg/mL的卡介苗)混合后以注射器反复推吸乳化，配制成II型胶原终浓度为2mg/mL的乳剂。

4.2动物的免疫：

从上海斯莱克动物中心购买5周龄的DBA-1近交系小鼠21只，随机分为三组，第一组4只，免疫方法为皮下多点免疫，免疫剂量为100μL生理盐水/只，隔周免疫一次，共免疫四次。第二组8只，免疫方法与第一组相同。第三组9只免疫方法为皮下多点免疫mTNF-PADRE，免疫剂量为50ug/只，隔周免疫一次，共免疫四次。

4.3模型的诱导和治疗：

免疫后10天，第一组小鼠每只尾根部皮内注射100μL生理盐水；第二组和第三组小鼠每只尾根部皮内注射100μL诱导剂。诱导21天后第一组小鼠每只尾根部皮内再次注射50μL生理盐水；第二组和第三组小鼠每只尾根部皮内再次注射50μL相同的诱导剂。

小鼠发病率和发病肢数统计：第二次诱导后次日即开始统计II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的发病率和平均每只小鼠的发病肢体数。结果如图15所示，与对照相比TNF-PADRE可以降低II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的发病率和平均每只小鼠的发病肢体数。

小鼠后足足厚的测量：第二次诱导后次日即开始测量后足的足厚，测量工具为螺旋测微器。双尾T检验检验组间差异。结果如图16所示，与对照相比TNF-PADRE可以降低II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的小鼠后足足厚。

小鼠关节炎病变评分标准：第二次诱导后次日即开始开始观察前后足肿胀程度并评分，以每只鼠前后关节病变评分为急性关节炎分数。关节炎指数(arthritis index，AI)评分标准如下：0分-无红肿；1分-关节稍肿；2分-关节轻度红、肿、热；3分-关节中度红、肿、热，轻度功能障碍；4分-关节重度红、肿、热，严重功能障碍，无法负重，晚期畸形。累积4个踝关节的得分即为每只小鼠的关节评分。双尾T检验检验组间差异。结果如图17所示，与对照相比TNF-PADRE可以降低II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的小鼠关节炎病变评分。

小鼠膝关节和踝关节病理检测：小鼠膝关节和踝关节以10％福尔马林溶液固定72h，脱钙液(8％甲酸溶液和8％盐酸溶液等量混匀)脱钙10天，每日换液，待骨软化后以流水冲洗36h，再经蒸馏水冲洗，石蜡包埋后切成5μm厚的切片，苏木精-伊红(HE)染色。加拿大树胶封片。光镜下观察关节腔的病理改变，每组样品选两张典型的切片与显微镜下观察并照相。其他切片密封后4C保存。结果如图18所示，与对照相比TNF-PADRE可以降低II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎关节的病变程度。

5.本发明的效果：

经实验证实本发明的效果如下：

(1)筛选并构建了TNF-PADRE融合蛋白疫苗。

(2)该疫苗保持了TNF的免疫原性，去除了TNF的生物活性。

(3)通过动物实验证实该融合蛋白能够在小鼠体内诱导出高滴度中和抗体。

(4)初步证明了该蛋白作为肿瘤疫苗可在一定程度上可以减轻TNF诱导的恶病质小鼠模型的症状，延长LPS诱导的急性肺损伤小鼠的生存期，减轻二型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠的症状。

pBV220-mTNF-TT/DH5α，pBV220-mTNF-HEL/DH5α和pBV220-mTNF-PADRE/DH5α

基因序列

全长小鼠TNF-TT的基因序列：其中划线部分为TT表位的核酸序列，加粗部分分别为Bgl II和Nde I酶切位点：

CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGC

TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGGTGCC

AGCCGATGGCTTGTACCTTGTGTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGTCAAGGCTGCCCAGACTACGTGCTCCTCACC

CACACCGTCAGCCGCTTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTGAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCTTGCCCTA

AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC

TCAGTACATCAAAGCTAACTCCAAATTCATCGGTATCACTGAACTTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAG

GTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG

全长小鼠TNF-HEL的基因序列：其中划线部分为HEL表位的核酸序列，加粗部分分别为Bgl II和Nde I酶切位点：

CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGC

TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGGTGCC

AGCCGATGGCTTGTACCTTGTGTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGTCAAGGCTGCCCAGACTACGTGCTCCTCACC

CACACCGTCAGCCGCTTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTGAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCTTGCCCTA

AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC

TAACACTGACGGTTCCACCGATTACGGCATTCTGCAGATCAACTCCCGCCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGT

CAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG

全长小鼠TNF-PADRE的基因序列：其中，划线部分为PADRE表位的核酸序列，加粗部分分别为Bgl II和Nde I酶切位点：

CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGC

TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGGTGCC

AGCCGATGGCTTGTACCTTGTGTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGTCAAGGCTGCCCAGACTACGTGCTCCTCACC

CACACCGTCAGCCGCTTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTGAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCTTGCCCTA

AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC

TGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTAC

TTTGGCGTTATTGCTCTG

Claims (2)

1.一种体内诱导出针对TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法，其特征在于，该方法采用人工合成mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE基因片段，将该片段插入pBV220载体中构建mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE蛋白基因；含有目的基因mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE的原核表达载体的构建及重组蛋白表达，经表达产物的鉴定、重组蛋白的纯化，将mTNF-TT830-844、mTNF-HEL46-61、mTNF-PADRE蛋白免疫小鼠后产生的抗血清与小鼠TNF-α的结合作用，该抗血清在体外可以中和小鼠TNF-α对L929细胞的杀伤；比较这三种分子诱导针对mTNF-α自身抗体的滴度，筛选出mTNF-PADRE蛋白；将筛选的mTNF-PADRE蛋白，通过免疫小鼠可突破小鼠的免疫限制，产生高滴度抗小鼠TNF-α自身抗体，其对应的重组人TNF-PADRE融合蛋白能在人体内产生抗人TNF-α自身抗体，即可得到TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按以下步骤完成：

(1)TNF-PADRE基因的克隆及原核表达载体的构建

根据大肠杆菌偏爱密码子、人和小鼠TNF氨基酸序列以及PADRE氨基酸序列，设计TNF-PADRE基因序列，其中小鼠TNF-PADRE的基因序列用PADRE的编码序列取代小鼠TNF126-140位氨基酸的编码序列，对应人TNF-PADRE的基因序列用PADRE的编码序列取代人TNF127-141位氨基酸的编码序列；设计小鼠TNF-PADRE的基因序列，上游引入Ecol1酶切位点，下游引入SalI酶切位点，并克隆入载体pBV220中；

将上述载体转化大肠杆菌DH5α，测序正确的质粒命名为pBV220-mTNF-PADRE，工程菌命名为pBV220-mTNF-PADRE/DH5α；其基因序列为：

CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGC

TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGGTGCC

AGCCGATGGCTTGTACCTTGTGTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGTCAAGGCTGCCCAGACTACGTGCTCCTCACC

CACACCGTCAGCCGCTTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTGAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCTTGCCCTA

AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC

TGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTAC

TTTGGCGTTATTGCTCTG；

(2)重组蛋白表达

挑取工程菌单菌落接种于5mL LB培养液中，所述的LB培养液含Amp100mg/L，30℃摇床培养过夜，次日以1∶100的比例再次转接到LB培养液中，在30℃摇床培养3h，至对数生长中期OD₆₀₀为0.4～0.6，42℃升温诱导，继续培养4h，离心收集菌体；

(3)表达产物的鉴定

①SDS-PAGE

取30μL裂菌上清，加入30μL 2×载样缓冲液，混匀；另取其他样品加入30μL水，混悬后再加入30μL2×载样缓冲液混匀，沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取10μL上清加样于18％分离胶6％浓缩胶，上样后电压为60V，20min，样品进入分离胶后电压升至100V，4h～5h，用0.5％考马斯亮兰R-250振荡染色2h～3h，脱色直至背景清晰后制备干胶保存；

②免疫印迹反应

SDS-PAGE结束后，按Bio-Rad产品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜靠近阳极一侧，置转移缓冲液中，缓冲液的配方为：25mmol/L Tris、192mmol/L Glycine、20％甲醇，100V恒压1h，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出硝酸纤维膜，用洗涤液TBST室温洗3次，洗涤液TBST含有0.02mol/L pH7.4 TBS、0.4％Tween20，室温洗3次，浸入封闭液中，该封闭液含2％BSA的TBST，37℃，1h，以TBST洗涤液室温洗3次，加羊抗小鼠TNF-α多克隆抗体，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入兔抗羊IgG-AP二抗，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸馏水冲洗终止反应；

③融合蛋白的纯化和复性

取含pBV220-mTNF-PADRE重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000rpm离心10min，收菌，超声裂菌；4℃，12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉淀；

将溶解的沉淀和上清分别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析，在证实目的蛋白以包涵体的形式表达后，用层析纯化所溶解的沉淀；按1g菌体加10mL裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌；12000rpm，离心15min，收集的裂菌沉淀用100ml饱含体洗涤液洗涤两次，该洗涤液为：4M Urea，1％Triton X-100，5mM EDTA，5mMβ-mercaptoethanol，50mM Tris-HCl，pH8.5；洗涤后的沉淀用包涵体溶解液溶解过夜，包涵体溶解液为：20mMβ-mercaptoethanol，7M guanidine hydrochloride；12,000rpm离心30min收集上清；1ml的TNF-PADRE的包涵体溶解上清，以0.5ml/min的流速过2.4×100cm的Sephacryl-300层析柱，流动相均为50mM Tris-HCl，pH8.5、8Murea，100mM NaCl；收集目的峰，以复性液透析复性8h，复性液为：10mM Tris-HCl，pH8.5，以体积比1/1000的β-mercaptoethanol，体积比1/105的0.5M CuSO4，之后以双蒸水透析过夜，用Bradford法测定蛋白浓度，即可筛选出mTNF-PADRE融合蛋白。

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